Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Ce protocole décrit une méthode pour générer des progéniteurs interneurones corticaux et des interneurones post-mitotiques précurseurs de cellules souches embryonnaires de souris à l’aide d’une méthode modifiée de corps-à-monocouche embryoïdes. Ces cellules souches/précurseurs peuvent être utilisés in vitro fluorescent triés et transplantés dans le néocortex néonatal pour l’étude de détermination de sort ou utilisés dans des applications thérapeutiques.

Abstract

Les corticales interneurones GABAergiques sont une population hétérogène de cellules qui jouent un rôle crucial en réglementant la production de neurones pyramidaux excitatrices mais aussi de synchroniser les sorties des ensembles de neurones pyramidaux. Les déficits en fonction d’interneurones ont été impliqués dans une variété de troubles neuropsychiatriques, y compris la schizophrénie, l’autisme et l’épilepsie. La dérivation des interneurones corticaux de cellules souches embryonnaires permet non seulement pour l’étude de leur développement et leur fonction, mais donne un aperçu sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénie des affections interneurones corticale. Interneurones ont également la capacité remarquable de survivre, migrer et intégrer dans hôte des circuits corticaux après la transplantation, rendant les candidats idéaux pour une utilisation dans les thérapies cellulaires. Nous présentons ici une méthode monocouche-à-corps embryoïdes évolutive, hautement efficace, mis à jour le pour la dérivation des progéniteurs d’interneurones exprimant Nkx2.1 et leur progéniture de cellules souches embryonnaires de souris (mESCs). En utilisant une ligne de mESC journaliste double Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, progéniteurs Nkx2.1 ou leur progéniture post-mitotiques exprimant le Lhx6 peut être isolé par cellule activée par fluorescence triant (FACS) et par la suite utilisé dans un certain nombre d’applications en aval. Nous fournissons également des méthodes pour enrichir pour la parvalbumine (PV) ou de la somatostatine sous-groupes d’interneurones (SST), qui peut être utile pour l’étude des aspects de la détermination du sort ou pour une utilisation dans des applications thérapeutiques qui pourraient bénéficier d’interneurones enrichie en sous-groupe transplantations d’organes.

Introduction

Chez les souris et les humains, environ la moitié des interneurones inhibiteurs tout corticales (CIns) sont créés dans une structure sous-corticale transitoire appelée l’éminence ganglionnaire médial (MGE), où les progéniteurs neuroépithéliales CIns et autres neuronales et gliales sous-groupes d’exprimer le facteur de transcription Nkx2.11,2. Sous-groupes de CIn ou sous-types sont définis par intersection morphologiques, neurochimiques, électrophysiologique et connectivité caractéristiques3,4. Les CIns MGE-dérivés peuvent être regroupés en sous-groupes pour la plupart non-cumul basé sur leur expression de PV ou de SST, l’expression de qui est en corrélation avec notamment électrophysiologiques et connectivité tendances5. Dysfonctionnement des interneurones, surtout dans le sous-groupe de PV, a été impliqué dans plusieurs neuropsychiatriques troubles et maladies6,7. L’objectif général de cette méthode est de produire des cellules souches dérivées de cellules souches mitotiques et migrateurs précurseurs enrichis pour PV ou SST CIn sort pour étudier la biologie des interneurones corticaux et pour utilisation dans les thérapies à base cellulaire.

Nous avons développé une méthode évolutive et très efficace pour la dérivation des progéniteurs d’interneurones exprimant Nkx2.1 et leur progéniture de mESCs. À l’aide d’un Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP double journaliste mESC line8, progéniteurs Nkx2.1 ou leur progéniture post-mitotiques exprimant le Lhx6 peut être isolées par l’intermédiaire de FACS et par la suite utilisé dans un certain nombre d’applications en aval. En manipulant un certain nombre de voies de signalisation, de la durée de la culture et le mode de la neurogenèse, nous pouvons obtenir des millions de précurseurs interneurone fluorescent étiquetés convenant à une multitude d’applications en aval.

Bien que plusieurs autres méthodes existent pour générer des progéniteurs MGE-like du mESCs9,10,11,12,13,14, notre méthode, qui repose sur la voie Wnt antagoniste de XAV-939, est particulièrement efficace de générer des Foxg1/Nkx2.1 exprimant des progéniteurs télencéphaliques. En outre, la possibilité de sélectionner des progéniteurs interneurone ou leur progéniture exprimant le Lhx6 post-mitotiques via notre système de double Rapporteur, améliore grandement la capacité de générer des cellules souches distinctes et leur progéniture.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Remarque : La ligne de mESC double journaliste décrite dans le présent protocole est disponible sur demande (sande@mail.med.upenn.edu).

1. préparation de support

NOTE : Réchauffer tous les médias à 37 ° C avant de l’utiliser en culture cellulaire.

  1. Médias de fibroblastes embryonnaires souris (MEF) (pour préparer 500 mL)
    1. Ajouter sérum foetal 50 mL (SVF) à 449 mL de milieu (DMEM modifié de l’aigle) de Dulbecco et filtrer sur une unité de filtration 500 mL 0,22 µm pore.
    2. Ajouter 1 mL antimicrobial agent (50 mg/mL) après filtration. Stocker les médias à 4 ° C jusqu'à 1 mois ou partie aliquote et magasin à ≤-20 ° C.
  2. Médias de N2 (pour préparer 500 mL)
    1. Ajouter 5 mL L-alanine-L-glutamine (x 100) et 500 µL 2-mercaptoéthanol (55 mM) à 489,5 mL DMEM : mélange de nutriments F-12 (DMEM/F-12) et filtrer sur une unité de filtration 500 mL 0,22 µm pore.
    2. Ajouter agent antimicrobien de 1 mL (50 mg/mL) et 5 mL N2 Supplément-B après filtration. Entreposer les médias à 4 ° C à l’obscurité pendant environ 1 mois.
  3. Milieu sans sérum croissance (KSR) (pour préparer 500 mL)
    1. Ajouter 75 mL supplément moyen sans sérum, 5 mL L-glutamine (x 100), 5 mL MEM (MEM-NEAA) des acides aminés Non essentiels (x 100), et 500 µL 2-mercaptoéthanol (55 mM) à 413,5 mL non-glutamine contenant DMEM et filtrer à travers une unité de filtration 500 mL 0,22 µm pore.
    2. Ajouter 1 mL antimicrobial agent (50 mg/mL) après filtration. Stocker les médias à 4 ° C pendant environ 1 mois.
  4. Médias de cellules souches embryonnaires de souris (pour préparer 500 mL)
    1. Ajouter catégorie de cellules souches 75 mL FBS, 5 mL MEM-NEAA (x 100), 5 mL L-glutamine (x 100), et 500 µL 2-mercaptoéthanol (55 mM) à 413,5 mL non-glutamine contenant DMEM et filtrer à travers une unité de filtration 500 mL 0,22 µm pore.
    2. Ajouter 1 mL antimicrobial agent (50 mg/mL) après filtration. Entreposer les médias à 4 ° C à l’obscurité pendant jusqu'à un mois ou partie aliquote et stocker à ≤-20 ° C.

2. culture mESCs

  1. Plaque des cellules nourricières MEF mitotically inactifs dans les médias sur des plaques de culture de tissus traitée à 3-4 x 104 cellules/cm2MEF. Laissez au moins 12 heures pour eux de s’installer dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2 avant les mESCs de placage. Si ne pas utilisée immédiatement, remplacer les médias MEF tous les 3 jours. Disposer de MEFs si ne pas utilisé dans les 7 jours du bordé.
  2. Ajouter mESCs (gamme de densité de 1-4 x 104 cellules/cm2) aux plaques de MEF dans mESC milieux contenant du facteur inhibiteur de leucémie de souris (mLIF) (1 000 U/mL). Incuber les cellules à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2.
  3. Passage de mESCs à l’aide de la trypsine-EDTA (0,05 % trypsine) (1:5-1:10) une fois que le plat devient ~ confluente de 70 à 80 % ou si les colonies commencent à toucher. En général, cela se produit tous les 2 jours, mais peut prendre jusqu'à 4 ou 5 jours selon la densité des ensemencements initiaux.
  4. Maintenir les mESCs sur une couche de conducteur MEF dans mESC moyen de garder la pluripotence.
  5. Avant de commencer la différenciation, le passage des cellules au moins une fois sur des plaques de gélatine enduit sans MEFs diluer sur les MEFs.
    1. Préparer des plaques de gélatine enduit en ajoutant 0,1 % gélatine dans saline tamponnée au phosphate (PBS) avec Ca2 +/Mg2 + pour un plat de culture de tissus traité et laissant à 37 ° C pendant au moins 1 h. plaque de 1,5 à 2 x 106 cellules/10 plaque de cm (2,7 à 3,6 x 104 cellules/cm2) et laissez les cellules afin d’élargir pour 2 jours avant le début de la différenciation.

3. différencier les mESCs vers MGE-comme progéniteurs télencéphaliques

  1. Jour de différenciation (DD) 0 = « float cellules »
    1. Après que les mESCs ont cultivé sur des plaques de gélatine couché pendant 2 jours, aspirer les médias et laver les cellules une fois avec du PBS sans Ca2 +/Mg2 +. Ajouter suffisamment la trypsine-EDTA (0,05 % trypsine) pour couvrir la surface de la plaque (en général 4 mL trypsine-EDTA pour un plat de culture de tissu de 10 cm) et remettre les cellules dans l’incubateur à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2 pendant 4 min.
    2. Après 4 min, étancher la trypsine-EDTA à l’aide de 2 fois le volume avec les médias de la mescaline. Transférer les cellules dans un tube à centrifuger de taille appropriée et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min. Après 5 min, retirez le tube et aspirer les médias sans déranger le culot. Resuspendre le culot dans 1 mL KSR:N2 media (1:1) contenant l’inhibiteur BMP LDN-193189 (250 nM) et l’inhibiteur de la voie Wnt XAV-939 (10 µM).
    3. Mesurer la concentration de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisées. Démarrer les cellules en croissance comme corps embryoïdes (EBs) en ajoutant 75 000 cellules/mL dans les médias de la KSR:N2 (1:1) contenant LDN-193189 (250 nM) et XAV-939 (10 µM) dans les plats de culture de tissus non adhérents. Incuber les cellules à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2.
  2. DD1, préparer pour la cellule « atterrissage » par revêtement tissu traité Pétri avec poly-L-lysine (10 µg/mL dans du PBS avec Ca2 +/Mg2 +) du jour au lendemain (O/N) à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative ou pendant au moins 1 h.
  3. DD2, aspirer la poly-L-lysine et enduire les plaques de laminine (10 µg/mL dans du PBS avec Ca2 +/Mg2 +) O/N à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative.
    Remarque : O/N est optimale, aussi peu que 2 h peut être suffisante. Si les plaques ne sont pas utilisés par le lendemain, aspirer la laminine, de remplacer avec du PBS sans Ca2 +/Mg2 +et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines.
  4. DD3 (« terre de cellules »)
    1. Avant de commencer la dissociation EB, aspirer la laminine et laisser les plaques à sécher sous une hotte de culture de tissus. Ne pas utiliser de plaques qui apparaissent brillantes ou visiblement humide. Transférer l’EBs avec les médias dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 3-4 min à 15 x g, ou jusqu'à ce que l’EBs ont granulée.
  5. Aspirer les médias et ajouter 3 mL de solution de détachement de cellules contenant la DNase (2 U/mL) et incuber à 37 ° C avec une humidité relative ≥ 95 % et 5 % CO2 pendant 15 min. balayer doucement le tube toutes les 3 min pour aider à la dissociation de l’EB.
  6. Une fois que l’EBs ne sont plus visibles ou 15 minutes se sont écoulées, ajoutez 6 mL KSR:N2 (1:1) contenant la DNase (1 U/mL) et centrifuger pendant 5 min à 200 x g.
  7. Les cellules de KSR:N2 (1:1) contenant LDN-193189 sur plaque (250 nM), XAV-939 (10 µM) et l’inhibiteur ROCK Y-27632 (10 µM) à 4,5 à 5 x 104 cellules/cm2.

4. enrichissement personnel SST protocole : « DD12 GFP haute Sonic Hedgehog (SHH) » (suite de l’étape 3,7)

  1. Sur DD5, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) et SSH (50 ng/mL).
  2. Préparer la modification des plaques le jour 8 (étape 4.4) plaques de culture de tissu en suivant les instructions décrites aux étapes 3.2-3.3.
  3. Sur DD7, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) et SHH (50 ng/mL).
  4. Sur DD8, re-plaque les cellules.
    NOTE : Bien que cette étape n’est pas essentielle, ré-ensemencement des cellules peut réduire types cellulaires début dissociés, indésirables. Modification des plaques aussi rompt les boules des cellules qui compliquent l’analyse immunohistochimique en aval et augmente l’efficacité des FACS aux moments plus tard.
    1. Pour re-plaque de cellules, de détacher les cellules de la plaque avec la trypsine-EDTA (0,05 % trypsine) pendant 5 min à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2. Étancher la trypsine-EDTA avec 2 fois le volume de KSR:N2, et centrifuger à 200 x g pendant 5 min. filtrer les cellules à travers un tube de filtre de 40 µm pour éliminer tout amas. Re-plaque les cellules à 250 000 cellules/cm2 à N2/KSR (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) et Y-27632 (10 µM) avec SHH (50 ng/mL).
      Remarque : Si au lieu de cela, la décision est prise ne pas à re-plaque les cellules sur DD8, changer les médias avec KSR:N2 contenant SHH (50 ng/mL) tous les 2 jours de DD7 à DD12 et continuer à ajouter des IGF-1 (20 ng/mL) et FGF-2 (10 ng/mL) jusqu'à DD9.
  5. Sur DD10, changer les médias avec KSR:N2 contenant SHH (50 ng/mL).
  6. Sur DD12, pour obtenir des cellules qui sont enrichis pour les sous-types de SST, utilisez FACS pour isoler Lhx6::GFP-exprimant seulement les cellules.
    1. Pour détacher les cellules, utilisez un réactif de dissociation cellulaire contenant non-trypsine plutôt que la trypsine-EDTA. Laver les cellules une fois avec du PBS sans Ca2 +/Mg2 +. Ajouter pré chauffé non-trypsine contenant la dissociation cellulaire réactif contenant DNase (2 U/mL) pour les cellules. Placez-les dans l’incubateur à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2 pendant 10 à 30 min ou jusqu'à ce que les cellules ont détaché. Secouer doucement les plaques toutes les 5 min pour la dissociation de l’aide.
      Remarque : Pour les cultures DD11-12, seulement 10-15 min peut être nécessaire. Pour les cultures DD15-16, 30 min ou plus peuvent être requis pour une dissociation complète.
    2. Une fois que les cellules ont complètement levées au large de la plaque, procéder à l’isolement de FACS en utilisant les protocoles standards ou utiliser les cellules dans d’autres analyses en aval.

5. PV-enrichir protocole : « DD11/DD17 mCherry + aPKCi » (suite de l’étape 3,7)

  1. Sur DD5, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL) et d’IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Préparer des plaques de culture de tissus pour ré-ensemencement sur DD8 (étape 4.4) en utilisant les instructions décrites dans les étapes 3.2-3.3.
  3. Sur DD7, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL) et d’IGF-1 (20 ng/mL).
  4. Sur DD8, re-plaque les cellules comme indiqué au point 4.4, avec les exceptions suivantes : lorsque la modification des plaques les cellules, remplacez SHH lissé agoniste (SAG ; 30 nM) et ajouter des inhibiteur de PKC atypique (aPKCi ; 2 µM). Pris ensemble, les médias re-électrodéposition est maintenant N2/KSR (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM) et aPKCi (2 µM).
  5. Sur DD10, changer les médias avec KSR:N2 contenant les aPKCi (2 µM).
  6. DD11
    Remarque : À ce stade, les cellules Nkx2.1::mCherry+ sont enrichis pour devenir PV CIns.
    1. Détacher les cellules de la plaque des FACS en utilisant le même protocole décrit à l’étape 4.6. Si la décision est prise à prélever des cellules Nkx2.1::mCherry+ à une date ultérieure de la différenciation, ignorez cette étape.
  7. Sur DD12, changer les médias avec KSR:N2 contenant les aPKCi (2 µM). Sur DD14, changer les médias avec KSR:N2 contenant les aPKCi (2 µM). Sur DD16, changer les médias avec KSR:N2 contenant les aPKCi (2 µM). Sur DD17, recueillir les cellules Nkx2.1::mCherry+ en utilisant le même protocole décrit à l’étape 4.6.

6. PV-enrichir protocole : « DD17 mCherry Low SHH » (suite de l’étape 3,7)

  1. Sur DD5, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL) et d’IGF-1 (20 ng/mL). Sur DD7, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL) et d’IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Sur DD9, changer les médias avec KSR:N2 (1:1). Partir de ce moment, aucun facteur de croissance supplémentaires ne sont nécessaires.
    1. Continuer à changer les médias tous les 2 jours jusqu'à la récolte des cellules sur DD17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le protocole décrit dans le présent document est une version modifiée de nos protocoles publiés15,16,17 et a été optimisé pour une utilisation avec notre gamme de double-journaliste mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. En ajoutant l’inhibiteur de la voie Wnt XAV-939 du DD0-5, combiné avec la modification des plaques à DD8, nous obtenons robuste Nkx2.1 induction, dans lequel plus de 50 % de tous les noyaux DAPI + en culture sont également Nkx2.1 exprimant (Figure 1 a, B). Immunohistochemistry pour la mCherry et les journalistes GFP montre l’expression claire dans les régions d’immunoréactivité Nkx2.1 positive (Figure 1 a). FACS de cellules vivantes à l’aide de la journaliste natif montre que quatre populations de cellules peuvent être clairement isolées : cellules de double négation GFP/mCherry (1), (2) mCherry-seul exprimant des cellules, des cellules exprimant (3) GFP-seul et les cellules exprimant double GFP (4) / mCherry ( Figure 1). En utilisant cette ligne, une petite fraction des progéniteurs commence à tourner sur le journaliste mCherry autour DD8-9. Les niveaux de mCherry de pointe entre DD12-13 et puis progressivement diminuent comme progéniteurs sortir du cycle cellulaire et produisent des précurseurs post-mitotiques de Lhx6::GFP + interneurone (Figure 1). Parallèlement, le journaliste Lhx6::GFP s’allume entre DD9-10 et les sommets autour de DD13-14 (Figure 1). Bien que le nombre total de cellules Lhx6::GFP continue d’augmenter dans la culture, le pourcentage ne fonctionne pas, probablement en raison de la prolifération des autres lignées. Une fois le Lhx6::GFP + exprime de journaliste, il reste décelable indéfiniment, étant donné que Lhx6 est exprimée stablement dans mature interneurones corticaux dérivé de MGE18,19. Bien que l’expression Nkx2.1 et Lhx6 sont en grande partie sans chevauchement dans le prosencéphale murin, il y a une population nomade de Nkx2.1::mCherry et Lhx6::GFP co exprimant des cellules en culture. C’est au moins en partie à cause de la perdurance de la journaliste mCherry au-delà du délai normal d’expression Nkx2.1, car la plupart des cellules marquées double n’exprime pas des niveaux détectables de protéine Nkx2.1 (Tyson et Anderson, inédit). Continuant à exprimer le journaliste Lhx6 et Cherry/Nkx2.1 protéine des cellules peuvent être striatale interneurones20. Cependant, d’après nos études d’imagerie live, il y a une fenêtre d’environ 18 h, dans laquelle les précurseurs synchrones, nouvellement post-mitotiques exprimer Nkx2.1::mCherry et Lhx6::GFP peuvent être isolés (Tischfield Anderson, inédites et voir Tischfield et al. 17). ainsi, en recueillant Nkx2.1::mCherry et Lhx6::GFP doubles cellules positives à tout moment pendant le protocole, il est possible d’obtenir une population de cellules qui ont quitté principalement du cycle cellulaire dans les environ 18 h de l’autre. Cela fait contraste avec Nkx2.1::mCherry et Lhx6::GFP-exprimant seulement les cellules, qui représentent les différents types de cellules souches et de précurseurs, respectivement, des dates de naissance différentes.

La ligne de double-journaliste mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP peut servir à enrichir des interneurones SST-voué. En général, ajoutant SHH aux cultures et la collecte GFP + cellules aux périodes antérieures dans la différenciation (p. ex., DD12) enrichit pour les sous-types de SST. D’après nos observations, nous n’avons pas vu une différence significative du ratio SST:PV selon que SHH est ajouté au DD5 ou DD8 (données non présentées). En ajoutant SHH (50 ng/mL) de DD8-12 et ensuite transplanter les cellules exprimant GFP seule, on obtient en moyenne un ratio de 7:1 SST:PV CIns (Figure 2 a)15,17. Pour plus de détails sur les effets de SHH et temps dans la culture sur le sort d’interneurones en utilisant notre ligne double-journaliste mESC, voir Tyson et al. 15

Pour enrichir pour PV-fated CIns, SHH devrait figurer dans les milieux de culture. À noter, conforme à l’exigence de SHH de signalisation maintenir l’expression Nkx2.1 progéniteurs mitotique21, SHH signalisation existe dans ces cultures sans SHH exogène ajouté depuis la SHH antagoniste cyclopamine élimine de signalisation Nkx2.1 expression15. Toutefois, si les cellules sont re-plaqués sur DD8, cette SHH endogène est supprimé, tel que SAG (30 nM) s’ajouteront aux médias de DD8-10 pour maintenir l’expression Nkx2.1 et la production de RISC. Notre précédente étude a montré que, en retenant SHH depuis les conditions de culture et de tri pour les cellules Nkx2.1::mCherry+ sur DD17, un ratio de ~2.6:1 de PV:SST des cellules peut être obtenu (Figure 2 b)15. Contrairement à la SST sous-types, qui sont enrichies à des stades antérieurs et en présence de SHH exogène, a augmenté la durée en culture et manque de SHH exogène enrichit pour PV sous-types15. Dans une étude plus récente, nous avons constaté qu’aPKCi appliquée à notre protocole « MGE » sensiblement augmente la fraction des progéniteurs Nkx2.1::mCherry qui expriment la cycline D217, un marqueur de de cellules progénitrices intermédiaire22. Cette variation de protocole reposait sur notre conclusion que CIns exprimant le PV provenaient principalement de progéniteurs intermédiaires, tandis que les progéniteurs SST provenaient principalement de progéniteurs radiales à la surface ventriculaire23. Nous avons trouvé que lorsque triés et transplantés dans le néocortex souris néonatales, ces progéniteurs sont grandement faussées de production PV-sous-types. En ajoutant aPKCi DD8-11 et puis tri Nkx2.1::mCherry cellules, nous avons pu obtenir un ratio de 5.8:1 de PV:SST sous-types (Figure 2)17. Pour enrichir davantage pour les sous-types de PV, nous avons également isolé Nkx2.1::mCherry cellules cultivées en présence d’aPCKi DD8-17. Cependant, on n’a pas atteint une augmentation du ratio de PV:SST au-delà de ce que nous avons pu obtenir à DD11, malgré une légère augmentation du pourcentage des sous-types de PV généré (Figure 2D). Organigrammes pour chacun de ces protocoles sont contenus dans la Figure 3. Immunostaining des souris brains 30 jours suivant la transplantation avec anti-PV, anti-SST et anti-GFP (pour améliorer l’identification des cellules Lhx6::GFP +) anticorps montre que Lhx6::GFP + cellules présentent des caractéristiques morphologiques matures avec des modes d’expression PV et SST semblable à leurs en vivo homologues (Figure 4 et Figure 5).

Pour vous aider à déterminer si une différenciation CIn apparaît fructueuse, nous avons préparé une série d’images à chaque étape du Protocole visant à démontrer la variabilité normale (Figure 6, Figure 7, , Figure 8). Nous incluons également une figure montrant comment une différenciation infructueuse apparaît sur DD4 (Figure 9). En général, les différenciations infructueuses rapportera faibles (moins de 10 %) d’expression Nkx2.1 et pourcentages d’induction Nkx2.1::mCherry et Lhx6::GFP d’environ 1 % ou moins.

Figure 1
Figure 1 : génération de précurseurs d’interneurones Nkx2.1::mCherry et Lhx6::GFP. (A) montré ici sont des images représentatives d’immunomarquage pour Nkx2.1 Nkx2.1::mCherry (DP) et Lhx6::GFP (GFP) d’une différenciation journée 12 (DD12) culture. Notez que ces images sont chevauchent des canaux du même champ de vue. Quantifier le pourcentage moyen de DAPI + noyaux qui expriment Nkx2.1 à DD12 dans la culture (B) (n = 3 différenciations indépendantes). (C), FACS représentant terrain démontrant les quatre différentes populations cellulaires qui peuvent être isolées à l’aide de notre gamme de mESC journaliste double. Notez que mCherry est sur l’axe des abscisses et GFP est sur l’axe y. Ainsi, la zone supérieure droite représente les cellules qui sont mCherry/GFP-double positives. (D) cours de temps d’induction Nkx2.1::mCherry et Lhx6::GFP du DD6-16, exprimée en pourcentage de cellules en culture qui sont mCherry seulement exprimer, GFP seule exprimer ou mCherry/GFP exprimant conjointement. Ces pourcentages ont été extraites des cellules cultivées en présence de SHH pendant un protocole SST d’enrichissement et représentent des moyennes de 3 différenciations indépendantes. Barres d’erreur (b) et (D) représentent SEM. échelle bar = 150 µm (A). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Manipulation des conditions de culture enrichit différemment pour PV-versus SST-fated mESC dérivé des interneurones corticaux. (A) pourcentage de PV + SST + et PV- / SST-interneurones obtient quand DD12, GFP uniquement les cellules exprimant cultivées en présence de SHH (50 ng/mL) du DD5-12 sont transplantées dans le néocortex néonatale et analysé post-transplantation de 30 jours. (B) pourcentage de PV + SST + et PV- / SST-interneurones obtient quand DD17, mCherry seule expression cellules cultivées sans SHH supplémentaire sont transplantés dans le néocortex néonatale et analysé 30 jours après la transplantation. (C) pourcentage de PV + SST + et PV- / SST-interneurones obtient lorsque DD11, mCherry uniquement les cellules exprimant cultivées en présence de SAG (30 nM ; Dd8-10) et aPKCi (2 µM ; Dd8-11) sont transplantés dans le néocortex néonatale et analysé post-transplantation de 30 jours. (D) pourcentage de PV + SST + et PV- / SST-interneurones obtient quand DD17, mCherry uniquement les cellules exprimant cultivées en présence de SAG (30 nM) de DD8-10 et aPKCi (2 µM) de DD8-17 sont transplantées dans le néocortex néonatale et analysé 30 jours après la transplantation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : organigrammes illustrant les protocoles différent PV et SST-enrichissement personnel décrites dans la présente étude. (A) pour tous les protocoles, les étapes précédant le début de la différenciation dont DD0-5 sont identiques. Toutes les cellules sont cultivées dans des corps embryoïdes DD0-3 en N2:KSR (1:1) additionnés de la LDN-193189 BMP-inhibiteur et de l’inhibiteur de la voie Wnt XAV-939. Sur DD3, les cellules sont « débarqués » dans N2:KSR (1:1) contenant LDN-193189, XAV-939 et inhibiteur de la roche Y-27632. Pour enrichir pour SST-sous-types, SHH est ajouté du DD5-12. Alternativement, SHH est ajoutée du DD8-12 puisque, dans notre expérience, l’ajout de SHH de DD5 versus DD8 partir n’impacte pas sensiblement le ratio des sous-types PV:SST généré. Les versions précédentes du protocole (voir Tyson et coll.. 15) n’a pas incorporé à une étape de re-électrodéposition sur DD8 et complétée au lieu de cela les médias avec SHH exogène sur DD5. Ce protocole a été plus tard modifié pour incorporer un pas re-électrodéposition sur DD8 ainsi que l’introduction de SHH, ni de ce qui modifierait sensiblement le rapport de PV:SST. Dans le présent protocole « haute-SHH », Lhx6::GFP + des cellules cultivées en présence de SHH exogène sont FACS isolé sur DD12 destiné aux applications en aval. (B) pour le « bas-SHH » PV-protocole SHH exogène, mais aussi l’étape de re-électrodéposition sur DD8 est omise. Au lieu de cela, les cellules Nkx2.1::mCherry+ sont FACS isolé sur DD17 destiné aux applications en aval. (C) pour le « + aPKCi » protocole de PV, SAG est ajoutée aux aPKCi de DD8-10 et seulement aPKCi est ajouté de DD10 à partir. DD11 ou DD17, les cellules Nkx2.1::mCherry sont FACS isolé destiné aux applications en aval. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : immunomarquage PV et SST en Lhx6::GFP + cellules 30 jours suivant la transplantation dans le néocortex néonatale. Image de haute puissance (A) d’un SST-exprimer, Lhx6::GFP + 30 jours après greffe de cellules dans le néocortex néonatale. Dans chaque colonne de quatre images sont des images de monocanal d’expression Lhx6::GFP, PV et SST avec une image fusionnée de 3 canaux au fond. Comme indiqué dans le panneau supérieur, ce neurone Lhx6::GFP + élabore plusieurs processus évocateurs d’une morphologie mature. Image de haute puissance (B) deux PV-exprimer, Lhx6::GFP + cellules 30 jours après la transplantation. Image de haute puissance (C) d’un SST / PV-double négatif, Lhx6::GFP + cell. Bien que cette cellule élabore plusieurs processus conformes complete différenciation et intégration corticale, cette cellule ne clairement exprime PV ou SST. Notez qu’il existe un noyau PV + adjacentes à la cellule de Lhx6::GFP +, mais qu’il ne se chevauche pas. Barreaux de l’échelle = 50 µm (A-C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : images d’expression de protéine PV, SST et Lhx6::GFP de puissance moyenne et basse 30 jours suivant la transplantation dans le néocortex néonatale. Image de moyenne puissance (A) d’une région du néocortex souris contenant 30 Lhx6::GFP + cellules 30 jours après la transplantation. Ces cellules sont cultivées en utilisant le protocole de PV (+ aPKCi DD8-11 ; FACS isoler et greffe Nkx2.1::mCherry+ sur DD11). Des 30 cellules vus ici, 16 express PV, 4 express SST et 10 express ni PV ni SST. Image de faible puissance (B) d’une région du néocortex souris contenant de nombreuses, bien différenciés Lhx6::GFP + cellules 30 jours suivant la transplantation. Notez l’abondance des processus Lhx6::GFP + coursé dans tout le cortex. Cellules occasionnels se trouvent également dans l’hippocampe, où elles semblent s’intégrer et d’élaborer des procédés compatibles avec un phénotype mature. Echelle = 50 µm (A) ; 550 µm (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : aspect Normal de la couche de conducteur souris fibroblastes embryonnaires et cellules souches indifférenciées. (A) montré ici sont 4 X et 10 X grossissement fond clair images démontrant l’aspect typique de notre chargeur de fibroblastes embryonnaires (MEF) de souris couches 24h après l’ensemencement. (B) montré ici est l’aspect typique de notre souris des cellules souches embryonnaires (mESCs) 2 jours après le placage sur les mangeoires MEF. À noter que les colonies ont un périmètre lumineux et elliptique ou ovoïde en apparence. Les colonies perdent ce périmètre lumineux ou commencent à envoyer des projections vers l’extérieur, ce sont des signes que les cellules peuvent se différencier. (C) montré ici sont mESCs 1 et 2 jours après modification des plaques sur des plats de gélatine enduit afin de diluer les mangeoires MEF avant le début de la différenciation. Notez que les cellules souches élargir considérablement après 48 h sur la gélatine et commencer à racheter un aspect ovoïde avec un périmètre lumineux. Echelle = 100 µm en 4 X et 10 X photos. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : apparition des cellules souches embryonnaires de souris les jours 1 à 7 de la différenciation. (A), un jour après le flottant, la tige des cellules peuvent être vu corps embryoïdes petits formage (EBs). En deux jours, l’EBs ont considérablement augmenté. Notez que certains EBs ont collés ensemble et forment le plus gros amas de cellules. Nous ne trouvons pas que cela influe négativement sur la différenciation. Après 3 jours, l’EBs ont augmenté encore plus, et certains ne plus transmettent la lumière à travers eux. Il est normal de voir des débris cellulaires en arrière-plan. (B) montré ici sont des cellules souches 24h après l’atterrissage au jour 4 de la différenciation (DD4). Notez la densité des cellules. Beaucoup ont commencé à étendre les processus petits, qui augmenteront à mesure que la différenciation continue. Notez ici que les cellules sont de même couleur avec petits points noirs répartis tout au long. Si les cellules sont brillantes ou homogène qui apparaît, c’est un signe de différenciation aberrante. (C) par DD5, les cellules ont continué à proliférer et former des rosettes neuronales. Plusieurs cellules ont étendu des processus longs et minces. (D) par DD7, les cellules doivent être confluentes. Il est normal de voir un modèle de « Gruyère », dans lequel les cellules grandes, plates, multinucléées (éventuellement épendymaires ou cellules gliales) créent les îles circulaires dans une couche de cellules souches neurales. Parfois ce modèle « Gruyère » lorsque la densité cellulaire est supérieure à la normale, ne pas le développement, comme le montre l’image du milieu. Selon la différenciation, cela peut affecter l’induction neurale. 4 x et 10 x indiquent le grossissement. Echelle = 100 µm en 4 X et 10 X photos. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : apparition de la différenciation jours 9 à 14. (A) les cellules individuelles peuvent être visualisées par un jour après la modification des plaques. Notez leur apparence bipolaire, ce qui est typique des progéniteurs neurones. La culture est homogène avec quelques autres types de cellules infiltrantes. La densité est appropriée pour cette étape. (B) par DD11, les cellules sont devenus d’une monocouche. Semblables à des stades antérieurs dans la différenciation, grande multi nucléées « semblables à des œufs » peuvent être vu intercalés dans l’ensemble. (C) par DD13 que les cellules ont continué à proliférer. Ils peuvent maintenant être vus formant de petits monticules. Plusieurs cellules « semblables à des œufs » sont toujours présents dans l’ensemble. Partir de ce moment, la culture montrera seulement quelques changements, à l’exception des amoncellements de plus en plus grandes. 4 X, 10Xx, et 20 X indique le grossissement. Echelle = 100 µm en 4 X et 10 X photos et barre d’échelle = 50 µm de 20 photos de X. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : apparition d’une différenciation infructueuse au jour 4. DD4 est important en ce qui concerne l’évaluation de la réussite d’une différenciation car il suit une des étapes plus difficiles du protocole : le débarquement sur DD3. Par DD4, les cellules ont eu 24h pour récupérer après être dissociée du corps embryoïdes. Comme peut être vu ici, la plupart des cellules sont brillant et homogène qui apparaît. Intercalées dans sont des cellules occasionnels qui semblent normaux, présentant un aspect plus sombre avec des petits points noirs répartis tout au long. En outre, grandes cellules aplaties (comme peuvent être vu dans le panneau gauche du bas) sont révélateurs de la différenciation aberrante. Dans le panneau droit du bas, au moins trois petits groupes de cellules (flèches jaunes) apparaissent comme des petits corps embryoïdes, indiquant soit la différenciation défectueuse, dissociation incomplète de EB ou mauvaise adhérence à la surface de la plaque de culture cellulaire. Contrairement à celles indiquées à la Figure 7 b, qui dépeignent saine et normale, ces images apparaissent des cellules sur DD4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alors que cette méthode est très efficace pour le patterning mESCs dérivé de J1 (CPCR-1010), nous avons connu un succès variable avec d’autres lignes de la mescaline et isolats clonales. Par exemple, Foxg1::venus mESCs (dérivés EB3 ; Danjo et al. 13) répondent mal au présent protocole et l’induction de la Foxg1 par DD12 est typiquement sur l’ordre de 1 à 2 %. Pour des raisons que nous ne comprenons pas entièrement, clone de journaliste double un autre Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP (appelé JQ59) qui a été isolé en même temps que la ligne décrite dans le présent protocole (appelé JQ27), produit moins de 1 % des cellules exprimant Nkx2.1 lorsqu’il est cultivé dans des conditions identiques. La lignée parentale (J1 ; ATCC SCRC-1010), cependant, répond bien au présent protocole et produit des pourcentages de cellules exprimant Nkx2.1 sur DD12 semblables à celles indiquées dans la Figure 1 b. Si nécessaire, les concentrations de XAV-939 et SHH/SAG peuvent être ajustées afin d’optimiser les conditions de la différenciation par ligne par ligne. Cependant, notre expérience utilisant ce protocole se pour différencier des autres lignes de mESC en progéniteurs MGE-like est limitée.

À propos de notre ligne de mESC journaliste double Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, pas tous Nkx2.1 + cellules expriment mCherry. Bien que presque tous les mCherry + cellules expriment la protéine Nkx2.1, expression de la journaliste est en retard Nkx2.1, expression protéique, surtout pendant les premiers stades de la différenciation (DD7-9). La fraction de Nkx2.1 + des cellules exprimant mCherry régulièrement augmente au cours de la différenciation. Aux niveaux maximaux (~ DD12-14) mCherry est exprimée dans environ 30 % de tous les Nkx2.1 exprimant des progéniteurs17. En outre, le même chromosome artificiel bactérien utilisé pour expression mCherry en voiture a été utilisé pour piloter une recombinase Cre dans domaines Nkx2.1-expression de souris transgéniques24. Chez ces souris, Cre-expression était faible dans les cellules exprimant le Nkx2.1 de la région dorsale de la MGE et cartographie sort avec cette souris semblait sous étiquette exprimant le SST CIns qui sont connus pour être générés en grande partie de cette région25, 26,27,28. Cependant, malgré ces divergences, les millions de GFP ou cellules exprimant mCherry peuvent être isolées avec seulement quelques heures de FACS.

Il y a deux principaux avantages de cette technique. Tout d’abord, lorsqu’il est combiné avec notre gamme de double-journaliste mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, il est possible d’obtenir un grand nombre de précurseurs d’interneurones enrichis pour devenir des PV ou SST-fated sous-types d’interneurones corticaux. Le deuxième principal avantage est la facilité relative avec laquelle un grand nombre d’interneurones fated cellules peuvent être obtenues. Bien que plusieurs autres techniques EB modifiés existent pour différencier les neurones et les cellules souches MGE, ces protocoles s’appuient généralement sur l’utilisation de molécules inhibitrices Wnt comme Dkk113,14,29. Nous avons trouvé que l’inhibiteur de la voie Wnt XAV-939 améliore considérablement la génération des progéniteurs télencéphaliques pallidale, comme en témoigne Foxg1 et Nkx2.1 expression15.

Comme mentionné précédemment, plusieurs autres méthodes existent pour générer des progéniteurs MGE-like de mESCs. Watanabe et al. 14 pionnière dans le domaine de la différenciation télencéphaliques de mESCs en étant le premier à développer une méthode de culture sans sérum suspension suivie par modification des plaques sur une surface adhésive. Ils ont constaté que les antagonistes Wnt et Nodal, Dkk1 et LeftyA, respectivement, efficacement percute mESCs début neuroectodermique lignées13. En appliquant SHH à ces cultures, ils a fait remarquer qu’entre 5 et 15 % de toutes les cellules en culture exprimée conjointement Nkx2.1/Foxg1 et pouvaient être considérées comme MGE-comme progéniteurs13. Cependant, tout en jetant les bases de nombreuses études à venir, cette étude n’a pas un moyen pour isoler des cellules souches MGE ou enrichir pour les sous-types de CIn particulières.

Plusieurs années plus tard, Danjo et al. 13 a utilisé la même méthode de culture sans sérum suspension en combinaison avec l’administration chronométrée de divers facteurs de croissance, en particulier SHH, pour atteindre spécification sous-régional des dérivés mESC ventrales télencéphaliques tissus. À l’aide d’une ligne de journaliste Foxg1::venus, ils ont trouvé que l’administration SHH de DD3-12 après que le traitement Dkk1 a entre 45 et 68 % de toutes les cellules exprimant le Foxg1::venus journaliste13la culture. Au sein de la population Foxg1::venus +, environ 32 % des cellules exprimé Nkx2.113. En remplaçant SHH pour SAG et ajoutant Fgf8, ils renforcée de la fraction des progéniteurs Nkx2.1 au sein de la population Foxg1::venus + à environ 41 %13. Lorsque analysés pour devenir, ces cellules produisent environ 17 % SST, PV de 21 %, 18 % NPY et 8 % calretinin sous-types13. Cependant, alors que cette étude décrit une méthode pour spécifier la CGE versus MGE dérivés CIn destins, il n’a pas décrit une méthode pour enrichir sélectivement pour les sous-types de PV ou SST.

L’année suivante, Cambray et al. 11 a utilisé une méthode de monocouche sans sérum avec modification des plaques sur DD5 pour étudier l’effet de l’activine sur la différenciation et l’identité des précurseurs neurones télencéphaliques, provenant de souris et ces humains. Bien que cette étude n’a pas signalé le pourcentage de cellules Nkx2.1 générée dans leur protocole, ils rapportent qu’environ 54 % des cellules en culture exprimée conjointement Nestin/Foxg1 DD2 (5 jours de croissance dans le sérum des médias libres suivies d’un autre 2 jours de culture après modification des plaques)11. Ils ont également signalé qu’avec l’ajout de l’activine, environ 55 % des cellules exprimé conjointement nestin et CouptfII, ce qui indique que ces cellules peuvent représenter caudales ganglionnaires eminence-cellules, qui produisent la majorité des interneurones corticaux exprimant le calretinin 11. en effet, par 8 jours de culture (13 jours ensemble) 39 % des cellules trouvées pour exprimer conjointement calretinin/BIII-tubuline, tandis que 59 % des cellules trouvées pour exprimer conjointement GABA/BIII-tubuline11. Cette étude n’a pas examiné la production de PV ou SST.

Encore une fois à l’aide d’une méthode modifiée de EB, Chen et al. 12 a démontré que renforceur de MGE propres éléments pourraient servir à suivre et à purifier les cellules souches dérivées de cellules MGE12. Dans cette étude, ils ont comparé l’effet des conditions de culture différente au cours des différenciations dirigées de mESCs en progéniteurs MGE ressemblant à l’aide d’une ligne de journaliste Lhx6::GFP ; la même ligne qui a servi de la lignée parentale pour la ligne de double-journaliste Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP décrite dans ce manuscrit. Ils ont démontré qu’en ajoutant Dkk1 dans la culture conditions DD0-3, suivi par l’addition de SAG, upwards de ~ 10 % de toutes les cellules en culture exprimée Lhx6::GFP12. Ils ont également constaté que le même protocole, appliqué à la ligne de Foxg1::venus décrite par Danjo et al. 12, entraîné environ 37 % de toutes les cellules exprimant le journaliste Foxg1::venus. Lorsque les cellules Lhx6::GFP ont été transplantés en vivo, les pourcentages moyens suivants de marqueurs de sous-type CIn a été observée : 22 % PV, SST de 58 % et 16 % NPY12.

Plus récemment, autres groupes ont utilisé l’expression forcée de lignée-définition des facteurs de transcription de spécifier directement CIns. La première démonstration de ceci était peut-être par Petros et al. 10 qui a utilisé un promoteur inductible par doxycycline pour piloter Nkx2.1 expression dans Ainv15 mESCs qui ont été modifiés pour inclure un chromosome artificiel bactérien Lhx6::GFP. Cette étude a utilisé des conditions de culture similaires à celles décrites dans le manuscrit actuel mais sans addition de XAV-93910. Toutefois, pour des raisons qui sont mal compris, un plus faible pourcentage de cellules Lhx6::GFP + ont été observées dans les mêmes conditions de différenciation par rapport à lorsque vous utilisez la ligne de parent J1 Lhx6::GFP décrite dans ce manuscrit10. Malgré des niveaux similaires de Foxg1 expression (total % inconnue), il y avait une réduction modérée du nombre total de Nkx2.1 cellules non supérieure à 2 % de toutes les cellules exprimant le journaliste de Lhx6::GFP10. Cette étude met en évidence les différences inhérentes qui existent entre les différentes lignes d’ESC et les défis que rencontrent les chercheurs lorsque vous tentez d’appliquer des protocoles de différenciation à ESC lignes différentes de celles qui ont servi à élaborer à l’origine des protocoles.

En utilisant une approche élégante, UA et al. 9 a utilisé l’expression forcée séquentielle des facteurs de transcription pour générer des sous-types spécifiques des interneurones corticaux en utilisant le même paradigme de différenciation télencéphaliques ventrale développé par Watanabe et al. 14 alors qu’ils ne signalent pas le pourcentage exact de Foxg1 +, Nkx2.1 + et Olig2 + précurseurs produites en culture, ils affirment qu’environ 50 % de toutes les cellules en culture se différencient en de neurones GABAergiques9. À différenciation après 11 jours, EBs ont été dissociées et transplanté dans le MGE de E13.5 hôte embryons9. Un petit pourcentage d'entre elles (moins de 1 %) ont migré de la MGE dans le cortex, où ils ont été identifiés par leur journaliste Dlx5/6-eGFP et analysées pour sort9. Les auteurs ont observé une variété de pourcentages de PV, SST et destins de CGE-like basés sur leur stratégie de choix induction forcée9. Fait intéressant, avec l’expression du facteur de transcription Lmo3, ils ont observé en moyenne environ 57 % PV, SST de 21 % et 15 % dérivé de CGE sous-types (SST- / reelin + ou VIP-only +)9. Le pourcentage le plus élevé des sous-types de SST observée a été obtenu à l’aide d’une ligne de GOF Nkx2.1/Dlx2, qui produit environ SST de 32 %, 35 % PV et 25 % dérivé de CGE sous-types9.

En 2015, Colasante et al. 30 a montré que l’expression forcée de cinq facteurs de transcription (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5 et Lhx6) au sein de fibroblastes de souris journaliste GAD67-GFP transformé 15 % de toutes les cellules GABAergiques type RISC. Remarquablement, environ 90 % de ces cellules a pour exprimer PV, avec seulement de rares cellules exprimant SST30. Bien que cette méthode n’était pas appliquée à mESCs, il a été utilisé avec CISP humaine, où il a été estimé qu’environ 30 % de toutes les cellules adopté une identité de GABAergique30.

Comme illustré à la Figure 2, il y a plusieurs façons de générer des populations enrichies de PV ou SST CIns. Les principaux avantages de l’aPKCi utilisant PV-protocole sur le protocole DD17 sont le plus grand nombre de cellules un peut isoler, la viabilité et la durée de culture de cellules. Bien que nous ne montrons pas de données pour les niveaux d’induction DD17 dans la Figure 1, il y a à peu près deux fois plus de cellules mCherry + à DD11 étant donné qu’à DD17 (données non présentées). Lors de la collecte de cellules destinés à la transplantation, nous trouvons qu’un plus grand nombre d’à partir de cellules (voir ci-dessous) est bénéfique, puisque environ 30 à 50 % des cellules sont perdus dans le processus de leur concentration pour injection. En outre, un plus grand nombre de cellules peut être obtenu avec des temps plus courts de FACS, qui limite la quantité de temps que les cellules sont sur la glace et réduit le coût global. Probablement parce qu’un pourcentage plus élevé des cerise + cellules sont progéniteurs, cellules des premiers stades de la culture (p. ex., DD11) montrent une plus grande survie comparativement aux cellules DD17 après la transplantation dans le néocortex néonatale. Lorsqu’un grand nombre de cellules viables est nécessaires, par exemple dans le cas d’une greffe de cellules pour traiter l’épilepsie, avoir une plus grande population de départ et d’une plus grande viabilité est un atout majeur.

Comme illustré à la Figure 2, selon le protocole, environ 25 à 39 % de cellules Lhx6::GFP + analysé 30 jours après la transplantation n’expriment pas des niveaux détectables de protéine PV ou SST avec l’immunohistochimie systématique. Généralement, ces PV- / SST-cellules expriment GABA ainsi que Sox6, un marqueur des interneurones corticaux MGE-dérivé (voir Tyson et al. 15, Tischfield et al. 17). moins de 1 % des PV- / SST - Lhx6::GFP + cellules marqueurs exprès des autres sous-groupes interneurones, comme calretinin, reelin ou le neuropeptide Y (données non présentées). Ceci est similaire à in vivo études cartographie sort, qui ont montré qu’entre ~ 15 à 25 % des interneurones dérivé de MGE n’expriment pas de PV ou SST23,25,31. Lorsque Nkx2.1::mCherry+ ou Lhx6::GFP + cellules sont isolées et ensemencés sur mangeoires corticale rat in vitro, nous avons constaté que ~ 40-70 % de Lhx6::GFP + cellules analysées après 28 jours de culture sont PV-/ SST-, avec une majorité de ceux qui tache positive exprimant la SST. Cette augmentation de PV - SST-cellules est peut-être en raison de l’absence d’un signal de maturation extrinsèque qui est présent en vivo, comme peut être particulièrement le cas pour l’expression mature de PV ou des entrées électrophysiologiques sous-optimal des cellules nourricières. Quel que soit la raison, nous préférons transplantez-les cellules néonatal néocortex pour différencier l’analyse plutôt que in vitro de sort.

Pour la plupart des expériences de transplantation, nous vous recommandons flottant sur DD0 un minimum de deux plats de culture de tissus non adhérents 10 cm chaque contenant 7,5 x 105 mESCs dans 10 mL de N2/KSR (7,5 x 104 cellules/mL ; 20 mL volume total). Ensemble, les deux plaques produira généralement 8 à 12 x 106 cellules, après dissociation EB sur DD3, dont 5,4 x 106 cellules permet d’ensemencer deux plaques 6 puits culture de tissus traitée (50 000 cellules/cm2; environ au total 110 cm2 ). Par DD8, chaque plaque 6 puits donne environ 5-7 x 107 cellules, qui peuvent alors servir pour amorcer les trois autres à cinq plaques 6 puits à une densité de 250 000 cellules/cm2 (nécessitant un total de 4,05 x 107 cellules, dans le cas de trois 6 puits plaques ou 6,75 x 107 cellules, dans le cas de cinq plaques 6 puits). Par DD14, chaque plaque 6 puits produira généralement 1-2. 5 x 106 mCherry ou cellules exprimant GFP. Selon les besoins de l’expérience, nous avons flottait un minimum de 7. 5 x 105 mESCs pour les analyses d’immunohistochimie à petite échelle à plus de 6 x 106 mESCs pour des projets de grand transplantation.

Les plus importantes étapes du protocole sont maintenant les mESCs dans un État pluripotent avant la différenciation de début et l’étape de débarquement/dissociation sur DD3. Si les cellules ont été maintenues correctement et l’atterrissage/dissociation sur DD3 est faite avec soin, la différenciation sera généralement réussie. Seules les cellules souches qui apparemment en bonne santé et doit être utilisées pour la différenciation. Si EBs ne parviennent pas à se former entre DD0-3 ou en former plusieurs, petits corps asymétriques, la différenciation est susceptible d’échouer. En outre, au cours de la dissociation de EB sur DD3, Conseil exécutif doit être soigneusement surveillés jusqu'à ce qu’il n’est plus visible par oeil pour éviter une exposition prolongée à la régente de dissociation cellulaire contenant non-trypsine.

Les résultats présentés dans ce document ont été obtenus dans des conditions optimisées à l’aide des réactifs de qualité contrôlée. Ceci est important à note puisque nous avons parfois la difficulté à atteindre l’induction Nkx2.1 robuste et par extension, mCherry et expression du Rapporteur GFP. Basé sur notre expérience, nous croyons que la variabilité lot à lot de comptes probables FBS pour ces changements. Par conséquent, il est sage de tester différents lots de FBS pour déterminer qui fonctionnent le mieux pour maintenir les mESCs. Bien que nous n’avons pas utilisé le système 2i/FRV (milieu sans sérum contenant le MEK inhibiteur PD03259010 GSK-3α/β inhibiteur et CHIR99021), il est possible que des conditions de milieu sans sérum mESC peuvent produire des résultats plus cohérents. Nous n’ont pas, cependant, ont vérifié cette hypothèse et n’avons aucune donnée quant à savoir si l’utilisation des médias sans sérum mESC influe sur la différenciation des mESCs en progéniteurs MGE-like. En outre, veillez à utiliser des facteurs de croissance fraîches lorsque cela est possible par aliquotage eux à usage unique. Selon l’utilisateur, la densité des cellules devrez être augmentée pour atteindre la survie des cellules adéquates, en particulier lors de l’étape de débarquement sur DD3.

Interneurones ont la capacité remarquable de survivre, migrer et intégrer après une transplantation hôte-circuits. Par conséquent, ce protocole peut être utilisé pour transplanter des précurseurs des interneurones dans souris épileptiques et les autres modèles de maladies neurologiques et neuropsychiatriques (voir Southwell et al. 32 et Tyson et Anderson33 pour les commentaires de cellule interneurone base thérapies). Par exemple, dans une étude récente Donegan et al. 34 enrichi de populations de PV et CIns SST pour la transplantation dans un modèle murin de la schizophrénie. Ils ont constaté que les PV et SST enrichi greffes produits différents effets sur le comportement de la souris, comptant PV enrichi en normalisant la schizophrénie endophénotypes qu’ils étudiaient.

Ces dernières années, le système de transposon de PiggyBac a été utilisé pour réaliser une expression stable de transgènes dans un certain nombre de systèmes. Nous avons utilisé ce système pour créer rapidement et facilement inductibles par doxycycline miRNA constructions afin d’étudier le rôle des gènes particuliers au cours du développement des interneurones exprimant de manière stable. Nous sommes également à l’aide de cette technologie pour créer journaliste double lignes mESC qui expriment des channelrhodopsin-2 (ChR2) à optogenetically disque mESC dérivés interneurones ou technologie du récepteur DREADD pour activer ou désactiver transplanté des cellules massivement.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants à Qing Xu pour développer le Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP double journaliste mESC ligne ainsi que Jennifer Tyson, Asif Maroof et Tim Petros pour leur premiers travaux sur les façons d’élaborer ce protocole. Nous remercions également le noyau de cytométrie de flux CHOP pour l’assistance technique. Ce travail a été soutenu par un NIH R01 MH066912 (SA) et F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Neurosciences numéro 130 cerveau souris interneurones différenciation cortex culture cellulaire les cellules souches transplantation
Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tischfield, D. J., Anderson, S. A.… More

Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter