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Neuroscience

Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von kortikalen Interneuron Stammväter und Post-mitotische Interneuron Vorstufen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit einer veränderten Embryoid Körper-Monolayer-Methode. Diese Vorfahren/Vorstufen können werden verwendet in-vitro- Eindringmittel sortiert und in Neugeborenen Neokortex für das Studium Schicksal Bestimmung verpflanzt oder in therapeutischen Anwendungen eingesetzt.

Abstract

Kortikale GABAergen Interneuronen sind eine heterogene Bevölkerung der Zellen, die kritische Rollen bei der Regelung des Ausgang des exzitatorischen pyramidale Neuronen sowie synchronisieren die Ausgänge der pyramidalen Neuron Ensembles spielen. Defizite im Interneuron Funktion haben in einer Vielzahl von neuropsychiatrischen Störungen wie Schizophrenie, Autismus und Epilepsie verwickelt. Die Ableitung der kortikale Interneurone aus embryonalen Stammzellen nicht nur für das Studium ihrer Entwicklung und Funktion ermöglicht, sondern bietet einen Einblick in die molekularen Mechanismen der Pathogenese der kortikalen Interneuron-Erkrankungen. Interneuronen haben auch die bemerkenswerte Fähigkeit, überleben, Migration und Integration in Host kortikalen Schaltung nach Transplantation, so dass sie ideale Kandidaten für den Einsatz in zellbasierten Therapien. Hier präsentieren wir Ihnen eine skalierbare, hocheffiziente, modifizierte Embryoid Körper-Monolayer-Methode zur Ableitung von Nkx2.1 exprimierenden Interneuron Vorfahren und deren Nachkommen aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs). Mit einem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Linie, Nkx2.1 Vorfahren oder Lhx6-mit dem Ausdruck nach dem mitotischen Nachkommen isoliert über Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) und anschließend in einer Reihe von downstream-Anwendungen verwendet. Wir bieten auch Methoden bereichern Parvalbumin (PV) oder Somatostatin (SST) Interneuron Untergruppen, die für das Studium Aspekte des Schicksal Bestimmung oder für den Einsatz in therapeutischen Anwendungen möglicherweise hilfreich, die von Interneuron Untergruppe angereicherte profitieren würde Transplantationen.

Introduction

Bei Mäusen und Menschen, rund die Hälfte aller kortikalen hemmenden Interneuronen (CIns) stammen im Rahmen einer vorübergehenden subkortikale Struktur bekannt als mediale ganglionic Eminenz (MGE), wo neuroepithelialer Vorfahren der CIns und anderen neuronalen und Gliazellen Untergruppen Ausdrücken der Transkriptionsfaktor Nkx2.11,2. CIn Untergruppen oder Subtypen sind durch sich überschneidende morphologische, neurochemische, elektrophysiologische und Konnektivität Merkmale3,4definiert. MGE-abgeleitete CIns in gruppiert werden können meist nicht überlappende Untergruppen basierend auf ihren Ausdruck der PV oder SST, der Ausdruck der welche korreliert mit bestimmten elektrophysiologische und Konnektivität Tendenzen5. Dysfunktion von Interneuronen, insbesondere in der PV-Untergruppe hat in mehreren-neuropsychiatrischen Störungen und Krankheiten6,7verwickelt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, mitotischen Vorläuferzellen Stammzellen abgeleitet und wandernden Vorstufen für PV oder SST CIn Schicksal für kortikale Interneuron Biologie zu studieren und für den Einsatz in zellbasierten Therapien angereichert zu produzieren.

Wir haben eine skalierbare und hocheffiziente Methode zur Ableitung von Nkx2.1 exprimierenden Interneuron Vorfahren und deren Nachkommen von mESCs entwickelt. Mit einem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Zeile8, Nkx2.1 Vorfahren oder Lhx6 exprimierenden Post-mitotischen Nachkommen über FACS isoliert und anschließend in einer Reihe von downstream-Anwendungen verwendet werden können. Durch die Manipulation einer Anzahl der Signalwege, Dauer der Kultur und Modus der Neurogenese, erhalten wir Millionen von Eindringmittel beschrifteten Interneuron Vorstufen für eine Vielzahl von downstream-Anwendungen geeignet.

Obwohl einige andere Methoden gibt es zur Erzeugung von MGE-ähnlichen Vorfahren aus mESCs9,10,11,12,13,14, unsere Methode, die stützt sich auf die Wnt Antagonist XAV-939 ist besonders effizient zu generieren Foxg1/Nkx2.1 Co Teleenzephalischer Vorfahren zum Ausdruck zu bringen. Stark erhöht die Fähigkeit, für Interneuron Stammväter oder Post-mitotischen Lhx6 exprimierenden Nachkommen über unser dual Reporter-System wählen die Fähigkeit, verschiedene Vorfahren und deren Nachkommen zu erzeugen.

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Protocol

Hinweis: Die dual Reporter mESC Linie beschrieben in diesem Protokoll sind auf Anfrage möglich (sande@mail.med.upenn.edu).

(1) Media-Vorbereitung

Hinweis: Warm alle Medien auf 37 ° C vor der Verwendung in der Zellkultur.

  1. Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) Medien (für die Zubereitung 500 mL)
    1. 449 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) und Filter durch eine Filteranlage 500 mL 0,22 µm Pore 50 mL fetalen bovine Serum (FBS) hinzufügen.
    2. Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C für bis zu 1 Monat oder Aliquote und Store bei ≤-20 ° C.
  2. N2-Medien (für die Zubereitung 500 mL)
    1. Geben Sie 5 mL L-Alanin-L-Glutamin (100 X) und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) bis 489,5 mL DMEM: Nährstoff-Mischung f-12 (DMEM/F-12) und Filter durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.
    2. Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) und 5 mL N2 Anhang-B nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C im Dunkeln bis zu 1 Monat.
  3. Serumfreien Wachstumsmedium (KSR) (für die Zubereitung 500 mL)
    1. Fügen Sie 75 mL serumfreien Medium Ergänzung, 5 mL L-Glutamin (100 X), 5 mL MEM nicht-essentiellen Aminosäuren (MEM-NEAA) (100 X), und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) auf 413,5 mL nicht-Glutamin enthält DMEM und Filtern durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.
    2. Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
  4. Maus embryonalen Stammzellen Medien (für die Zubereitung 500 mL)
    1. 75 mL Stammzellen Grade FBS, 5 mL MEM-NEAA hinzufügen (100 X), 5 mL L-Glutamin (100 X), und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) auf 413,5 mL nicht-Glutamin enthält DMEM und Filtern durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.
    2. Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C im Dunkeln für bis zu 1 Monat oder Aliquote und Store bei ≤-20 ° C.

2. Kultivierung mESCs

  1. Platte mitotically inaktiven MEF Feeder Zellen in MEF Medien auf Gewebekultur behandelt Teller mit 3-4 x 104 Zellen/cm2. Lassen Sie mindestens 12 Stunden für sie in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 Regeln vor der Beschichtung der mESCs. Wenn nicht sofort verwendet wird, ersetzen Sie die MEF-Medien alle 3 Tage. Entsorgen Sie MEFs, wenn nicht innerhalb von 7 Tagen nach der Beschichtung verwendet.
  2. MEF-Platten in mESC Medien Maus Leukämie hemmenden Faktor (mLIF) (1.000 U/mL) mit fügen Sie mESCs (Dichteumfang von 1-4 x 104 Zellen/cm2 hinzu). Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
  3. Durchgang mit Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) mESCs (1:5-1:10) Sobald das Gericht wird ~ 70-80 % Zusammenfluss oder wenn die Kolonien beginnen zu berühren. Dies in der Regel erfolgt alle 2 Tage, aber kann bis zu 4 oder 5 Tage, je nach der anfänglichen Beschichtung Dichte nehmen.
  4. Pflegen Sie die mESCs auf einem MEF Feeder Layer mESC Mittel-und Pluripotenz zu halten.
  5. Vor Beginn der Differenzierung, die passage der Zellen mindestens einmal auf Gelatine beschichtete Platten ohne MEFs, die MEFs zu verdünnen.
    1. Bereiten Gelatine beschichtete Platten durch Zugabe von 0,1 % Gelatine in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2 +/Mg2 + zu einem Gericht Gewebekultur behandelt und bei 37 ° C für mindestens 1 h Platte 1,5-2 x 106 Zellen/10 cm Platte verlassen (2,7 bis 3,6 x 104 Zellen/cm2) und lassen Sie die Zellen, für 2 Tage vor Beginn der Differenzierung zu erweitern.

3. mESCs in Richtung MGE-ähnliche Teleenzephalischer Stammväter Differenzierung

  1. Differenzierung-Tag (TT) 0 = "float Zellen"
    1. Nachdem die mESCs gewachsen sind, auf Gelatine beschichtete Platten für 2 Tage, aspirieren Sie die Medien und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Fügen Sie genügend Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) bedecken die Oberfläche der Platte (in der Regel 4 mL Trypsin-EDTA für eine 10 cm Gewebekultur Teller), und legen Sie die Zellen wieder in den Brutschrank bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 4 min.
    2. Stillen Sie nach 4 min die Trypsin-EDTA mit 2 Mal das Volumen mit mESC Medien. Die Zellen auf eine entsprechend dimensionierte Zentrifugenröhrchen übertragen und die Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie nach 5 min das Rohr und aspirieren Sie die Medien ohne zu stören das Pellet. Aufschwemmen das Pellet in 1 mL KSR:N2 Medien (1:1) mit der BMP-Inhibitor LDN-193189 (250 nM) und der Wnt-Inhibitor XAV-939 (10 µM).
    3. Messen Sie die Zellkonzentration unter Verwendung eines Hemocytometer oder automatisierte Zelle Zähler. Start wachsenden Zellen als Embryoid Körper (EBs) durch Zugabe von 75.000 Zellen/mL in KSR:N2 Medium (1:1) mit LDN-193189 (250 nM) und XAV-939 (10 µM) in Gewebekultur-anhaftende Gerichte. Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
  2. Am DD1 bereiten Sie für Zelle "Landung" durch Beschichtung Gewebekultur behandelt Gerichte mit Poly-L-Lysin (10 µg/mL in PBS mit Ca2 +/Mg2 +) über Nacht (O/N) bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchte oder mindestens 1 h.
  3. DD2, Aspirieren der Poly-L-Lysin und Beschichten der Platten mit Laminin (10 µg/mL in PBS mit Ca2 +/Mg2 +) O/N bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit.
    Hinweis: Während O/N optimal ist, weniger als 2 h kann ausreichend sein. Wenn Platten nicht am nächsten Tag verwendet werden, Aspirieren Laminin, ersetzen mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen aufbewahren.
  4. DD3 ("land Zellen")
    1. Vor Beginn der EB Dissoziation, Aspirieren der Laminin und die Platten trocken in einer Gewebekultur-Haube. Verwenden Sie keine Platten, die glänzende oder sichtbar nass erscheinen. Übertragen Sie die EBs mit Medien in eine 15 mL-Tube und Zentrifuge für 3-4 min 15 x g oder bis der EBs haben oelletiert.
  5. Aspirieren Sie die Medien und 3 mL Zelle Ablösung Lösung mit DNase (2 U/mL) und Inkubation bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchte und 5 % CO2 für 15 min. sanft flick das Rohr alle 3 min um EB Dissoziation zu erleichtern.
  6. Sobald der EBs sind nicht mehr sichtbar oder 15 Minuten vergangen sind, fügen Sie 6 mL KSR:N2 (1:1) mit DNase (1 U/mL) und Zentrifuge für 5 min bei 200 X g.
  7. Die Zellen in KSR:N2 (1:1) mit LDN-193189 Platte (250 nM), XAV-939 (10 µM), und der ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 µM) bei 4,5-5 x 104 Zellen/cm2.

(4) SST-Anreicherung Protokoll: "DD12 GFP hohe Sonic Hedgehog (SHH)" (Fortsetzung von Schritt 3,7)

  1. Ändern Sie auf DD5, Medien mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und SSH (50 ng/mL).
  2. Gewebekultur Platten vorbereiten, wieder am Tag 8 (Schritt 4.4) Beschichtung mit in Schritte 3.2-3.3 aufgeführten Anweisungen.
  3. Ändern Sie auf DD7, Medien mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und SHH (50 ng/mL).
  4. Auf DD8 Platte wieder die Zellen.
    Hinweis: Während dieser Schritt nicht notwendig ist, kann wieder galvanischen Zellen frühen differenziert, unerwünschte Zelltypen reduzieren. Re Beschichtung auch Kugeln aus Zellen, die die nachgelagerten immunhistochemische Analysen erschweren bricht, und erhöht die Effizienz der FACS zu späteren Zeitpunkten.
    1. Neu Platte Zellen, die Zellen von der Platte mit Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) für 5 min bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2zu lösen. Die Trypsin-EDTA mit 2 Mal das Volumen mit KSR:N2 zu stillen und Zentrifuge bei 200 X g für 5 min. filtern die Zellen durch einen 40 µm Filter Schlauch, Klumpen zu entfernen. Platte wieder die Zellen bei 250.000 Zellen/cm2 N2/KSR (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und Y-27632 (10 µM) mit SHH (50 ng/mL).
      Hinweis: Wenn stattdessen die Entscheidung getroffen wird, nicht auf die Zellen auf DD8 Re Platte wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit SHH (50 ng/mL) alle 2 Tage ab DD7, DD12 und IGF-1 hinzufügen (20 ng/mL) und FGF-2 (10 ng/mL) bis DD9.
  5. Auf DD10, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit SHH (50 ng/mL).
  6. Auf DD12, um Zellen zu erhalten, die für SST Untertypen angereichert sind, verwenden FACS, um Lhx6::GFP zu isolieren-Zellen nur zum Ausdruck zu bringen.
    1. Um die Zellen zu entfernen, verwenden Sie eine nicht-Trypsin enthaltenden Zelle-Dissoziation Reagenz als Trypsin-EDTA. Waschen Sie Zellen einmal mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Fügen Sie vorgewärmt nicht Trypsin enthaltenden Zelle-Dissoziation Reagenz mit DNase (2 U/mL) auf die Zellen. Legen Sie sie in den Inkubator bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 10-30 Minuten oder bis die Zellen getrennt haben. Klopfen Sie leicht die Platten alle 5 min um die Dissoziation zu unterstützen.
      Hinweis: Für DD11-12 Kulturen kann nur 10-15 Minuten erforderlich sein. Für DD15-16 Kulturen kann 30 Minuten oder mehr für vollständige Dissoziation erforderlich.
    2. Sobald die Zellen komplett von der Platte gehoben haben, fahren Sie mit FACS Isolierung unter Verwendung von standard-Protokollen oder verwenden Sie die Zellen in anderen nachgeschalteten Analysen.

5. PV-Anreicherung Protokoll: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (Fortsetzung von Schritt 3,7)

  1. Auf DD5, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Gewebekultur Platten vorbereiten, wieder Beschichtung auf DD8 (Schritt 4.4) mit die Anweisungen gemäß 3.2-3.3 Schritte.
  3. Am DD7, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).
  4. Auf DD8, neu Platte Zellen wie unter Schritt 4.4 mit folgenden Ausnahmen: Wenn die Zellen neu Plattieren, SHH mit gespachtelten Agonist zu ersetzen (SAG; 30 nM) und atypische PKC-Hemmer (aPKCi; 2 µM) hinzufügen. Zusammengenommen, die erneut Galvanik Medien jetzt N2/KSR (1:1) enthält FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM), und aPKCi (2 µM).
  5. Auf DD10 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM).
  6. DD11
    Hinweis: an dieser Stelle sind Nkx2.1::mCherry+ Zellen angereichert um PV CIns zu werden.
    1. Trennen Sie die Zellen aus der Platte für FACS verwenden das gleiche Protokoll in Schritt 4.6 beschrieben. Wenn die Entscheidung getroffen wird, um Nkx2.1::mCherry+ Zellen an einem späteren Tag Differenzierung zu sammeln, ignorieren Sie diesen Schritt.
  7. Auf DD12 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Auf DD14 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Auf DD16 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Sammeln Sie auf DD17 die Nkx2.1::mCherry+ Zellen unter Verwendung des gleichen Protokolls in Schritt 4.6 beschrieben.

(6) PV-Anreicherung Protokoll: "DD17 mCherry Low SHH" (Fortsetzung von Schritt 3,7)

  1. Auf DD5, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL). Am DD7, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Auf DD9 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1). Ab diesem Zeitpunkt sind keine zusätzliche Wachstumsfaktoren notwendig.
    1. Weiterhin die Medien alle 2 Tage bis zur Ernte der Zellen auf DD17 ändern.

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Representative Results

Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen ist eine modifizierte Version von unseren veröffentlichten Protokolle15,16,17 und wurde für den Einsatz mit unseren Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP Dual-Reporter mESC optimiert. Durch das Hinzufügen der Wnt-Inhibitors XAV-939 DD0-5, kombiniert mit neu bei DD8 Beschichtung, erreichen wir robuste Nkx2.1 Induktion, wobei mehr als 50 % der alle DAPI + Kerne in Kultur auch Nkx2.1 (Abb. 1A, B) zum Ausdruck bringen. Immunohistochemistry für die mCherry und die GFP Reporter zeigt deutlich zum Ausdruck in den Regionen des Nkx2.1-positiven Immunoreactivity (Abbildung 1A). FACS von lebenden Zellen mithilfe der systemeigenen Reporters zeigt, dass vier Populationen von Zellen eindeutig isoliert werden können: (1) GLP/mCherry doppelt Negative Zellen, (2) mCherry-nur mit dem Ausdruck Zellen, (3) GLP-nur mit dem Ausdruck ihrer Zellen und (4) GLP/mCherry doppelt exprimierenden Zellen ( Abbildung 1). Mit dieser Linie, beginnt ein kleiner Bruchteil der Vorfahren auf der mCherry Reporter um DD8-9 zu drehen. Die mCherry ihren Höhepunkt zwischen DD12-13 und dann stetig sinken, da Vorfahren den Zellzyklus verlassen und nach dem mitotische Lhx6::GFP + Interneuron Vorstufen (Abbildung 1 produzieren). Entsprechend die Lhx6::GFP Reporter schaltet zwischen DD9-10 und Gipfeln rund um DD13-14 (Abbildung 1). Obwohl die Gesamtzahl der Lhx6::GFP Zellen in Kultur zu erhöhen weiterhin, nicht der Prozentsatz, wahrscheinlich durch die Verbreitung von anderen Linien. Einmal die Lhx6::GFP + Reporter drückt, bleibt es nachweisbar, auf unbestimmte Zeit, da Lhx6 stabil im Reifen MGE abgeleitet kortikale Interneurone18,19zum Ausdruck kommt. Obwohl Nkx2.1 und Lhx6 Ausdruck sind weitgehend nicht-überlappende innerhalb der murinen Vorderhirn, gibt es eine vorübergehende Bevölkerung von Nkx2.1::mCherry und Lhx6::GFP zusammen mit dem Ausdruck Zellen in Kultur. Dies ist zumindest teilweise auf Perdurance von der mCherry-Reporter über den normalen Zeitrahmen des Nkx2.1 Ausdrucks, da die meisten Doppel-markierten Zellen nicht nachweisbare Konzentrationen des Nkx2.1 Proteins (Tyson und Anderson, unveröffentlicht) ausdrücken. Zellen, die weiterhin die Lhx6 Reporter und Kirsche/Nkx2.1 Protein ausdrücken können striatalen Interneuronen20sein. Basierend auf unserer live-imaging-Studien, es gibt jedoch ein Fenster von ca. 18 h wobei synchron, neu nach dem mitotischen Vorläufer mit dem Ausdruck Nkx2.1::mCherry und Lhx6::GFP isoliert werden (Tischfield und Anderson, unveröffentlicht, und siehe Tischfield Et Al. 17). so, durch das Sammeln von Nkx2.1::mCherry und Lhx6::GFP doppelt positive Zellen zu jedem Zeitpunkt während des Protokolls, ist es möglich, eine Population von Zellen zu erhalten, die überwiegend den Zellzyklus innerhalb von ca. 18 h voneinander verlassen haben. Dies steht im Gegensatz zu Nkx2.1::mCherry und Lhx6::GFP-Zellen, die verschiedene Arten von Vorfahren und Vorstufen, bzw. der unterschiedlichen Geburtsdaten repräsentieren nur zum Ausdruck zu bringen.

Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP Dual-Reporter mESC Linie lässt sich für SST-fated Interneuronen bereichern. In der Regel die Kulturen SHH hinzufügen und das Sammeln von GFP + Zellen zu früheren Zeitpunkten bei der Differenzierung (z.B.DD12) für SST Untertypen bereichert. Aufgrund unserer Beobachtungen, haben wir nicht gesehen, einen signifikanten Unterschied im Verhältnis SST:PV je nachdem, ob SHH DD5 oder DD8 hinzugefügt wird (Daten nicht gezeigt). Durch das Hinzufügen von SHH (50 ng/mL) von DD8-12 und dann Umpflanzen der GFP-nur mit dem Ausdruck ihrer Zellen, erhalten wir im Durchschnitt ein 7:1-Verhältnis von SST:PV CIns (Abbildung 2A)15,17. Für weitere Einzelheiten über die Auswirkungen der SHH und Zeit in Kultur auf Interneuron Schicksal mit unserer Dual-Reporter mESC Linie siehe Tyson Et al. 15

Für PV-fated CIns bereichern, sollten SHH aus der Nährmedien weggelassen werden. Der Hinweis vorhanden ist konsistent mit der Anforderung der SHH Signalisierung zu Nkx2.1 Ausdruck in der mitotischen Stammväter21SHH Signalisierung in diesen Kulturen ohne exogene SHH hinzugefügt wird, seit die SHH Signaltechnik Antagonist Cyclopamine beseitigt Nkx2.1 Ausdruck15. Allerdings, wenn die Zellen auf DD8 neu vergoldet sind, ist dieser endogenen SHH entfernt, so dass SAG (30 nM) sollten die Medien DD8-10 weiterhin Nkx2.1 Ausdruck und die Produktion von CIns hinzugefügt werden. Unsere früheren Studie zeigte, dass durch die Kulturbedingungen SHH vorzuenthalten und Sortierung für Nkx2.1::mCherry+ Zellen auf DD17, ein ~2.6:1 Verhältnis von PV:SST Zellen gewonnen werden (Abb. 2 b)15. Im Gegensatz zum SST Subtypen, die in früheren Stadien und in Anwesenheit von exogenen SHH angereichert sind, erhöhte Dauer in Kultur und Mangel an exogene SHH bereichert für PV-Subtypen15. In einer neueren Studie fanden wir, dass aPKCi deutlich auf unsere "MGE" Protokoll angewendet erhöht den Bruch von Nkx2.1::mCherry Vorfahren, die cyclin D217, ein Marker für fortgeschrittene Stammvater Zellen22ausdrücken. Diese Protokoll-Variante basierte auf unsere Feststellung, dass die PV-mit dem Ausdruck CIns in erster Linie aus zwischen-Vorfahren stammen, während SST Stammväter in erster Linie aus radial Vorfahren an der ventrikulären Oberfläche23stammen. Wir haben festgestellt, dass wenn sortiert und in Neugeborenen Maus Neokortex verpflanzt, diese Vorfahren stark voreingenommen sind für die Herstellung von PV-Subtypen. APKCi DD8-11 hinzufügen und dann sortieren Nkx2.1::mCherry Zellen waren wir in der Lage, ein 5.8:1 Verhältnis PV:SST Untertypen (Abbildung 2)17zu erhalten. Für PV-Subtypen weiter zu bereichern, haben wir auch Nkx2.1::mCherry Zellen gewachsen in Anwesenheit von aPCKi DD8-17 isoliert. Allerdings haben wir nicht erreicht, eine Zunahme des PV:SST Verhältnisses über was wir an DD11, trotz einer marginalen Erhöhung des Anteils von PV-Subtypen erzeugt (Abb. 2D) erhalten konnten. Flussdiagramme für jedes dieser Protokolle sind in Abbildung 3ff. Immunostaining Maus Gehirne 30 Tage nach der Transplantation mit Anti-PV, Anti-SST und Anti-GLP (Stärkung der Identifikation von Lhx6::GFP +-Zellen) Antikörper zeigt, dass Lhx6::GFP +-Zellen Reifen morphologische Merkmale mit Mustern von PV und SST Ausdruck aufweisen ähnlich wie in Vivo Gegenstücke (Abbildung 4 und Abbildung 5).

Zur Unterstützung bei der Bestimmung, ob eine CIn Differenzierung erfolgreich angezeigt wird, haben wir eine Reihe von Bildern in jeder Phase des Protokolls zum normalen Variabilität (Abbildung 6, Abbildung 7, Abbildung 8) demonstrieren vorbereitet. Wir sind auch eine Figur, die demonstrieren, wie eine erfolglose Differenzierung auf DD4 angezeigt wird (Abbildung 9). Im Allgemeinen werden erfolglose Differenzierungen geringe (weniger als 10 %) Nkx2.1 Ausdruck und Prozentsätze der Nkx2.1::mCherry und Lhx6::GFP Induktion von ca. 1 % oder weniger Ausbeute.

Figure 1
Abbildung 1: Generierung von Nkx2.1::mCherry und Lhx6::GFP Interneuron Vorstufen. (A) siehe hier sind repräsentative Bilder von Immunostaining für Nkx2.1, Nkx2.1::mCherry (RFP) und Lhx6::GFP (GFP) aus einer Differenzierung Tag 12 (DD12) Kultur. Beachten Sie, dass diese Bilder Kanäle aus der gleichen Sichtfeld überlappen. (B) Quantifizierung des durchschnittlichen Prozentsatzes des DAPI + Kerne, die Nkx2.1 am DD12 in Kultur ausdrücken (n = 3 unabhängige Differenzierungen). (C) repräsentative FACS-Plot zeigt die vier verschiedenen Zell-Populationen, die mithilfe unserer dual Reporter mESC Linie isoliert werden können. Beachten Sie, dass mCherry auf der x-Achse und GFP auf der y-Achse ist. Daher stellt Feld obere rechts Zellen, die mCherry/GLP-doppelt positiv sind. (D) zeitlicher Verlauf der Nkx2.1::mCherry und Lhx6::GFP Induktion von DD6-16, ausgedrückt als Prozentsatz der Zellen in der Kultur, die mCherry nur zum Ausdruck bringen, GFP-nur zum Ausdruck bringen oder mCherry/GFP Co zum Ausdruck zu bringen. Diese Prozentsätze stammen aus Zellen gezüchtet in Anwesenheit von SHH während eines Protokolls SST bereichern und stellen Mittelwerte aus 3 unabhängigen Differenzierungen. Fehlerindikatoren in (B) und (D) repräsentieren SEM Scale bar = 150 µm (A). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Manipulation der Kulturbedingungen differentiell bereichert für PV-versus SST-fated abgeleitet mESC kortikale Interneurone. (A) Prozentsatz der PV + SST + und PV- / SST-Interneuronen erreicht, wenn DD12, GFP-nur mit dem Ausdruck ihrer Zellen, die in Anwesenheit von SHH gezüchtet (50 ng/mL) von DD5-12 sind in Neugeborenen Neokortex verpflanzt und analysiert 30 Tage nach Transplantation. (B) Prozentsatz der PV + SST + und PV- / SST-Interneuronen erhalten, wenn DD17, mCherry nur mit dem Ausdruck gewachsen Zellen ohne zusätzliche SHH in Neugeborenen Neokortex verpflanzt werden und analysiert 30 Tage nach Transplantation. (C) Prozentsatz der PV + SST + und PV- / SST-Interneuronen erreicht, wenn DD11, mCherry nur mit dem Ausdruck ihrer Zellen, die in Anwesenheit von SAG gezüchtet (30 nM; DD8-10) und aPKCi (2 µM; DD8-11) sind in Neugeborenen Neokortex verpflanzt und analysiert 30 Tage nach Transplantation. (D) Prozentsatz der PV + SST + und PV- / SST-Interneuronen erreicht, wenn DD17, mCherry nur mit dem Ausdruck ihrer Zellen, die in Anwesenheit von SAG gezüchtet (30 nM) aus DD8-10 und aPKCi (2 µM) DD8-17 sind in Neugeborenen Neokortex verpflanzt und analysiert 30 Tage Post-Transplantation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Flussdiagramme veranschaulicht die verschiedenen PV und SST-Anreicherung Protokolle in dieser Studie beschriebenen. (A) für alle Protokolle, die Schritte bis zum Beginn der Differenzierung einschließlich DD0-5 sind identisch. Alle Zellen sind als Embryoid Körper DD0-3 in N2:KSR (1:1) mit der BMP-Inhibitor LDN-193189 und der Wnt-Inhibitor XAV-939 ergänzt angebaut. Auf DD3 sind die Zellen in N2:KSR (1:1) mit LDN-193189, XAV-939 und der ROCK-Inhibitor Y-27632 "gelandet". SST-Subtypen zu bereichern, ist SHH von DD5-12 hinzugefügt. Alternativ wird SHH von DD8-12 hinzugefügt, da erfahrungsgemäß die Zugabe von SHH von DD5 versus DD8 ab nicht erheblich das Verhältnis der PV:SST Untertypen generiert auswirkt. Frühere Versionen des Protokolls (siehe Tyson Et Al. 15) hat keinen erneute Panzerung Schritt auf DD8 aufgenommen und stattdessen ergänzt die Medien mit exogenen SHH auf DD5. Dieses Protokoll wurde später geändert, um eine erneute Galvanik Schritt auf DD8 zusammen mit der Einführung von SHH, integrieren von denen keiner das PV:SST Verhältnis erheblich verändern. Lhx6::GFP +-Zellen in Anwesenheit von exogenen SHH gewachsen sind in diesem Protokoll "hoch-SHH" FACS isoliert auf DD12 für den Einsatz in downstream-Anwendungen. (B) für das "Low-SHH" PV-Protokoll, exogene SHH sowie der neu Panzerung Schritt auf DD8 entfallen. Stattdessen sind Nkx2.1::mCherry+ Zellen FACS isoliert auf DD17 für den Einsatz in downstream-Anwendungen. (C) für die "+ aPKCi" PV-Protokoll, aPKCi ist zusammen mit SAG DD8-10 und nur aPKCi hinzugefügt von DD10 vorwärts. Nkx2.1::mCherry Zellen sind auf DD11 oder DD17 FACS isoliert für den Einsatz in downstream-Anwendungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: PV und SST Immunostaining in Lhx6::GFP + Zellen 30 Tage nach der Transplantation in Neugeborenen Neokortex. (A) Hochleistungs-Bild einen SST-zum Ausdruck zu bringen, Lhx6::GFP + Zelle 30 Tage nach der Transplantation in Neugeborenen Neokortex. In jeder Spalte von vier Bildern sind einkanalige Bilder von Lhx6::GFP, PV und SST Ausdruck mit einer 3-Kanal zusammengefügte Bild unten. Wie in der oberen Leiste dargestellt, erläutert dieses Neuron Lhx6::GFP + mehrere Prozesse für eine Reife Morphologie. Hochleistungs-Bild (B) zwei PV-zum Ausdruck zu bringen, Lhx6::GFP + Zellen 30 Tage nach der Transplantation. (C) Hochleistungs-Bild der SST- / PV-Double negative, Lhx6::GFP + Zelle. Obwohl diese Zelle mehrere Prozesse mit kompletten Differenzierung und kortikalen Integration erarbeitet, drückt diese Zelle eindeutig PV oder SST nicht. Beachten Sie, dass ein PV + Kern neben den Lhx6::GFP + Zelle aber, dass es nicht überlappt. Skalieren von Balken = 50 µm (A-C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Medium und Low power Bilder von PV, SST und Lhx6::GFP Protein-Expression 30 Tage nach der Transplantation in Neugeborenen Neokortex. (A) mittlerer Leistung Bild einer Region des Maus Neocortex mit 30 Lhx6::GFP + Zellen 30 Tage nach der Transplantation. Diese Zellen wurden angebaut, mit der PV-Protokoll (+ aPKCi DD8-11; FACS isolieren und Transplantation Nkx2.1::mCherry+ auf DD11). Der 30 Zellen hier gesehen 16 express PV, 4 express SST und 10 express PV weder SST. (B) Low-Power-Bild einer Region der Maus Neokortex, enthält zahlreiche, gut differenzierte Lhx6::GFP + Zellen 30 Tage nach der Transplantation. Beachten Sie die Fülle der Lhx6::GFP + Prozesse coursing in der Hirnrinde. Gelegentliche Zellen finden sich auch im Hippocampus, wo sie erscheinen, zu integrieren und Prozesse konsequent mit einem ausgereiften Phänotyp zu erarbeiten. Maßstabsleiste = 50 µm (A); 550 µm (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: normale Darstellung der Maus embryonalen Fibroblasten Feeder Schicht und undifferenzierte Stammzellen. (A) siehe hier sind 4 X und 10 X Vergrößerung Hellfeld Bilder zeigen das typische Erscheinungsbild unserer Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) Feeder "layers" 24 h nach der Beschichtung. (B) gezeigt, hier ist das typische Erscheinungsbild von unserer Maus embryonale Stammzellen (mESCs) 2 Tage nach der Beschichtung auf MEF-Feeder. Beachten Sie, dass die Kolonien einen hellen Rand haben und sind elliptisch oder eiförmig in Erscheinung. Wenn die Kolonien diese hellen Perimeter verlieren oder mit dem äußeren Projektionen zu senden beginnen, handelt es sich um Zeichen, die die Zellen differenzieren können. (C) siehe hier sind mESCs 1 und 2 Tage nach der Beschichtung wieder auf Gelatine beschichtet Gerichte um MEF Anleger vor Beginn der Differenzierung zu verdünnen. Beachten Sie, dass die Stammzellen erheblich nach 48 h auf Gelatine erweitern und beginnen, eine eiförmige Erscheinung mit einem hellen Rand zurückzukaufen. Maßstabsleiste = 100 µm im 4 X und 10 X Fotos. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Auftritt von embryonalen Stammzellen der Maus auf Differenzierung Tage 1 bis 7. (A) einen Tag nach schweben, die Stammzellen, die Zellen gesehen werden können bilden kleine Embryoid Körper (EBs). Tag zwei der EBs sind erheblich gewachsen. Beachten Sie, dass einige EBs zusammengeklebt und größere Gruppen von Zellen gebildet haben. Wir finden nicht, dass dies wirkt sich negativ auf die Differenzierung. Nach 3 Tagen der EBs haben sogar größer geworden und einige nicht mehr Licht durch sie hindurch übertragen. Es ist normal, Zellenrückstand im Hintergrund zu sehen. (B) siehe hier sind Stammzellen 24 h nach der Landung am 4. Tag Differenzierung (DD4). Beachten Sie die Dichte der Zellen. Viele haben begonnen, kleine Prozesse erhöhen wird, da die Differenzierung weiter zu erweitern. Beachten Sie hierbei, dass die Zellen selbst mit kleinen schwarzen Punkten verteilt gefärbt sind. Wenn die Zellen sind glänzend oder homogen erscheint, ist das ein Zeichen von aberranten Differenzierung. (C) durch DD5, haben die Zellen weiter vermehren und neuronale Rosetten bilden. Viele Zellen haben lange, dünne Prozesse erweitert. (D) durch DD7, sollten die Zellen konfluierende sein. Es ist normal, wenn eine "Schweizer Käse"-Muster, wobei flache, mehrkernigen Zellen (möglicherweise ependymalen oder Gliazellen) kreisförmige Inseln innerhalb einer Schicht von neuronalen Vorläuferzellen zu schaffen. Gelegentlich macht wenn die Zelldichte höher als normal ist, dieses "Schweizer Käse" Muster nicht Entwicklung wie im mittleren Bild gezeigt. Je nach der Differenzierung kann das neurale Induktion beeinflussen. 4 X und 10 X zeigen die Vergrößerung. Maßstabsleiste = 100 µm im 4 X und 10 X Fotos. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: Darstellung der Differenzierung an Tagen 9 bis 14. (A) einzelne Zellen eines Tages nach neu Plattieren visualisiert werden können. Beachten Sie ihre bipolare Darstellung, die typisch für neurale Vorläuferzellen. Die Kultur ist homogen mit einigen anderen eindringende Zelltypen. Die Dichte eignet sich für diese Phase. (B) durch DD11, sind die Zellen zu einem monomolekularen Film geworden. Ähnlich wie bei früheren Stadien in der Differenzierung, große "Ei-Like" Multi-kernhaltigen Zellen durchsetzt im ganzen zu sehen. (C) von DD13, die die Zellen weiter zu vermehren. Sie können jetzt gesehen werden, bilden kleine Hügel. Viele "Ei-Like" Zellen sind noch in der gesamten. Ab diesem Zeitpunkt wird die Kultur nur wenige Änderungen mit Ausnahme der Grabhügel größer angezeigt. 4 X, 10Xx, und geben Sie 20 X Vergrößerung. Maßstabsleiste = 100 µm im 4 X und 10 X Fotos und Maßstabsleiste = 50 µm im 20 X Fotos. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9: Darstellung einer erfolglosen Differenzierung am 4. Tag. DD4 ist wichtig in Bezug auf die Bewertung des Erfolgs der eine Differenzierung, weil es einer der schwierigsten Schritte des Protokolls folgt: die Landung auf DD3. DD4 haben die Zellen 24 h wieder nach wird von Embryoid Körper getrennt hatte. Wie man hier sehen kann, sind die meisten Zellen glänzend und homogen erscheinen. In der gesamten durchsetzt sind gelegentliche Zellen, die normal, dass ein dunkleres Aussehen mit kleinen schwarzen Punkten verteilt erscheinen. Darüber hinaus sind große flache Zellen (wie im unteren linken Bereich gesehen werden können) Richtwerte der aberranten Differenzierung. In der unteren rechten Seite erscheinen mindestens drei kleine Gruppen von Zellen (gelbe Pfeile) als kleine Embryoid Körper, zeigt fehlerhafte Differenzierung, unvollständige EB Dissoziation oder Armen festhalten an der Oberfläche der Zellplatte Kultur. Diese Bilder sind im Gegensatz zu denen dargestellt in Abbildung 7 b, die bildlich darstellen, gesunde, normale Zellen auf DD4 erscheinen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Während diese Methode ist sehr effektiv bei der Musterung J1 abgeleitet mESCs (SCRC-1010), erlebten wir Variablen Erfolg mit anderen mESC Linien und klonale Isolate. Zum Beispiel, Foxg1::venus mESCs (EB3 abgeleitet; Danjo Et al. 13) reagieren schlecht auf dieses Protokoll und Foxg1 Induktion durch DD12 ist in der Regel in der Größenordnung von 1 %-2 %. Aus Gründen, die wir nicht vollständig verstehen, produziert ein weiteres Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter Klon (genannt JQ59), die gleichzeitig als die Linie beschrieben in diesem Protokoll (genannt JQ27), isoliert wurde weniger als 1 % Nkx2.1 exprimierenden Zellen wenn gewachsen unter identischen Bedingungen. Die Ausgangslinie (J1; ATCC SCRC-1010), allerdings reagiert gut auf dieses Protokoll und produziert Prozentsätze von Nkx2.1 exprimierenden Zellen auf DD12 ähnlich wie in Abbildung 1 bgezeigt. Bei Bedarf können die Konzentrationen von XAV-939 und SHH/SAG die Differenzierung Bedingungen auf einer Zeile für Zeile Basis optimieren angepasst werden. Unsere Erfahrung mit diesem Protokoll, um andere mESC Linien in MGE-ähnlichen Vorfahren zu unterscheiden ist jedoch begrenzt.

Über unsere Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Linie express nicht alle Nkx2.1 + Zellen mCherry. Obwohl fast alle mCherry + Zellen Nkx2.1 Protein ausdrücken, hinkt Reporter Ausdruck Nkx2.1 Protein-Expression, vor allem in frühen Phasen der Differenzierung (DD7-9). Der Anteil der Nkx2.1 +-Zellen, die mCherry stetig ausdrücken erhöht sich im Laufe der Differenzierung. Bei Pegelspitzen (~ DD12-14) mCherry ist in etwa 30 % aller Nkx2.1 mit dem Ausdruck ihrer Vorfahren17ausgedrückt. Darüber hinaus wurde die gleiche bakterielle künstliche Chromosom verwendet, um Laufwerk mCherry Ausdruck zur Cre-Rekombinase in Nkx2.1-Ausdruck Domänen von transgenen Mäusen24fahren. In diesen Mäusen Cre-Expression wurde schwach in den Nkx2.1 exprimierenden Zellen der dorsalen-die meisten Region die MGE und Schicksal-Mapping mit dieser Maus erschien unter Label SST exprimierenden CIns, die bekanntermaßen weitgehend aus dieser Region25erzeugt werden, 26,27,28. Jedoch trotz dieser Unstimmigkeiten absperrbar Millionen von GFP oder mCherry exprimierenden Zellen mit nur ein paar Stunden von FACS.

Es gibt zwei Hauptvorteile dieser Technik. Erstens in Kombination mit unseren Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP Dual-Reporter mESC Linie ist es möglich, große Anzahl von Interneuron Vorprodukten angereichert um PV oder SST-fated kortikalen Interneuron Subtypen werden zu erhalten. Der zweite wesentliche Vorteil ist die relative Leichtigkeit, mit welcher zahlreicher Interneuron beschieden, dass Zellen erreicht werden können. Obwohl einige andere modifizierte EB Techniken existieren, um MGE Stammväter und Neuronen unterscheiden, verlassen diese Protokolle in der Regel über die Verwendung der Wnt-hemmenden Moleküle wie Dkk113,14,29. Wir haben festgestellt, dass die Wnt-Inhibitor XAV-939 die Generation der pallidal Teleenzephalischer Vorfahren verbessert, wie Foxg1 und Nkx2.1 Ausdruck15belegt.

Wie bereits erwähnt, gibt es mehrere andere Methoden zur Erzeugung von MGE-ähnlichen Vorfahren aus mESCs. Watanabe Et al. 14 leistete Pionierarbeit im Bereich der Teleenzephalischer Differenzierung von mESCs indem es als erstes eine serumfreien Aussetzung Kultur Methode gefolgt von erneut auf eine anhaftende Oberfläche Galvanik entwickelt. Sie fanden, dass die Wnt und Nodal-Antagonisten, Dkk1 und LeftyA, beziehungsweise, effizient mESCs in frühen Neuroectodermal Linien13Gefahren. SHH auf dieser Kulturen anwenden, sie beobachtet, dass zwischen 5-15 % aller Zellen in Kultur Co exprimierten Nkx2.1/Foxg1 und könnte als MGE-ähnlichen Vorfahren13angesehen werden. Jedoch während der Grundstein für viele Studien zu kommen, haben diese Studie keinen Weg zu isolieren MGE Stammväter oder für bestimmte CIn Subtypen zu bereichern.

Einige Jahre später, Danjo Et al. 13 verwendet die gleichen serumfreien Aussetzung-Kultur-Methode in Kombination mit der zeitgesteuerten Verwaltung der verschiedenen Wachstumsfaktoren in bestimmten SHH subregionalen Spezifikation mESC abgeleitet ventralen Teleenzephalischer Gewebe zu erreichen. Mit einem Foxg1::venus Reporter, fanden sie, dass SHH-Verwaltung von DD3-12 nach Dkk1 Behandlung zwischen 45-68 % aller Zellen in Kultur, die mit dem Ausdruck der Foxg1::venus Reporter13geführt. Bei der Foxg1::venus + Bevölkerung ausgedrückt etwa 32 % der Zellen Nkx2.113. Durch Substitution von SHH für SAG und Hinzufügen von Fgf8, verbessert sie weiter den Bruch von Nkx2.1 Vorfahren innerhalb der Foxg1::venus + Bevölkerung auf etwa 41 %13. Wenn für Schicksal untersucht, produziert diese Zellen ca. 17 % SST, 21 % BW, 18 % NPY und 8 % Calretinin Subtypen13. Jedoch während dieser Studie eine Methode dahingehend CGE versus MGE abgeleitet CIn Schicksale beschrieben, beschreiben es keine Methode, um selektiv bereichern für PV oder SST Subtypen.

Im folgenden Jahr, Cambray Et al. 11 verwendet eine serumfreien Monolayer-Methode mit Re Beschichtung auf DD5, um die Wirkung von Activin auf die Differenzierung und Identität des Teleenzephalischer neuronalen Vorstufen abgeleitet von Mäusen und menschlichen WSR zu studieren. Obwohl diese Studie nicht den Prozentsatz der Nkx2.1 Zellen, die in ihrem Protokoll generiert melden, berichten sie, dass etwa 54 % der Zellen in Kultur Nestin/Foxg1 auf DD2 (5 Tage des Wachstums im Serum ausgedrückt, freie Medien um weitere 2 Tage Kultur gefolgt, Co Nach erneuten Beschichtung)11. Sie berichteten auch, dass mit dem Zusatz von Activin, ~ 55 % der Zellen Co ausgedrückt nestin und CouptfII, darauf hinweist, dass diese Zellen kaudalen ganglionic Eminenz-wie Zellen darstellen können, erzeugen die meisten Calretinin exprimierenden kortikale Interneurone 11. 39 % der Zellen fanden in der Tat um 8 Tage in Kultur (insgesamt 13 Tage) Calretinin/BIII-Tubulin, Co auszudrücken, während 59 % der Zellen gefunden wurden, GABA/BIII-Tubulin11Zusammenarbeit zum Ausdruck bringen. Diese Studie habe nicht geprüft, die Produktion von PV oder SST Subtypen.

Noch einmal mit einem modifizierten EB Methode, Chen Et al. 12 unter Beweis gestellt, dass MGE-spezifische Enhancer, die Elemente verwendet werden könnten, zu folgen und zu reinigen Stammzellen abgeleitet MGE-wie Zellen12. In der vorliegenden Studie verglichen sie die Wirkung der verschiedenen Kulturbedingungen während gerichtete Differenzierungen des mESCs in MGE-ähnlichen Vorfahren über eine Lhx6::GFP-Reporter-Leitung; die gleiche Linie diente als der Ausgangslinie für die Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP-Dual-Reporter-Linie in diesem Manuskript beschrieben. Sie zeigten, dass durch das Hinzufügen von Dkk1 zur Kultur Bedingungen von DD0-3, gefolgt durch die Zugabe von SAG, ab ~ 10 % aller Zellen in Kultur ausgedrückt Lhx6::GFP12. Sie fanden auch, dass das gleiche Protokoll, auf der Foxg1::venus Linie von Danjo Et Al. beschrieben angewendet 12, führte zu etwa 37 % aller Zellen, die mit dem Ausdruck der Foxg1::venus Reporters. Als Lhx6::GFP Zellen transplantierten in Vivowaren, wurde die folgenden durchschnittlichen Prozentsätze CIn Subtyp Marker beobachtet: 22 % PV, SST 58 % und 16 % NPY12.

Andere Gruppen haben in jüngerer Zeit, die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren Linie definieren verwendet, um direkt CIns anzugeben. Vielleicht war dies die erste Demonstration von Petros Et al. 10 , die Doxycyclin-induzierbaren Promoter verwendet, um Nkx2.1 Ausdruck in Ainv15 mESCs zu fahren, die modifiziert wurden, um ein Lhx6::GFP bakterielle künstliches Chromosom enthalten. Dieser Studie verwendet, Kulturbedingungen ähnlich wie beschrieben im aktuellen Manuskript aber ohne die Zugabe von XAV-93910. Jedoch aus Gründen, die schlecht verstanden werden, ein geringer Prozentsatz an Lhx6::GFP +-Zellen beobachtet den gleichen Bedingungen Differenzierung im Vergleich zu Verwendung der J1 Lhx6::GFP Ausgangslinie in diesem Manuskript10beschrieben. Trotz vergleichbarer Foxg1 Ausdruck (total % unbekannt), gab es ein moderater Rückgang der Gesamtzahl der Nkx2.1 Zellen ohne mehr als 2 % aller Zellen der Lhx6::GFP Reporter10zum Ausdruck zu bringen. Diese Studie unterstreicht die angeborene Unterschiede, die zwischen verschiedenen ESC-Linien und die Herausforderungen bestehen, dass Forscher Gesicht beim ESC Linien unterscheiden sich von denen Differenzierung Protokolle zuweisen, mit denen ursprünglich die Protokolle entwickeln.

Mit Hilfe einer eleganten Ansatz, Au Et al. 9 zur die sequentielle erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren Erzeugung von spezifischen Subtypen der kortikale Interneurone, die mit dem gleichen ventralen Teleenzephalischer Differenzierung Paradigma von Watanabe Et Al. entwickelt 14 , während sie die genauen Prozentsätze von Foxg1 + Nkx2.1 + und Olig2 + Vorstufen in Kultur produziert nicht berichten, erklären sie, dass ca. 50 % aller Zellen in Kultur in GABAergen Neuronen9 differenziert. 11 Tage Post-Differenzierung EBs wurden getrennt und in die MGE E13.5 Host Embryonen9verpflanzt. Ein kleiner Prozentsatz davon (weniger als 1 %) von der MGE in der Hirnrinde, wo sie durch ihre Dlx5/6-eGFP-Reporter identifiziert und analysiert für Schicksal9migriert. Die Autoren beobachteten eine Vielzahl der Prozentsätze der PV, SST und CGE-ähnliche Schicksale basierend auf ihren gewählten Zwangsinduktion Strategie9. Interessanterweise mit Expression des Transkriptionsfaktors Lmo3, sie beobachtet im Durchschnitt etwa 57 % PV, 21 % SST und 15 % CGE-abgeleitete Subtypen (SST- / reelin + oder VIP-nur +)9. Der größte Anteil der SST-Subtypen beobachtet wurde mittels einer Nkx2.1/Dlx2 GOF-Linie, die ungefähr 32 % SST, 35 % PV und 25 % CGE-abgeleitete Subtypen9produziert erhalten.

Im Jahr 2015, Colasante Et al. 30 zeigten, dass die erzwungene Ausdruck der fünf Transkriptionsfaktoren (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5 und Lhx6) in Fibroblasten von GAD67-GFP Reporter Mäusen GABAergen-artigen CIns 15 % aller Zellen umgewandelt. Bemerkenswerterweise ging etwa 90 % dieser Zellen auf PV, nur selten Zellen mit dem Ausdruck SST30zum Ausdruck zu bringen. Obwohl diese Methode nicht auf mESCs angewendet wurde, diente es mit menschlichen iPSCs, wo wurde es geschätzt, dass etwa 30 % aller Zellen einen GABAergen Identität30angenommen.

Wie in Abbildung 2dargestellt, gibt es mehrere Möglichkeiten, angereicherte Populationen von PV oder SST CIns zu generieren. Die wichtigsten Vorteile der PV-Protokoll unter Verwendung aPKCi über das DD17-Protokoll sind die größere Zahl der Zellen einer kann isolieren, Zell-Lebensfähigkeit und die Dauer der Kultur. Obwohl wir Daten für DD17 Induktion Ebenen nicht in Abbildung 1zeigen, gibt es rund doppelt so viele mCherry + Zellen bei DD11 wie es bei DD17 (Daten nicht gezeigt). Beim Sammeln von Zellen für Transplantationszwecke finden wir, dass eine größere Anzahl von Zellen (siehe unten) ist vorteilhaft, da etwa 30-50 % der Zellen sind in den Prozess der Injektionslösung Konzentration verloren. Darüber hinaus kann eine größere Anzahl von Zellen mit kürzeren FACS, die schränkt die Menge der Zeit, dass die Zellen auf dem Eis und senkt die Gesamtkosten erworben werden. Wahrscheinlich weil ein höherer Prozentsatz der Kirsche + Zellen sind Vorfahre, weisen Zellen aus früheren Stadien der Kultur (z.B.DD11) größere überleben im Vergleich zu DD17 Zellen nach der Transplantation in Neugeborenen Neokortex. Wenn große Anzahl der lebensfähigen Zellen benötigt werden, ist zum Beispiel bei Stammzelltransplantation zur Behandlung von Epilepsie, mit einer größeren Bevölkerung ab und größere Rentabilität ein großer Vorteil.

Wie in Abbildung 2dargestellt, abhängig vom Protokoll, analysiert ca. 25-39 % Lhx6::GFP + Zellen 30 Tage nach Transplantation drücken nicht nachweisbare Konzentrationen von PV oder SST Protein mit Routine Immunohistochemistry. In der Regel diese PV- / SST-Zellen express GABA sowie Sox6, ein Marker für MGE abgeleitet kortikale Interneurone (siehe Tyson Et Al. 15, Tischfield Et al. 17). weniger als 1 % der PV- / SST - Lhx6::GFP + Zellen ausdrückliche Marker für andere Interneuron Untergruppen, wie z. B. Calretinin reelin oder Neuropeptid Y (Daten nicht gezeigt). Dies ist vergleichbar mit in Vivo Schicksal Mapping Studien, die gezeigt haben, dass zwischen ~ 15-25 % der MGE abgeleitet Interneuronen nicht ausdrücklich PV oder SST23,25,31. Als Nkx2.1::mCherry+ oder Lhx6::GFP + Zellen isoliert und auf Ratte kortikalen Feeder in-vitro-plattiert, fanden wir, dass ~ 40-70 % der Lhx6::GFP + analysiert nach 28 Tagen in Kultur PV - Zellen / SST-mit einer Mehrheit von denen, die positive Fleck mit dem Ausdruck SST. Dieser Anstieg der PV- / SST-Zellen können aufgrund des Fehlens von einer extrinsischen maturational Signal, das vorhanden in Vivo, ist vor allem bei Reifen PV Ausdruck oder suboptimale elektrophysiologische Input von Feeder-Zellen der Fall sein mag. Was auch immer die Gründe sein mögen, bevorzugen wir Zellen in Neugeborenen Neokortex Schicksal Analyse eher als in-vitro- Differenzierung zu verpflanzen.

Für die meisten Transplantation Experimente empfehlen wir schwimmend auf DD0 ein Minimum von zwei 10-cm-anhaftende Gewebekultur Gerichte jedes enthaltenden 7,5 x 105 mESCs in 10 mL N2/KSR (7,5 x 104 Zellen/mL, 20 mL Gesamtvolumen). Zusammen, erbringt beide Platten in der Regel 8-12 x 106 Zellen nach EB Dissoziation auf DD3, davon 5,4 x, die 106 Zellen verwendet werden, um zwei behandelt 6-Well-Zellkultur-Platten (50.000 Zellen/cm2; ca. 110 cm2 insgesamt) Samen. Durch DD8 ergibt jede 6-Well-Platte ca. 5-7 x 107 Zellen, die dann verwendet werden, um eine zusätzliche drei bis fünf 6-Well-Platten bei einer Dichte von 250.000 Zellen/cm2 (erfordert insgesamt 4,05 x 107 Zellen bei drei 6-Well seed Platten oder 6,75 x 107 Zellen bei fünf 6-Well-Platten). Von DD14 erbringt jeder 6-Well-Platte in der Regel 1-2,5 x 106 mCherry oder GFP exprimierenden Zellen. Je nach den Bedürfnissen des Experiments haben wir ein Minimum von 7,5 x 105 mESCs für kleine immunhistochemische Analysen zu aufwärts von 6 x 106 mESCs für große Transplantation Projekte schwebte.

Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind die mESCs in einen pluripotenten Zustand vor Beginn Differenzierung und der Landung/Dissoziation Schritt auf DD3 beibehalten. Wenn die Zellen richtig beibehalten wurden und die Landung/Dissoziation auf DD3 sorgfältig erfolgt, wird die Differenzierung in der Regel erfolgreich sein. Nur Stammzellen, die gesund erscheinen und sollte für die Differenzierung verwendet werden. Wenn EBs nicht bilden zwischen DD0-3 oder mehrere bilden, dürfte kleine, asymmetrische Körper, die Differenzierung nicht erfolgreich sein. Darüber hinaus sollte bei EB Dissoziation auf DD3, die EB bis nicht mehr sichtbar vom Auge über längere Zeit zu nicht-Trypsin enthaltenden Zelle-Dissoziation Regent zu vermeiden überwacht werden.

In diesem Whitepaper vorgestellten Ergebnisse wurden unter optimierten Bedingungen mit qualitätsgeprüften Reagenzien. Dies ist wichtig zu beachten, da wir gelegentlich haben Schwierigkeit, robuste Nkx2.1 Induktion erzielen und durch Verlängerung, mCherry und GFP Reporter Ausdruck. Basierend auf unserer Erfahrung, unseres Erachtens, dass viel zu viel Variabilität der FBS am ehesten Konten für diese Änderungen. Als solches ist es ratsam, die verschiedene Partien FBS zu bestimmen, welche am besten funktionieren, für die Aufrechterhaltung der mESCs zu testen. Obwohl wir nicht das 2i/LIF-System (serumfreien Medium mit der MEK-Inhibitor PD03259010 und GSK-3α/β-Inhibitor CHIR99021) verwendet haben, ist es möglich, dass serumfreien mESC Bedingungen konsistentere Ergebnisse produzieren können. Wir haben jedoch nicht, diese Hypothese getestet und haben keine Daten, ob die Verwendung von mESC serumfreie Medien die Differenzierung des mESCs in MGE-ähnlichen Vorfahren betrifft. Darüber hinaus achten Sie darauf, frische Wachstumsfaktoren wenn möglich durch Aliquotierung verwenden Sie für den einmaligen Gebrauch. Abhängig von der Benutzer müssen möglicherweise Zelldichten erhöht werden, um ausreichende Zelle überleben, vor allem bei der Landung auf DD3 zu erreichen.

Interneuronen haben die bemerkenswerte Fähigkeit zu überleben, Migration und Integration in die Host-Schaltung nach Transplantation. So dieses Protokoll kann zur Transplantation Interneuron Vorstufen in epileptischen Mausmodellen und andere Modelle der neurologische und neuropsychiatrische Krankheit (siehe Southwell Et Al. 32 und Tyson und Anderson33 Bewertungen von Interneuron Zelle basierte Therapien). Zum Beispiel in einer aktuellen Studie Donegan Et al. 34 bereichert Populationen von PV und SST CIns für Transplantationen in einem Mausmodell der Schizophrenie. Sie fanden heraus, dass PV und SST Transplantationen produziert unterschiedliche Auswirkungen auf Verhalten der Maus, angereichert mit PV bereichert Populationen Normalisierung der Schizophrenie Endophenotypen, die sie studierten.

In den letzten Jahren hat das PiggyBac Transposon System eingesetzt, um stabile Expression von transgenen in einer Anzahl von Systemen zu erreichen. Wir haben dieses System verwendet, um schnell und einfach erstellen stabil Doxycyclin-induzierbaren MiRNA Konstrukte zur Untersuchung der Rolle von bestimmten Genen während Interneuron Entwicklung zum Ausdruck zu bringen. Wir sind auch mit dieser Technologie dual Reporter mESC Linien erstellen, die Channelrhodopsin-2 (ChR2), Optogenetically express Laufwerk mESC abgeleitet Interneuronen oder DREADD-Rezeptor-Technologie zu aktivieren oder deaktivieren transplantierten Zellen massenhaft.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir sind dankbar, Qing Xu für die Entwicklung der Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dual Reporter mESC Linie und Jennifer Tyson, Asif Maroof, sowie Tim Petros für ihre frühen Arbeiten zu helfen, dieses Protokoll zu entwickeln. Wir danken auch den CHOP Flow Cytometry Kern für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde von einem NIH R01 MH066912 (SA) und F30 MH105045-02 (DT) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

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References

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Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

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