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Neuroscience

Cortical न्यूरॉन पुरोगामी में माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का भेदभाव

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल एक संशोधित embryoid बॉडी-टू-monolayer पद्धति का उपयोग करके माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से cortical न्यूरॉन progenitors और पोस्ट-mitotic न्यूरॉन पुरोगामी पैदा करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. इन progenitors/पुरोगामी में इस्तेमाल किया जा सकता है या फ्लोरोसेंट हल और भाग्य दृढ़ संकल्प, या चिकित्सीय अनुप्रयोगों में इस्तेमाल के लिए नवजात neocortex में प्रत्यारोपित ।

Abstract

GABAergic cortical न्यूरॉन्स कोशिकाओं की एक विषम आबादी है कि उत्तेजक पिरामिड न्यूरॉन्स के उत्पादन को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और साथ ही पिरामिड न्यूरॉन पहनावे के outputs तुल्यकालन. घाटा ंयूरॉन समारोह में एक प्रकार का पागलपन, आत्मकेंद्रित, और मिर्गी सहित neuropsychiatric विकारों की एक किस्म में फंसाया गया है । भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से cortical न्यूरॉन्स के व्युत्पत्ति न केवल उनके विकास और समारोह के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, लेकिन आणविक cortical के रोगजनन अंतर्निहित तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है विकारों से संबंधित. न्यूरॉन्स भी जीवित रहने के लिए उल्लेखनीय क्षमता है, प्रवास, और मेजबान cortical सर्किट के बाद प्रत्यारोपण में एकीकृत, उन्हें सेल आधारित चिकित्सा में उपयोग के लिए आदर्श उम्मीदवार बना. यहाँ, हम एक स्केलेबल, अत्यधिक कुशल, संशोधित embryoid शरीर के लिए monolayer विधि के व्युत्पत्ति के लिए प्रस्तुत nkx 2.1-एक्सप्रेस न्यूरॉन progenitors और उनकी संतान से माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (mESCs). एक nkx 2.1 का उपयोग:: mCherry: Lhx6:: GFP दोहरी रिपोर्टर mESC लाइन, nkx 2.1 progenitors या उनके Lhx6-व्यक्त पोस्ट-mitotic संतान प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के माध्यम से अलग किया जा सकता है और बाद में बहाव अनुप्रयोगों की एक संख्या में इस्तेमाल किया । हम भी parvalbumin (पीवी) या सोमेटोस्टेटिन (एसएसटी) के लिए समृद्ध करने के लिए विधियाँ प्रदान करते हैं, जो भाग्य निर्धारण के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए या चिकित्सीय अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए सहायक हो सकता है कि न्यूरॉन उपसमूह से लाभ होगा-समृद्ध प्रत्यारोपण ।

Introduction

दोनों चूहों और मनुष्यों में, सभी cortical निरोधात्मक न्यूरॉन्स (CIns) का लगभग आधा औसत दर्जे का ganglionic उभार (MGE) के रूप में जाना एक क्षणिक subcortical संरचना के भीतर उत्पन्न, जहां neuroepithelial के progenitors CIns और अन्य न्यूरॉन और glial उपसमूह प्रतिलेखन कारक nkx 2.11,2व्यक्त । CIn उपसमूह या उपप्रकारों को प्रतिच्छेदन रूपात्मक, neurochemical, electrophysiological और कनेक्टिविटी विशेषताओं3,4द्वारा परिभाषित किया गया है । MGE-व्युत्पन्न CIns या तो PV या एसएसटी की उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर ज्यादातर गैर अतिव्यापी उपसमूह में समूहीकृत किया जा सकता है, जो की अभिव्यक्ति विशेष electrophysiological और कनेक्टिविटी प्रवृत्तियों के साथ संबंधित है5. न्यूरॉन्स की शिथिलता, विशेष रूप से PV उपसमूह में उन, कई neuropsychiatric विकारों और रोगों में फंसाया गया है6,7. इस विधि का समग्र लक्ष्य स्टेम सेल-व्युत्पन्न mitotic progenitors और प्रवासी पुरोगामी cortical न्यूरॉन बायोलॉजी के अध्ययन के लिए और सेल-आधारित उपचारों में उपयोग के लिए या तो पीवी या एसएसटी सीन भाग्य के लिए समृद्ध उत्पादन करने के लिए है ।

हम nkx के व्युत्पत्ति के लिए एक स्केलेबल, अत्यधिक कुशल विधि विकसित की है 2.1-व्यक्त progenitors और mESCs से उनकी संतान । एक nkx 2.1 का उपयोग:: mCherry: Lhx6:: GFP दोहरी रिपोर्टर mESC लाइन8, nkx 2.1 progenitors या उनके Lhx6-व्यक्त पोस्ट-mitotic संतान FACS के माध्यम से अलग किया जा सकता है और बाद में बहाव अनुप्रयोगों के एक नंबर में इस्तेमाल किया । संकेत मार्ग, संस्कृति की अवधि, और neurogenesis के मोड की एक संख्या में हेरफेर करके, हम फ्लोरोसेंट के बहाव अनुप्रयोगों के एक मेजबान के लिए उपयुक्त न्यूरॉन्स लेबल के लाखों प्राप्त कर सकते हैं.

हालांकि कई अंय तरीकों mESCs9,10,11,12,13,14, हमारी विधि है, जो Wnt पर निर्भर करता है से MGE-तरह progenitors पैदा करने के लिए मौजूद विरोधी XAV-९३९, Foxg1/nkx 2.1 सह-व्यक्त telencephalic progenitors पैदा करने में विशेष रूप से कुशल है । इसके अतिरिक्त, हमारे दोहरे रिपोर्टर प्रणाली के माध्यम से न्यूरॉन progenitors या उनके पद-mitotic Lhx6-व्यक्त संतान के लिए चयन करने की क्षमता, बहुत अलग progenitors और उनकी संतति उत्पन्न करने की क्षमता को बढ़ाता है.

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित दोहरी रिपोर्टर mESC रेखा अनुरोध (sande@mail.med.upenn.edu) पर उपलब्ध है ।

1. मीडिया की तैयारी

नोट: सेल संस्कृति में उपयोग करने से पहले ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए सभी मीडिया गर्म ।

  1. माउस भ्रूण Fibroblast (MEF) मीडिया (५०० एमएल तैयार करने के लिए)
    1. जोड़ें ५० एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के ४४९ मिलीलीटर, और एक ५०० मिलीलीटर ०.२२ µm ताकना फिल्टर इकाई के माध्यम से फिल्टर ।
    2. छानने के बाद 1 मिलीलीटर रोगाणुरोधी एजेंट (५० मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें । 1 महीने या aliquot और ≤-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया स्टोर ।
  2. N2 मीडिया (५०० एमएल तैयार करने के लिए)
    1. 5 एमएल जोड़ें एल-alanine-एल-glutamine (100x) और ५०० µ एल 2-Mercaptoethanol (५५ मिमी) ४८९.५ मिलीलीटर DMEM करने के लिए: पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 (DMEM/एफ 12), और एक ५०० मिलीलीटर ०.२२ µm ताकना फिल्टर इकाई के माध्यम से फिल्टर ।
    2. 1 मिलीलीटर रोगाणुरोधी एजेंट (५० मिलीग्राम/एमएल) और 5 एमएल N2 पूरक-बी निस्पंदन के बाद जोड़ें । 4 ° c पर मीडिया को अंधेरे में 1 महीने तक स्टोर करें ।
  3. सीरम मुक्त विकास मध्यम (KSR) (५०० एमएल तैयार करने के लिए)
    1. जोड़ें ७५ एमएल सीरम मुक्त मध्यम पूरक, 5 मिलीलीटर एल-glutamine (100x), 5 एमएल मेम गैर आवश्यक अमीनो एसिड (मेम-NEAA) (100x), और ५०० µ एल 2-Mercaptoethanol (५५ मिमी) से ४१३.५ मिलीलीटर गैर glutamine युक्त DMEM, और एक ५०० मिलीलीटर ०.२२ µm ताकना फिल्टर इकाई के माध्यम से फिल्टर ।
    2. छानने के बाद 1 मिलीलीटर रोगाणुरोधी एजेंट (५० मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें । 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया स्टोर ।
  4. माउस भ्रूण स्टेम सेल मीडिया (५०० एमएल की तैयारी के लिए)
    1. इसमें ७५ एमएल स्टेम सेल ग्रेड FBS, 5 एमएल मेम-NEAA (100x), 5 एमएल एल-glutamine (100x), और ५०० µ एल 2-Mercaptoethanol (५५ एमएम) से ४१३.५ मिलीलीटर नॉन glutamine युक्त DMEM, और फिल्टर के माध्यम से एक ५०० एमएल ०.२२ µm ताकना फिल्टर यूनिट ।
    2. छानने के बाद 1 मिलीलीटर रोगाणुरोधी एजेंट (५० मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें । 1 महीने या aliquot और ≤-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए अंधेरे में 4 ° c पर मीडिया स्टोर ।

2. संवर्धन mESCs

  1. प्लेट mitotically निष्क्रिय MEF फीडर कोशिकाओं MEF मीडिया में ऊतक संस्कृति पर इलाज प्लेटों पर 3-4 x 104 कोशिकाओं/ उन्हें mESCs चढ़ाना से पहले ≥ ९५% सापेक्षिक आर्द्रता और 5% सह के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति मशीन में बसने के लिए कम से कम 12 घंटे की अनुमति दें । अगर तुरंत इस्तेमाल नहीं किया, MEF मीडिया हर 3 दिन की जगह । MEFs के निपटान अगर चढ़ाना के 7 दिनों के भीतर इस्तेमाल नहीं किया ।
  2. जोड़ें mESCs (घनत्व रेंज से 1-4 x 104 कोशिकाओं/mESC मीडिया में MEF प्लेट्स करने के लिए माउस ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर (एमएलआईएफ) (१,००० यू/एमएल) युक्त । ≥ ९५% सापेक्षिक आर्द्रता और 5% CO2के साथ ३७ ° c पर कोशिकाओं को मशीन ।
  3. गद्यांश mESCs प्रयोग trypsin-EDTA (०.०५% trypsin) (1:5-1:10) एक बार पकवान बन जाता है ~ 70-80% धाराप्रवाह या यदि कालोनियों को छूने लगे हैं । यह आमतौर पर हर 2 दिन होता है, लेकिन प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व के आधार पर 4 या 5 दिनों के लिए ले जा सकते हैं ।
  4. pluripotency रखने के लिए mESC मीडियम में एक MEF फीडर लेयर पर mESCs को बनाए रखें ।
  5. भेदभाव शुरू करने से पहले, MEFs के बिना MEFs बाहर पतला करने के लिए कोशिकाओं कम एक बार जिलेटिन लेपित प्लेटों पर ।
    1. एक ऊतक संस्कृति का इलाज किया डिश के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में ०.१% जिलेटिन को जोड़कर जिलेटिन लेपित प्लेटें (/Mg2 +) के लिए तैयार है और ३७ डिग्री सेल्सियस पर जा रहा है कम से 1 एच के लिए । प्लेट 1.5-2 x 106 कोशिकाओं/10 सेमी प्लेट (2.7-3.6 x 104 कोशिकाओं/2) और कोशिकाओं 2 दिनों के लिए भेदभाव शुरुआत से पहले विस्तार करने की अनुमति ।

3. MGE की ओर mESCs विभेद करना-जैसे Telencephalic Progenitors

  1. विभेद दिन (डीडी) 0 = "फ्लोट सेल"
    1. mESCs 2 दिनों के लिए जिलेटिन लेपित प्लेटों पर हो गया है के बाद, मीडिया महाप्राण और बिना सीए2 +/Mg2 +पंजाबियों के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें । प्लेट की सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त trypsin-EDTA (०.०५% trypsin) जोड़ें (आमतौर पर 4 मिलीलीटर trypsin-EDTA के लिए १ १० सेमी टिशू कल्चर डिश), और ३७ ° c में ≥ ९५% सापेक्ष आर्द्रता और 5% सह 4 मिनट के लिए2 के साथ मशीन में वापस कोशिकाओं जगह है ।
    2. 4 मिनट के बाद, trypsin-EDTA mESC मीडिया के साथ 2 गुना मात्रा का उपयोग कर बुझाने । स्थानांतरण कोशिकाओं को एक उचित आकार के केंद्रापसारक ट्यूब और 5 मिनट के लिए २०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक । 5 मिनट के बाद, ट्यूब को हटाने और गोली परेशान बिना मीडिया महाप्राण । 1 मिलीलीटर KSR में गोली reसस्पेंड: N2 मीडिया (1:1) बीएमपी अवरोधक LDN युक्त-१९३१८९ (२५० एनएम) और Wnt अवरोध करनेवाला XAV-९३९ (10 µ मीटर) ।
    3. एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिका एकाग्रता को मापने । embryoid निकायों (EBs) के रूप में कोशिकाओं के बढ़ते शुरू KSR में ७५,००० कोशिकाओं/एमएल में जोड़कर: N2 मीडिया (1:1) LDN युक्त-१९३१८९ (२५० एनएम) और XAV-९३९ (10 µ एम) गैर अनुयाई ऊतक संस्कृति व्यंजन में । ≥ ९५% सापेक्षिक आर्द्रता और 5% CO2के साथ ३७ ° c पर कोशिकाओं को मशीन ।
  2. DD1 पर, सेल के लिए तैयार "लैंडिंग" कोटिंग ऊतक संस्कृति से पाली-L-lysine के साथ व्यंजन का इलाज किया (10 µ जी/सीए के साथ पंजाब में एमएल2 +/Mg2 +) रातोंरात (O/N) ३७ ° c पर ≥ ९५% सापेक्षिक आर्द्रता के साथ या कम से 1 h के लिए ।
  3. DD2 पर, महाप्राण पाली-L-lysine और कोट laminin के साथ प्लेटों (10 µ g/एमएल के साथ पंजाब में Ca2 +/Mg2 +) O/३७ ° c पर ≥ ९५% सापेक्षिक आर्द्रता के साथ ।
    नोट: O/N इष्टतम है, के रूप में कम के रूप में 2 h पर्याप्त हो सकता है । यदि प्लेटें अगले दिन, महाप्राण laminin द्वारा इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, Ca2 +/Mg2 +के बिना पंजाबियों के साथ की जगह है, और 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  4. DD3 ("भूमि कोशिकाएं")
    1. शुरुआत से पहले EB पृथक्करण, महाप्राण laminin और प्लेटों को पूरी तरह से एक ऊतक संस्कृति हूड में सूखी अनुमति देते हैं । चमकदार या दिख रहे गीले दिखाई प्लेटों का उपयोग न करें । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में मीडिया के साथ EBs स्थानांतरण और 15 x g पर 3-4 मिनट के लिए केंद्रापसारक या जब तक EBs है गोली ।
  5. मीडिया महाप्राण और सेल टुकड़ी DNase (2 यू/एमएल) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ≥ ९५% सापेक्ष आर्द्रता और 5% सह के साथ मशीन के साथ 3 मिलीलीटर समाधान जोड़ने के लिए 15 मिनट के लिए 1. धीरे ट्यूब हर 3 मिनट झटका EB पृथक्करण में सहायता करने के लिए ।
  6. एक बार EBs नहीं रह रहे है या 15 मिनट गुजर चुके हैं, जोड़ें 6 मिलीलीटर KSR: N2 (1:1) DNase युक्त (1 U/एमएल) और 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर २०० x जी ।
  7. प्लेट KSR में कोशिकाओं: N2 (1:1) युक्त LDN-१९३१८९ (२५० एनएम), XAV-९३९ (10 µ मीटर), और रॉक अवरोधक Y-२७६३२ (10 µ एम) 4.5-5 x 104 कोशिकाओं/

4. एसएसटी-समृद्ध प्रोटोकॉल: "DD12 GFP उच्च ध्वनि हेज हॉग (श्श्श)" (३.७ कदम से निरंतरता)

  1. DD5 पर, KSR के साथ मीडिया बदलें: N2 (1:1) युक्त FGF-2 (10 एनजी/एमएल), IGF-1 (20 एनजी/एमएल), और SSH (५० एनजी/
  2. तैयार ऊतक संस्कृति प्लेटें पुनः के लिए दिन पर चढ़ाना 8 (चरण ४.४) चरणों में उल्लिखित निर्देशों का उपयोग 3.2-3.3 ।
  3. DD7 पर, KSR के साथ मीडिया बदलें: N2 (1:1) युक्त FGF-2 (10 एनजी/एमएल), IGF-1 (20 एनजी/एमएल), और श्श्श (५० एनजी/एमएल) ।
  4. DD8 पर, कोशिकाओं को री-प्लेट करें ।
    नोट: जब यह कदम आवश्यक नहीं है, फिर से चढ़ाना कोशिकाओं को जल्दी-विभेदित, अवांछित कोशिका प्रकार को कम कर सकते हैं । पुनः चढ़ाना भी कोशिकाओं है कि बहाव immunohistochemical विश्लेषण मुश्किल बनाने की गेंदों को तोड़ता है, और बाद में समय अंक पर FACS की क्षमता बढ़ जाती है ।
    1. कोशिकाओं को फिर से प्लेट, trypsin-EDTA (०.०५% trypsin) के साथ थाली से अलग करने के लिए ३७ ° c पर 5 मिनट के लिए ≥ ९५% सापेक्षिक आर्द्रता और 5% CO2के साथ । trypsin बुझाने-EDTA KSR के साथ 2 बार मात्रा का उपयोग कर: N2, और 5 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक । किसी भी झुरमुट को हटाने के लिए ४० µm फ़िल्टर ट्यूब के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करें । N2/KSR (1:1) में FGF-2 (10 एनजी/एमएल), IGF-1 (20 एनजी/एमएल), और श्श्श (५० एनजी/एमएल) के साथ Y-२७६३२ (10 µ एम) में कोशिकाओं को फिर से प्लेट २५०,०००/
      नोट: यदि इसके बजाय, निर्णय DD8 पर कोशिकाओं को फिर से प्लेट नहीं किया जाता है, KSR के साथ मीडिया बदलें: श्श्श युक्त N2 (५० एनजी/हर 2 दिन DD7 से DD12 के लिए और IGF-1 (20 एनजी/एमएल) और FGF-2 (10 एनजी/एमएल) जोड़ने के लिए जारी DD9 तक ।
  5. DD10 पर, KSR के साथ मीडिया बदलें: N2 युक्त श्श्श (५० एनजी/
  6. DD12 पर, एसएसटी उपप्रकारों के लिए समृद्ध है कि कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, Lhx6 अलग करने के लिए FACS का उपयोग करें:: GFP-केवल व्यक्त कोशिकाओं.
    1. कक्षों को अलग करने के लिए, trypsin-EDTA के बजाय एक नॉन-trypsin युक्त कक्ष-पृथक्करण एजेंट का उपयोग करें । 2 +/Mg2 +सीए के बिना पंजाबियों के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें । सेल में प्री-वार्म्ड नॉन-trypsin युक्त कोशिका-पृथक्करण रिएजेंट शामिल करें जिसमें DNase (2 यू/एमएल/ उंहें ३७ ° c में ≥ ९५% सापेक्षिक आर्द्रता और 5% सह के लिए 10-30 मिनट या जब तक कोशिकाओं अलग है के साथ मशीन में रखें । धीरे पृथक्करण सहायता करने के लिए हर 5 मिनट प्लेटों नल ।
      नोट: DD11-12 संस्कृतियों के लिए, केवल 10-15 मिनट आवश्यक हो सकता है । DD15-16 संस्कृतियों, 30 मिनट या अधिक के लिए पूरा पृथक्करण के लिए आवश्यक हो सकता है ।
    2. एक बार कोशिकाओं को पूरी तरह से प्लेट उठा लिया है, FACS मानक प्रोटोकॉल का उपयोग अलगाव या अन्य अनुप्रवाह विश्लेषण में कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए आगे बढ़ना.

5. PV-समृद्ध प्रोटोकॉल: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (निरंतरता से ३.७ कदम)

  1. DD5 पर, KSR के साथ मीडिया बदलें: N2 (1:1) FGF-2 (10 एनजी/एमएल) और IGF-1 (20 एनजी/एमएल) युक्त ।
  2. DD8 पर पुनः चढ़ाना के लिए ऊतक संस्कृति प्लेटें तैयार (चरण ४.४) 3.2-3.3 चरणों में उल्लिखित निर्देशों का उपयोग कर ।
  3. DD7 पर, KSR के साथ मीडिया बदलें: N2 (1:1) FGF-2 (10 एनजी/एमएल) और IGF-1 (20 एनजी/एमएल) युक्त ।
  4. DD8 पर, निंन अपवाद के साथ चरण ४.४ में वर्णित के रूप में कक्षों को re-प्लेट: जब re-चढ़ाना कोशिकाओं, श्श्श smoothened एगोनिस्ट (सग; 30 एनएम) के साथ बदलें और असामान्य PKC अवरोधक (aPKCi; 2 µ m) जोड़ें । एक साथ ले लिया, फिर से चढ़ाना मीडिया अब N2/KSR (1:1) FGF-2 (10 एनजी/एमएल), IGF-1 (20 एनजी/एमएल), वाई-२७६३२ (10 µ एम), प्रसूता (30 एनएम), और aPKCi (2 µ मीटर) युक्त है ।
  5. DD10 पर, KSR के साथ मीडिया बदलें: N2 युक्त aPKCi (2 µ एम) ।
  6. DD11
    नोट: इस बिंदु पर, nkx 2.1:: mCherry + कोशिकाओं पीवी CIns बनने के लिए समृद्ध कर रहे हैं ।
    1. कक्ष ४.६ चरण में उल्लिखित समान प्रोटोकॉल का उपयोग कर FACS के लिए प्लेट से अलग है । यदि निर्णय nkx 2.1 इकट्ठा करने के लिए किया जाता है:: mCherry + कोशिकाओं को एक बाद में भेदभाव दिन, इस कदम की उपेक्षा ।
  7. DD12 पर, KSR के साथ मीडिया बदलें: N2 युक्त aPKCi (2 µ एम) । DD14 पर, KSR के साथ मीडिया बदलें: N2 युक्त aPKCi (2 µ एम) । DD16 पर, KSR के साथ मीडिया बदलें: N2 युक्त aPKCi (2 µ एम) । DD17 पर, nkx 2.1:: mCherry + कक्ष ४.६ चरण में उल्लिखित समान प्रोटोकॉल का उपयोग करके संग्रहीत करें ।

6. PV-समृद्ध प्रोटोकॉल: "DD17 mCherry कम श्श्श" (निरंतरता से कदम ३.७)

  1. DD5 पर, KSR के साथ मीडिया बदलें: N2 (1:1) FGF-2 (10 एनजी/एमएल) और IGF-1 (20 एनजी/एमएल) युक्त । DD7 पर, KSR के साथ मीडिया बदलें: N2 (1:1) FGF-2 (10 एनजी/एमएल) और IGF-1 (20 एनजी/एमएल) युक्त ।
  2. DD9 पर, KSR के साथ मीडिया बदलें: N2 (1:1) । इस बिंदु से आगे, कोई अतिरिक्त वृद्धि कारकों आवश्यक हैं ।
    1. DD17 पर कोशिकाओं को संचयन तक हर 2 दिनों में मीडिया को बदलने के लिए जारी रखें ।

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Representative Results

इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल हमारे प्रकाशित प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण है15,16,17 और हमारे nkx 2.1 के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है:: mCherry: Lhx6:: GFP दोहरे रिपोर्टर mESC लाइन । जोड़कर Wnt अवरोधक XAV-९३९ से DD0-5, DD8 पर पुनः चढ़ाना के साथ संयुक्त, हम मजबूत nkx 2.1 प्रेरण, जिसमें सभी DAPI + संस्कृति में नाभिक के ५०% की ऊपर की ओर भी कर रहे है nkx 2.1 एक्सप्रेस (चित्र 1a, बी) । mCherry और GFP रिपोर्टर्स के लिए Immunohistochemistry nkx 2.1-पॉजिटिव immunoreactivity (चित्र 1a) के क्षेत्रों के भीतर स्पष्ट अभिव्यक्ति दिखाता है. जीवित कोशिकाओं के FACS देशी रिपोर्टर का उपयोग करके पता चलता है कि कोशिकाओं की चार आबादी स्पष्ट रूप से अलग किया जा सकता है: (१) GFP/mCherry दोहरे ऋणात्मक कक्ष, (२) mCherry-ही व्यक्त कोशिकाएँ, (३) GFP-ही व्यक्त कोशिकाएँ, और (४) GFP/mCherry दोहरे व्यक्त कक्ष ( चित्रा 1C). इस लाइन का प्रयोग, progenitors का एक छोटा सा अंश को DD8-9 के आसपास mCherry संवाददाता पर बारी शुरू होता है । mCherry स्तर DD12 के बीच पीक-13 और फिर तेजी से गिरावट के रूप में progenitors सेल चक्र से बाहर निकलें और उत्पादन के बाद mitotic Lhx6:: GFP + न्यूरॉन पुरोगामी (चित्रा 1 डी). तदनुसार, Lhx6:: GFP रिपोर्टर DD9-10 और DD13 के आसपास चोटियों-14 के बीच पर बदल जाता है (चित्रा 1 d) । हालांकि Lhx6 की कुल संख्या:: GFP कोशिकाओं को संस्कृति में वृद्धि जारी है, प्रतिशत नहीं है, शायद अंय वंश के प्रसार के कारण । एक बार Lhx6:: GFP + रिपोर्टर एक्सप्रेस, यह अनिश्चित काल के बाद से Lhx6 छुरा परिपक्व MGE में व्यक्त किया जाता है-cortical ंयूरॉंस18,19व्युत्पंन रहता है । हालांकि nkx 2.1 और Lhx6 अभिव्यक्ति मोटे तौर पर गैर murine forebrain भीतर अतिव्यापी हैं, वहां nkx 2.1:: mCherry और Lhx6 की एक क्षणिक जनसंख्या है: GFP सह संस्कृति में एक्सप्रेस कोशिकाओं । इस nkx 2.1 अभिव्यक्ति की सामांय समय सीमा से परे mCherry रिपोर्टर के perdurance के लिए कम से आंशिक कारण है, के रूप में डबल लेबल कोशिकाओं के अधिकांश nkx 2.1 प्रोटीन (टायसन और एंडरसन, अप्रकाशित) के detectable स्तर व्यक्त नहीं करते । कोशिकाओं Lhx6 रिपोर्टर और चेरी/nkx 2.1 प्रोटीन व्यक्त करने के लिए सतत striatal ंयूरॉंस20हो सकता है । हालांकि, हमारे जीने इमेजिंग अध्ययन के आधार पर, वहां के बारे में 18 एच की एक खिड़की जिसमें तुल्यकालिक, नव पोस्ट mitotic nkx 2.1 व्यक्त करने के अग्रदूत:: mCherry और Lhx6:: GFP अलग किया जा सकता है (Tischfield और एंडरसन, अप्रकाशित, और Tischfield एट अल देखें । 17). इस प्रकार, nkx 2.1 इकट्ठा करके:: mCherry और Lhx6:: GFP प्रोटोकॉल के दौरान किसी भी बिंदु पर डबल सकारात्मक कोशिकाओं, यह कोशिकाओं है कि मुख्य रूप से एक दूसरे के लगभग 18 एच के भीतर सेल चक्र से बाहर निकला है की एक जनसंख्या प्राप्त करने के लिए संभव है । यह nkx 2.1 के विपरीत है:: mCherry और Lhx6:: GFP-केवल व्यक्त कोशिकाओं है, जो क्रमशः अलग जन्मतिथि के progenitors और अग्रदूतों के विभिन्न प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

nkx 2.1:: mCherry: Lhx6:: GFP दोहरे रिपोर्टर mESC लाइन को एसएसटी-दुर्भाग्यशाली न्यूरॉन्स के लिए समृद्ध किया जा सकता है । सामांय में, संस्कृतियों के लिए श्श्श जोड़ने और GFP का संग्रह + भेदभाव में पहले समय बिंदुओं पर कोशिकाओं (उदा, DD12) एसएसटी उपप्रकार के लिए समृद्ध । हमारी टिप्पणियों के आधार पर, हम एसएसटी में एक महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा है: PV अनुपात के आधार पर कि क्या श्श्श DD5 या DD8 में जोड़ा गया है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । श्श्श जोड़कर (५० एनजी/एमएल) से DD8-12 और फिर GFP ही व्यक्त कोशिकाओं रोपाई, हम औसत पर प्राप्त करें एसएसटी के 7:1 अनुपात: पीवी CIns (चित्रा 2a)15,17. हमारे दोहरे रिपोर्टर mESC लाइन का उपयोग करते हुए न्यूरॉन्स पर संस्कृति में श्श्श और समय के प्रभाव पर अधिक विस्तार के लिए, टायसन एट अल देखें. 15

पीवी-दुर्भाग्यशाली CIns के लिए समृद्ध करने के लिए संस्कृति मीडिया से श्श्श का लोप होना चाहिए । नोट के, mitotic progenitors में 2.1 अभिव्यक्ति nkx बनाए रखने के लिए संकेत श्श्श की आवश्यकता के अनुरूप21, श्श्श संकेतन exogenous श्श्श के बाद से जोड़ा जा रहा है के बिना इन संस्कृतियों में मौजूद है विरोधी श्श्श सिग्नलिंग समाप्त nkx 2.1 अभिव्यक्ति15. तथापि, यदि DD8 पर कोशिकाओं को पुनः चढ़ाया जाता है, तो इस अंतर्जात श्श्श को हटा दिया जाता है, ऐसी कि प्रसूता (३० एनएम) को nkx २.१ अभिव्यक्ति और CIns के उत्पादन को बनाए रखने के लिए DD8-१० से मीडिया से जोड़ा जाना चाहिए. हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि संस्कृति की स्थिति से श्श्श रोक और 2.1 nkx के लिए छंटाई से:: mCherry + DD17 पर कोशिकाओं, एक ~ 2.6: PV के 1 अनुपात: एसएसटी कोशिकाओं प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 2 बी)15। एसएसटी उपप्रकार, जो पहले के चरणों में समृद्ध कर रहे है और exogenous श्श्श की उपस्थिति में, संस्कृति में वृद्धि की अवधि और exogenous श्श्श की कमी के विपरीत में पीवी उपप्रकार15के लिए समृद्ध । एक और हाल के अध्ययन में, हमने पाया है कि aPKCi हमारे "MGE" प्रोटोकॉल के लिए लागू काफी nkx 2.1 के अंश:: mCherry progenitors कि एक्सप्रेस cyclin17, मध्यवर्ती जनक कोशिकाओं के एक मार्कर22से बढ़ जाती है । यह प्रोटोकॉल भिंनता हमारी खोज पर आधारित थी कि पीवी-एक्सप्रेस CIns मुख्य रूप से मध्यवर्ती progenitors से उत्पंन होती है, जबकि एसएसटी progenitors मुख्य रूप से वेंट्रिकुलर सतह पर रेडियल progenitors से उत्पंन होता है23। हमने पाया है कि जब हल और नवजात माउस neocortex में प्रत्यारोपित, इन progenitors बहुत PV-उपप्रकार के उत्पादन के लिए पक्षपातपूर्ण हैं । DD8 से aPKCi जोड़कर-11 और फिर nkx 2.1 छंटाई:: mCherry कोशिकाओं, हम एक 5.8: के 1 अनुपात को प्राप्त करने में सक्षम थे पीवी: एसएसटी उपप्रकार (चित्रा 2c)17। आगे पीवी उपप्रकार के लिए समृद्ध करने के लिए, हम भी nkx 2.1 अलग है:: mCherry कोशिकाओं DD8 से aPCKi की उपस्थिति में उगाया-17 । हालांकि, हम क्या हम DD11 में प्राप्त करने में सक्षम थे परे pv: एसएसटी अनुपात में वृद्धि हासिल नहीं किया, pv उपप्रकार उत्पंन की प्रतिशत में एक सीमांत वृद्धि के बावजूद (चित्रा 2d) । इनमें से प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए फ़्लोचार्ट आरेख 3में होते हैं । माउस दिमाग का Immunostaining 30 दिनों के बाद विरोधी के साथ प्रत्यारोपण-पीवी, विरोधी एसएसटी, और विरोधी GFP (Lhx6 की पहचान बढ़ाने के लिए:: GFP + कोशिकाओं) एंटीबॉडी से पता चलता है कि Lhx6:: GFP + कोशिकाओं के प्रदर्शन परिपक्व रूपात्मक सुविधाओं के पैटर्न के साथ pv और एसएसटी अभिव्यक्ति vivo समकक्षों (चित्रा 4 और चित्रा 5) में उनके जैसा ।

एक सीन भेदभाव सफल प्रतीत होता है कि क्या निर्धारित करने में सहायता करने के लिए, हम प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण में छवियों की एक श्रृंखला तैयार किया है सामांय परिवर्तनशीलता (चित्रा 6, चित्रा 7, चित्रा 8) का प्रदर्शन । हम यह भी एक असफल भेदभाव कैसे DD4 (चित्रा 9) पर प्रकट होता है का प्रदर्शन आंकड़ा शामिल हैं । सामान्य तौर पर, असफल भेदभाव कम स्तर (nkx 2.1 अभिव्यक्ति और nkx 2.1 के प्रतिशत से कम 10%):: mCherry और Lhx6:: GFP प्रेरण लगभग 1% या उससे कम की उपज होगी ।

Figure 1
चित्र 1: nkx 2.1 की जनरेशन:: mCherry और Lhx6:: GFP ंयूरॉन पुरोगामी. (a) यहां दिखाए गए immunostaining के प्रतिनिधि छवियां है nkx 2.1, nkx 2.1:: mCherry (आरएफपी), और Lhx6:: GFP (GFP) से एक भिंनता दिन 12 (DD12) संस्कृति । ध्यान दें कि इन छवियों को देखने के एक ही क्षेत्र से अतिव्यापी चैनल हैं । (B) DAPI + नाभिक के औसत प्रतिशत का ठहराव जो DD12 में संस्कृति में nkx 2.1 व्यक्त करता है (n = 3 स्वतंत्र विभेद) । (ग) प्रतिनिधि FACS चार अलग सेल आबादी है कि हमारे दोहरे रिपोर्टर mESC लाइन का उपयोग कर अलग किया जा सकता है प्रदर्शन साजिश । ध्यान दें कि mCherry x-अक्ष पर है और GFP y-अक्ष पर है । इस प्रकार, शीर्ष दाएं बॉक्स mCherry/GFP-डबल सकारात्मक है कि कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है । (D) nkx 2.1 का समय पाठ्यक्रम:: mCherry और Lhx6:: GFP प्रेरण DD6-16 से संस्कृति में कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया है कि या तो mCherry केवल व्यक्त कर रहे हैं, GFP केवल व्यक्त, या mCherry/GFP सह व्यक्त । ये प्रतिशत एक एसएसटी-समृद्ध प्रोटोकॉल के दौरान श्श्श की उपस्थिति में उगाई गई कोशिकाओं से प्राप्त किए गए थे और 3 स्वतंत्र विभेदों से औसत दर्शाते हैं । (B) में त्रुटि पट्टियां और (D) SEM. स्केल पट्टी = १५० µm (A) का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: संस्कृति की स्थिति में हेरफेर अंतर पीवी-बनाम एसएसटी-दुर्भाग्यशाली mESC व्युत्पंन cortical न्यूरॉन्स के लिए समृद्ध बनाता है । (क) पीवी + का प्रतिशत, एसएसटी +, और PV-/SST-न्यूरॉन्स प्राप्त जब DD12, GFP ही व्यक्त कोशिकाओं श्श्श की उपस्थिति में हो (५० एनजी/एमएल) DD5 से-12 नवजात neocortex में प्रत्यारोपित कर रहे है और 30 दिनों के बाद प्रत्यारोपण का विश्लेषण किया । (B) pv +, एसएसटी + का प्रतिशत, और pv-/SST-न्यूरॉन्स प्राप्त जब DD17, mCherry ही व्यक्त कोशिकाओं पूरक श्श्श के बिना उगाया नवजात neocortex में प्रत्यारोपित कर रहे हैं और 30 दिनों के बाद प्रत्यारोपण का विश्लेषण किया. (C) pv +, एसएसटी +, और pv-/SST-न्यूरॉन्स का प्रतिशत प्राप्त जब DD11, mCherry-केवल व्यक्त कोशिकाओं प्रसूता की उपस्थिति में उगाया (30 एनएम; DD8-10) और aPKCi (2 µ m; DD8-11) नवजात neocortex में प्रत्यारोपित और 30 दिनों के बाद प्रत्यारोपण का विश्लेषण कर रहे हैं । (D) PV + का प्रतिशत, एसएसटी +, और PV-/SST-न्यूरॉन्स प्राप्त जब DD17, mCherry-केवल व्यक्त कोशिकाओं DD8 से प्रसूता (30 एनएम) की उपस्थिति में उगाया-10 और aPKCi (2 µ m) से DD8-17 नवजात neocortex में प्रत्यारोपित कर रहे हैं और 30 दिनों का विश्लेषण प्रत्यारोपण के बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: इस अध्ययन में वर्णित विभिन्न पीवी-और एसएसटी-समृद्ध प्रोटोकॉल को दर्शा ने वाले फ़्लोचार्ट्स । प्रोटोकॉल के सभी के लिए (ए), कदम DD0 सहित भेदभाव के शुरू करने के लिए अग्रणी-5 समान हैं । सभी कोशिकाओं N2 में DD0-3 से embryoid निकायों के रूप में उगाया जाता है: KSR (1:1) बीएमपी-अवरोधक LDN-१९३१८९ और Wnt अवरोधक XAV-९३९ के साथ पूरक । DD3 पर, कोशिकाओं "N2 में उतरा" रहे हैं: KSR (1:1) युक्त LDN-१९३१८९, XAV-९३९, और रॉक अवरोधक Y-२७६३२ । एसएसटी-उपप्रकार के लिए समृद्ध करने के लिए, श्श्श DD5-12 से जोड़ा गया है । वैकल्पिक रूप से, श्श्श DD8 से जोड़ा जाता है-12 के बाद से, हमारे अनुभव में, DD5 बनाम DD8 से श्श्श के अलावा काफी PV: एसएसटी उपप्रकार उत्पंन के अनुपात पर प्रभाव नहीं पड़ता । प्रोटोकॉल के पिछले संस्करण (देखें टायसन एट अल. 15) DD8 पर एक फिर से चढ़ाना कदम शामिल नहीं किया है और इसके बजाय DD5 पर exogenous श्श्श के साथ मीडिया पूरक । इस प्रोटोकॉल बाद में एक फिर से DD8 पर कदम चढ़ाना श्श्श की शुरूआत के साथ एक साथ शामिल करने के लिए बदल दिया गया था, जिनमें से न तो काफी बदल पीवी: एसएसटी अनुपात । इस "उच्च श्श्श" प्रोटोकॉल में, Lhx6:: GFP + exogenous श्श्श की उपस्थिति में उगाया कोशिकाओं बहाव अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए FACS पर पृथक DD12 हैं । (ख) "कम-श्श्श" पीवी-प्रोटोकॉल के लिए, exogenous श्श्श के साथ-साथ DD8 पर पुनः चढ़ाना कदम का लोप कर रहे हैं । इसके बजाय, nkx 2.1:: mCherry + कोशिकाओं बहाव अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए DD17 पर अलग FACS हैं । (C) "+ aPKCi" PV प्रोटोकॉल के लिए, aPKCi को DD8-10 से प्रसूता के साथ जोड़ा जाता है और केवल aPKCi आगे DD10 से जोड़ा जाता है । DD11 या DD17, nkx 2.1:: mCherry कोशिकाओं को अनुप्रवाह अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए अलग-थलग FACS हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: Lhx6 में पीवी और एसएसटी immunostaining:: GFP + कोशिकाओं 30 दिनों के बाद नवजात neocortex में प्रत्यारोपण । (क) एक एसएसटी के उच्च शक्ति छवि-व्यक्त, Lhx6:: GFP + सेल 30 दिनों के बाद नवजात neocortex में प्रत्यारोपण । चार छवियों के प्रत्येक कॉलम के भीतर Lhx6 के एकल चैनल छवियां हैं:: GFP, PV, और एक 3 चैनल के साथ एसएसटी अभिव्यक्ति नीचे में विलय छवि । के रूप में शीर्ष पैनल में दिखाया गया है, इस Lhx6:: GFP + ंयूरॉन एकाधिक प्रक्रियाओं एक परिपक्व आकृति विज्ञान के सुझाव को सविस्तार । (ख) दो पीवी-एक्सप्रेस के उच्च शक्ति छवि, Lhx6:: GFP + कोशिकाओं 30 दिनों के बाद प्रत्यारोपण । (ग) एक एसएसटी की उच्च शक्ति छवि-/PV-डबल निगेटिव, Lhx6:: GFP + सेल । यद्यपि यह कक्ष पूर्ण विभेदन और cortical एकीकरण के अनुरूप एकाधिक प्रक्रियाओं को विस्तृत करता है, लेकिन यह कक्ष स्पष्ट रूप से पीवी या एसएसटी एक्सप्रेस नहीं है । ध्यान दें कि Lhx6 के निकटवर्ती एक PV + नाभिक है:: GFP + सेल लेकिन यह ओवरलैप नहीं होता है । स्केल बार्स = ५० µm (A-C) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: पीवी, एसएसटी, और Lhx6 के मध्यम और निंन शक्ति छवियां:: GFP प्रोटीन अभिव्यक्ति 30 दिनों के बाद नवजात neocortex में प्रत्यारोपण । (A) माउस neocortex के किसी क्षेत्र की मध्यम शक्ति छवि जिसमें 30 Lhx6:: GFP + कोशिकाओं 30 दिनों के बाद प्रत्यारोपण । इन कोशिकाओं PV प्रोटोकॉल का उपयोग कर बड़े थे (+ aPKCi DD8 से-11; FACS अलग और प्रत्यारोपण nkx 2.1:: mCherry + पर DD11) । यहां देखी गई 30 कक्षों में से 16 एक्सप्रेस पीवी, 4 एक्सप्रेस एसएसटी, व 10 एक्सप्रेस न तो पीवी और न ही एसएसटी की है । (ख) माउस neocortex के एक क्षेत्र की कम बिजली की छवि जिसमें अनेक, अच्छी तरह से विभेदित Lhx6:: GFP + कोशिकाओं 30 दिनों के बाद प्रत्यारोपण । Lhx6 की बहुतायत नोट:: GFP + प्रक्रियाओं दौड़ भर में प्रांतस्था । सामयिक कोशिकाओं को भी हिप्पोकैंपस में पाया जाता है, जहां वे एकीकृत और विस्तृत प्रक्रियाओं एक परिपक्व phenotype के साथ संगत दिखाई देते हैं । स्केल बार = ५० µm (A); ५५० µm (ख) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: माउस भ्रूण fibroblast फीडर परत और विभेदित स्टेम कोशिकाओं के सामांय उपस्थिति । (A) यहां दिखाया 4x और 10x आवर्धन brightfield हमारे माउस भ्रूण fibroblast (MEF) फीडर परतों 24 ज चढ़ाना के बाद की विशिष्ट उपस्थिति का प्रदर्शन छवियां हैं । (ख) यहां दिखाया गया है हमारे माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के ठेठ उपस्थिति (mESCs) 2 दिन MEF भक्षण पर चढ़ाना के बाद । ध्यान रहे कि कालोनियों में चमकीली परिधि होती है और दिखने में अंडाकार या अंडाकार होते हैं । यदि कालोनियों इस उज्ज्वल परिधि खो या जावक अनुमानों भेजने के लिए शुरू, ये संकेत है कि कोशिकाओं में अंतर हो सकता है । (ग) यहां दिखाया mESCs 1 और 2 दिनों के बाद फिर से जिलेटिन लेपित व्यंजन पर चढ़ाना क्रम में भेदभाव शुरू करने से पहले MEF भक्षण को पतला कर रहे हैं । ध्यान दें कि स्टेम सेल जिलेटिन पर ४८ एच के बाद काफी विस्तार और एक उज्ज्वल परिधि के साथ एक अंडाकार उपस्थिति प्राप्त करने के लिए शुरू करते हैं । स्केल बार = १०० 4x और 10x फ़ोटो में µm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: विभेदन पर माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के रूप 1 से 7 । (क) एक दिन तैरते रहने के बाद, तने हुए कक्षों को छोटे embryoid निकायों (EBs) के गठन के रूप में देखा जा सकता है. दो दिन तक EBs काफी हो गए हैं. ध्यान दें कि कुछ EBs एक साथ फँस गया है और कक्षों के बड़े क्लस्टर का गठन किया है । हम नहीं पाते है कि यह नकारात्मक भेदभाव को प्रभावित करता है । 3 दिनों के बाद, EBs भी बड़ा हो गया है और कुछ अब उनके माध्यम से प्रकाश संचारित । बैकग्राउंड में सेल का मलबा देखना सामान्य है । (ख) यहां दिखाया गया है स्टेम सेल भिंनता 4 (DD4) दिन पर उतरने के बाद 24 एच । कोशिकाओं के घनत्व पर ध्यान दें । कई छोटी प्रक्रियाओं का विस्तार करने के लिए शुरू कर दिया है, जो भेदभाव जारी है के रूप में वृद्धि होगी । यहां ध्यान दें कि कोशिकाओं को भी छोटे काले भर में फैले डॉट्स के साथ रंग का है । यदि कोशिकाओं को चमकदार या समरूप दिखाई दे रहे हैं, कि ंयायपालिका भेदभाव का संकेत है । (ग) DD5 द्वारा, कोशिकाओं को पैदा और तंत्रिका rosettes के रूप में जारी किया है । कई कोशिकाओं लंबी, पतली प्रक्रियाओं बढ़ाया है । (D) DD7 द्वारा, कोशिकाओं को धाराप्रवाह होना चाहिए । यह एक "स्विस-पनीर" पैटर्न, जिसमें बड़े, सपाट, multinucleated कोशिकाओं (संभवतः ependymal या glial कोशिकाओं) को देखने के लिए सामांय है तंत्रिका progenitors की एक परत के भीतर परिपत्र द्वीपों बनाएं । कभी-कभार जब कोशिका घनत्व सामान्य से अधिक होता है, तो यह "स्विस-चीज़" पैटर्न विकास नहीं करता, जैसा कि बीच की छवि में दिखाया गया है. भेदभाव के आधार पर, यह तंत्रिका प्रेरण को प्रभावित कर सकते हैं । 4x और 10x आवर्धन संकेत मिलता है । स्केल बार = १०० 4x और 10x फ़ोटो में µm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8:9 से 14 दिनों के अंतर का प्रकटन । (A) एकल कक्षोंकोपुन: चढ़ाना के बाद एक दिन विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है । उनके द्विध्रुवी उपस्थिति, जो तंत्रिका progenitors की खासियत है ध्यान दें । संस्कृति कुछ अंय घुसपैठ सेल प्रकार के साथ समरूप है । इस अवस्था के लिए घनत्व उपयुक्त है । (ख) DD11 द्वारा, कोशिकाओं को एक monolayer में वृद्धि हुई है । भेदभाव में पहले के चरणों के समान, बड़े "अंडा की तरह" बहु nucleated कोशिकाओं interspersed भर में देखा जा सकता है । (C) द्वारा DD13 कक्षों को पैदा जारी रखा है । अब उन्हें छोटे टीले का गठन करते देखा जा सकता है. कई "अंडे की तरह" कोशिकाओं को अभी भी भर में मौजूद हैं । इस बिंदु से आगे, संस्कृति केवल कुछ परिवर्तन दिखाएगा, टीले के अपवाद के साथ बड़ा बढ़ रहा है । 4x, 10Xx, और 20X आवर्धन इंगित करते हैं । स्केल पट्टी = १०० 4x और 10x फ़ोटो में µm, और स्केल बार = ५० 20X तस्वीरों में µm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9:4 दिन पर एक असफल भेदभाव की उपस्थिति । DD4 एक भेदभाव की सफलता के मूल्यांकन के मामले में महत्वपूर्ण है क्योंकि यह प्रोटोकॉल के सबसे कठिन चरणों में से एक: DD3 पर लैंडिंग निंनानुसार है । DD4 द्वारा embryoid शवों से असंबद्ध होने के बाद कोशिकाओं को ठीक करने के लिए २४ ज पड़ा है. के रूप में यहां देखा जा सकता है, कोशिकाओं के सबसे चमकदार और समरूप दिखाई दे रहे हैं । Interspersed भर में सामयिक कोशिकाओं है कि सामांय दिखाई दे रहे हैं, छोटे काले भर में फैले डॉट्स के साथ एक गहरा उपस्थिति रही । इसके अलावा, बड़े फ्लैट कोशिकाओं (नीचे बाएँ पैनल में देखा जा सकता है) ंयायपालिका भेदभाव का संकेत कर रहे हैं. नीचे सही पैनल में, कम से तीन कोशिकाओं के छोटे समूहों (पीले तीर) छोटे embryoid निकायों के रूप में दिखाई देते हैं, या तो दोषपूर्ण भेदभाव, अपूर्ण EB पृथक्करण, या गरीब पालन सेल संस्कृति की थाली की सतह को दर्शाता है । ये छवियां चित्रा 7Bमें दिखाए गए लोगों के विपरीत हैं, जो DD4 पर स्वस्थ, सामांय दिखने वाले कक्षों को चित्रित करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हालांकि इस विधि J1-व्युत्पंन mESCs (SCRC-१०१०) पैटर्न में अत्यधिक प्रभावी है, हम अंय mESC लाइनों और क्लोनी अलग के साथ चर सफलता का अनुभव है । मसलन, Foxg1:: शुक्र mESCs (EB3-व्युत्पन्न; Danjo एट अल. 13) इस प्रोटोकॉल और DD12 द्वारा Foxg1 प्रेरण के लिए खराब जवाब 1-2% के आदेश पर आम तौर पर है । कारण है कि हम पूरी तरह से समझ में नहीं आता के लिए, एक और nkx 2.1:: mCherry: Lhx6:: GFP दोहरी रिपोर्टर क्लोन (JQ59) है कि एक साथ इस प्रोटोकॉल में वर्णित लाइन के रूप में अलग किया गया था (अवधि के JQ27), उत्पादन से कम 1% nkx 2.1-एक्सप्रेस कोशिकाओं जब उगाया समरूप शर्तों के तहत । पैरेंट रेखा (J1; ATCC SCRC-१०१०), तथापि, अच्छी तरह से इस प्रोटोकॉल के लिए प्रतिक्रिया करता है और nkx के प्रतिशत का उत्पादन 2.1-DD12 पर व्यक्त कोशिकाओं के समान चित्र 1bमें दिखाया गया है । यदि आवश्यक हो, XAV-९३९ और श्श्श/प्रसूता की सांद्रता रेखा के आधार पर एक पंक्ति पर भिंनता शर्तों का अनुकूलन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । हालांकि, हमारे अनुभव इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए MGE में अंय mESC लाइनों अंतर-progenitors की तरह सीमित है ।

हमारे nkx 2.1 के संबंध में:: mCherry: Lhx6:: GFP दोहरी रिपोर्टर mESC लाइन, सभी nkx 2.1 + कोशिकाओं एक्सप्रेस mCherry । हालांकि लगभग सभी mCherry + कोशिकाओं nkx 2.1 प्रोटीन, रिपोर्टर अभिव्यक्ति lags के पीछे nkx 2.1 प्रोटीन अभिव्यक्ति, विशेष रूप से विभेदन (DD7-9) के प्रारंभिक दौर के दौरान व्यक्त करते हैं । nkx के अंश 2.1 + कोशिकाओं है कि व्यक्त mCherry तेजी से भेदभाव के पाठ्यक्रम में बढ़ जाती है । चोटी के स्तर पर (~ DD12-14) mCherry सभी nkx 2.1 व्यक्त progenitors के बारे में 30% में व्यक्त की है17। इसके अतिरिक्त, mCherry अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए उपयोग किया गया एक ही जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र nkx 2.1-अभिव्यक्ति डोमेन में ट्रांसजेनिक चूहों की Cre recombinase ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया गया है24। इन चूहों में, Cre-अभिव्यक्ति nkx 2.1-व्यक्त MGE के अधिकांश क्षेत्र के कोशिकाओं के भीतर कमजोर था, और भाग्य-इस माउस के साथ मानचित्रण के तहत लेबल एसएसटी-व्यक्त CIns कि मोटे तौर पर इस क्षेत्र से उत्पंन होने के लिए जाना जाता है प्रकट25, 26,27,28. हालांकि, इन विसंगतियों के बावजूद, GFP या mCherry-एक्सप्रेस कोशिकाओं के लाखों FACS के केवल कुछ ही घंटों के साथ अलग किया जा सकता है ।

इस तकनीक के दो मुख्य फायदे हैं । सबसे पहले, जब हमारे nkx 2.1 के साथ संयुक्त:: mCherry: Lhx6:: GFP दोहरे रिपोर्टर mESC लाइन, यह संभव है के लिए एक बड़ी संख्या में प्राप्त करने के लिए ंयूरॉन के अग्रदूत बनने के लिए समृद्ध PV या एसएसटी-दुर्भाग्यशाली cortical ंयूरॉन उपप्रकार । दूसरा मुख्य लाभ सापेक्ष आसानी है जिसके साथ बड़ी संख्या में न्यूरॉन दुर्भाग्यशाली कोशिकाओं प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि कई अंय संशोधित EB तकनीकों MGE progenitors और न्यूरॉन्स अंतर करने के लिए मौजूद हैं, इन प्रोटोकॉल आम तौर पर निरोधात्मक13,14,29के रूप में Wnt-Dkk1 अणुओं के उपयोग पर भरोसा करते हैं । हमने पाया है कि Wnt अवरोध करनेवाला XAV-९३९ बहुत pallidal telencephalic progenitors की पीढ़ी को बढ़ाता है, के रूप में Foxg1 और nkx 2.1 अभिव्यक्ति15द्वारा सबूत है ।

जैसा कि पहले उल्लेख किया है, कई अंय तरीकों mESCs से MGE की तरह progenitors पैदा करने के लिए मौजूद हैं । वातानाबे एट अल. 14 एक अनुयाई सतह पर फिर से चढ़ाना के बाद एक सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति विधि विकसित करने के लिए पहली जा रहा द्वारा mESCs से telencephalic भेदभाव के क्षेत्र का बीड़ा उठाया । उंहोंने पाया कि Wnt और नोडल विरोधी, Dkk1 और LeftyA, क्रमशः, कुशलतापूर्वक जल्दी neuroectodermal वंश में mESCs13खदेड़ दिया । इन संस्कृतियों के लिए श्श्श लागू करके, उंहोंने कहा कि संस्कृति सह में सभी कोशिकाओं के 5-15% के बीच व्यक्त nkx 2.1/Foxg1 और MGE के रूप में माना जा सकता है-progenitors की तरह13। हालांकि, कई अध्ययनों के लिए नींव बिछाने के लिए आते हैं, इस अध्ययन MGE progenitors अलग या विशेष रूप से CIn उपप्रकार के लिए समृद्ध करने के लिए एक रास्ता नहीं था.

कई साल बाद, Danjo एट अल । 13 के संयोजन में एक ही सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति विधि विभिंन विकास कारकों के समय पर प्रशासन के साथ प्रयोग किया, विशेष श्श्श में, mESC-व्युत्पंन ventral telencephalic ऊतकों के उपक्षेत्रीय विनिर्देश प्राप्त करने के लिए । एक Foxg1 का उपयोग करना:: वीनस रिपोर्टर लाइन, उंहोंने पाया कि DD3 से श्श्श प्रशासन-12 Dkk1 उपचार के बाद संस्कृति में सभी कोशिकाओं के 45-68% के बीच में परिणाम Foxg1:: वीनस रिपोर्टर13। Foxg1 के भीतर:: वीनस + जनसंख्या, लगभग ३२% कोशिकाओं की nkx 2.113व्यक्त की । प्रसूता के लिए श्श्श प्रतिस्थापन और Fgf8 जोड़ने के द्वारा, वे आगे Foxg1 के भीतर nkx 2.1 progenitors के अंश को बढ़ाया:: वीनस + जनसंख्या के लिए लगभग ४१%13। जब भाग्य के लिए परख, इन कोशिकाओं का उत्पादन लगभग 17% एसएसटी, 21% पीवी, 18% NPY, और 8% calretinin उपप्रकार13। हालांकि, जबकि इस अध्ययन CGE बनाम MGE-व्युत्पन्न सीन किस्मत निर्दिष्ट करने के लिए एक विधि वर्णित है, यह एक विधि का वर्णन नहीं किया है चुनिंदा PV या एसएसटी उपप्रकार के लिए समृद्ध ।

म् यर, Cambray एट अल. 11 DD5 पर फिर से चढ़ाना के साथ एक सीरम मुक्त monolayer विधि का इस्तेमाल किया भेदभाव और telencephalic तंत्रिका पूर्ववर्ती माउस और मानव ESCs से व्युत्पंन की पहचान पर activin के प्रभाव का अध्ययन । हालांकि इस अध्ययन nkx 2.1 अपने प्रोटोकॉल में उत्पंन कोशिकाओं के प्रतिशत की रिपोर्ट नहीं किया है, वे रिपोर्ट है कि लगभग ५४% संस्कृति के सह में कोशिकाओं के Nestin/Foxg1 पर DD2 (सीरम मुक्त मीडिया में वृद्धि के 5 दिनों के बाद एक अतिरिक्त 2 दिनों के संस्कृति पुन: चढ़ाना के बाद)11. उंहोंने यह भी बताया कि activin के अलावा, ~ कोशिकाओं के ५५% सह व्यक्त nestin और CouptfII, यह दर्शाता है कि इन कोशिकाओं caudal ganglionic उभार की तरह कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, जो calretinin के बहुमत का उत्पादन cortical न्यूरॉन्स व्यक्त 11. दरअसल, संस्कृति में 8 दिनों तक (13 दिन समग्र) कोशिकाओं के ३९% को सह-एक्सप्रेस calretinin/BIII-tubulin पाया गया, जबकि ५९% कोशिकाओं को सह एक्सप्रेस गाबा/BIII-tubulin11पाया गया । इस अध्ययन में पीवी या एसएसटी उपप्रकारों के उत्पादन की जांच नहीं हुई ।

फिर से एक संशोधित EB विधि का उपयोग कर, चेन एट अल । 12 का प्रदर्शन किया है कि MGE-विशिष्ट बढ़ाने के तत्वों का पालन करें और स्टेम सेल व्युत्पंन MGE-जैसे कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है12। इस अध्ययन में, वे MGE में mESCs के निर्देशित भेदभाव के दौरान विभिंन संस्कृति की स्थिति के प्रभाव की तुलना में progenitors की तरह एक Lhx6 का उपयोग:: GFP रिपोर्टर लाइन; एक ही पंक्ति है जो nkx 2.1 के लिए जनक रेखा के रूप में सेवा की:: mCherry: Lhx6:: GFP दोहरे रिपोर्टर इस पांडुलिपि में वर्णित लाइन । उंहोंने दिखाया है कि DD0 से संस्कृति की स्थिति को Dkk1 जोड़कर-3, प्रसूता के अलावा के बाद, ऊपर की ओर ~ संस्कृति में सभी कोशिकाओं के 10% Lhx6 व्यक्त:: GFP12। उंहोंने यह भी पाया कि एक ही प्रोटोकॉल, Foxg1 के लिए लागू:: वीनस रेखा Danjo एट अल द्वारा वर्णित है । 12, सभी Foxg1 व्यक्त कोशिकाओं के लगभग ३७% के परिणामस्वरूप:: वीनस रिपोर्टर । जब Lhx6:: GFP कोशिकाओं vivo मेंप्रत्यारोपण किया गया था, CIn उपप्रकार मार्करों के निम्नलिखित औसत प्रतिशतों मनाया गया था: 22% पीवी, ५८% एसएसटी, और 16% NPY12.

हाल ही में, अंय समूहों वंश के मजबूर अभिव्यक्ति का इस्तेमाल किया है प्रतिलेखन कारकों को परिभाषित करने के लिए सीधे CIns निर्दिष्ट करें । शायद इस का पहला प्रदर्शन पेट्रो एट अल ने किया था । 10 जो एक doxycycline-inducible प्रमोटर का इस्तेमाल किया Ainv15 mESCs में nkx 2.1 अभिव्यक्ति ड्राइव है कि एक Lhx6 शामिल करने के लिए संशोधित किया गया:: GFP जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र । इस अध्ययन के मौजूदा पांडुलिपि में वर्णित है लेकिन XAV के अलावा बिना उन लोगों के लिए समान संस्कृति की स्थिति का इस्तेमाल किया-९३९10। हालांकि, कारण है कि खराब समझ रहे हैं, के लिए Lhx6 का एक कम प्रतिशत:: GFP + कोशिकाओं को एक ही भिंनता शर्तों के तहत जब J1 Lhx6 का उपयोग कर के लिए मनाया गया:: GFP जनक रेखा इस पांडुलिपि में वर्णित10। Foxg1 अभिव्यक्ति (कुल% अज्ञात) के समान स्तर को प्राप्त करने के बावजूद, वहां nkx की कुल संख्या में एक उदारवादी कमी थी 2.1 कोशिकाओं के साथ कोई अधिक से अधिक 2% सभी कोशिकाओं के Lhx6 व्यक्त:: GFP रिपोर्टर10। इस अध्ययन अंतर्निहित अंतर है कि विभिंन लाइनों esc और चुनौतियों के बीच मौजूद है कि शोधकर्ताओं का सामना जब उन है कि मूल प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया से अलग लाइनों esc के लिए भिंनता प्रोटोकॉल लागू करने का प्रयास कर रहे है पर प्रकाश डाला गया ।

एक सुरुचिपूर्ण दृष्टिकोण का उपयोग करना, Au एट अल । 9 प्रतिलेखन कारकों की अनुक्रमिक मजबूर अभिव्यक्ति का इस्तेमाल किया cortical एक ही ventral telencephalic भेदभाव वातानाबे एट अल द्वारा विकसित प्रतिमान का उपयोग कर के विशिष्ट उपप्रकार उत्पंन करते हैं । 14 जबकि वे Foxg1 के सटीक प्रतिशत की रिपोर्ट नहीं +, nkx 2.1 +, और Olig2 + संस्कृति में उत्पादित पुरोगामी, वे राज्य है कि संस्कृति में सभी कोशिकाओं के लगभग ५०% GABAergic ंयूरॉंस में अंतर9। 11 दिनों के बाद भेदभाव, EBs थे असंबद्ध और ई 13.5 मेजबान भ्रूण के MGE में प्रत्यारोपण9। इन का एक छोटा सा प्रतिशत (कम से 1%) प्रांतस्था में MGE से चले गए, जहां वे अपने Dlx5 द्वारा पहचाने गए/6-eGFP रिपोर्टर और भाग्य के लिए विश्लेषण9। लेखक पीवी, एसएसटी के प्रतिशत की एक किस्म मनाया, और CGE की तरह उनके चुने मजबूर प्रेरण रणनीति9पर आधारित भाग्य । दिलचस्प है, प्रतिलेखन कारक Lmo3 की अभिव्यक्ति के साथ, वे औसत पर मनाया लगभग ५७% PV, 21% एसएसटी, और 15% CGE-व्युत्पन्न उपप्रकार (एसएसटी-/reelin + या वीआईपी-केवल +)9। एसएसटी उपप्रकार मनाया का सबसे बड़ा प्रतिशत एक nkx 2.1/Dlx2 गोफ लाइन है, जो लगभग ३२% एसएसटी, ३५% PV और 25% CGE-व्युत्पंन उपप्रकार9का उत्पादन का उपयोग कर प्राप्त किया गया था ।

२०१५ में, Colasante एट अल । 30 से पता चला है कि पांच प्रतिलेखन कारकों की मजबूर अभिव्यक्ति (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5, और Lhx6) fibroblasts से GAD67 के भीतर-GFP रिपोर्टर चूहों सभी कोशिकाओं के 15% GABAergic में परिवर्तित-जैसे CIns. उल्लेखनीय है, लगभग ९०% इन कोशिकाओं के लिए पर चला गया था पीवी एक्सप्रेस, केवल दुर्लभ कोशिकाओं के साथ एसएसटी30व्यक्त । यद्यपि इस पद्धति को mESCs पर लागू नहीं किया गया था, यह मानव iPSCs के साथ उपयोग किया गया था, जहां यह अनुमान लगाया गया था कि सभी कक्षों के लगभग 30% एक GABAergic पहचान30को अपनाया है ।

जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है, पीवी या एसएसटी CIns की समृद्ध आबादी उत्पन्न करने के लिए कई तरीके हैं । PV-प्रोटोकॉल DD17 प्रोटोकॉल पर aPKCi का उपयोग का मुख्य लाभ कोशिकाओं की अधिक से अधिक संख्या में एक को अलग कर सकते हैं, सेल व्यवहार्यता, और संस्कृति की अवधि । हालांकि हम चित्रा 1में DD17 प्रेरण स्तर के लिए डेटा नहीं दिखा है, वहां लगभग दो बार कर रहे है के रूप में कई mCherry + DD11 पर कोशिकाओं के रूप में वहां DD17 पर है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । जब प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं का संग्रह, हम पाते हैं कि कोशिकाओं को शुरू करने की एक बड़ी संख्या (नीचे देखें) लाभकारी है, के बाद से लगभग 30-50% कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए उन्हें ध्यान देने की प्रक्रिया में खो रहे हैं. इसके अलावा, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या कम FACS समय के साथ प्राप्त किया जा सकता है, जो समय की राशि है कि कोशिकाओं को बर्फ पर है सीमा और कुल लागत कम करती है । शायद इसलिए कि चेरी की एक उच्च प्रतिशत + कोशिकाओं progenitors हैं, संस्कृति के पहले चरण से कोशिकाओं (उदा., DD11) जब नवजात neocortex में प्रत्यारोपण के बाद DD17 कोशिकाओं की तुलना में अधिक से अधिक जीवित रहने का प्रदर्शन । जब व्यवहार्य कोशिकाओं की बड़ी संख्या की जरूरत है, उदाहरण के लिए कोशिका प्रत्यारोपण के मामले में मिर्गी का इलाज करने के लिए, दोनों एक बड़ा शुरू जनसंख्या और अधिक से अधिक व्यवहार्यता एक प्रमुख लाभ है ।

के रूप में चित्रा 2में चित्रित, प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, Lhx6 के लगभग 25-39%:: GFP + कोशिकाओं का विश्लेषण 30 दिनों के बाद प्रत्यारोपण नियमित immunohistochemistry के साथ PV या एसएसटी प्रोटीन का पता लगाने के स्तर व्यक्त नहीं करते । सामान्यत: ये पीवी-/SST-कोशिकाएं गाबा के साथ-साथ Sox6, MGE-व्युत्पन्न cortical न्यूरॉन्स का मार्कर भी व्यक्त करती हैं (देखें टायसन एट अल. 15, Tischfield एट अल. 17). PV-/SST-Lhx6 के 1% से कम:: GFP + कोशिकाएं अंय न्यूरॉन उपसमूहों के व्यक्त मार्करों, जैसे calretinin, reelin, या neuropeptide Y (डेटा नहीं दिखाया गया है) । यह vivo भाग्य मानचित्रण अध्ययन जो पता चला है कि के बीच ~ 15-25% MGE-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के बीच के समान है पीवी या एसएसटी23,25,31व्यक्त नहीं करते । जब 2.1 nkx:: mCherry + या Lhx6:: GFP + कोशिकाओं को अलग कर रहे है और चूहे पर चढ़ाया इन विट्रो मेंcortical भक्षण, हमने पाया है कि ~ Lhx6 के 40-70%:: GFP + कोशिकाओं संस्कृति में 28 दिनों के बाद विश्लेषण कर रहे है PV-/SST-, उन है कि सकारात्मक दाग के बहुमत के साथ व्यक्ती एसएसटी. pv-/SST-कोशिकाओं में यह वृद्धि एक बाह्य परिपक्वता संकेत है कि vivo मेंमौजूद है के अभाव के कारण हो सकता है, के रूप में विशेष रूप से परिपक्व पीवी अभिव्यक्ति, या फीडर कोशिकाओं से इष्टतम electrophysiological इनपुट के लिए मामला हो सकता है । जो भी कारण हो सकता है, हम भाग्य विश्लेषण के लिए नवजात neocortex में कोशिकाओं को प्रत्यारोपण के बजाय इन विट्रो भेदभाव पसंद करते हैं ।

सबसे ट्रांसप्लांटेशन प्रयोगों के लिए, हम DD0 पर तैरते अनुशंसा करते हैं २ १०-cm non-अनुयाई टिशू कल्चर व्यंजन प्रत्येक जिसमें ७.५ x 10 5 mESCs की 10 मिलीलीटर में N2/KSR (७.५ x 10 4 कोशिकाओं/एमएल; 20 एमएल कुल मात्रा) । एक साथ, दोनों प्लेटों आम तौर पर DD3 पर EB पृथक्करण के बाद 8-12 x 106 कोशिकाओं उपज होगी, जिनमें से ५.४ x 106 कोशिकाओं दो 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति का इलाज प्लेटों (५०,००० कोशिकाओं/cm2; लगभग ११० सेमी2 कुल) बीज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता DD8 द्वारा, प्रत्येक 6 अच्छी तरह से थाली पैदावार लगभग 5-7 x 107 कोशिकाओं, जो तब २५०,००० कोशिकाओं के घनत्व पर एक अतिरिक्त तीन से पांच 6 अच्छी तरह से प्लेटें बीज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है/cm2 (तीन 6 के मामले में ४.०५ x 107 कोशिकाओं की कुल आवश्यकता-well प्लेटें या ६.७५ x 107 कोशिकाओं पांच 6 के मामले में अच्छी तरह से प्लेटें) । DD14 द्वारा, प्रत्येक 6 अच्छी तरह से थाली आम तौर पर 1-2.5 x 106 mCherry या GFP-एक्सप्रेस कोशिकाओं उपज होगी । प्रयोग की जरूरतों के आधार पर, हम बड़े प्रत्यारोपण परियोजनाओं के लिए 6 एक्स 106 mESCs के ऊपर के लिए छोटे पैमाने पर immunohistochemistry विश्लेषण के लिए ७.५ x 105 mESCs की एक ंयूनतम मंगाई है ।

प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण कदम एक pluripotent राज्य में भेदभाव शुरू करने से पहले mESCs बनाए रखने रहे है और DD3 पर लैंडिंग/पृथक्करण कदम । यदि कोशिकाओं को ठीक से बनाए रखा गया है और DD3 पर लैंडिंग/पृथक्करण ध्यान से किया जाता है, भेदभाव आमतौर पर सफल हो जाएगा । केवल स्टेम कोशिकाओं है कि स्वस्थ दिखाई देते है और भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यदि EBs DD0-3 या फार्म के बीच के रूप में विफल एकाधिक, छोटे, विषम निकायों, भेदभाव के असफल होने की संभावना है । इसके अतिरिक्त, DD3 पर EB पृथक्करण के दौरान, है EB सावधानी से नजर रखने के लिए गैर-trypsin युक्त सेल-पृथक्करण regent के लिए लंबे समय तक निवेश से बचने के लिए आंख से अब दिखाई चाहिए ।

इस पत्र में प्रस्तुत परिणामों को गुणवत्ता नियंत्रित रिएजेंट का उपयोग कर अनुकूलित शर्तों के तहत प्राप्त किया गया । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि हम कभी कभार मजबूत nkx 2.1 प्रेरण प्राप्त करने में कठिनाई है, और विस्तार, mCherry और GFP रिपोर्टर अभिव्यक्ति द्वारा । हमारे अनुभव के आधार पर, हमारा विश्वास है कि इन परिवर्तनों के लिए FBS सबसे अधिक संभावना वाले खातों की बहुत-बहुत परिवर्तनशीलता । जैसे, यह FBS के विभिंन बहुत परीक्षण के लिए निर्धारित जो mESCs बनाए रखने के लिए सबसे अच्छा काम बुद्धिमान है । यद्यपि हम 2i/लिफ प्रणाली का उपयोग नहीं किया है (सीरम मुक्त खल्क अवरोध करनेवाला PD03259010 और जीएसके-3α/β अवरोधक CHIR99021) युक्त माध्यम से, यह संभव है कि सीरम मुक्त mESC स्थितियों अधिक सुसंगत परिणाम पैदा कर सकता है । हम नहीं है, तथापि, इस परिकल्पना का परीक्षण किया है और क्या सीरम मुक्त mESC मीडिया के उपयोग के रूप में कोई डेटा नहीं है MGE में mESCs के भेदभाव-progenitors की तरह प्रभावित करता है । इसके अलावा, उंहें एकल उपयोग के लिए aliquoting द्वारा जब संभव ताजा वृद्धि कारकों का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें । उपयोगकर्ता के आधार पर, सेल घनत्व को पर्याप्त सेल अस्तित्व को प्राप्त करने के लिए वृद्धि की आवश्यकता हो सकती है, विशेष रूप से DD3 पर लैंडिंग चरण के दौरान ।

ंयूरॉंस उल्लेखनीय क्षमता को जीवित है, प्रवास, और मेजबान में एकीकृत-सर्किट के बाद प्रत्यारोपण । जैसे, इस प्रोटोकॉल मिरगी माउस मॉडल और स्नायविक और neuropsychiatric रोग के अन्य मॉडलों में न्यूरॉन अग्रदूतों प्रत्यारोपण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (Southwell एट अल देखें. ३२ और टायसन और एंडरसन३३ न्यूरॉन सेल आधारित उपचारों की समीक्षा के लिए). उदाहरण के लिए, हाल ही में एक अध्ययन में Donegan एट अल. ३४ एक प्रकार का पागलपन के एक माउस मॉडल में ट्रांसप्लांटेशन के लिए PV और एसएसटी CIns की आबादी को समृद्ध । उंहोंने पाया कि pv और एसएसटी समृद्ध प्रत्यारोपण माउस व्यवहार पर अलग प्रभाव का उत्पादन किया, पीवी के साथ समृद्ध आबादी एक प्रकार का पागलपन endophenotypes कि वे अध्ययन कर रहे थे ।

हाल के वर्षों में, PiggyBac transposon प्रणाली के लिए प्रणाली की एक संख्या में transgenes की स्थिर अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हम इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है जल्दी और आसानी से छुरा व्यक्त doxycycline-inducible miRNA बनाने के लिए ंयूरॉन विकास के दौरान विशेष जीन की भूमिका का अध्ययन । हम भी इस तकनीक का उपयोग कर रहे है दोहरी रिपोर्टर mESC लाइनें बनाने के लिए कि एक्सप्रेस channelrhodopsin-2 (ChR2) को optogenetically ड्राइव mESC व्युत्पंन ंयूरॉंस या खूंखार रिसेप्टर प्रौद्योगिकी के लिए या बंद पर प्रत्यारोपित कोशिकाओं को बारी सामूहिक।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम nkx 2.1:: mCherry: Lhx6: GFP दोहरी रिपोर्टर mESC रेखा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जेनिफर टायसन, आसिफ मारूफ, और टिम पेट्रो के लिए इस प्रोटोकॉल विकसित करने में मदद करने पर उनके जल्दी काम के विकास के लिए किंग Xu के आभारी हैं । हम भी तकनीकी सहायता के लिए जल्द प्रवाह cytometry कोर का शुक्र है । यह कार्य एक NIH R01 MH066912 (SA) और F30 MH105045-02 (DT) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

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References

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Cortical न्यूरॉन पुरोगामी में माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का भेदभाव
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Tischfield, D. J., Anderson, S. A.… More

Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

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