Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

Abstract

GABAergic 대뇌 피 질의 수는 흥분 성의 피라미드 뉴런의 출력 조절 피라미드 뉴런 앙상블의 출력을 동기화에 중요 한 역할을 하는 셀의 이종 인구. 정신병 무질서, 정신 분열 증, 자폐증, 간 질 등의 다양 한에서 적자 interneuron 함수에 연루 되었습니다. 배아 줄기 세포 로부터 대뇌 피 질의 수의 뿐만 아니라 그들의 개발 및 기능 연구에 대 한 허용 하지만 대뇌 피 질의 interneuron 관련 장애의 병 인을 기본 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 수는 또한, 마이그레이션, 생존과 호스트 대뇌 피 질의 회로 후 이식, 그들 세포 기반 요법에 사용 하기 위해 이상적인 후보자를 만들기에 통합 놀라운 능력을가지고. 여기, 우리 Nkx2.1 표현 interneuron 창시자와 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 그들의 자손의 파생에 대 한 확장성, 높은 효율, 수정 embryoid 몸 단층 방법 제시. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 mESC 라인을 사용 하 여, Nkx2.1 창시자 또는 그들의 Lhx6 표현 포스트 mitotic 자손 수 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 통해 격리 되며 이후 다운스트림 응용 프로그램의 숫자에 사용. 우리는 또한 방법을 풍부 하 게 parvalbumin (태양광 발전) 또는 somatostatin (SST) interneuron 하위 그룹을 도움이 될 수 있습니다 운명 결정의 측면을 공부 하거나 사용 하기 위해 하위 그룹 농축 interneuron에서 도움이 될 것 이라고 하는 치료 응용 프로그램에 제공 이식입니다.

Introduction

두 생쥐와 인간에 대략 절반 모든 대뇌 피 질의 억제 수 (CIns)의 발생 과도 subcortical 구조 중간 절 예 하 (MGE) 어디 라고 내 CIns 및 다른 신경 그리고 glial의 neuroepithelial 창시자 하위 그룹 표현 녹음 방송 요인 Nkx2.11,2. CIn 하위 그룹 또는 하위 형태학, neurochemical electrophysiological, 교차 및 연결 특성3,4로 정의 됩니다. MGE 파생 된 CIns로 그룹화 할 수 있습니다 대부분 비중첩 하위 PV 또는 SST, 특정 electrophysiological 및 연결 추세5와 어떤 관계가 식의 그들의 식에 따라. 부전 수, PV 비율에서 특히 그들의 여러 정신병 무질서 및 질병6,7에 연루 되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 줄기 세포 유래 mitotic 창시자 및 대뇌 피 질의 interneuron 생물학 연구 및 세포 기반 요법에 사용 하기 위해 태양광 또는 SST CIn 운명에 대 한 농축 철새 선구자입니다.

Interneuron 창시자 표현 하는 Nkx2.1 및 mESCs에서 그들의 자손의 파생에 대 한 확장 가능한, 매우 능률적인 방법을 개발 했습니다. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP을 사용 하 여 듀얼 기자 mESC 선8, Nkx2.1 창시자 또는 그들의 Lhx6 표현 포스트 mitotic 자손은 FACS를 통해 격리 되 고 이후 다운스트림 응용 프로그램의 수에 사용 될 수 있습니다. 다양 한 신호 경로, 문화, 그리고 성체의 모드를 조작 하 여 우리 붙일 레이블된 interneuron 선구자 다운스트림 응용 프로그램의 호스트에 대 한 적합의 수백만 얻을 수 있습니다.

MESCs9,10,11,12,13,14, 의존 하는 Wnt 우리의 방법에서에서 MGE 같은 창시자를 생성 하기 위한 여러 가지 다른 방법 존재 길 항 근 XAV-939, Foxg1/Nkx2.1 공동 telencephalic 창시자 표현 생성에 특히 효율적입니다. 또한, interneuron 창시자 또는 우리의 듀얼 기자 시스템을 통해 그들의 포스트 mitotic Lhx6 표현 자손에 대 한 선택 수는 크게 고유 창시자 그리고 그들의 자손을 생성 하는 능력을 향상 시킵니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

참고:이 프로토콜에서 설명 하는 듀얼 기자 mESC 라인은 요청 (sande@mail.med.upenn.edu).

1. 미디어 준비

참고: 모든 미디어 세포 배양에 사용 하기 전에 37 ° C를 따뜻하게.

  1. 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 미디어 (500 mL를 준비)
    1. Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM), 및 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터 449 ml 50 mL 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 추가 합니다.
    2. 여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)를 추가 합니다. 최대 1 달 또는 약 수 ≤에 저장소에 대 한 4 ° C에서 미디어를 저장-20 ° c.
  2. N2 미디어 (500 mL를 준비)
    1. 5 mL L-알라닌-L-글루타민 추가 (100 x) 및 500 µ L 2-Mercaptoethanol (55mm) 489.5 ml DMEM: 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12), 그리고 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터.
    2. 여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)와 5 mL n 2 보충-B를 추가 합니다. 최대 1 달 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 미디어를 저장 합니다.
  3. 혈 청 무료 성장 매체 (KSR) (500 mL를 준비)
    1. 추가 75 mL 혈 청 무료 중간 보충, 5 mL L-글루타민 (100 배), 5 mL MEM 비 필수 아미노산 (MEM-NEAA) (100 x), 그리고 500 µ L 2-Mercaptoethanol (55mm) 413.5 mL 비-글루타민을 포함 된 DMEM, 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터링.
    2. 여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)를 추가 합니다. 최대 1 개월 4 ° C에서 미디어를 저장 합니다.
  4. 마우스 배아 줄기 세포 미디어 (500 mL를 준비)
    1. 75 mL 줄기 세포 학년 FBS, 5 mL MEM NEAA 추가 (100 배) 5 mL L-글루타민 (100 x), 그리고 500 µ L 2-Mercaptoethanol (55mm) 413.5 mL 비-글루타민을 포함 된 DMEM, 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터링.
    2. 여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)를 추가 합니다. 최대 1 달 또는 약 수 ≤에 저장소에 대 한 어둠 속에서 4 ° C에서 미디어를 저장-20 ° c.

2. 경작 mESCs

  1. 플레이트 mitotically 비활성 MEF 피더 세포 조직 문화에 MEF 미디어에 3-4 x 104 셀/cm2접시를 취급. 적어도 12 h는 mESCs를 도금 하기 전에 ≥ 95% 상대 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 정착 하도록 허용 합니다. 즉시 사용 하지, MEF 미디어 3 일 마다 교체 합니다. 도금의 7 일 이내 사용 하지 않을 경우 MEFs의 처분.
  2. 마우스 백혈병 금지 요인 (mLIF) (1000 U/mL)를 포함 하는 mESC 미디어에서 MEF 번호판 mESCs (밀도 범위 1-4 x 104 셀/cm2)를 추가 합니다. ≥ 95% 상대 습도 및 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.
  3. 트립 신-EDTA (0.05 %trypsin)를 사용 하 여 mESCs 통로 (1:5-1:10)는 요리 되 ~ 70-80% 합칠 또는 식민지 터치 하기 시작 하는 경우. 이 일반적으로 2 일 마다 발생 하지만 초기 도금 밀도 따라 4 ~ 5 일이 걸릴 수 있습니다.
  4. Pluripotency를 유지 mESC 매체에서 MEF 급지대 레이어에 mESCs을 유지 관리 합니다.
  5. 차별화를 시작 하기 전에 적어도 한 번 MEFs MEFs 밖으로 희석 없이 젤라틴 코팅 접시에 셀 통로.
    1. 캘리포니아2 +/Mg2 + 취급 하는 조직 문화 접시에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 젤라틴 0.1% 추가 하 여 젤라틴 코팅 접시를 준비 하 고 적어도 1 헤 x 106 세포/10 c m 플레이트 플레이트 1.5-2에 대 한 37 ° C에서 떠나 (2.7-3.6 10 x4 셀/cm2) 차별화를 시작 하기 전에 2 일에 대 한 확장을 세포 허용.

3. 차별화 MGE 같은 Telencephalic 창시자 향해 mESCs

  1. 차별화 일 (DD) 0 = "셀 플 로트"
    1. mESCs 성장 후 젤라틴 코팅 판 2 일에 대 한 미디어를 발음 하 고 한번 없이 캘리포니아2 +/Mg2 +PBS 가진 세포를 씻어. 충분 한 트립 신-EDTA (0.05 %trypsin) 4 분 ≥95% 상대 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 배양 기에 다시 셀을 (일반적으로 4 mL 트립 신-EDTA 한 10cm 조직 문화 접시), 판의 표면을 커버를 추가 합니다.
    2. 4 분 후 트립 신-EDTA mESC 미디어 2 배 볼륨을 사용 하 여 끄다. 적절 한 크기의 원심 분리기 튜브에 세포를 전송 하 고 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심. 5 분 후 튜브를 제거 하 고 미디어는 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. 1 ml KSR:N2 미디어 (1:1) 펠 릿 포함 된 BMP 억제제 LDN-193189 resuspend (250 nM) 및 Wnt 억제제 XAV-939 (10 µ M).
    3. Hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 농도 측정 합니다. LDN-193189를 포함 하는 KSR:N2 미디어 (1:1)에 75, 000 셀/mL을 추가 하 여 셀 embryoid 몸 (EBs)으로 성장 하는 시작 (250 nM) 및 XAV-939 (10 µ M) 비 점착 조직 문화 요리에서. ≥ 95% 상대 습도 및 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.
  2. DD1에 셀에 대 한 "방문" 폴 리-L-리 신 (10 µ g/mL PBS에 캘리포니아2 +/Mg2 +) 코팅 처리 하는 조직 문화 요리에 의해 하룻밤 (O/N) ≥ 95% 상대 습도와 37 ° C에 또는 적어도 1 시간에 대 한 준비.
  3. DD2, 폴 리-L-리 신을 발음 하 고 laminin (10 µ g/mL PBS에 캘리포니아2 +/Mg2 +)와 플레이트 코트 O/N ≥ 95% 상대 습도와 37 ° C에서.
    참고: O/N은 최적의 조금은 2 h 수 있습니다 충분. 다음 날 접시 사용 되지 않는, laminin를 발음 하 고 없이 Ca2 +/Mg2 +, PBS 바꿉니다 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장.
  4. DD3 ("토지는 세포")
    1. EB 분리를 시작 하기 전에 laminin 발음 하 고 하 판 조직 문화 후드에 완전히 건조. 나타나는 반짝 또는 가시 젖은 접시를 사용 하지 마십시오. 15 mL 튜브 15 g x 또는 EBs는 수송과 때까지 3-4 분 동안 원심 분리기로 미디어와 EBs를 전송 합니다.
  5. 미디어를 발음 하 고 DNase를 포함 하는 세포 분리 솔루션의 3 개 mL를 추가 (2 U/mL) ≥ 95% 상대 습도와 37 ° C에서 품 어와 15 분의 5% CO2 는 부드럽게 EB 분리에 도움 관 모든 3 분 영화.
  6. EBs는 더 이상 표시 하거나 15 분 경과, 추가 6 mL KSR:N2 (1:1) 포함 하는 DNase (1 U/mL) 및 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기.
  7. KSR:N2 (1:1) LDN-193189를 포함 하는 셀을 접시 (250 nM), XAV-939 (10 µ M), 그리고 바위 억제제 Y-27632 (10 µ M) 4.5-5 x 104 셀/c m2에.

4. SST 풍요롭게 프로토콜: "DD12 GFP 높은 소닉 고슴도치 (쉬)" (단계 3.7에서에서 계속)

  1. DD5, 변경 FGF-2를 포함 하는 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), ssh (50 ng/mL).
  2. 다시 하루 8 (단계 4.4)에 도금을 위한 조직 배양 배지 준비 단계 3.2 3.3에에서 설명 된 지침을 사용 하 여.
  3. DD7, 변경 FGF-2를 포함 하는 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), 그리고 쉬이 잇 (50 ng/mL).
  4. DD8에 다시 셀 접시.
    참고:이 단계는 필수, 다시 도금 셀 줄일 수 있습니다, 원치 않는 초기 분화 세포 유형. 다시 도금 다운스트림 immunohistochemical 분석을 어렵게 하는 셀의 공을 휴식 그리고 나중 시간 포인트에서 FACS의 효율을 증가.
    1. 다시 셀을 접시, ≥95% 상대 습도 및 5% CO2와 37 ° C에서 5 분에 대 한 트립 신-EDTA (0.05 %trypsin)와 플레이트에서 세포를 분리. 트립 신-EDTA와 KSR:N2, 2 배 볼륨을 사용 하 여 담금질 및 5 분에 대 한 200 x g에서 원심 분리기 필터 어떤 덩어리를 제거 하려면 40 µ m 필터 튜브를 통해 셀. FGF-2 포함 된 N2/로켓 (1:1)에서 250, 000 셀/c m2 에서 셀을 다시 접시 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), 및 Y-27632 (10 µ M) 쉬와 (50 ng/mL).
      참고: 다시 DD8 셀 접시 않기로 결정 했다 대신, 쉬를 포함 하는 KSR:N2와 미디어 변경 (50 ng/mL) DD7에서 DD12 2 일 마다 계속 IGF-1을 추가 하 고 (20 ng/mL)와 FGF-2 (10 ng/mL) DD9까지.
  5. DD10에 쉬를 포함 하는 KSR:N2와 미디어 변경 (50 ng/mL).
  6. 에 DD12, SST 하위 유형에 대 한 풍성 하 게 하는 셀을 얻기 위해을 사용 하 여 FACS Lhx6::GFP-만 셀을 표현.
    1. 세포를 분리, 트립 신-EDTA 보다는 비 트립 신 포함 휴대-분리 시 약을 사용 합니다. 한 번 없이 Ca2 +/Mg2 +PBS 가진 세포를 씻어. 미리 데워 진된 비 트립 신 포함 하 셀 분리 시 약 DNase를 포함 추가 (2 U/mL)는 세포에. 10-30 분 또는 세포가 분리 될 때까지 ≥95% 상대 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 배치 합니다. 부드럽게 분리를 돕기 위해 접시 마다 5 분을 누릅니다.
      참고: DD11-12 문화에 대 한 10-15 분만 필요할 수 있습니다. DD15-16 문화에 대 일 분 이상 완전 한 분리에 대 한 필요할 수 있습니다.
    2. 일단 세포는 접시에서 완전히 해제 됩니다, FACS 절연 표준 프로토콜을 사용 하 여 진행 하거나 다른 다운스트림 분석 셀을 사용 합니다.

5. PV 풍요롭게 프로토콜: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (단계 3.7에서에서 계속)

  1. DD5, KSR:N2 (1:1) FGF-2를 포함 하는 미디어 변경 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL).
  2. DD8에 다시 도금 조직 문화 접시 준비 3.2 3.3 단계 (단계 4.4)에 설명 된 지침을 사용 하 여.
  3. DD7, 변경 포함 된 FGF-2 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL).
  4. DD8에 다시 접시 셀 다음 예외 4.4 단계에서 설명한 대로: 다시 셀 도금, 쉬 흐려져 주 작동 근으로 대체 (SAG; 30 nM) 비정형 PKC 억제제 (aPKCi; 2 µ M)를 추가 하 고. 합쳐, 다시 도금 미디어는 지금 N2/로켓 (1:1) 포함 된 FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µ M), 처 짐 (30 nM), 및 aPKCi (2 µ M).
  5. DD10에 KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경.
  6. DD11
    참고:이 시점에서, Nkx2.1::mCherry+ 세포는 풍부 하 게 될 태양광 발전 CIns.
    1. FACS 단계 4.6에서에서 설명 하는 동일한 프로토콜을 사용 하 여에 대 한 접시에서 세포를 분리 합니다. 나중 차별화 하루에 Nkx2.1::mCherry+ 세포를 수집 결정 경우이 단계를 무시 하십시오.
  7. 에 DD12, KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경. 에 DD14, KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경. 에 DD16, KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경. DD17에서 Nkx2.1::mCherry+ 셀 단계 4.6에서에서 설명 하는 동일한 프로토콜을 사용 하 여 수집 합니다.

6. 태양광 발전 풍부 프로토콜: "DD17 mCherry 낮은 쉬" (단계 3.7에서에서 계속)

  1. DD5, KSR:N2 (1:1) FGF-2를 포함 하는 미디어 변경 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL). DD7, 변경 포함 된 FGF-2 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL).
  2. DD9, KSR:N2 (1:1)와 함께 미디어 변경 합니다. 이 시점에서 앞으로, 아니 추가 성장 요인이 필요 하다.
    1. 계속 미디어 DD17에 셀 수확까지 2 일 마다 변경.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

이 문서에 설명 된 프로토콜 우리의 게시 프로토콜15,,1617 의 수정된 된 버전 이며, 우리의 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼-기자 mESC 선으로 사용 하기 위해 최적화 되었습니다. DD0-5, 다시 도금 DD8에서 결합 XAV 939 Wnt 억제제를 추가 하 여 우리는 어떤 점에서 모든 DAPI + 핵 문화에서의 50% 이상을 또한 Nkx2.1 표현 (그림 1A, B) 강력한 Nkx2.1 유도 달성. MCherry 및 GFP 기자 Immunohistochemistry Nkx2.1-긍정적인 immunoreactivity (그림 1A)의 영역에서 명확한 식을 보여 줍니다. FACS 네이티브 기자를 사용 하 여 라이브 셀의 표시 셀의 4 인구 명확 하 게 고립 될 수 있다: (1) GFP/mCherry 이중 부정 셀, (2) mCherry 전용 셀, (3) GFP 전용 표현 셀, 및 (4) GFP/mCherry 더블 표현 셀 ( 표현 그림 1 c). 이 라인을 사용 하 여, 창시자의 극히 DD8 9 주위 mCherry 기자 설정 하기 시작 합니다. MCherry 레벨 DD12-13 사이 피크 고 창시자 세포 주기를 종료 하 고 포스트 mitotic Lhx6::GFP + interneuron 선구자 (그림 1D) 생산으로 꾸준히 감소. 대응 하 게, Lhx6::GFP 기자 DD9-10와 봉우리 사이 켜지는 DD13-14 (그림 1D) 주위. 하지만 Lhx6::GFP 세포의 총 수 문화에서 증가 하 고, 비율 하지 않습니다, 아마 다른 계보의 확산으로 인해. 한 번 Lhx6::GFP + 기자 표현, 그것 남아 있다 감지 Lhx6은 안정적으로 성숙한 MGE 파생 대뇌 피 질의 수18,19표현 때문에 무기한. Nkx2.1 및 Lhx6 식 크게 겹치지 murine 개 내는, Nkx2.1::mCherry 및 공동 문화에 있는 세포를 표현 하는 Lhx6::GFP의 일시적인 인구는. 이것은 적어도 부분적으로 perdurance Nkx2.1 식의 정상적인 기간 넘어 mCherry 기자로 대부분 이중 표시 된 셀의 Nkx2.1 단백질 (타이슨과 앤더슨, 미 출판)의 감지 레벨을 표현 하지 않습니다. Lhx6 기자와 체리/Nkx2.1 단백질을 표현 하기 위해 계속 셀 striatal 수20수 있습니다. 그러나, 어떤 점에서 동기, 새로 포스트 mitotic 선구자 Nkx2.1::mCherry와 Lhx6::GFP는 고립 될 수 있다 약 18 h의 창 있다 우리의 라이브 이미징 연구에 따라, (Tischfield와 앤더슨, 고 참조 Tischfield 외. 17). 따라서, 프로토콜 중 Nkx2.1::mCherry 및 Lhx6::GFP 언제 든 지 두 배 긍정적인 세포를 수집 하 여 그것은 서로 약 18 h 내 세포 주기 종료 주로 세포의 인구를 얻을 수. 이 함수는 Nkx2.1::mCherry 및 Lhx6::GFP 대조-만 셀, 각각, 다양 한 생일의 창시자와 선구자, 다양 한 종류를 대표 하는 표현.

Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼-기자 mESC 선 SST 운명 수에 대 한 풍부 하 게 사용할 수 있습니다. 일반적으로, 문화에 쉬를 추가 하 고 수집 GFP + 셀 (예를 들어, DD12) 분화에 이전 시간 지점에서 SST 하위 유형에 대 한 풍요롭게. 우리의 관측을 바탕으로, 우리가 하지 본 쉬 DD5 또는 DD8 추가 여부에 따라 SST:PV 비율에서 상당한 차이 (데이터 표시 되지 않음). 쉬를 추가 하 여 (50 ng/mL)를 DD8 12 다음 GFP 전용 표현 세포 이식, 우리 얻을 SST:PV CIns (그림 2A)15,17의 7:1 비율 평균. 우리의 듀얼 기자 mESC 라인을 사용 하 여 interneuron 운명에 쉬와 시간 문화에의 효과에 더 자세히 참조 타이슨 외. 15

태양광 운명 CIns에 대 한 풍부 하 쉬 문화 미디어에서 생략 한다. 노트, mitotic 창시자21, Nkx2.1 식을 유지 하기 위해 신호 쉬의 요구와 일치 쉬 신호에 있는 이러한 문화 exogenous 쉬 쉬 적 cyclopamine 제거 신호 이후 추가 없이 Nkx2.1 식15. 그러나, 셀 DD8에 다시 도금 인 경우 내 생이 쉬는 제거, 같은 그 SAG (30 nM) DD8-10 Nkx2.1 식 CIns의 생산을 유지 하기 위해 미디어에 추가 되어야 한다. 우리의 이전 연구는 문화 조건에서 쉬를 원천으로 그리고 DD17에 Nkx2.1::mCherry+ 세포에 대 한 정렬, PV:SST 세포의 ~2.6:1 비율 얻을 수 있었습니다 (그림 2B)15. SST 달리는 이전 단계에서와 외 인 쉬이 잇의 농축, 하위 문화에 기간 증가 하 고 PV 하위15풍요롭게 하는 외 인 쉬이 잇의 부족. 더 최근의 연구에서 우리는 크게 우리의 "MGE" 프로토콜에 적용 되는 aPKCi 증가  D217, 중간 뿌리 세포22의 마커를 나타내는 Nkx2.1::mCherry 창시자의 분수를 발견. SST 창시자23실의 표면 방사형 창시자에서 주로 발생 하는 반면이 프로토콜 변형 태양광 표현 CIns 중간 창시자에서 주로 발생 하는 우리의 발견에 근거 했다. 우리는 그 때 정렬 및 신생아 마우스 피 질에 이식,이 창시자는 크게 편견 PV 하위 생산을 발견 했다. DD8 11에서 aPKCi를 추가 하 고 다음 Nkx2.1::mCherry 셀 정렬, PV:SST 하위 (그림 2C)17의 5.8:1 비율을 얻을 수 있었습니다. PV 하위 유형에 대 한 더 풍요롭게, 우리 또한 DD8 17에서 aPCKi의 면 전에 서 성장 하는 Nkx2.1::mCherry 세포 절연 되어 있습니다. 그러나, 우리는 우리가 PV 하위 생성 (그림 2D)의 백분율에 한계 증가도 불구 하 고 DD11에 얻을 수 있었다 넘어 PV:SST 비율에 있는 증가 달성 하지 않았다. 각 이러한 프로토콜에 대 한 순서도 그림 3에 포함 되어 있습니다. 마우스의 Immunostaining 머리 30 일 후 이식 안티-태양광, 안티-SST, 및 안티-GFP (Lhx6::GFP + 셀의 식별 향상)을 항 체 Lhx6::GFP + 셀 PV와 SST 식의 패턴으로 성숙한 형태학 상 특징을 전시 보여줍니다 가까운 그들의 비보에 대응 (그림 4 및 그림 5).

CIn 차별화 성공 표시 여부 결정에 도움, 우리 정상적인 변화 (그림 6, , 그림 7 그림 8)을 설명 하는 프로토콜의 각 단계에서 이미지의 시리즈를 준비 했습니다. 우리는 또한 실패 한 차별화 DD4에 표시 되는 모양을 보여 주는 그림을 포함 (그림 9). 일반적으로, 실패 한 차별점 Nkx2.1 식 및 Nkx2.1::mCherry 및 Lhx6::GFP 유도 약 1%의 또는 더 적은 비율의 낮은 수준 (10% 미만)를 얻을 것입니다.

Figure 1
그림 1: Nkx2.1::mCherry와 Lhx6::GFP interneuron 일어나 세대. (A) 표시 여기는 차별화 하루 12 (DD12) 문화에서 Nkx2.1, Nkx2.1::mCherry (RFP), 및 Lhx6::GFP (GFP)에 대 한 immunostaining의 대표 이미지. 참고 이러한 이미지 보기의 동일한 필드에서 채널 중복 됩니다. DAPI + 문화에 DD12에서 Nkx2.1를 나타내는 핵의 평균 비율의 부 량 (B) (n = 3 독립적인 차별점). (C) 대표 FACS 줄거리 우리의 듀얼 기자 mESC 라인을 사용 하 여 격리 될 수 있는 4 개의 다른 세포 인구를 보여주는. MCherry는 x 축에 고 y 축에는 GFP note. 따라서, 상단 오른쪽 상자 두 번 mCherry/GFP 긍정적인 셀을 나타냅니다. (D) Nkx2.1::mCherry 및 Lhx6::GFP 유도 DD6-16 mCherry 전용 표현, GFP 전용 표현, 또는 mCherry/GFP 공동 표현 문화에 있는 세포의 백분율로 표시의 시간 과정. 이러한 비율 SST 풍요롭게 프로토콜 동안 쉬 면 전에 서 성장 하는 세포에서 가져온 고 3 독립 차별점에서 평균을 나타냅니다. 오차 막대 (b) 및 (D) SEM. 규모 바 = 150 µ m (A). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 문화 조건의 조작 차동 태양광 발전에 대 한 풍요롭게-SST 운명 대 mESC 파생 대뇌 피 질의 수. (A) 비율의 PV +, SST +, 그리고 태양광 발전-SST-수 때 취득 / DD12, GFP 전용 표현 셀 쉬이 잇의 면 전에 서 성장 (50 ng/mL) DD5-12에서 신생아 피 질에 이식 되 고 30 일 후 이식 분석. (B) 비율의 PV +, SST +, 그리고 태양광 발전-SST-수 얻을 때 DD17, 성장 없이 보충 쉬는 신생아 피 질에 이식 하 고 30 일을 분석 후 이식 세포 mCherry 전용 표현 /. (C) 비율의 PV +, SST +, 그리고 태양광 발전-SST-수 때 취득 / DD11, mCherry 전용 표현 셀 SAG의 성장 (30 nM; DD8-10)와 aPKCi (2 µ M; DD8-11) 신생아 피 질에 이식 하 고 30 일 후 이식 분석. (D) 비율의 PV +, SST +, 그리고 태양광 발전-SST-수 때 취득 / DD17, mCherry 전용 표현 셀 SAG의 성장 (30 nM) DD8 10 DD8 17에서 aPKCi (2 µ M)에서 신생아 피 질에 이식 되 고 30 일 분석 후 이식입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3:이 연구에서 설명 된 다른 PV 및 SST 풍요롭게 프로토콜을 설명 하는 순서도. (A) 모든 프로토콜에 대 한 최대 선도 단계 DD0-5를 포함 하 여 차별화의 시작 같습니다. 모든 세포는 embryoid 몸 DD0-3에서 N2:KSR (1:1)에서 BMP 억제제 LDN-193189와 Wnt 억제제 XAV 939 보충로. DD3에 셀은 "착륙" LDN-193189, XAV-939, 그리고 바위 억제제 Y-27632 N2:KSR (1:1). SST 하위에 대 한 풍부 하 쉬 DD5-12에서 추가 됩니다. 이후, 우리의 경험, DD8 대 DD5에서 쉬이 잇의 추가 이후 크게 영향을 주지 않습니다 생성 PV:SST의 비율 또는 쉬 DD8 12에서 추가 됩니다. 프로토콜의 이전 버전 (타이슨 외를 참조 하십시오. 15) DD8에 다시 도금 단계를 포함 하지 않았다, 대신 DD5에 세 쉬와 미디어를 보충. 이 프로토콜은 나중 쉬, 어느 것도 크게 PV:SST 비율 변경의 도입과 함께 DD8에 다시 도금 단계 통합 변경 됩니다. 이 "높은-쉬" 프로토콜에서 Lhx6::GFP + 셀 세 쉬의 성장 FACS 다운스트림 응용 프로그램에 사용 하기 위해 DD12에 고립 된 있습니다. (B) "낮은-쉬" PV 프로토콜에 대 한 외 인 쉬로 DD8에 다시 도금 단계는 생략 됩니다. 대신, Nkx2.1::mCherry+ 셀은 FACS 다운스트림 응용 프로그램에 사용 하기 위해 DD17에 고립. (C)에 "+ aPKCi" PV 프로토콜, aPKCi DD8-10에서 SAG 함께 추가 되 고만 aPKCi 이후 DD10에서 추가 됩니다. DD11 또는 DD17, Nkx2.1::mCherry 셀 FACS 다운스트림 응용 프로그램에 사용 하기 위해 절연 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: Lhx6::GFP + 셀 30 일 후 이식 신생아 피 질에 있는 PV와 SST immunostaining. (A)는 SST-표현, Lhx6::GFP + 셀 30 일 후 이식 신생아 피 질으로의 고성능 이미지. 4 이미지의 각 열 내는 3 채널 병합 된 이미지 하단에 Lhx6::GFP, 태양광 발전, 그리고 SST 식의 단일 채널 이미지입니다. 상단 패널에서와 같이,이 Lhx6::GFP + 신경 여러 프로세스 성숙 형태학의 암시 elaborates. (B) 고성능 이미지 두 PV 표현, Lhx6::GFP + 셀 30 일 후 이식. (C) 고성능 이미지의 SST-/ PV-더블, Lhx6::GFP + 셀. 이 셀 여러 프로세스 완전 한 차별화과 대뇌 피 질의 통합 elaborates, 비록이 셀은 명확 하 게 표현 하지 PV 또는 SST. 참고 Lhx6::GFP + 셀에 인접 한 PV + 핵입니다 하지만 그것은 중복 되지 않습니다. 스케일 바 50 µ m (A-C) =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 중간 및 낮은 전원 태양광, SST, 및 Lhx6::GFP 단백질 식의 이미지 30 일 신생아 피 질에 포스트 이식. (A) 마우스 피 질 포함 30 Lhx6::GFP + 셀 30 일 후 이식의 영역의 중간 전력 이미지. 이 세포는 PV 프로토콜 (+ DD8-11;에서 aPKCi를 사용 하 여 성장 했다 FACS 분리 하 고 이식 DD11에 Nkx2.1::mCherry+). 여기 본 30 셀 16 태양광 발전을 표현 하 고 4 익스프레스 SST, 10 익스프레스 PV도 SST. (B) 저전력 이미지, 포함 된 마우스 피 질 영역의 잘 차별화 된 Lhx6::GFP + 셀 30 일 후 이식. Lhx6::GFP + 프로세스 피 질을 통해 전기가 풍부한 note 또한 가끔 셀 통합 하 고 정교한 프로세스 성숙 형 일치 나타나는 해 마에 발견 된다. 눈금 막대 = 50 µ m (A); 550 µ m (B) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 마우스 미 발달 섬유 아 세포 급지대 레이어 및 미 분화 줄기 세포의 정상적인 모습. (A) 표시 여기는 4 X 10 X 배율 대물 이미지 우리의 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 급지대의 전형적인 모습 도금 후 24 h 레이어 시연. (B) 여기는 우리의 마우스의 전형적인 모습 배아 줄기 세포 (mESCs) MEF 지류에 도금 후에 2 일 표시. 식민지는 밝은 경계 있고, 타원형 또는 ovoid 모양에 참고. 식민지가 밝은 경계를 잃게 하거나 보낼 밖으로 계획 하기 시작, 이들은 표시 셀 차별화 될 수 있습니다. (C) 표시 여기는 다시 젤라틴 코팅 접시에 차별화 하기 MEF 지류를 희석 하기 위해 도금 후 mESCs 1, 2 일. 참고 줄기 세포 젤라틴에 48 h 후 상당히 확장 하 고 밝은 경계와 난 형 외관을 다시 시작 합니다. 눈금 막대 = 4 X 100 µ m와 10 X 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 차별화 일 1-7에 마우스 배아 줄기 세포의 모습. (A) 부동, 줄기 세포를 볼 수 있습니다 후에 1 일 형성 작은 embryoid 몸 (EBs). 하루 2는 EBs는 상당히 성장 했다. 참고 일부 EBs 함께 붙어 있고 세포의 더 큰 클러스터를 형성 합니다. 우리는이 감 별 법에 부정적인 영향을 발견 하지 않습니다. 3 일 후, EBs도 더 큰 성장 하 고 일부는 더 이상 그들을 통해 빛을 전송 합니다. 그것은 배경에서 셀 파편을 보고 정상입니다. (B) 표시 여기 줄기 세포 분화 날 4에 착륙 후 24 h (DD4) 이다. 셀의 밀도 note 많은 차별을 계속 증가할 것 이다 작은 프로세스를 확장 하기 시작 했습니다. 참고 여기 있는 셀도 작은 검은 점 들에 걸쳐 확산과 색깔. 셀 반짝 또는 동종 나타나는 경우는 탈 분화의 표시 이다. (C)에 의해 DD5, 셀 격 증 및 신경 근 엽 형성을 계속 했다. 많은 세포는 길고, 얇은 프로세스를 확대 했습니다. (D)에 의해 DD7 셀 confluent 이어야 한다. 그것은 큰, 평면, multinucleated 셀 (아마도 衣 또는 glial 세포) 신경 창시자의 계층 내에서 순환 제도 생성 하는 어떤 점에서 "스위스 치즈" 패턴을 보고 정상. 때때로 때 셀 밀도 정상 보다 높은,이 "스위스 치즈" 패턴이 않습니다 하지 개발 중간 이미지와 같이. 따라 차별화,이 신경 유도 영향을 미칠 수 있습니다. 4 배속과 10 배 배율을 나타냅니다. 눈금 막대 = 4 X 100 µ m와 10 X 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: 9 14 일 분화의 모습. (A) 단일 셀 다시 도금 후에 1 일 구상 될 수 있다. 전형적인 신경 창시자의 그들의 바이 폴라 모양을 note합니다 문화는 몇 가지 다른 유형과 침투 셀 균질 성. 밀도이 단계에 적합 합니다. (B)에 의해 DD11, 세포를 단층으로 성장 했다. 차별화, 큰 초기 단계와 유사한 "달걀 모양의" 다중 nucleated 세포 볼 수 있습니다 걸쳐 산재. (C)에 의해 DD13 세포 증식을 계속 했다. 그들은 지금 형성 하는 작은 고 분 볼 수 있습니다. 많은 "달걀 같은" 셀은 통해 여전히 존재 한다. 이 시점에서 앞으로, 문화 더 큰 성장 하는 고 분을 제외 하 고 몇 가지 변경 내용만 표시 됩니다. 4 X, 10Xx, 20 X 배율을 나타냅니다. 눈금 막대 100 µ m 4 X 10 X 사진, 및 눈금 막대 = = 20 X 사진에서 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9: 하루에 4 실패 한 차별화의 모습. DD4 그것 프로토콜의 가장 어려운 단계 중 하나를 따릅니다 때문에 감 별 법의 성공 평가 측면에서 중요 하다: DD3에 상륙. DD4, 여 셀 24 h embryoid 시체에서 해리 되 고 후 복구를 했다. 여기 볼 수 있는, 세포의 대부분은 반짝하 고 동질적인 게재. 통해 interspersed 있습니다 가끔 나타나는 정상, 작은 검은 점 들에 걸쳐 확산과 어두운 외관을 데. 또한, 대형 평면 세포 (하단 왼쪽된 패널에서 볼 수 있습니다)로 탈 분화의 지표. 하단 오른쪽 패널에서 셀 (노란색 화살표)의 적어도 3 개의 작은 그룹 결함이 차별화, 불완전 한 EB 분리, 또는 세포 배양 접시의 표면에 불 쌍 한 준수를 나타내는 작은 embryoid 몸으로 나타납니다. 이러한 이미지는 달리 건강 하 고, 정상적인 그림 7B, 묘사는에 표시 된 셀 DD4 게재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 메서드는 J1 파생 된 mESCs (SCRC-1010) 패턴에 매우 효과적인, 우리 다른 mESC 라인과 클론 분리 변수 성공을 경험 했다. 예를 들어, Foxg1::venus mESCs (EB3 파생; Danjo 외. 이 프로토콜을 Foxg1 DD12에 의해 유도 제대로 13) 응답은 일반적으로 1-2%의 순서. 이유로 우리가 완전히 이해 하지 않는 또 다른 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 클론 (나 JQ59) (JQ27 불리)이이 프로토콜에서 설명 하는 라인으로 동시에 고립 되었던 생산 1% 미만 Nkx2.1 표현 세포 성장 하는 때 동일한 조건. 상위 라인 (J1; 그러나 ATCC SCRC-1010),,이 프로토콜에 잘 응답 하 고 그림 1B에서 표시 된 것과 유사한 DD12에 Nkx2.1 표현 세포의 백분율을 생성. 필요한 경우 XAV 939와 쉬/SAG의 농도 줄 단위로 분화 조건을 최적화 하기 위해 조정할 수 있습니다. 그러나, 우리의 경험 MGE 같은 창시자에 다른 mESC 라인을 차별화 하는이 프로토콜을 사용 하 여 제한 됩니다.

우리의 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 mESC 라인에 관한 모든 Nkx2.1 + 셀 mCherry 익스프레스. Nkx2.1 단백질을 표현 하는 거의 모든 mCherry + 셀, 비록 기자 식 Nkx2.1 단백질 표정, 특히 차별화 (DD7-9)의 초기 단계 동안에 뒤에 lags. Nkx2.1 + mCherry을 꾸준히 표현 하는 셀의 일부는 분화의 과정 전반에 걸쳐 증가 합니다. 피크 레벨 (~ DD12-14) mCherry 창시자17을 표현 하는 모든 Nkx2.1의 약 30%에 표시 됩니다. 또한, 드라이브 mCherry 표현 하는 데 사용 같은 세균성 인공적인 염색체 유전자 변형 쥐24의 Nkx2.1 식 도메인 Cre recombinase 운전 사용 되었습니다. 이 마우스에 Cre 식 등 대부분 지역의 MGE의 Nkx2.1 표현 하는 세포 내에서 약한 되었고 운명-매핑이이 마우스와 함께이 지역25에서 크게 생성 될 것으로 알려진 아래의 레이블 SST 표현 CIns에 등장 26,,2728. 그러나, 이러한 불일치에도 불구 하 고 GFP 또는 mCherry 표현 세포의 수백만 수 있습니다 격리 FACS의 몇 시간 밖에.

이 기술의 두 가지 주요 이점이 있다. 첫째, 우리의 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼-기자 mESC 라인와 결합 하면, 그것은 PV 또는 SST 운명 대뇌 피 질의 interneuron 하위 될 농축 interneuron 선구자의 많은 수를 얻을 수 있습니다. 두 번째 주요 장점은 interneuron 운명 세포를 얻을 수 있습니다의 많은 수는 상대적으로 완화입니다. 몇 가지 다른 수정된 EB 기법 MGE 창시자와 뉴런을 차별화 하는 존재, 이러한 프로토콜은 일반적으로 Dkk113,,1429같은 Wnt 억제 분자의 사용에 의존 합니다. 우리 Foxg1과 Nkx2.1 식15에 의해 입증으로 Wnt 억제제 XAV 939 pallidal telencephalic 창시자의 생성을 크게 향상 시킵니다 발견 했다.

앞에서 설명 했 듯이, 다른 여러 가지 방법을 MGE 같은 창시자를 생성 하는 mESCs에서 존재 합니다. 와타나베 외. 14 먼저 뒤에 다시 부착 표면에 도금 하 여 혈 청 무료 정지 문화 방법을 개발 하 여 mESCs에서 telencephalic 차별화의 분야를 개척 했습니다. 그들은 그는 Wnt 및 Nodal 길 항 제, Dkk1 및 LeftyA, 각각, 효율적으로 몰고 mESCs 초기 neuroectodermal 계보13에 발견. 적용 하 여 쉬가이 문화에, 그들은 그 사이 있는 모든 셀의 5-15% 공동 표현된 Nkx2.1/Foxg1 문화 관찰 하 고 MGE 같은 창시자13로 간주 될 수 있다. 그러나, 많은 연구 서를 위한 토대를 하는 동안이 연구 하지 않았습니다 MGE 창시자를 격리 하거나 특정 CIn 하위에 대 한 풍부 하는 방법.

몇 년 후, Danjo 외. 13 mESC 파생 된 복 부 telencephalic 조직의 subregional 규격을 달성 하기 위해 다양 한 성장 인자, 특정 쉬에서의 시간된 관리와 함께에서 같은 혈 청 무료 정지 문화 방법을 사용. Foxg1::venus 기자 라인을 사용 하 여, 그들은 그 쉬 관리에서에서 발견 DD3-12 후 Foxg1::venus 기자13를 표현 하는 문화에서 모든 셀의 45-68% 사이 Dkk1 치료 결과. Foxg1::venus + 인구, 내 세포의 약 32% Nkx2.113표현. SAG 대 쉬를 대체 하 고 Fgf8를 추가, 그들은 더 약 4113Foxg1::venus + 인구 내의 Nkx2.1 창시자의 분수를 강화. 운명에 대 한 분석 때 약 17 %SST, PV는 21%, 18 %NPY, 및 8 %calretinin 하위13이 세포 생산. 그러나,이 연구 MGE 파생 CIn 운명을 대 CGE를 지정 하는 방법을 설명 하는 동안 선택적으로 태양광 또는 SST 하위에 대 한 풍부 하 게 하는 방법을 설명 하지 않았다.

다음 해, Cambray 외. 11 사용 혈 청 무료 단층 메서드 DD5에 다시 도금 마우스 및 인간의 ESCs에서 파생 된 telencephalic 신경 선구자의 정체성 분화에 activin의 효과 공부 하 고. 비록이 연구 그들의 프로토콜에서 생성 된 Nkx2.1 셀의 비율을 보고 하지 않았다, 그들은 문화에 있는 세포의 약 54% 공동 Nestin/Foxg1 DD2 (5 일 혈 청 자유로운 미디어 다음 추가 2 일 문화의 성장에 표현 보고 다시 도금) 후11. 그들은 또한 그 activin의 추가 함께 셀 ~ 55% 공동 표현 nestin 및 이러한 셀 꼬리 절 예 하 모양의 세포, calretinin을 표현 하는 대뇌 피 질의 수의 대부분을 생산 수 있습니다 나타내는 나타내는 CouptfII 보고 11. 실제로, 문화 (13 일 전반적인)에서 8 일에 의해 셀의 39% 공동 표현 하는 calretinin/BIII-tubulin, 동안 셀의 59% 공동 GABA/BIII-tubulin11익스프레스를 발견을 발견 했다. 이 연구는 태양광 또는 SST의 생산을 검사 하지 않았다.

다시 메서드를 사용 하 수정 EB, 첸 외. 12 그 MGE 관련 증강 요소를 따라 줄기 세포 파생 MGE 같은 셀12정화 사용 수를 설명 했다. 이 연구에서 그들은 Lhx6::GFP 기자 선;를 사용 하 여 MGE 같은 창시자에 mESCs의 감독된 차별점 중 다른 문화 조건의 효과 비교 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼-기자 선이이 원고에 설명 된에 대 한 상위 라인으로 봉사는 같은 라인. 그들은 그 문화에 Dkk1를 추가 하 여 DD0-3, 조건 따라 SAG의 추가 의해의 upwards 나타났다 ~ 문화에 있는 모든 셀의 10% 표현 Lhx6::GFP12. 그들은 또한 동일한 프로토콜, Danjo 그 외 여러분 에 의해 설명 된 Foxg1::venus 줄에 적용 발견 12, 귀착되 었 다 Foxg1::venus 기자를 표현 하는 모든 셀의 약 37%입니다. Lhx6::GFP 세포 이식 비보에있을 때, CIn 하위 마커의 다음과 같은 평균 비율 관찰 되었다: PV는 22%, 58 %SST, 및 16% NPY12.

더 최근에, 다른 그룹 직접 지정 CIns을 혈통 정의 녹음 방송 요인의 강제 식 사용. 아마도 이것의 첫 번째 데모가 했다 페트 로스 외. 10 Ainv15 mESCs Lhx6::GFP 세균 인공 염색체를 포함 하도록 수정 된에서 Nkx2.1 식 운전 doxycycline 유도할 수 있는 발기인을 사용. 이 연구는 문화 조건이 비슷한 XAV 93910의 추가 하지 않고 현재 원고에 설명 된 사용. 그러나, 제대로 이해 이유로, Lhx6::GFP + 셀의 낮은 비율 J1 Lhx6::GFP 부모 선이 원고10에 설명 된 사용 하는 경우에 비해 동일한 차별화 조건 하에서 관찰 되었다. Foxg1의 달성에 불구 하 고 식 (총 % 알 수 없는), Nkx2.1의 총 수에 적당 한 감소 했다 없이 세포 Lhx6::GFP 기자10을 표현 하는 모든 셀의 2% 보다 큰. 이 연구는 ESC 라인 원래 프로토콜을 개발 하는 데 사용 된 다른 분화 프로토콜을 적용 하려고 할 때 그 연구자 얼굴 도전과 다양 한 ESC 라인 사이 존재 하는 고유의 차이 강조 표시 합니다.

사용 하 여 우아한 접근, Au 외. 9 특정 하위 와타나베 연구진이 개발한 같은 복 부 telencephalic 차별화 패러다임을 사용 하 여 대뇌 피 질의 수의 생성 하 녹음 방송 요인의 순차 강제 식 사용 14 그들은 Foxg1 +, Nkx2.1 + 및 Olig2 + 선구자에서 문화 생산의 정확한 백분율을 보고 하지 않으면, 하는 동안 그들은 국가 문화에 있는 모든 셀의 약 50 %GABAergic 신경9로 분화. 11 일 후 차별화에서 EBs는 해리 되었고9E13.5 MGE 호스트 배아 이식. 작은 비율의 (1% 미만) 피 질, 그들은 그들의 Dlx5/6-eGFP 기자에 의해 발견 되었다 고 운명9에 대 한 분석으로 MGE에서 마이그레이션. 저자는 PV, SST, CGE와 같은 운명을 따라 그들의 선택한 강제 유도 전략9의 비율의 다양 한 관찰. 흥미롭게도, 녹음 방송 요인 Lmo3의 표현, 그들은 관찰 평균 약 57% 태양광, 21 %SST, CGE 파생 하위 15% (SST-/ reelin + 또는 VIP-유일한 +)9. 관찰 SST의 큰 비율 약 32 %SST, 생산과 35% 태양광 25 %CGE 파생 하위9는 Nkx2.1/Dlx2 프 라인을 사용 하 여 얻은 했다.

2015 년, Colasante 외. 30 GAD67 GFP 기자 쥐에서 섬유 아 세포 내에서 5 개의 녹음 방송 요인 (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5, 및 Lhx6)의 강제 식 GABAergic 같은 CIns로 모든 셀의 15%를 개조 했다. 놀랍게도, 이러한 세포의 약 90%에 갔다 SST30을 표현 하는 드문 셀만 PV, 표현. 이 메서드는 mESCs에 적용 되지, 있지만 사용 되었다 인간의 Ipsc 함께 어디 GABAergic 정체성30채택 하는 모든 셀의 약 30% 견적 되었다.

그림 2에서 같이 태양광 또는 SST CIns의 풍부한 인구를 생성 하는 여러 방법이 있다. DD17 프로토콜을 통해 PV 프로토콜 활용 aPKCi의 주요 이점은 셀 하나 큰 수 분리, 세포 생존, 및 문화의 기간. 우리는 그림 1에 DD17 유도 수준에 대 한 데이터를 표시 하지 않습니다, 비록 대략 두번 많은 mCherry + 셀에 있다 DD11 DD17에 있다 (데이터 표시 되지 않음). 이식에 대 한 셀 때, 우리는 더 많은 수의를 찾을 시작 셀 (아래 참조)은 도움이, 때문에 대략 세포의 30 ~ 50% 주입을 위해 그들을 집중 하는 과정에서 손실. 또한, 세포의 큰 번호는 셀 얼음에 있는 시간의 양을 제한 하 고 전체 비용을 낮추고 FACS 시간 단축으로 얻을 수 있습니다. 아마 체리 + 셀의 더 높은 백분율 때문에 창시자, 문화 (예, DD11)의 초기 단계에서 세포 신생아 피 질으로 이식 후 DD17 세포에 비해 더 큰 생존을 전시 한다. 많은 수의 가능한 셀이 필요한 경우 예 치료 간 질, 세포 이식의 경우 더 큰 시작 인구와 더 큰 생존 하는 데 장점은 주요.

프로토콜, 따라 그림 2에서 묘사 된 대로 Lhx6::GFP + 셀의 약 25-39% 분석 30 일 후 이식 일상적인 immunohistochemistry PV 또는 SST 단백질의 감지 레벨을 표현 하지 않습니다. 일반적으로, 이러한 태양광 발전-SST-세포 표현 GABA로 Sox6, MGE 파생 대뇌 피 질의 수 (타이슨 외. 참조 마커 / 15, Tischfield 외. 17).의 태양광 발전-1% 미만 / SST-Lhx6::GFP + 셀 다른 interneuron 하위 그룹, calretinin, 등, reelin neuropeptide Y의 명시적인 마커 (데이터 표시 되지 않음). Vivo에서 운명 매핑 연구는 사이 그 표시가 비슷합니다 ~ MGE 파생 수의 15-25 %PV 또는 SST23,,2531을 표현 하지 않습니다. Nkx2.1::mCherry+ 또는 Lhx6::GFP + 세포 격리 하 쥐 대뇌 피 질의 지류에 생체 외에서에 도금, 우리는 발견 하는 ~ Lhx6::GFP + 셀 문화에 28 일 후 태양광 발전-분석의 40-70% / 긍정적인 얼룩 할 그의 대다수와 SST-, SST를 표현합니다. 태양광 발전-이 증가 / SST 세포 특히 성숙한 태양광 발전 식 또는 피더 세포에서 차선 electrophysiological 입력 경우 있을 수 있습니다 존재 vivo에서, 외부 maturational 신호의 부재로 인해 수 있습니다. 이유 일지도 모른다 무엇 이건, 우리 운명 분석 보다는 체 외에서 차별 화를 위한 신생아 피 질으로 세포를 이식 하는 선호 한다.

대부분 이식 실험에 대 한 권장 최소 두 10 cm 비 점착 조직 문화 요리 DD0에 떠 있는 N2/로켓의 10 ml에서 105 mESCs x 포함 하 각 7.5 (4 셀/10ml x 7.5; 20 mL 전체 볼륨). 함께, 두 접시 일반적으로 5.4 x 10의6 셀 사용할 수 두 치료 6 잘 조직 문화 접시 (50, 000 셀/cm2; 약 110 cm2 총)을 시드하 DD3에 EB 분리 후 8-12 x 106 셀을 얻을 것입니다. DD8, 여 각 6 잘 플레이트 수익률 약 5-7 107 셀, 250, 000 셀/cm2 (총 3 개의 6-잘 경우 107 셀 x 4.05 요구의 조밀도에 5 6 잘 플레이트를 추가 3 씨앗을 사용할 수 있는 접시 또는 5 6 잘 플레이트의 경우 107 셀 x 6.75). DD14, 여 각 6 잘 플레이트 일반적으로 1-2.5 x 106 mCherry 또는 GFP 표현 셀을 얻을 것입니다. 실험의 요구에 따라 우리 큰 이식 프로젝트에 대 한 6 x 106 mESCs 이상에 소규모 immunohistochemistry 분석 105 mESCs x 7.5의 최소를 떠내려 있다.

프로토콜의 가장 중요 한 단계는 시작 차별화 이전 만능 주 및 DD3에 방문/분리 단계에서 mESCs을 유지 하 고 있다. 셀을 제대로 유지 하 고 방문/분리 DD3에 신중 하 게 이루어집니다, 차별화 성공 일반적으로 있을 것입니다. 만 줄기 세포 건강 한 나타나고는 차별화에 대 한 사용 해야 합니다. EBs DD0-3 사이 형성 또는 여러 형성에 실패, 작은, 비대칭 바디, 차별화가 높습니다 성공 하. 또한, DD3에 EB 분리, 중 EB의 모니터링 해야 합니다 수 신중 하 게 더 이상 표시 될 때까지 비 트립 신 포함 휴대-분리 리 젠 트에 장기간된 노출을 피하기 위해 눈으로.

이 문서에 소개 된 결과 품질 제어 시 약을 사용 하 여 최적화 된 조건 하에서 얻은 했다. 참고 이후 우리는 때때로 강력한 Nkx2.1 유도, 달성 하는 어려움 및 확장, mCherry 및 GFP 기자 식으로 중요 하다. 우리의 경험을 바탕으로, 우리는 이러한 변화에 대 한 가장 가능성이 계정 FBS의 로트 다양성을 믿습니다. 따라서, 테스트는 mESCs를 유지 하기 위한 최고의 작품을 결정 하는 FBS의 다른 많은 현명 하다. 우리는 2i/LIF 시스템 (혈 청 무료 매체는 MEK 억제제 PD03259010와 GSK-3α/β 억제 물 CHIR99021를 포함)를 사용 하지 않은, 비록 혈 청 무료 mESC 조건 보다 일관 된 결과 얻을 수이 가능 하다. 그러나 우리는,, 테스트를 하지 않은이 가설 하 고 혈 청 무료 mESC 미디어 사용 MGE 같은 창시자에 mESCs의 차별화에 영향을 미치는 여부에 관해서는 데이터가 없는. 또한, 가능 하면 신선한 성장 인자를 사용 하 여 aliquoting에 의해 반드시 단일 사용에 대 한 그들. 사용자에 따라 셀 밀도 DD3에 착륙 단계 동안 특히 충분 한 세포 생존을 달성 하기 위하여 증가 해야 합니다.

수, 마이그레이션, 생존과 호스트 회로 후 이식에 통합 놀라운 능력을가지고. 간 질환 마우스 모델 및 신경 정신병 병의 다른 모델에 interneuron 선구자를 이식 하이 프로토콜을 사용 하는 등, (참조 Southwell 외. 32 와33 interneuron 셀의 리뷰를 타이슨과 앤더슨 기반 요법). 예를 들어 최근 연구 Donegan 외. 34 의 정신 분열 증 마우스 모델에 이식 PV와 SST CIns의 인구를 풍성 하 게. 그들은 PV와 SST 태양광 농축 인구 그들은 공부 했다 정신 분열 증 endophenotypes 정상화와 마우스 동작에 다른 효과 생산 하는 이식 농축 발견.

최근 몇 년 동안, PiggyBac transposon 시스템은 다양 한 시스템에에서 안정적인 표현의 transgenes 달성 하기 위해 사용 되었습니다. 우리는 신속 하 고 쉽게 만들 안정적 interneuron 개발 하는 동안 특정 유전자의 역할을 연구 하기 doxycycline 유도할 수 있는 미르 구문 표현에이 시스템을 이용 했다. 우리는 또한이 기술을 사용 하 여 만들 듀얼 기자 optogenetically에 channelrhodopsin-2 (ChR2)을 나타내는 mESC 라인 드라이브 mESC 파생 수 또는 DREADD 수용 체 기술을 설정 또는 해제 이식 세포가 한꺼번에.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는이 프로토콜을 개발 하는 데 도움에 그들의 초기 작업에 대 한 Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP 듀얼 기자 mESC 라인으로 제니퍼 타이슨, Asif Maroof 및 팀 페트 로스를 개발 하기 위한 청나라 Xu에 감사. 우리는 또한 빨리 흐름 cytometry 핵심을 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품은 NIH R01 MH066912 (SA)와 F30 MH105045-02 (DT)에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

신경 과학 문제 130 뇌 마우스 interneuron 차별화 피 세포 배양 줄기 세포 이식
대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tischfield, D. J., Anderson, S. A.… More

Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter