Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Differensiering av mus embryonale stamceller i kortikale Interneuron forløpere

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for å generere kortikale interneuron progenitors og post mitotisk interneuron forløpere fra mus embryonale stamceller med en modifisert embryoid kroppen-å-monolayer-metode. Disse progenitors/forløpere kan være brukt i vitro fluorescently sortert og transplantert inn i neonatale neocortex for å studere skjebne bestemmelse eller brukes i terapeutiske programmer.

Abstract

GABAergic kortikale interneurons er en heterogen befolkning som spiller viktige roller i regulerer produksjonen av eksitatoriske pyramidale nevroner, samt synkronisere resultatene av pyramideformet Nevron ensembler. Underskudd i interneuron funksjon har vært innblandet i en rekke nevropsykiatriske lidelser, inkludert schizofreni, autisme og epilepsi. Avledning av kortikale interneurons fra embryonale stamceller ikke bare tillater for studier av deres utvikling og funksjon, men gir innsikt i molekylær mekanismene bak patogenesen av kortikale interneuron-relaterte lidelser. Interneurons har også bemerkelsesverdig evne til å overleve, overføre og integrere vert kortikale krets etter transplantasjon, gjør dem velegnet for bruk i cellen-basert behandling. Her presenterer vi en skalerbar, svært effektiv, endret embryoid kroppen-å-monolayer metode for avledning av Nkx2.1-uttrykke interneuron progenitors og deres avkom fra mus embryonale stamceller (mESCs). Bruker en Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dobbel reporter mESC linje, Nkx2.1 progenitors eller deres Lhx6-uttrykke post mitotisk avkom kan være isolert via fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) og senere brukt i en rekke nedstrøms programmer. Vi tilbyr også metoder for å berike parvalbumin (PV) eller somatostatin (SST) interneuron undergruppene, som kan være nyttig for å studere aspekter av skjebnen bestemmelse eller til bruk i terapeutiske programmer som ville ha nytte interneuron undergruppe-beriket transplantasjoner.

Introduction

Både mus og mennesker, omtrent halvparten av alle kortikale hemmende interneurons (CIns) kommer fra en forbigående subkortikal struktur kalt mediale ganglionic eminense (MGE), hvor de neuroepithelial progenitors av CIns og andre neuronal og glial undergrupper uttrykke transkripsjon faktor Nkx2.11,2. CIn undergrupper eller subtyper defineres av kryssende morfologiske, nevrokjemiske, elektrofysiologiske og tilkobling egenskaper3,4. MGE-avledet CIns kan grupperes i hovedsakelig ikke-overlappende undergrupper basert på deres gjengivelsen av PV eller SST, uttrykk for som korrelerer med bestemte elektrofysiologiske og tilkobling tendenser5. Dysfunksjon av interneurons, særlig de i PV undergruppen, har vært innblandet i flere nevropsykiatriske lidelser og sykdommer6,7. Det overordnede målet med denne metoden er å produsere Stamcelle-avledet mitotisk progenitors og vandrende forløpere beriket for PV eller SST CIn skjebne studere kortikale interneuron biologi og bruk i cellen-basert behandling.

Vi har utviklet en skalerbar og svært effektiv metode for avledning av Nkx2.1-uttrykke interneuron progenitors og deres avkom fra mESCs. Bruker en Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dobbel reporter mESC linje8, Nkx2.1 progenitors eller deres Lhx6-uttrykke post mitotisk avkom kan isolert via FACS og senere brukt i en rekke nedstrøms programmer. Ved å manipulere en rekke signalveier, varighet av kultur og modus for neurogenesis, kan vi få millioner av fluorescently merket interneuron forløpere egnet for en rekke nedstrøms programmer.

Selv om flere andre metoder eksisterer for å generere MGE-lignende progenitors fra mESCs9,10,11,12,13,14, våre metoden, som bruker Wnt antagonist XAV-939, er spesielt effektiv til å generere Foxg1/Nkx2.1 co uttrykke telencephalic progenitors. I tillegg forbedrer muligheten til å velge for interneuron progenitors eller deres post mitotisk Lhx6-uttrykke avkom via to reporter systemet, evnen til å generere forskjellige progenitors og deres avkom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Dobbelt reporter mESC linjen beskrevet i denne protokollen er tilgjengelig på forespørsel (sande@mail.med.upenn.edu).

1. Media forberedelse

Merk: Varm alle medier 37 ° c før bruk i cellekultur.

  1. Mus embryonale Fibroblast (MEF) media (for utarbeidelse 500 mL)
    1. Legge til 50 mL fosterets bovin serum (FBS) 449 mL av Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM), og filtrere gjennom en 500 mL 0.22 µm pore filter enhet.
    2. Legg 1 mL antimikrobiell agent (50 mg/mL) etter at filtrering. Lagre media på 4 ° C for inntil 1 måned eller aliquot og butikk på ≤ 20 ° C.
  2. N2 media (for utarbeidelse 500 mL)
    1. Legge til 5 mL L-alanin-L-glutamin (100 x) og 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) til 489.5 mL DMEM: næringsstoff blanding F-12 (DMEM/F-12), og filtrere gjennom en 500 mL 0.22 µm pore filter enhet.
    2. Legge 1 mL antimikrobiell agent (50 mg/mL) og 5 mL N2 supplement-B etter filtrering. Lagre media på 4 ° C i mørket for inntil 1 måned.
  3. Serum-free oppblomstringen medium (KSR) (for utarbeidelse 500 mL)
    1. Legge til 75 mL serum-free middels supplement, 5 mL L-glutamin (100 x), 5 mL MEM ikke-essensielle aminosyrer (MEM-NEAA) (100 x), og 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) til 413.5 mL ikke-glutamin som inneholder DMEM, og filtrere gjennom en 500 mL 0.22 µm pore filter enhet.
    2. Legg 1 mL antimikrobiell agent (50 mg/mL) etter at filtrering. Lagre media på 4 ° C i opptil 1 måned.
  4. Mus embryonale stamcelleforskningen media (for utarbeidelse 500 mL)
    1. Legge til 75 mL stamcelleforskningen klasse FBS, 5 mL MEM-NEAA (100 x), 5 mL L-glutamin (100 x), og 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) til 413.5 mL ikke-glutamin som inneholder DMEM, og filtrere gjennom en 500 mL 0.22 µm pore filter enhet.
    2. Legg 1 mL antimikrobiell agent (50 mg/mL) etter at filtrering. Lagre media på 4 ° C i mørket for inntil 1 måned eller aliquot og butikk på ≤ 20 ° C.

2. dyrking mESCs

  1. Platen mitotically inaktive MEF mater celler i MEF medier på vev kultur behandlet plater på 3-4 x 104 celler/cm2. Tillat minst 12 h for dem å bosette seg i en celle kultur inkubator på 37 ° C med ≥ 95% relativ fuktighet og 5% CO2 før plating av mESCs. Hvis ikke brukt umiddelbart, erstatte MEF media hver tredje dag. Kast MEFs hvis ikke brukes innen 7 dager etter plating.
  2. Legg til mESCs (tetthet varierer fra 1-4 x 104 celler/cm2) MEF plater i mESC mediet som inneholder musen leukemi hemmende faktor (mLIF) (1000 U/mL). Inkuber cellene på 37 ° C med ≥ 95% relativ fuktighet og 5% CO2.
  3. Passasje mESCs bruker trypsin-EDTA (0,05% trypsin) (1:5-1:10) når parabolen blir ~ 70-80% confluent eller hvis koloniene begynner å røre. Dette vanligvis oppstår hver 2 dager, men kan ta opptil 4 eller 5 dager avhengig av første plating tetthet.
  4. Opprettholde mESCs på et MEF mater lag i mESC medium å holde pluripotency.
  5. Før du starter differensiering, passasje cellene minst en gang på gelatin belagt plater uten MEFs å fortynne ut av MEFs.
    1. Forberede gelatin belagt plater ved å legge til 0,1% gelatin i fosfat bufret saltvann (PBS) med Ca2 +/Mg2 + til en vev kultur behandlet rett og forlate ved 37 ° C i minst 1 h. Plate 1,5-2 x 106 celler/10 cm plate (2.7-3.6 x 104 celler/cm2) og at cellene å utvide for 2 dager før begynnelsen differensiering.

3. skille mESCs mot MGE-lignende Telencephalic Progenitors

  1. Differensiering dag (DD) 0 = "flyter celler"
    1. Etter at mESCs har vokst gelatin belagt plater for 2 dager, Sug opp media og vask cellene gang med PBS uten Ca2 +/Mg2 +. Legg nok trypsin-EDTA (0,05% trypsin) dekker overflaten av platen (vanligvis 4 mL trypsin-EDTA for en 10 cm vev kultur parabol) og plasserer cellene tilbake i inkubator på 37 ° C med ≥95% relativ fuktighet og 5% CO2 for 4 min.
    2. Etter 4 min, slukke trypsin-EDTA 2 ganger volumet med mESC media. Overføre cellene til en passende størrelse sentrifuge rør og sentrifuge cellene på 200 x g i 5 min. Etter 5 min, Fjern røret og Sug opp media uten å forstyrre pellet. Resuspend pellets i 1 mL KSR:N2 medier (1:1) inneholder den BMP inhibitor LDN-193189 (250 nM) og den Wnt inhibitor XAV-939 (10 µM).
    3. Måle celle konsentrasjonen med en hemocytometer eller automatisert celle teller. Starte vokse celler som embryoid organer (EBs) ved å legge til 75 000 celler/mL i KSR:N2 medier (1:1) som inneholder LDN-193189 (250 nM) og XAV-939 (10 µM) i ikke-tilhenger vev kultur retter. Inkuber cellene på 37 ° C med ≥ 95% relativ fuktighet og 5% CO2.
  2. På DD1, forberede for celle "landing" av belegg vev kultur behandlet retter med poly-L-lysine (10 µg/mL i PBS med Ca2 +/Mg2 +) natten (O/N) på 37 ° C med ≥ 95% relativ fuktighet eller minst 1 time.
  3. På DD2, Sug opp poly-L-lysine og pels platene med laminin (10 µg/mL i PBS med Ca2 +/Mg2 +) O/N på 37 ° C med ≥ 95% relativ fuktighet.
    Merk: Mens O/N er optimal, så lite som 2 h kan være tilstrekkelig. Hvis platene ikke brukes av neste dag, Sug opp laminin, erstatte med PBS uten Ca2 +/Mg2 +og lagre på 4 ° C 2 uker.
  4. DD3 ("land celler")
    1. Før du starter EB dissosiasjon, Sug opp laminin og la platene til helt tørt i vev kultur hette. Ikke bruk plater som skinnende eller synlig våt. Overføre EBs med medier i en 15 mL tube og sentrifuger i 3-4 min 15 x g eller til EBs har pelleted.
  5. Sug opp media og legge 3 mL celle avdeling løsning som inneholder DNase (2 U/mL) og ruge på 37 ° C med ≥ 95% relativ fuktighet og 5% CO2 i 15 min. forsiktig sveip røret hver 3 minutter til hjelp i EB dissosiasjon.
  6. Når EBs er ikke lenger synlig eller 15 min har gått, legge 6 mL KSR:N2 (1:1) som inneholder DNase (1 U/mL) og sentrifuge for 5 min 200 x g.
  7. Plate cellene i KSR:N2 (1:1) som inneholder LDN-193189 (250 nM), XAV-939 (10 µM), og den ROCK inhibitor Y-27632 (10 µM) på 4,5-5 x 104 celler/cm2.

4. SST-berikende protokollen: "DD12 GFP høy soniske pinnsvin (SSH)" (fortsettelse fra trinn 3.7)

  1. DD5, endre media med KSR:N2 (1:1) som inneholder FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), og SSH (50 ng/mL).
  2. Forberede vev kultur plater re plating på dag 8 (trinn 4.4) bruke instruksjonene i trinn 3.2 3,3.
  3. DD7, endre media med KSR:N2 (1:1) som inneholder FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), og SSH (50 ng/mL).
  4. På DD8, nytt plate cellene.
    Merk: Dette trinnet er ikke nødvendig, nytt plating cellene kan redusere tidlig-differensiert, uønskede celletyper. Nytt plating også bryter opp baller av celler som gjør nedstrøms immunohistochemical analyser vanskelig, og øker effektiviteten av FACS på senere tidspunkt.
    1. Nytt plate celler, koble cellene fra platen med trypsin-EDTA (0,05% trypsin) i 5 min på 37 ° C med ≥95% relativ fuktighet og 5% CO2. Slukke trypsin-EDTA 2 ganger volumet med KSR:N2 og sentrifuge 200 x g for 5 min. filtrerer cellene til en 40 µm filter tube å fjerne alle klumper. Nytt plate cellene på 250.000 celler/cm2 i N2/KSR (1:1) som inneholder FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), og Y-27632 (10 µM) med SSH (50 ng/mL).
      Merk: Hvis i stedet vedtaket er gjort ikke til nytt plate cellene i DD8, endre media med KSR:N2 som inneholder SSH (50 ng/mL) hver 2 dager fra DD7 til DD12 og legge IGF-1 (20 ng/mL) og FGF-2 (10 ng/mL) til DD9.
  5. DD10, endre media med KSR:N2 som inneholder SSH (50 ng/mL).
  6. På DD12, for å få celler som er beriket for SST subtyper, bruke FACS isolere Lhx6::GFP-bare uttrykke celler.
    1. Hvis du vil koble cellene, bruk en ikke-trypsin inneholder celle-dissosiasjon reagens i stedet for trypsin-EDTA. Vask celler når med PBS uten Ca2 +/Mg2 +. Legge til forvarmes ikke-trypsin inneholder celle-dissosiasjon reagens som inneholder DNase (2 U/mL) til cellene. Plass dem i kuvøse på 37 ° C med ≥95% relativ fuktighet og 5% CO2 i 10-30 min eller til cellene har frittliggende. Forsiktig Tapp plater hver 5 min hjelp dissosiasjon.
      Merk: For DD11-12 kulturer, bare 10-15 minutter være nødvendig. For DD15-16 kulturer, kan 30 min eller mer være nødvendig for komplett dissosiasjon.
    2. Når cellene har helt løftet av platen, videre til FACS isolasjon ved hjelp av standardprotokoller eller celler i andre nedstrøms analyser.

5. PV-berikende protokollen: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (fortsettelse fra trinn 3.7)

  1. DD5, endre media med KSR:N2 (1:1) som inneholder FGF-2 (10 ng/mL) og IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Forberede vev kultur plater re plating på DD8 (trinn 4.4) ved hjelp av instruksjonene angitt i trinn 3.2 3,3.
  3. DD7, endre media med KSR:N2 (1:1) som inneholder FGF-2 (10 ng/mL) og IGF-1 (20 ng/mL).
  4. På DD8, nytt plate cellene som beskrevet i trinn 4.4 med følgende unntak: når nytt plating cellene, erstatte SHH med smoothened Agonistiske (SAG; 30 nM) og legge atypisk PKC hemmer (aPKCi, 2 µM). Til sammen re plating media er nå N2/KSR (1:1) inneholder FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM), og aPKCi (2 µM).
  5. DD10, endre media med KSR:N2 som inneholder aPKCi (2 µM).
  6. DD11
    Merk: på dette punktet Nkx2.1::mCherry+ celler er beriket for å bli PV CIns.
    1. Koble cellene fra platen for FACS bruke samme protokoll i trinn 4.6. Hvis vedtaket er gjort for å samle Nkx2.1::mCherry+ celler på døgnet for senere differensiering, se bort fra dette trinnet.
  7. DD12, endre media med KSR:N2 som inneholder aPKCi (2 µM). DD14, endre media med KSR:N2 som inneholder aPKCi (2 µM). DD16, endre media med KSR:N2 som inneholder aPKCi (2 µM). På DD17, samle Nkx2.1::mCherry+ cellene med samme protokoll i trinn 4.6.

6. PV-berikende protokollen: "DD17 mCherry lav SSH" (fortsettelse fra trinn 3.7)

  1. DD5, endre media med KSR:N2 (1:1) som inneholder FGF-2 (10 ng/mL) og IGF-1 (20 ng/mL). DD7, endre media med KSR:N2 (1:1) som inneholder FGF-2 (10 ng/mL) og IGF-1 (20 ng/mL).
  2. DD9, endre media med KSR:N2 (1:1). Fra dette punktet og framover er ingen ytterligere vekst faktorer nødvendig.
    1. Fortsette å endre media hver 2 dager til høsting cellene i DD17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen beskrevet i denne hvitboken er en modifisert versjon av våre publiserte protokoller15,16,17 og er optimalisert for bruk med vår Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC linje. Ved å legge den Wnt inhibitor XAV-939 fra DD0-5, kombinert med nytt plating på DD8, oppnå vi robust Nkx2.1 induksjon, der opp 50% av alle DAPI + kjerner i kultur også Nkx2.1 uttrykker (figur 1A, B). Immunohistochemistry for mCherry og GFP journalister viser klart uttrykk i regioner i Nkx2.1-positive immunoreactivity (figur 1A). FACS levende celler ved hjelp av innfødte reporteren viser at fire populasjoner av celler kan isoleres klart: (1) GFP/mCherry dobbel negativ celler, (2) mCherry bare uttrykke celler, (3) GFP bare uttrykke celler og (4) GFP/mCherry dobbel-uttrykke celler ( Figur 1 c). Bruker denne linjen, begynner en liten brøkdel av progenitors å slå på mCherry reporteren rundt DD8-9. De mCherry nivåene topp mellom DD12-13 og deretter avta jevnt som progenitors avslutte cellen syklus og produsere etter mitotisk Lhx6::GFP + interneuron prekursorer (figur 1 d). Tilsvarende, reporteren Lhx6::GFP slår på mellom DD9-10 og topper rundt DD13-14 (figur 1 d). Selv om antall Lhx6::GFP celler fortsetter å øke i kultur, prosenten ikke, sannsynligvis på grunn av spredning av andre overleveringslinjer. Når Lhx6::GFP + reporter uttrykker, forblir synlig på ubestemt tid siden Lhx6 er stabilt uttrykt i eldre MGE-avledet kortikale interneurons18,19. Selv om Nkx2.1 og Lhx6 er i stor grad ikke-overlappende i murine forebrain, er det en forbigående befolkningen i Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP co uttrykke celler i kultur. Dette er delvis på grunn av perdurance av mCherry reporteren utover normal tidsrammen Nkx2.1 uttrykk, som de fleste av dobbel-merket cellene ikke uttrykke Detektbart nivåer av Nkx2.1 protein (Tyson og Anderson, upublisert). Celler fortsetter å uttrykke både Lhx6 reporter og kirsebær/Nkx2.1 protein kan være striatal interneurons20. Basert på vår live tenkelig studier, men det er en vindu av ca 18 h der synkron, nylig etter mitotisk forløpere uttrykke Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP kan isoleres (Tischfield Anderson, upubliserte og se Tischfield et al. 17). dermed ved å samle Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP dobbel positiv celler når som helst under protokollen, er det mulig å få en populasjon av celler som har hovedsakelig gått ut celle syklus innen ca 18 timer av hverandre. Dette er Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP-bare uttrykke celler, som representerer ulike typer progenitors og forløpere, henholdsvis av varierende bursdager.

Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC linjen kan brukes å berike for SST-skjebnebestemt interneurons. Vanligvis legge SSH til kulturer og samle GFP + celler på tidligere tidspunkt atskilling (f.eksDD12) beriker for SST undertyper. Basert på våre observasjoner, har vi ikke sett en betydelig forskjell i SST:PV forholdet avhengig av om SHH legges på DD5 eller DD8 (data ikke vist). Ved å legge til SSH (50 ng/mL) fra DD8-12 og deretter transplanting GFP bare uttrykke cellene, får vi i gjennomsnitt en 7:1-forhold av SST:PV CIns (figur 2A)15,17. For flere detaljer om effekten av SSH og tid i kultur på interneuron skjebne bruke våre dual-reporter mESC, se Tyson et al. 15

For å berike for PV-skjebnebestemt CIns, skal SSH utelates fra kultur media. Av notatet, forenlig med kravet til SSH signalisering til å opprettholde Nkx2.1 uttrykk i mitotisk progenitors21, SHH signalering finnes i disse kulturene uten eksogene SHH legges siden SHH signalering antagonist cyclopamine eliminerer Nkx2.1 uttrykk15. Men hvis cellene er nytt belagt på DD8, denne endogene SSH er fjernet, slik at SAG (30 nM) skal legges til media DD8-10 å opprettholde Nkx2.1 uttrykk og produksjon av CIns. Vår forrige studie viste at av forskuddsskatt SSH fra kultur betingelsene og sortering for Nkx2.1::mCherry+ celler i DD17, ~2.6:1 forholdet PV:SST celler kan fås (figur 2B)15. I motsetning til SST subtyper, som er beriket på tidligere stadier og i nærvær av eksogene SHH, økt varighet i kultur og mangel på eksogene SHH beriker PV subtyper15. I en nyere studie fant vi at aPKCi brukes på vår "MGE" protokollen betydelig øker brøkdel av Nkx2.1::mCherry progenitors som uttrykker cyclin D217, merketråd mellomliggende stamfar celler22. Denne protokollen varianten var basert på våre funn som PV-uttrykke CIns kommer hovedsakelig fra mellomliggende progenitors, mens SST progenitors kommer hovedsakelig fra radial progenitors av ventrikkel overflaten23. Vi har funnet at når sortert og transplantert inn i neonatal musen neocortex, er disse progenitors sterkt partisk for produksjon PV-deltyper. Ved å legge aPKCi fra DD8-11, og deretter sortere Nkx2.1::mCherry celler, kunne vi få 5.8:1 forholdet PV:SST undertyper (figur 2C)17. For å berike for PV subtyper, har vi også isolert Nkx2.1::mCherry celler dyrket i nærvær av aPCKi fra DD8-17. Men oppnår vi ikke en økning i PV:SST forholdet utover hva vi klarte å få tak på DD11, til tross for en marginale økning i andelen PV subtyper generert (figur 2D). Flytskjemaer for hver av disse protokollene finnes i Figur 3. Immunostaining mus hjerner 30 dager etter transplantasjon med anti-PV, anti-SST og anti-GFP (for å bedre identifikasjon av Lhx6::GFP + celler) antistoffer viser at Lhx6::GFP + celler ha eldre morfologiske funksjoner med mønstre for PV og SST uttrykk som i vivo papirformat (Figur 4 og figur 5).

For å hjelpe å bestemme om en CIn differensiering vises vellykket, har vi forberedt en rekke bilder i hvert trinn av protokollen for å vise normal variasjon (figur 6, figur 7, Figur 8). Vi har også en figur viser hvordan en mislykket differensiering vises på DD4 (figur 9). Mislykkede atskillinger vil vanligvis gi lave nivåer (mindre enn 10%) av Nkx2.1 uttrykk og prosenter av Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP induksjon av ca 1% eller mindre.

Figure 1
Figur 1: generering av Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP interneuron prekursorer. (A) vises her er representativt bilder av immunostaining for Nkx2.1, Nkx2.1::mCherry (RFP) og Lhx6::GFP (GFP) fra en differensiering dag 12 (DD12) kultur. Merk at disse bildene er overlappende kanaler fra samme synsfelt. (B) kvantifisering av den gjennomsnittlige prosentandelen av DAPI + kjerner som uttrykker Nkx2.1 på DD12 i kultur (n = 3 uavhengige atskillinger). (C) representant FACS plott demonstrere de fire ulike celle populasjonene som kan isoleres ved hjelp av våre dual reporter mESC linje. Merk at mCherry er på x-aksen og GFP på y-aksen. Dermed representerer den øverste høyre boksen celler som er mCherry/GFP-dobbel positive. (D) gang løpet av Nkx2.1::mCherry og Lhx6::GFP induksjon fra DD6-16 uttrykt som en prosentandel av celler i kultur som er bare mCherry uttrykke, GFP bare uttrykker, eller mCherry/GFP co uttrykke. Disse prosenter Hentet fra celler dyrket i nærvær av SSH under en SST-berikende protokoll og representerer gjennomsnitt fra 3 uavhengige atskillinger. Feilfelt med (B) og (D) representerer SEM. skala bar = 150 µm (A). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: manipulering av oppdrettsforholdene ulikt beriker for PV-versus SST-skjebnebestemt mESC avledet kortikale interneurons. (A) prosentandel av PV +, SST + og PV- / SST-interneurons oppnådd når DD12, GFP-bare uttrykke celler dyrket i nærvær av SSH (50 ng/mL) fra DD5-12 er transplanted inn i neonatale neocortex og analysert 30 dager etter transplantasjon. (B) prosentandel av PV +, SST + og PV- / SST-interneurons oppnådd ved DD17, mCherry-bare uttrykke celler dyrket uten supplerende SHH transplantert inn i neonatale neocortex og analysert 30 dager etter transplantasjon. (C) prosentandel av PV +, SST + og PV- / SST-interneurons oppnådd når DD11, mCherry-bare uttrykke celler dyrket i nærvær av SAG (30 nM; DD8-10) og aPKCi (2 µM; DD8-11) er transplanted inn i neonatale neocortex og analysert 30 dager etter transplantasjon. (D) prosentandel av PV +, SST + og PV- / SST-interneurons oppnådd når DD17, mCherry-bare uttrykke celler dyrket i nærvær av SAG (30 nM) fra DD8-10 og aPKCi (2 µM) fra DD8-17 er transplanted inn i neonatale neocortex og analysert 30 dager Etter transplantasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: flytskjemaer illustrerer de forskjellige PV - og SST-berikende protokollene som beskrevet i denne studien. (A) For alle protokoller, trappene til starten av differensiering inkludert DD0-5 er identiske. Alle celler dyrkes som embryoid organer fra DD0-3 i N2:KSR (1:1) supplert med BMP-hemmer LDN-193189 og den Wnt inhibitor XAV-939. På DD3, er cellene "landet" i N2:KSR (1:1) inneholder LDN-193189, XAV-939 og ROCK hemmer Y-27632. For å berike for SST-subtyper, legges SSH fra DD5-12. Eventuelt legges SSH fra DD8-12 siden, i vår erfaring, tillegg av SSH fra DD5 mot DD8 og utover betydelig ikke påvirker forholdet mellom PV:SST subtyper generert. Tidligere versjoner av protokollen (se Tyson et al. 15) ikke innlemme et nytt plating skritt på DD8 og i stedet supplert media med eksogene SSH på DD5. Denne protokollen ble senere endret til å inkludere et nytt plating skritt på DD8 sammen med innføringen av SSH, verken som vesentlig endre PV:SST forholdet. I denne "høy-SSH" protokollen er Lhx6::GFP + celler dyrket i nærvær av eksogene SSH FACS isolert på DD12 for bruk i nedstrøms programmer. (B) For "lav-SSH" PV-protokollen, eksogene SHH samt re plating trinnet på DD8 er utelatt. I stedet er Nkx2.1::mCherry+ celler FACS isolert på DD17 for bruk i nedstrøms programmer. (C) For den "+ aPKCi" PV-protokollen, aPKCi legges sammen med SAG DD8-10 og bare aPKCi legges fra DD10 og framover. DD11 eller DD17 er Nkx2.1::mCherry celler FACS isolert for bruk i nedstrøms programmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: PV og SST immunostaining i Lhx6::GFP + celler 30 dager etter transplantasjon i neonatale neocortex. (A) høy effekt bilde av en SST-uttrykke, Lhx6::GFP + cellen 30 dager etter transplantasjon i neonatale neocortex. Er én kanal bilder av Lhx6::GFP, Nåverdi og SST uttrykk med en 3-kanals sammenslåtte bildet nederst i hver kolonne av fire bilder. Som vist i toppanelet, utdyper denne Lhx6::GFP + Nevron flere prosesser kan tyde på en moden morfologi. (B) høy effekt bilde av to PV-uttrykke, Lhx6::GFP + celler 30 dager etter transplantasjon. (C) høy effekt bilde av en SST- / PV-dobbel negativ, Lhx6::GFP + cellen. Selv om denne cellen utdyper flere prosesser samsvar med komplett differensiering og kortikale integrering, uttrykker denne cellen tydelig ikke PV eller SST. Merk at det er en PV + kjerne tilstøtende til Lhx6::GFP +-cellen, men at den ikke overlapper. Skalere barer = 50 µm (-vekselstrøm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: middels og lav makt bilder av PV, SST og Lhx6::GFP protein uttrykk 30 dager etter transplantasjon i neonatale neocortex. (A) middels effekt bilde av en region av musen neocortex som inneholder 30 Lhx6::GFP + celler 30 dager etter transplantasjon. Disse cellene var vokst bruker PV-protokollen (+ aPKCi fra DD8-11; FACS isolere og transplantere Nkx2.1::mCherry+ på DD11). Av 30 celler sett her, 16 express PV, 4 express SST og 10 express PV verken SST. (B) strømsparingsmodus bildet av en region av musen neocortex inneholder mange, godt differensiert Lhx6::GFP + celler 30 dager etter transplantasjon. Merk at mange Lhx6::GFP + prosesser coursing gjennom cortex. Sporadiske celler finnes også i hippocampus, hvor de vises å integrere og utdype prosesser samsvar med en eldre fenotypen. Skala bar = 50 µm (A); 550 µm (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: normalt utseende mus embryonale fibroblast mater lag og udifferensierte stamceller. (A) vises her er 4 X og 10 X forstørrelse brightfield bilder viser typisk utseendet på våre mus embryonale fibroblast (MEF) mater lag 24 timer etter plating. (B) vises her er typisk utseendet på vår mus embryonale stamceller (mESCs) 2 dager etter plating på MEF matere. Merk at koloniene har en lys omkrets og elliptiske eller ovale i utseende. Hvis koloniene miste denne lyse omkretsen eller begynne å sende utover anslag er at cellene kan skille. (C) vises her er mESCs 1 og 2 dager etter re plating på gelatin belagt retter for å fortynne ut MEF matere før begynnelsen differensiering. Merk at stamceller utvide betydelig etter 48 h gelatin og begynne å hente på nytt en ovale opptreden med en lys omkrets. Skala bar = 100 µm i 4 X og 10 X bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: utseendet på mus embryonale stamceller på differensiering dager 1 til 7. (A) en dag etter flytende, stammen celler kan sees danner små embryoid organer (EBs). Dag to EBs har vokst betydelig. Merk at noen EBs har holdt sammen og dannet større klynger av celler. Vi finner ikke at dette negativt påvirker differensiering. EBs har vokst enda større etter 3 dager, og noen ikke lenger overføre lys gjennom dem. Det er vanlig å se celle rusk i bakgrunnen. (B) vises her er stamceller 24 timer etter landing på differensiering dag 4 (DD4). Merk tettheten av cellene. Mange har begynt å utvide små prosesser, som vil øke som differensiering fortsetter. Merk her at cellene er også farget med små svarte prikker spredt over hele. Hvis cellene er blanke eller homogen vises, er det et tegn på avvikende differensiering. (C) av DD5, cellene har fortsatt å spre seg og danne nevrale rosetter. Mange celler har utvidet lange, tynne prosesser. (D) av DD7, cellene skal confluent. Det er vanlig å se en "Swiss-ost" mønster, der store, flate, multinucleated celler (muligens ependymal eller gliacellene) opprette sirkulære øyene i et lag av nevrale progenitors. Noen ganger når cellen tetthet er høyere enn normalt, dette "Swiss-ost" mønsteret ikke ikke utvikling, som vist i midten image. Avhengig av differensieringen, kan dette påvirke neural induksjon. 4 x og 10 x angir forstørrelsen. Skala bar = 100 µm i 4 X og 10 X bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: utseendet av differensiering på dager 9 til 14. (A) enkeltceller kan visualiseres dagen etter re plating. Merk bipolar utseendet av nevrale progenitors. Kulturen er homogen med noen andre infiltrere celletyper. Tetthet er egnet for dette stadiet. (B) av DD11, cellene har vokst til en monolayer. Ligner på tidligere stadier i differensiering, store "egg-like" mange--kjerne celler kan sees utblandet gjennom. (C) av DD13 cellene har fortsatt å spre seg. De kan nå sees danner små hauger. Mange "egg-like" cellene er fortsatt til stede gjennom. Fra dette punktet og framover viser kultur noen få endringer, med unntak av hauger stadig større. 4 X, 10Xx, og 20 X angir forstørrelsen. Skala bar = 100 µm i 4 X 10 X bilder og skala bar = 50 µm i 20 X bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: utseendet av en mislykket differensiering på dag 4. DD4 er viktig i å vurdere hvor vellykket en differensiering fordi den følger en av de vanskeligste trinnene av protokollen: landing på DD3. Av DD4 har cellene 24 h å komme seg etter blir skilt fra embryoid organer. Som kan sees her, er de fleste cellene skinnende og homogen vises. Ispedd hele er sporadisk celler som vises normalt, ha en mørkere utseende med små svarte prikker spredt over hele. I tillegg er store flat celler (som kan sees i nedre venstre panel) veiledende av avvikende differensiering. I nederste høyre felt vises minst tre små grupper av celler (gule piler) som små embryoid organer, som angir enten feil differensiering, ufullstendig EB dissosiasjon, eller dårlig tilslutning til overflaten av celle kultur plate. Disse bildene er i motsetning til de som vises i figur 7B, som skildrer sunne, normale vises celler i DD4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne metoden er svært effektiv på mønstre J1-avledet mESCs (SCRC-1010), har vi opplevd variabel suksess med andre mESC og klonal isolater. For eksempel, Foxg1::venus mESCs (EB3-avledet; Danjo et al. 13) svare dårlig til denne protokollen og Foxg1 induksjon av DD12 er vanligvis på 1-2%. Grunner som vi ikke forstår helt, produserer en annen Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dobbelt reporter klone (kalt JQ59) som ble isolert samtidig som linje beskrevet i denne protokollen (kalt JQ27), mindre enn 1% Nkx2.1-uttrykke celler når vokst under like forhold. Ättlinjen (J1; ATCC SCRC-1010), men svarer godt til denne protokollen og produserer prosenter av Nkx2.1-uttrykke celler i DD12 ligner på de som vises i figur 1B. Om nødvendig kan konsentrasjonen av XAV-939 og SSH/SAG justeres for å optimalisere differensiering forholdene på linje for linje basis. Vår erfaring med denne protokollen for å differensiere andre mESC linjer i MGE-lignende progenitors er imidlertid begrenset.

Om våre Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dobbelt reporter mESC linje uttrykke ikke alle Nkx2.1 + celler mCherry. Selv om nesten alle mCherry + celler uttrykke Nkx2.1 protein, henger reporter uttrykk etter Nkx2.1 protein uttrykk, spesielt i tidlige stadier av differensiering (DD7-9). Brøkdelen av Nkx2.1 + celler som uttrykker mCherry stadig øker i løpet av differensiering. På topp nivå (~ DD12-14) mCherry uttrykkes i ca 30% av alle Nkx2.1 uttrykke progenitors17. I tillegg har samme bakteriell kunstig kromosomet brukes til å kjøre mCherry uttrykk blitt brukt til å kjøre grobunn recombinase i Nkx2.1-uttrykket domener av transgene mus24. I mus grobunn uttrykk var svak innenfor Nkx2.1 uttrykker celler dorsal mest regionen i MGE og skjebne-kartlegging med denne musen syntes å under etiketten SST-uttrykke CIns som kan genereres i stor grad fra denne regionen25, 26,27,28. Men til tross for disse avvikene, kan millioner av GFP eller mCherry-uttrykke celler være isolert med bare et par timer av FACS.

Det er to viktigste fordelene med denne teknikken. Først, kombinert med vår Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC linje, er det mulig å få et stort antall interneuron forløpere beriket for å bli PV eller SST-skjebnebestemt kortikale interneuron undertyper. Andre Hovedfordelen er det er relative enkelt med hvilke store antall interneuron skjebnebestemt celler kan oppnås. Selv om flere andre endret EB teknikker eksisterer for å skille MGE progenitors og neurons, stole disse protokollene vanligvis på bruk av Wnt-hemmende molekyler som Dkk113,14,29. Vi har funnet at den Wnt inhibitor XAV-939 forbedrer generering av pallidal telencephalic progenitors, som dokumentert av Foxg1 og Nkx2.1 uttrykk15.

Som nevnt tidligere, finnes flere andre metoder for å generere MGE-lignende progenitors fra mESCs. Watanabe et al. 14 pioner innen telencephalic differensiering fra mESCs ved å være først til å utvikle en serum-free suspensjon kultur metode etterfulgt av nytt plating på en tilhenger overflate. De fant at Wnt og Nodal antagonister, Dkk1 og LeftyA, henholdsvis, effektivt kjørte mESCs i tidlig neuroectodermal linjene13. Bruker SSH disse kulturene, de observerte at mellom 5-15% av alle celler i kultur co uttrykt Nkx2.1/Foxg1 og kan betraktes som MGE-lignende progenitors13. Men mens du legger grunnlaget for mange studier framover, har denne studien ikke en måte å isolere MGE progenitors eller berike for bestemt CIn undertyper.

Flere år senere, Danjo et al. 13 brukt samme serum-free suspensjon kultur metode i kombinasjon med tidsbestemte administrasjonen av ulike vekstfaktorer, i bestemt SHH, for å oppnå subregionale spesifikasjon av mESC-avledet ventrale telencephalic vev. Bruke en Foxg1::venus reporter, fant de at SSH-administrasjon fra DD3-12 etter Dkk1 behandlingen resulterte i mellom 45-68% av alle celler i kultur uttrykke Foxg1::venus reporter13. I Foxg1::venus + befolkningen uttrykte omtrent 32% av cellene Nkx2.113. Ved å erstatte SSH for SAG og legge Fgf8, forsterket de fremme brøkdel av Nkx2.1 progenitors i befolkningen Foxg1::venus + til 41%13ca. Når assayed for skjebne, produsert disse cellene ca 17% SST, 21% PV, 18% NPY og 8% calretinin subtyper13. Men mens denne studien beskrevet en metode for å angi CGE versus MGE-avledet CIn skjebne, det ikke beskriver en metode å selektivt berike for PV eller SST undertyper.

Året Cambray et al. 11 brukt serum-free monolayer metode med nytt plating på DD5 for å studere effekten av activin på differensiering og identiteten til telencephalic nevrale forløpere musen og menneskelige ESCs. Selv om denne studien ikke rapporterte prosentandelen av Nkx2.1 celler generert i deres protokollen, rapporterer de at ca 54% av celler i kultur co-uttrykkes Nestin/Foxg1 på DD2 (5 dager vekst i serum gratis media etterfulgt av ytterligere 2 dager med kultur etter re plating)11. De rapporterte også at med tillegg av activin, ~ 55% av celler co uttrykt nestin og CouptfII, som indikerer at disse cellene kan representere caudal ganglionic eminense som celler, som produserer fleste calretinin-uttrykke kortikale interneurons 11. 8 dager i kultur (13 dager samlede) fant faktisk 39% av celler co uttrykke calretinin/BIII-tubulin, mens 59% av celler ble funnet co uttrykke GABA/BIII-tubulin11. Denne studien undersøker ikke produksjonen av PV eller SST undertyper.

Igjen med en modifisert EB metode, Chen et al. 12 vist at MGE-spesifikke enhancer elementer kan brukes til å følge og rense stamcelleforskningen avledet MGE-lignende celler12. I denne studien sammenlignet de effekten av ulike oppdrettsforholdene under rettet atskillinger av mESCs i MGE-lignende progenitors bruker en Lhx6::GFP reporter linjen. den samme linjen som fungerte som ättlinjen for Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter linjen beskrevet i dette manuskriptet. De viste at ved å legge Dkk1 til kulturen forhold fra DD0-3, etterfulgt av tillegg av SAG, upwards av ~ 10% av alle celler i kultur uttrykt Lhx6::GFP12. De fant også at samme protokoll, brukes Foxg1::venus linjen som Danjo et al. 12, resulterte i ca 37% av alle celler uttrykke Foxg1::venus reporter. Når Lhx6::GFP celler var transplantert i vivofølgende gjennomsnittlig prosenter av CIn undertype markører ble observert: 22% PV, 58% SST og 16% NPY12.

Andre grupper har nylig brukt tvunget uttrykk for avstamning-definerende transkripsjonsfaktorer direkte angi CIns. Kanskje var den første demonstrasjonen av dette Petros et al. 10 som brukte en doxycycline-induserbart arrangøren til å kjøre Nkx2.1 uttrykk i Ainv15 mESCs som ble endret for å inneholde en Lhx6::GFP bakteriell kunstig kromosom. Denne studien brukte kultur forhold som ligner de i gjeldende manuskriptet men uten tilsetning av XAV-93910. Men av grunner som er dårlig forstått, en lavere andel av Lhx6::GFP + celler ble observert differensiering oppstiller sammenlignet med når du bruker J1 Lhx6::GFP ättlinjen beskrevet i dette manuskriptet10. Til tross for å oppnå samme nivå Foxg1 uttrykk (totalt % ukjent), var det en moderat reduksjon i antall Nkx2.1 celler uten større enn 2% av alle celler uttrykke Lhx6::GFP reporter10. Denne studien fremhever iboende forskjellene som eksisterer mellom ulike ESC linjene og utfordringene forskere ansiktet når du forsøker å bruke differensiering protokoller på ESC linjer forskjellige fra de som ble brukt til å utvikle de opprinnelig.

Bruke en elegante tilnærming, Au et al. 9 brukes sekvensielt tvunget uttrykk for transkripsjonsfaktorer til å generere bestemte undergrupper av kortikale interneurons bruker samme ventrale telencephalic differensiering paradigmet utviklet av Watanabe et al. 14 mens de ikke rapporterer de nøyaktige prosentverdiene for Foxg1 + Nkx2.1 + og Olig2 + forløpere produsert i kultur, sier de at ca 50% av alle celler i kultur differensiert i GABAergic neurons9. 11 dager etter differensiering, var EBs avstand og transplantert inn i MGE av E13.5 vert embryo9. En liten andel av disse (mindre enn 1%) overført fra MGE til cortex, hvor de ble identifisert av deres Dlx5/6-eGFP og analysert for skjebnen9. Forfatterne observert en rekke prosentdeler PV, SST og CGE-lignende skjebne basert på deres valgte tvunget induksjon strategi9. Interessant, med uttrykk av transkripsjon faktor Lmo3, de observerte i gjennomsnitt ca 57% PV, 21% SST og 15% CGE-avledet undertyper (SST- / reelin + eller VIP-bare +)9. Den største andelen av SST subtyper observert ble oppnådd ved hjelp av en Nkx2.1/Dlx2 GOF linje, som produserte omtrent 32% SST, 35% PV og 25% CGE-avledet subtyper9.

I 2015, Colasante et al. 30 viste at tvunget uttrykk for fem transkripsjonsfaktorer (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5 og Lhx6) i fibroblaster fra GAD67-GFP reporter mus konverteres 15% av alle celler til GABAergic som CIns. Bemerkelsesverdig, ca 90% av disse cellene gikk på å uttrykke PV, med bare sjelden celler uttrykke SST30. Selv om denne metoden ikke ble brukt på mESCs, ble det brukt med menneskelige iPSCs, hvor det ble anslått at ca. 30% av alle celler vedtatt en GABAergic identitet30.

Som vist i figur 2, finnes det flere måter å generere beriket bestander av PV eller SST CIns. De viktigste fordelene med PV-protokollen utnytte aPKCi over DD17 protokollen er større antall celler som kan isolere, levedyktighet og varigheten av kultur. Selv om vi ikke viser data for DD17 induksjon nivåer i figur 1, det er omtrent dobbelt så mange mCherry + celler på DD11 som finnes på DD17 (data ikke vist). Når celler for transplantasjon, finner vi at et større antall starter celler (se nedenfor) er nyttig, siden omtrent 30-50% av celler er tapt under konsentrere seg for injeksjon. I tillegg kan et større antall celler fås med kortere FACS tider, som begrenser mengden tid som cellene på isen og senker totalkostnad. Sannsynligvis fordi en høyere prosentandel av kirsebær + cellene progenitors, viser celler fra tidligere stadier av kultur (f.eksDD11) større overlevelse i forhold til DD17 celler etter transplantasjon i neonatale neocortex. Når et stort antall levedyktige cellers er nødvendig, er for eksempel i cellen transplantasjon til å behandle epilepsi, har både større Start befolkning og større levedyktighet en stor fordel.

Som vist i figur 2, avhengig av protokollen, analysert ca 25-39% av Lhx6::GFP + celler 30 dager etter transplantasjon ikke uttrykke Detektbart nivåer av PV eller SST protein med rutinemessige immunohistochemistry. Vanligvis disse PV- / SST-celler uttrykke GABA samt Sox6, en markør for MGE-avledet kortikale interneurons (se Tyson et al. 15, Tischfield et al. 17). mindre enn 1% av PV- / SST - Lhx6::GFP + celler uttrykke markører for andre interneuron undergruppene, som calretinin, reelin eller blindhet (data ikke vist). Dette ligner i vivo skjebne kartlegging studier som har vist at mellom ~ 15-25% av MGE-avledet interneurons ikke uttrykke PV eller SST23,25,31. Når Nkx2.1::mCherry+ eller Lhx6::GFP + celler er isolert og belagt på rotte kortikale matere i vitro, vi har funnet at ~ 40-70% av Lhx6::GFP + celler analysert etter 28 dager i kultur er PV-/ SST-, med et flertall av de som flekken positiv uttrykke SST. Denne økningen i PV- / SST-celler kan skyldes fravær av et ytre maturational signal som er tilstede i vivo, som kan spesielt være tilfellet for eldre PV uttrykk eller suboptimal elektrofysiologiske innspill fra materen celler. Uansett hva grunnen måtte være, foretrekker vi å transplantere celler i neonatale neocortex for skjebnen analyse snarere enn i vitro differensiering.

For de fleste transplantasjon eksperimenter, anbefaler vi flyter på DD0 minimum to 10 cm ikke-tilhenger vev kultur retter hver inneholder 7.5 x 105 mESCs i 10 mL N2/KSR (7.5 x 104 celler/mL, 20 mL totalvolum). Sammen vil begge platene vanligvis gi 8-12 x 106 celler etter EB dissosiasjon på DD3, hvilke 5.4 x 106 celler kan brukes å frø to 6-og vev kultur behandlet plater (50 000 celler/cm2, ca 110 cm2 totalt). Av DD8 gir hver 6-vel plate ca 5-7 x 107 celler, som deretter kan brukes å frø ytterligere tre til fem 6-vel-plater på en tetthet av 250.000 celler/cm2 (krever totalt 4.05 x 107 celler i tre 6-brønn plater eller 6,75 x 107 celler i fem 6-vel plater). Av DD14, vil hver 6-vel plate vanligvis gi 1-2.5 x 106 mCherry eller GFP-uttrykke celler. Avhenger på nødvendig av eksperimentet, har vi fløt minimum 7.5 x 105 mESCs for småskala immunohistochemistry analyser til opp 6 x 106 mESCs for store transplantasjon prosjekter.

De viktigste trinnene av protokollen opprettholder mESCs til en pluripotent tilstand før begynnelsen differensiering og landing/dissosiasjon trinnet på DD3. Hvis cellene har blitt opprettholdt riktig og landing/dissosiasjon på DD3 er gjort nøye, differensiering vil vanligvis være vellykket. Bare stilk celler som sunn og bør brukes for differensiering. Hvis EBs ikke danne mellom DD0-3 eller danne flere, små, asymmetrisk organer, differensieringen er trolig bli mislykket. I tillegg under EB dissosiasjon på DD3, bør EBS nøye overvåket til ikke lenger synlig av øyet å unngå langvarig eksponering for ikke-trypsin inneholder celle-dissosiasjon regent.

Resultatene som presenteres i dette dokumentet ble innhentet under optimalisert forhold benytter kvalitetssikrede reagenser. Dette er viktig å merke siden vi noen ganger har problemer med å oppnå robust Nkx2.1 induksjon, og ved forlengelse, mCherry og GFP reporter uttrykk. Basert på vår erfaring, tror vi at parti til parti variasjon av FBS sannsynligvis kontoer for disse endringene. Som sådan, er det lurt å teste ulike masse FBS å bestemme som virker best for å opprettholde mESCs. Selv om vi ikke har brukt 2i/LIF systemet (serum-fri medium som inneholder den MEK hemmer PD03259010 og GSK-3α/β inhibitor CHIR99021), er det mulig at serum-free mESC forhold kan produsere mer konsekvente resultater. Vi har imidlertid ikke testet denne hypotesen og har ikke noen data som om bruk av serum-free mESC media påvirker differensiering av mESCs i MGE-lignende progenitors. I tillegg må du bruke fersk vekstfaktorer når mulig ved aliquoting dem for enkel bruk. Avhengig av brukeren må cellen Tettheten økes for å oppnå tilstrekkelig celle overlevelse, spesielt under landing trinnet på DD3.

Interneurons har bemerkelsesverdig evne til å overleve, overføre og integrere i vert-krets etter transplantasjon. Slik denne protokollen kan brukes å transplantere interneuron forløpere til epileptiske musen modeller og andre modeller av nevrologiske og nevropsykiatriske sykdom (se Southwell et al. 32 og Tyson og Anderson33 for vurderinger av interneuron celle basert terapi). For eksempel i en fersk studie gjort et al. 34 beriket befolkninger PV og SST CIns transplantasjon i en musemodell av schizofreni. De fant at PV og SST beriket transplantasjoner produsert forskjellige effekter på museinnstillinger, med PV beriket bestander normalisere schizofreni endophenotypes som de studerer.

De siste årene, har PiggyBac transposon systemet blitt brukt til å oppnå stabil uttrykk for effekter av transgener i en rekke systemer. Vi har brukt dette systemet raskt og enkelt opprette stabilt uttrykke doxycycline-induserbart miRNA konstruksjoner for å studere rollen til bestemte gener under interneuron utvikling. Vi er også bruker denne teknologien til å lage to reporter mESC linjer som uttrykker channelrhodopsin-2 (ChR2) å optogenetically stasjonen mESC stammer interneurons eller DREADD reseptor teknologi for å aktivere eller deaktivere transplantert celler blasts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for Qing Xu for å utvikle Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dobbelt reporter mESC linjen som Jennifer Tyson, Asif Maroof, og Tim Petros for deres tidlig arbeid med å utvikle denne protokollen. Vi takker også CHOP flyt cytometri kjernen for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av en NIH R01 MH066912 (SA) og F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Nevrovitenskap problemet 130 hjernen mus interneuron differensiering cortex cellekultur stamceller transplantasjon
Differensiering av mus embryonale stamceller i kortikale Interneuron forløpere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tischfield, D. J., Anderson, S. A.… More

Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter