Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Дифференциация мышиных эмбриональных стволовых клеток в корковых межнейронного прекурсоров

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Этот протокол описывает метод для генерации прародителями корковых межнейронного и пост митотическая межнейронного прекурсоров из мышиных эмбриональных стволовых клеток с помощью модифицированного метода embryoid тело монослоя. Эти предшественники/прекурсоров дневно сортируются и пересадить в неонатальной Неокортекс для изучения определения судьбы может быть использоваться в пробирке или терапевтического применения.

Abstract

ГАМК корковых интернейронов являются гетерогенной популяция клеток, которые играют решающую роль в регулировании вывода возбуждающих нейронов пирамидальный, а также Синхронизация выходов Пирамидальный нейрон ансамблей. Дефицит в межнейронного функции были причастны целый ряд психоневрологических расстройств, шизофрении, аутизм и эпилепсии. Дифференцирование корковых интернейронов из эмбриональных стволовых клеток не только позволяет для изучения их развития и функционирования, но обеспечивает проницательность в молекулярные механизмы, лежащие в основе патогенеза корковых расстройств, связанных с межнейронного. Интернейронов также имеют замечательную способность выжить, миграции и интеграции в принимающей корковых схемы после трансплантации, что делает их идеальными кандидатами для использования в терапии на основе ячеек. Здесь мы представляем масштабируемый, высокоэффективных, модифицированных embryoid тело монослоя метод для расчета Nkx2.1 выражая прародителями межнейронного и их потомков из мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs). С помощью Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP двойной репортер mESC линии, Nkx2.1 прародителями или их Lhx6-выражая пост митотическая потомства можно изолировали через активированный флуоресценции клеток, сортируя (FACS) и впоследствии используется в ряде нисходящие приложения. Мы также предоставляют методы для обогащения Парвальбумин (PV) или соматостатина (SST) межнейронного подгрупп, которые могут быть полезны для изучения аспектов определения судьбы или для использования в терапевтических приложений, которые выиграют от межнейронного подгруппа обогащенный трансплантаций.

Introduction

В обоих мышей и людей, примерно половина всех корковых ингибирующее интернейронов (ЦИН) происходят в рамках переходных подкорковые структуры, известный как медиальный Ганглиозный возвышение (MGE), где нейроэпителиальных прародителями Цин и других нейронов и глиальных подгруппы Экспресс фактор транскрипции Nkx2.11,2. Цин подгрупп или подтипы определяются пересекающихся морфологических, нейрохимических, электрофизиологических и подключения характеристики3,4. Цин МГЕ производные могут быть сгруппированы в основном non перекроя подгруппы на основе их выражения PV или SST, выражение которого коррелирует с частности электрофизиологических и подключения тенденции5. Дисфункция интернейронов, особенно те, в подгруппе PV, был вовлечен в несколько нервно-психических расстройств и заболеваний6,7. Общая цель этого метода-производить стволовых клеток митотическая прародителями и мигрирующих прекурсоров, обогащенные для PV или SST CIn судьбу для изучения биологии корковых межнейронного и для использования в терапии на основе ячеек.

Мы разработали масштабируемый, высокоэффективный метод для расчета Nkx2.1 выражая прародителями межнейронного и их потомства от mESCs. С помощью Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP двойной репортер mESC линии8, Nkx2.1 прародителями или их Lhx6-выражая пост митотическая потомства может быть изолирован через СУИМ и впоследствии используется в ряде нисходящие приложения. Изменяя количество сигнальных путей, продолжительность культуры и режим нейрогенез, мы можем получить миллионы дневно обозначенные межнейронного прекурсоров для множество нисходящие приложения.

Хотя существуют несколько других методов для генерации МГЕ как предшественники из mESCs9,10,11,12,13,14, наш метод, который опирается на Wnt антагонист Демонического-939, особенно эффективен при генерации Foxg1/Nkx2.1 совместно выражая telencephalic прародителями. Кроме того возможность выбора для межнейронного прародителями или их пост митотическая Lhx6-выражая потомства через нашу систему двойного репортер, значительно повышает способность генерировать собственный прародителями и их потомства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Линия mESC двойной репортер, указанных в настоящем Протоколе доступен по запросу (sande@mail.med.upenn.edu).

1. средства массовой информации подготовка

Примечание: Теплый все средства массовой информации до 37 ° C перед использованием в клеточной культуре.

  1. Мышь эмбриональных фибробластов (MEF) СМИ (для подготовки 500 мл)
    1. Добавьте 50 мл плода бычьим сывороточным (ФБС) 449 мл Дульбекко орла изменения среднего (DMEM), и процеживают через блок поры фильтра 500 мл 0,22 мкм.
    2. Добавление антимикробное средство 1 мл (50мг/мл) после фильтрации. Хранить при 4 ° C до 1 месяца или Алиготе и хранить при ≤-20 ° C.
  2. Средства массовой информации N2 (для подготовки 500 мл)
    1. Добавьте 5 мл L-аланин L-глютамин (100 x) и 500 мкл 2-меркаптоэтанол (55 мм) до 489,5 мл DMEM: питательной смеси F-12 (DMEM/F-12) и процеживают через блок поры фильтра 500 мл 0,22 мкм.
    2. Добавление антимикробное средство 1 мл (50мг/мл) и 5 мл N2 дополнение B после фильтрации. Храните при 4 ° C в темное время суток до 1 месяца.
  3. Сыворотка свободный рост среднего (KSR) (для подготовки 500 мл)
    1. Добавьте 75 мл сыворотки бесплатно средних дополнение, 5 мл L-глютамин (100 x), 5 мл MEM Non-Essential аминокислоты (MEM-NEAA) (100 x), и 500 мкл 2-меркаптоэтанол (55 мм) для не 413.5 мл-глютамин содержащие DMEM и процеживают через блок поры фильтра 500 мл 0,22 мкм.
    2. Добавление антимикробное средство 1 мл (50мг/мл) после фильтрации. Храните при 4 ° C до 1 месяца.
  4. Средства массовой информации эмбриональных стволовых клеток мыши (для подготовки 500 мл)
    1. Добавьте класс 75 мл стволовых клеток в FBS, 5 мл MEM-NEAA (100 x), 5 мл L-глютамин (100 x), и 500 мкл 2-меркаптоэтанол (55 мм) для не 413.5 мл-глютамин содержащие DMEM и процеживают через блок поры фильтра 500 мл 0,22 мкм.
    2. Добавление антимикробное средство 1 мл (50мг/мл) после фильтрации. Хранить при 4 ° C в темноте до 1 месяца или Алиготе и хранить при ≤-20 ° C.

2. выращивание mESCs

  1. Плита mitotically неактивных MEF фидер клетки в MEF СМИ на культуре ткани лечение пластины в 3-4 х 104 клетки/см2. Позвольте по крайней мере 12 h для них поселиться в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с ≥ 95% относительной влажности и 5% CO2 до обшивки mESCs. Если не используется сразу, замените MEF СМИ каждые 3 дня. Распоряжаться MEFs, если не используется в течение 7 дней обшивки.
  2. Добавьте mESCs (плотность диапазон от 1-4 х 104 клетки/см2) MEF пластин в mESC массовой информации, содержащие мыши лейкемия ингибирующего фактора (mLIF) (1000 ед/мл). Инкубируйте клетки при 37 ° C с ≥ 95% относительной влажности и 5% CO2.
  3. Проход с помощью трипсина ЭДТА (0,05% трипсин) mESCs (1:5-1:10) как только блюдо становится ~ 70-80% притока или если колоний начинают на ощупь. Обычно это происходит каждые 2 дня, но может занять до 4 или 5 дней в зависимости от плотности первоначального покрытия.
  4. Сохранить mESCs на слое фидер MEF в mESC среде держать плюрипотентности.
  5. Перед началом дифференциации, проход клетки по крайней мере один раз на желатин покрытием пластин без MEFs для разбавления вне MEFs.
    1. Подготовить желатин покрытием пластин, добавив 0,1% желатина в фосфатный буфер (PBS) с Ca2 +/Mg2 + в культуре ткани лечение блюдо и оставляя при 37 ° C для по крайней мере 1 h. плита 1,5-2 х 106 клеток/10 см пластины (2,7-3,6 x 104 клетки/см2) и позволяют клеткам расширить за 2 дня до начала дифференциации.

3. дифференциация mESCs к Telencephalic прародителями МГЕ как

  1. Дифференциация день (DD) 0 = «флоат-клетки»
    1. После mESCs выросли на желатин покрытием пластин на 2 дня, аспирационная СМИ и вымыть клетки один раз с PBS без Ca2 +/Mg2 +. Добавьте достаточно трипсина ЭДТА (0,05% трипсин) для покрытия поверхности пластины (обычно 4 мл трипсина ЭДТА на одно блюдо культуры ткани 10 см) и место клетки обратно в инкубаторе при 37 ° C с ≥95% относительной влажности и 5% CO2 на 4 мин.
    2. После 4 мин утолите трипсина ЭДТА, используя 2 раза объем с mESC средствами массовой информации. Передача клетки трубка подходящего размера центрифуги и центрифуги клетки на 200 x g за 5 мин. После 5 минут снять трубку и аспирационная СМИ не нарушая гранулы. Ресуспензируйте Пелле в 1 мл KSR:N2 СМИ (1:1), содержащий ингибитор BMP LDN-193189 (250 Нм) и ингибитор Wnt Демонического-939 (10 мкм).
    3. Измерение концентрации клеток с помощью Горяева или счетчик автоматизированных клеток. Начало роста клетки как embryoid органов (EBs), добавив в СМИ KSR:N2 (1:1), содержащий LDN-193189 75000 клеток/мл (250 Нм) и Демонического-939 (10 мкм) в культуре ткани non сторонник блюда. Инкубируйте клетки при 37 ° C с ≥ 95% относительной влажности и 5% CO2.
  2. На DD1 подготовьте для ячейки «посадки» покрытие ткани Культура лечение блюда с поли L-лизин (10 мкг/мл в PBS с Ca2 +/Mg2 +) ночь (O/N) при 37 ° C ≥ 95% относительной влажности или по крайней мере 1 час.
  3. На DD2, аспирационная поли L-лизин и пальто пластины с Ламинин (10 мкг/мл в PBS с Ca2 +/Mg2 +) O/N при 37 ° C ≥ 95% относительной влажности.
    Примечание: Хотя O/N является оптимальным, как мало, как 2 h может быть достаточно. Если на следующий день не используются пластины, аспирационная Ламинин, замените PBS без Ca2 +/Mg2 +и хранить при 4 ° C на срок до 2 недель.
  4. DD3 («Земля клетки»)
    1. Перед началом EB диссоциации, аспирационная Ламинин и позволяют пластины для полностью сухой в культуре ткани капюшоном. Не используйте пластины, которые выглядят блестящими или заметно влажной. Перенесите EBs с СМИ в 15 мл трубки и центрифуги для 3-4 мин 15 x g или до тех пор, пока гранулированных EBs.
  5. Аспирационная средства массовой информации и добавить 3 мл раствора отряд ячейки, содержащие DNase (2 ед/мл) и инкубировать при 37 ° C ≥ 95% относительной влажности и 5% CO2 на 15 мин осторожно проведите трубку каждые 3 мин для помощи в EB диссоциации.
  6. После того как EBs больше не видны или прошло 15 минут, добавить 6 мл KSR:N2 (1:1) содержащий DNase (1 ед/мл) и центрифуги для 5 минут при 200 x g.
  7. Пластина клетки в KSR:N2 (1:1), содержащий LDN-193189 (250 Нм), Демонического-939 (10 мкм) и рок ингибитор Y-27632 (10 мкм) на 4,5-5 х 104 клетки/см2.

4. SST-обогащение протокол: «DD12 GFP высокой Sonic ежа (ТСС)» (продолжение от шага 3.7)

  1. На DD5, изменить СМИ с KSR:N2 (1:1), содержащий ФБП-2 (10 нг/мл), IGF-1 (20 нг/мл) и SSH (50 нг/мл).
  2. Подготовить культуры ткани пластины для повторного покрытия на день 8 (шаг 4.4) с помощью инструкции, описанные в шагах 3.2-3.3.
  3. На DD7, изменить СМИ с KSR:N2 (1:1), содержащий ФБП-2 (10 нг/мл), IGF-1 (20 нг/мл) и Тсс (50 нг/мл).
  4. На DD8, повторно плите клетки.
    Примечание: Хотя этот шаг не является необходимым, повторное покрытие клетки может уменьшить типы раннего продифференцировано, нежелательных клеток. Повторное покрытие также ломает вверх шарики клеток, которые затрудняют течению Иммуногистохимический анализ и увеличивает эффективность СУИМ в позднее время точках.
    1. Чтобы повторно пластины клетки, отсоединить клетки из пластины с трипсина ЭДТА (0,05% трипсин) для 5 минут при 37 ° C с ≥95% относительной влажности и 5% CO2. Утолить трипсина ЭДТА, используя 2 раза объем с KSR:N2, и центрифуги на 200 x g для 5 минут фильтр клетки через трубку 40 мкм фильтр для удаления любых сгустки. Повторно пластины клетки в 250.000 клеток/см2 N2/KSR (1:1), содержащие ФБП-2 (10 нг/мл), IGF-1 (20 нг/мл) и Y-27632 (10 мкм) с Тсс (50 нг/мл).
      Примечание: Если вместо этого, принято решение не для того, чтобы повторно пластины на DD8 ячейки, измените СМИ с KSR:N2, содержащих Тсс (50 нг/мл) каждые 2 дня от DD7 до DD12 и продолжать добавлять IGF-1 (20 нг/мл) и ФБП-2 (10 нг/мл) до DD9.
  5. На DD10, измените СМИ с KSR:N2, содержащих Тсс (50 нг/мл).
  6. На DD12, чтобы получить клетки, которые обогащаются SST подтипов, используйте СУИМ для изоляции Lhx6::GFP-только выражая клетки.
    1. Чтобы отсоединить клетки, используйте не трипсин содержащих клеток диссоциации реагент вместо трипсина ЭДТА. Вымойте клетки один раз с PBS без Ca2 +/Mg2 +. Добавить подогретым не трипсина содержащих клеток диссоциации реагент содержащие DNase (2 ед/мл) в клетки. Поместите их в инкубаторе при 37 ° C с ≥95% относительной влажности и 5% CO2 на 10-30 мин, или до тех пор, пока клетки отдельный. Аккуратно нажмите пластин каждые 5 мин для помощи диссоциации.
      Примечание: Для DD11-12 культур, только 10-15 мин может оказаться необходимым. Для культур DD15-16 30 минут или больше, может потребоваться для полной диссоциации.
    2. После того, как клетки полностью снять пластину, переходите к FACS изоляции с помощью стандартных протоколов или использовать клетки в других течению анализов.

5. PV-обогащение протокол: «DD11/DD17 mCherry + aPKCi» (продолжение от шага 3.7)

  1. На DD5, измените СМИ с KSR:N2 (1:1), содержащий ФБП-2 (10 нг/мл) и IGF-1 (20 нг/мл).
  2. Подготовить культуры ткани пластины для повторного покрытия на DD8 (шаг 4.4) с помощью инструкции изложенных в шаги 3.2-3.3.
  3. На DD7, измените СМИ с KSR:N2 (1:1), содержащий ФБП-2 (10 нг/мл) и IGF-1 (20 нг/мл).
  4. На DD8, повторно плите клетки, как описано в шаге 4.4 со следующими исключениями: когда повторное покрытие клетки, замените сглаженную агонист Тсс (SAG; 30 Нм) и добавить нетипичных PKC ингибиторы (aPKCi; 2 мкм). Взятые вместе, повторно plating СМИ теперь N2/KSR (1:1) содержит ФБП-2 (10 нг/мл), IGF-1 (20 нг/мл), Y-27632 (10 мкм), SAG (30 Нм) и aPKCi (2 мкм).
  5. На DD10 измените СМИ с KSR:N2, содержащих aPKCi (2 мкм).
  6. DD11
    Примечание: на данный момент, Nkx2.1::mCherry+ клетки обогащены стать PV Цин.
    1. Отсоедините клетки от пластины для СУИМ, используя тот же протокол, описанные в шаге 4.6. Если принято решение собрать Nkx2.1::mCherry+ клеток на день позже дифференциации, игнорировать этот шаг.
  7. На DD12 измените СМИ с KSR:N2, содержащих aPKCi (2 мкм). На DD14 измените СМИ с KSR:N2, содержащих aPKCi (2 мкм). На DD16 измените СМИ с KSR:N2, содержащих aPKCi (2 мкм). На DD17 Соберите Nkx2.1::mCherry+ клетки, используя тот же протокол, описанные в шаге 4.6.

6. PV-обогащение протокол: «DD17 mCherry температура Тсс» (продолжение от шага 3.7)

  1. На DD5, измените СМИ с KSR:N2 (1:1), содержащий ФБП-2 (10 нг/мл) и IGF-1 (20 нг/мл). На DD7, измените СМИ с KSR:N2 (1:1), содержащий ФБП-2 (10 нг/мл) и IGF-1 (20 нг/мл).
  2. На DD9 измените СМИ с KSR:N2 (1:1). С этого момента без дополнительных факторов роста являются необходимыми.
    1. Продолжайте изменять СМИ каждые 2 дней до сбора урожая на DD17 ячейки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протокол, описанные в настоящем документе представляет собой модифицированную версию нашего опубликованные протоколы по15,16,17 и оптимизирована для использования с нашей линии двойной репортер mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Путем добавления ингибитора Wnt Демонического-939 из DD0-5, в сочетании с повторного покрытия на DD8, мы достигаем надежные индукции Nkx2.1, в котором свыше 50% всех DAPI + ядер в культуре также Nkx2.1 выражают (рис. 1A, B). Иммуногистохимия для mCherry и Репортеры GFP показывает четкое выражение в регионах Nkx2.1 позитивных иммунореактивности (рис. 1A). СУИМ живых клеток, используя родной репортер показывает, что четыре популяции клеток могут быть четко выделены: (1) GFP/mCherry двойное отрицание клеток, (2) mCherry только выражения клетки, (3) GFP-только выражая клетки и клетки двойной выражая GFP (4) / mCherry ( Рисунок 1 c). С помощью этой строки, небольшая часть прародителей начинает включите mCherry репортер вокруг DD8-9. MCherry уровни пика между DD12-13 и затем неуклонно снижаться как предшественники выход клеточного цикла и производят после митотическая Lhx6::GFP + межнейронного прекурсоров (рис. 1 d). Соответственно, репортер Lhx6::GFP включается между DD9-10 и пики вокруг DD13-14 (рис. 1 d). Хотя общее количество клеток Lhx6::GFP продолжает увеличиваться в культуре, процент не делает, вероятно из-за распространения других линий. Однажды Lhx6::GFP + выражает репортер, он по-прежнему обнаруживаемая на неопределенный срок, поскольку Lhx6 стабильно выражается в зрелых МГЕ производные корковых интернейронов18,19. Хотя Nkx2.1 и Lhx6 выражение, основном non перекроя в мышиных переднего мозга, существует временной населения Nkx2.1::mCherry и Lhx6::GFP, совместно выражая клеток в культуре. Это по крайней мере частично объясняется perdurance mCherry репортер за пределами нормального срока Nkx2.1 выражение, как большая часть клетки двойной меченых не выражают обнаружению уровней Nkx2.1 белка (Тайсон и Андерсон, неопубликованные). Клетки, продолжает выражать Lhx6 репортер и вишня/Nkx2.1 белка могут быть полосатой интернейронов20. Однако, основываясь на наших живых изображений исследования, есть окно около 18 часов, которой можно изолировать синхронные, недавно пост митотическая прекурсоров, выражая Nkx2.1::mCherry и Lhx6::GFP (Tischfield Андерсон, неопубликованных и увидеть Tischfield и др. 17). Таким образом, собирая Nkx2.1::mCherry и Lhx6::GFP двойной положительный клетки в любой момент во время протокол, это можно получить популяция клеток, которые вышли преимущественно клеточного цикла в течение примерно 18 h друг от друга. Это в отличие от Nkx2.1::mCherry и Lhx6::GFP-только выражая клетки, которые представляют различные типы прародителями и прекурсоров, соответственно, из различной рождений.

Двойной репортер mESC линия Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP может использоваться для обогащения для SST-суждено интернейронов. В общем добавив Тсс культур и собирая GFP + клетки на более ранние моменты времени в дифференциации (например, DD12) обогащает SST подтипов. На основании наших наблюдений, мы не видели существенное различие в SST:PV соотношении в зависимости от того, добавляется ли Тсс DD5 или DD8 (данные не показаны). Добавив Тсс (50 нг/мл) от DD8-12 и затем пересадка GFP-только выражая клетки, мы получаем в среднем соотношении 7:1 SST:PV Цин (рисунок 2A)15,17. Более подробно о последствиях Тсс и времени в культуре межнейронного судьбы с помощью нашей двойной репортер mESC линии см Тайсон и др. 15

Для обогащения для PV-суждено Цин, Тсс следует исключить из культуры средств массовой информации. Следует отметить в соответствии с требованием Тсс сигнализации для поддержания Nkx2.1 выражение в митотическая прародителями21, Тсс сигнализации существует в этих культур без экзогенного SHH, добавляемый с Тсс сигнализации антагонист cyclopamine устраняет Nkx2.1 выражение15. Однако, если клетки повторно покрытием на DD8, этот эндогенного Тсс удален, такие что SAG (30 Нм) следует добавить средства массовой информации от DD8-10 для поддержания производства Цин и Nkx2.1 выражения. Наши предыдущие исследования показали, что путем удержания Тсс от условий, культуры и сортировка клеток Nkx2.1::mCherry+ на DD17, ~2.6:1 отношение PV:SST клетки могут быть получены (рис. 2B)15. В отличие от SST подтипы, которые обогащаются на ранних стадиях и при наличии экзогенных SHH, увеличение продолжительности в культуре и отсутствие экзогенных Тсс обогащает для PV подтипы15. В более недавнем исследовании мы обнаружили, что aPKCi, применительно к нашей «МГЕ» протокола значительно увеличивает долю Nkx2.1::mCherry прародителей, которые выражают циклин D217, маркер промежуточных прогениторных клеток22. Этот вариант протокола была основана на наших вывод, что PV-выражая Цин проистекают главным образом из промежуточных прародителями, тогда как SST прародителями возникают главным образом от радиального прародителями желудочковой поверхности23. Мы обнаружили, что когда сортируются и пересадить в неонатальной мыши коры головного мозга, эти предшественники сильно смещены для производства PV-подтипы. Путем добавления aPKCi DD8-11 и затем сортировка клеток Nkx2.1::mCherry мы смогли получить 5.8:1 отношение PV:SST подтипы (рис. 2 c)17. Для дальнейшего обогащения для PV подтипы, мы выделили Nkx2.1::mCherry клетки, выращенных в присутствии aPCKi DD8-17. Однако мы не удалось достичь увеличения коэффициента PV:SST за то, что мы смогли получить в DD11, несмотря на незначительное увеличение доли PV подтипы генерируется (Рисунок 2D). Блок-схемы для каждого из этих протоколов содержатся в рисунке 3. Иммуноокрашивания мыши мозги 30 дней после пересадки с анти PV, анти SST и анти GFP (для повышения идентификации Lhx6::GFP + клеток) антител показывает, что Lhx6::GFP + клетки exhibit Зрелые морфологические особенности с узорами PV и SST выражения сродни их в vivo коллегами (рис. 4 и 5).

Для помощи в определении, появляется ли дифференциация CIn успешно, мы подготовили серию изображений на каждом этапе протокола продемонстрировать нормальной изменчивости (рис. 6, Рисунок 7, рис. 8). Мы также включают в себя рис, демонстрируя, как неудачной дифференциация появляется на DD4 (рис. 9). В общем неудачных дифференцирования даст низкий уровень (менее 10%) Nkx2.1 выражения и процент Nkx2.1::mCherry и Lhx6::GFP индукции приблизительно 1% или меньше.

Figure 1
Рисунок 1: поколение прекурсоров, Nkx2.1::mCherry и Lhx6::GFP межнейронного. (A) показанный здесь представитель образы иммуноокрашивания для Nkx2.1, Nkx2.1::mCherry (ППП) и Lhx6::GFP (ГПУП) от дифференциации день 12 (DD12) культуры. Обратите внимание, что эти образы являются перекрывающимися каналы из той же поле зрения. (B) количественная оценка средний процент DAPI + ядер, которые выражают Nkx2.1 в DD12 в культуре (n = 3 независимых дифференцирования). Участок (C) представитель СУИМ, демонстрации четыре различных клеточных популяций, которые могут быть изолированы с помощью нашей двойной репортер mESC линии. Обратите внимание, что mCherry на оси x и GFP на оси y. Таким образом верхнем правом поле представляет ячейки, которые являются положительными mCherry GFP-двухместный. (D) время курс Nkx2.1::mCherry и Lhx6::GFP индукции от DD6-16, выраженные как процент клеток в культуре, которые являются mCherry только выражения, GFP-только выражения либо mCherry/GFP совместно выражения. Эти показатели были получены из клеток, выращенных в присутствии Тсс во время SST-обогащение протокол и представляют собой средние от 3 независимых дифференцирования. Погрешностей в (B) и (D) представляют собой SEM. шкалы бар = 150 мкм (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: манипуляции условий культуры обогащает дифференцированно для PV-против SST-суждено mESC производные корковых интернейронов. (A) доля из PV +, SST + и PV - SST-интернейронов получены при DD12, GFP-только выражая клетки, выращенных в присутствии Тсс (50 нг/мл) от DD5-12 пересаживают в неонатальной Неокортекс и проанализированы 30 дней после пересадки. (Б) процент от PV +, SST + и PV - SST-интернейронов получены при DD17, mCherry только выражая клетки выросли без дополнительного Тсс пересадить в неонатальной Неокортекс и проанализированы 30 дней после пересадки. (C) процент от PV +, SST + и PV - SST-интернейронов получены при DD11, mCherry только выражая клетки, выращенных в присутствии SAG (30 Нм; DD8-10) и aPKCi (2 мкм; DD8-11) пересаживают в неонатальной Неокортекс и проанализированы 30 дней после пересадки. (D) процент от PV +, SST + и PV - SST-интернейронов получены при DD17, mCherry только выражая клетки, выращенных в присутствии SAG (30 Нм) от DD8-10 и aPKCi (2 мкм) от DD8-17 пересаживают в неонатальной Неокортекс и проанализированы 30 дней После пересадки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: блок-схемы, иллюстрирующие различные PV - и SST-обогащение протоколы, описанные в настоящем исследовании. (A) для всех протоколов, шагов, ведущих к начала дифференциации, включая DD0-5 являются идентичными. Все клетки выращивают как embryoid тела от DD0-3 в N2:KSR (1:1) дополняется BMP-ингибитор LDN-193189 и ингибитора Wnt Демонического-939. DD3 клетки являются «приземлился» в N2:KSR (1:1), содержащий LDN-193189, Демонического-939 и рок ингибитор Y-27632. Чтобы обогатить для SST-подтипы, Тсс добавляется DD5-12. Кроме того Тсс добавляется DD8-12, поскольку в наш опыт, добавлением Тсс от DD5 против DD8 года значительно не снижают отношение PV:SST подтипы генерируется. Предыдущие версии протокола (см. Тайсон и др. 15) не включить повторно plating шаг на DD8 и вместо этого дополнения средств массовой информации с внешних Тсс на DD5. Этот протокол был позднее изменен включить повторно plating шаг на DD8 вместе с введением SHH, ни одна из которых существенно изменить отношение PV:SST. В настоящем Протоколе «высокой Тсс» Lhx6::GFP + клетки, выращенных при наличии экзогенных Тсс являются СУИМ, изолированные на DD12 для использования в нисходящие приложения. (B) для «низкая Тсс» PV-протокола, экзогенных SHH, а также повторно plating шаг на DD8 опущены. Вместо этого Nkx2.1::mCherry+ клетки являются СУИМ, изолированные на DD17 для использования в нисходящие приложения. (C) для «+ aPKCi» PV протокол, aPKCi добавляется вместе с SAG DD8-10, и только aPKCi добавляется от DD10 вперед. На DD11 или DD17 Nkx2.1::mCherry клетки являются СУИМ, изолированные для использования в нисходящие приложения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: PV и SST иммуноокрашивания в Lhx6::GFP + клетки 30 дней после трансплантации в неонатальной Неокортекс. (A) изображение высокой мощности SST-выражая, Lhx6::GFP + 30 дней после трансплантации клеток в неонатальной коры головного мозга. Внутри каждого столбца четыре изображения образы один канал Lhx6::GFP, PV и SST выражения с 3-канальный объединенного изображения в нижней части. Как показано в верхней панели, этот Lhx6::GFP + нейрон разрабатывает несколько процессов наводящий Зрелые морфологии. (B) высокой мощности изображение двух PV-выражения, Lhx6::GFP + клетки 30 дней после пересадки. (C) изображения высокой мощности SST- / PV-двойной негативный, Lhx6::GFP + клеток. Хотя эта ячейка разрабатывает несколько процессов в соответствии с полной дифференциации и корковые интеграции, эта ячейка не четко PV или SST. Обратите внимание, что рядом с Lhx6::GFP + клетки PV + ядро, но что он не перекрываются. Масштаб баров = 50 мкм (A-C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: средней и низкой мощности изображения экспрессии белков PV, SST и Lhx6::GFP 30 дней после трансплантации в неонатальной Неокортекс. (A) средней мощности изображение области коры головного мозга мыши, содержащих 30 Lhx6::GFP + клетки 30 дней после пересадки. Эти клетки были выращены с помощью протокола PV (+ aPKCi от DD8-11; СУИМ изолировать и трансплантации Nkx2.1::mCherry+ на DD11). 30 клеток, видел здесь 16 Экспресс PV, 4 express SST и 10 Экспресс PV ни SST. (B) малой мощности изображение области коры головного мозга мыши, содержащие многочисленные, высокодифференцированных Lhx6::GFP + клетки 30 дней после пересадки. Обратите внимание на обилие Lhx6::GFP + процессов, пробегает по всему коры. Также иногда клетки находятся в гиппокампе, где они появляются для интеграции и разработки процессов в соответствии с зрелой фенотип. Шкалы бар = 50 мкм (A); 550 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: нормальный вид мыши эмбриональных фибробластов фидер слоя и недифференцированных стволовых клеток. (A) показанный здесь находятся 4 X и 10 X увеличение brightfield изображений демонстрирует типичный внешний вид нашей мыши эмбриональных фибробластов (MEF) подачи слоями 24 ч после покрытия. (B) показано Вот типичный внешний вид нашей мыши эмбриональные стволовые клетки (mESCs) через 2 дня после покрытия на кормушки MEF. Обратите внимание, что колонии имеют яркие периметра и эллиптической или яйцевидные по внешнему виду. Если колоний потерять этот яркий периметра или начать прислать наружу прогнозов, это признаки того, что клетки могут различия. (C) показано здесь, mESCs 1 и 2 дней после повторного покрытия на желатин покрытием блюда для того, чтобы разбавлять, MEF питатели до начала дифференциации. Обратите внимание, что стволовые клетки расширить значительно после 48 ч на желатин и начинают обрести яйцевидные внешний вид с яркими периметра. Шкалы бар = 100 мкм в 4 X и 10 X фотографий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: внешнего вида мышиных эмбриональных стволовых клеток на дифференциации дней 1-7. (A) один день после плавающей, стволовые клетки можно увидеть формирование малых embryoid органов (EBs). На второй день EBs значительно выросли. Обратите внимание, что некоторые EBs застряли вместе и сформировали большие кластеры клеток. Мы не находим, что это негативно влияет на дифференциации. После 3 дней EBs выросли еще больше, и некоторые больше не пропускает свет через них. Это нормально, чтобы увидеть ячейки мусор в фоновом режиме. (B) показанный здесь находятся стволовые клетки 24 ч после приземления на дифференциации день 4 (DD4). Обратите внимание на плотность клеток. Многие начали расширять малые процессы, которые будет увеличиваться по мере дифференциации. Здесь следует отметить, что клетки даже цветные с маленькие черные точки, распространилась по всей. Если клетки являются блестящими или однородных появляться, что является признаком аберрантных дифференциации. (C), DD5, клетки продолжали размножаются и образуют нейронные розеток. Многие клетки продлил длинные, тонкие процессы. (D) по DD7, клетки должны быть вырожденная. Это нормально, чтобы увидеть шаблон «Швейцарский сыр», в которой большие, плоские, многоядерные клетки (возможно эпендимальных или глиальные клетки) создать круговой острова в пределах слоя нейронной прародителей. Иногда этот шаблон «Швейцарский сыр» когда плотность клеток выше, чем обычно, делает не развития, как показано в середине изображения. В зависимости от дифференциации это может повлиять на нейронной индукции. 4 x и 10 x укажите масштаб. Шкалы бар = 100 мкм в 4 X и 10 X фотографий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: появление дифференциации в дни 9-14. (A) отдельные клетки могут быть визуализированы один день после повторного покрытия. Обратите внимание на их биполярного внешний вид, который является типичным нейронных прародителей. Культура является однородной с несколько других типов инфильтрирующие клетки. Плотность подходит для этой стадии. (B), DD11, клетки превратились в монослоя. Похож на более ранних этапах в дифференциации, большой «яйцо как» многосторонних ядерных клеток может рассматриваться перемежаются всей. (C), DD13 клетки продолжают размножаться. Они теперь можно увидеть формирование мелких курганов. Многие клетки «яйцо как» по-прежнему присутствуют во всем. С этого момента Культура покажет лишь несколько изменений, за исключением курганов, расти больше. 4 X, 10Xx, и 20 X указывают на увеличение. Шкалы бар = 100 мкм в 4 X и 10 X фотографии и шкалы бар = 50 мкм 20 X фотографии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9: появление неудачной дифференциации на день 4. DD4 имеет важное значение с точки зрения оценки успеха дифференциации, потому, что он один из самых трудных шагов протокола: Посадка на DD3. По DD4 клетки имеют 24 h восстановить после отделять от embryoid органов. Как можно увидеть здесь, большинство из клетки являются блестящими и однородной появляться. Перемежаются всей являются случайные клетки, которые появляются нормальные, имея темный вид с маленькие черные точки, распространилась по всей. Кроме того большие плоские клетки (как можно увидеть на нижней левой панели) свидетельствует об ошибочной дифференциации. В нижней правой панели по крайней мере три небольшие группы клеток (Желтые стрелки) отображаются как малые embryoid тела, указанием неисправной дифференциации, неполной EB диссоциации или низкой приверженности к поверхности плиты культуры клеток. В отличие от показанных в Рисунок 7B, которые изображают здорового, нормального эти изображения появляются на DD4 ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя этот метод очень эффективен на кучность J1-производные mESCs (ПКРК-1010), мы испытали переменным успехом с другими mESC линий и клоновых изолятов. К примеру, Foxg1::venus mESCs (EB3-производных; Danjo и др. 13) реагируют плохо этот протокол и Foxg1 индукции, DD12 обычно составляет порядка 1-2%. По причинам, которые мы не понимаем, полностью другой Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP двойной репортер клон (называется JQ59), который был выделен одновременно как линия, указанных в настоящем Протоколе (называется JQ27), производит меньше, чем 1% Nkx2.1 выражая клетки при выращивании в одинаковых условиях. В родительской строке (J1; ATCC SCRC-1010), однако, хорошо реагирует на этот протокол и производит проценты Nkx2.1 выражая клеток на DD12, аналогичных показанным на рисунке 1B. При необходимости, концентрации Демонического-939 и SHH/SAG может корректироваться для оптимизации условий дифференциации на основе линии. Однако наш опыт, используя этот протокол дифференцировать других mESC линий в МГЕ как предшественники ограничен.

Что касается нашей Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP двойной репортер mESC линии не все Nkx2.1 + клетки Экспресс mCherry. Хотя почти все mCherry + клеток выразить белка Nkx2.1, репортер выражение отстает от Nkx2.1 белков, особенно во время ранних стадиях дифференцировки (DD7-9). Фракция Nkx2.1 + клеток, которые выражают mCherry неуклонно увеличивается на протяжении дифференциации. На пиковых уровнях (~ DD12-14) mCherry выражается в около 30% всех Nkx2.1, выражая прародителями17. Кроме того же бактериальных искусственных хромосом, используется для привода mCherry выражение используется для привода рекомбиназа КРР в доменах Nkx2.1 выражение трансгенных мышей24. В этих мышей Cre выражение было слабым в пределах Nkx2.1 выражая клетки спинной большинство региона MGE, и судьба сопоставления с этой мыши представляется недостаточной лейбл SST-выражая Цин, которые известны в основном создан из этого региона25, 26,27,28. Однако несмотря на эти расхождения, миллионы GFP или mCherry выражая клетки может быть изолированы с лишь несколько часов СУИМ.

Есть два основных преимущества этой методики. Во-первых в сочетании с нашей линии двойной репортер mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, можно получить большое количество межнейронного прекурсоров, обогащенный стать PV или SST-суждено корковых межнейронного подтипы. Вторым преимуществом является относительной легкостью, с которой большое количество межнейронного суждено клетки могут быть получены. Хотя несколько модифицированные методики EB дифференцировать МГЕ прародителями и нейронов, эти протоколы обычно полагаются на использование Wnt тормозящий молекул, таких как Dkk113,14,29. Мы нашли, что ингибитор Wnt Демонического-939 значительно повышает поколения pallidal telencephalic прародителями, о чем свидетельствует выражение Foxg1 и Nkx2.115.

Как упоминалось ранее, некоторые другие методы существуют для генерации МГЕ как предшественники из mESCs. Ватанабэ и др. 14 pioneered поле telencephalic дифференциации от mESCs быть первым, чтобы разработать метод культуры сыворотки бесплатно подвеска, следуют повторное хромирование адэрентных поверхность. Они обнаружили, что антагонисты Wnt и Nodal, Dkk1 и LeftyA, соответственно, эффективно управляли mESCs в начале нейроэктодермальная линий13. Применяя Тсс этих культур, они отметил, что между 5-15% от всех клеток в культуры совместно выразили Nkx2.1/Foxg1 и может рассматриваться как МГЕ как предшественники13. Однако закладывая основы для многих исследований в будущем, это исследование не имеют способ изолировать МГЕ прародителями или обогатить для конкретного подтипы CIn.

Несколько лет спустя, Danjo и др. 13 используется один и тот же метод культуры сыворотки бесплатные подвески в сочетании с приурочен администрации различных факторов роста, в частности SHH, для достижения субрегиональных спецификация mESC производные брюшной telencephalic тканей. С помощью строки репортер Foxg1::venus, они нашли что SHH администрации от DD3-12 после Dkk1 лечение привело между 45-68% от всех клеток в культуре, выражая репортер Foxg1::venus13. В рамках Foxg1::venus + населения приблизительно 32% клеток выражена Nkx2.113. Подставляя Тсс для SAG и добавляя Fgf8, они укреплены часть прародителей Nkx2.1 в пределах Foxg1::venus + населения приблизительно 41%13. Когда assayed для судьбы, эти клетки производятся приблизительно 17% SST, PV 21%, 18% NPY и 8% calretinin подтипы13. Однако хотя это исследование описал метод для указания КГЭ против МГЕ производные CIn судьбы, он не сделал описания метода выборочно обогатить PV или SST подтипов.

Следующем году, Cambray и др. 11 используется метод свободных сыворотки монослоя с повторного покрытия на DD5 для изучения эффект от activin на дифференциацию и личность telencephalic нейронных прекурсоров, производные от мыши и человеческие ЭСК. Хотя это исследование не сообщают процент клеток Nkx2.1, созданных в их протокол, они сообщают, что примерно 54% клеток в культуре совместно выразили Nestin/Foxg1 на DD2 (5 дней роста в сыворотке, свободные средства массовой информации следуют еще 2 дня культуры После повторного покрытия)11. Они также сообщили, что с добавлением activin, ~ 55% клеток совместно выразили Нестин и CouptfII, указав, что эти клетки могут представлять собой хвостовой Ганглиозный Высокопреосвященнейшего как клетки, которые производят большинство calretinin выражая корковых интернейронов 11. действительно, на 8 дней в культуре (13 дней общий) были обнаружены 39% клеток выразить совместно calretinin/BIII-тубулина, в то время как 59% клеток были найдены совместно Express ГАМК/BIII-тубулина11. Это исследование не рассматривал производства Фотоэлектрических или SST подтипы.

Снова с помощью модифицированного метода EB, Чэнь и др. 12 продемонстрировал что усилитель МГЕ конкретные элементы могут быть использованы следовать и очищают стволовых клеток получены МГЕ подобных клеток12. В этом исследовании они сравнивали различные культуры условий во время направленного дифференцирования mESCs в МГЕ как восходящей линии репортер Lhx6::GFP; той же линии, который служил в качестве родительского линия для линии двойной репортер Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, описанные в этой рукописи. Они показали, что, добавив Dkk1 в культуру условий от DD0-3, последованного за добавлением SAG, вверх ~ 10% от всех клеток в культуре выразил Lhx6::GFP12. Они также обнаружили, что тот же протокол, применяется к линии Foxg1::venus, характеризуется Danjo и др. 12, в результате примерно 37% от всех клеток, выражая Foxg1::venus репортер. Когда Lhx6::GFP клетки были трансплантированы в естественных условиях, следующие средние проценты CIn подтип маркеров было отмечено: 22% ПВ, SST 58% и 16% NPY12.

Совсем недавно другие группы использовали принудительный выражение линии определение факторов транскрипции непосредственно указывать Цин. Вероятно первая демонстрация этого был Петрос и др. 10 , который используется доксициклин индуцибельной промоутер для привода Nkx2.1 выражение в Ainv15 mESCs, которые были изменены, чтобы содержать Lhx6::GFP бактериальных искусственных хромосом. Это исследование используется культура условия, аналогичные описанным в текущем рукописи, но без добавления Демонического-93910. Однако по причинам, которые плохо понимают, на тех же условиях дифференциации по сравнению с при использовании материнской линии J1 Lhx6::GFP, описанные в этой рукописи10наблюдались более низкий процент Lhx6::GFP + клеток. Несмотря на достижение аналогичного уровня Foxg1 выражение (всего % неизвестно), существует умеренное сокращение общего количества Nkx2.1 клеток с без больше чем 2% от всех клеток, выражая репортер Lhx6::GFP10. Это исследование подчеркивает естественные различия, которые существуют между различными ESC линии и проблем, с которыми сталкиваются исследователи при попытке применить дифференциация протоколы к ESC линии отличаются от тех, которые были использованы для первоначально разработки протоколов.

С помощью элегантный подход, Au и др. 9 используется последовательный принудительного выражение факторов транскрипции для создания конкретных подтипы корковых интернейронов, используя ту же парадигму брюшной telencephalic дифференциация, разработанная Ватанабэ et al. 14 в то время как они не сообщают точные проценты Foxg1 +, Nkx2.1 + и Olig2 + прекурсоров, произведенных в культуре, они заявляют, что примерно 50% всех клеток в культуре дифференцированы в ГАМК нейронов9. На 11 дней после дифференциации EBs были отделены и пересадить в MGE E13.5 хост эмбрионов9. Небольшой процент из них (менее 1%) мигрировали от MGE в коре головного мозга, где они были определены по их Dlx5/6-eGFP репортер и проанализированы для судьбы9. Авторы отметили различные проценты PV, SST и КГЭ как судьбы на основе стратегии их выбрали наддува9. Интересно, что с выражением транскрипционного фактора Lmo3, они наблюдали в среднем приблизительно 57% ПВ, SST 21% и 15% КГЭ производные подтипы (SST- / рилина + или VIP-только +)9. Наибольший процент SST подтипы наблюдается был получен с помощью GOF Nkx2.1/Dlx2 линия, которая подготовила приблизительно 32% SST, PV 35% и 25% КГЭ производные подтипы9.

В 2015 году, Colasante и др. 30 показал, что принудительный выражение пяти факторов транскрипции (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5 и Lhx6) в пределах фибробластов от мышей репортер GAD67-GFP преобразованы 15% от всех клеток в ГАМК как Цин. Удивительно около 90% этих клеток пошел выразить PV, с только редкие клетки, выражая SST30. Хотя этот метод не применяется к mESCs, оно было использовано с человеческой iPSCs, где предполагалось, что примерно 30% от всех клеток принят ГАМК личность30.

Как показано на рисунке 2, существует несколько способов создания обогащенных населения PV или SST Цин. Основными преимуществами использования aPKCi PV-протокол по DD17 протоколу являются большее количество клеток один можно изолировать телефоны, жизнеспособность и продолжительность культуры. Хотя мы не показывать данные для уровней индукции DD17 на рис. 1, есть примерно вдвое больше mCherry + клеток в DD11 как на DD17 (данные не показаны). При сборе клеток для трансплантации, мы находим, что большее количество начиная клеток (см. ниже) является полезным, поскольку примерно 30-50% клеток теряются в процессе сосредоточения их для инъекций. Кроме того большее количество клеток могут быть получены с короче СУИМ раз, который ограничивает количество времени, которое клетки находятся на льду и снижает общую стоимость. Вероятно потому, что более высокий процент вишни + клеток являются прародителями, клетки от более ранних стадиях развития культуры (например, DD11) демонстрируют более выживания, по сравнению с DD17 клеток после пересадки в неонатальной Неокортекс. Когда большое количество жизнеспособных клеток необходимы, например в случае трансплантации клеток для лечения эпилепсии, имея большую жизнеспособность и больше начального населения является основным преимуществом.

Как показано на рисунке 2, в зависимости от протокола, примерно 25-39% Lhx6::GFP + клеток проанализированы 30 дней после пересадки не выражают обнаружению уровней PV или SST белка с рутинной иммуногистохимия. Как правило, эти PV- / SST-клетки Экспресс ГАМК, а также Sox6, маркер МГЕ производные корковых интернейронов (см. Тайсон и др. 15, Tischfield и др. 17). менее 1% ПВ- / SST - Lhx6::GFP + клеток Экспресс маркеры других подгрупп межнейронного, например calretinin, рилин или нейропептида Y (данные не показаны). Это похоже на сопоставление в vivo судьба исследования, которые показали, что между ~ 15-25% МГЕ производные интернейронов не выражают PV или SST23,25,31. Когда Nkx2.1::mCherry+ или Lhx6::GFP + клетки изолированы и покрытием на крыса корковых кормушки в пробирке, мы обнаружили, что ~ 40-70% Lhx6::GFP + клеток, проанализированы после 28 дней в культуре PV-/ SST-, с большинством из тех, которые окрашивают положительных выражая SST. Это увеличение PV- / SST-клетки могут быть из-за отсутствия внешняя тенденциозным сигнала, что настоящее в естественных условиях, как особенно может быть случай для зрелой PV выражение, или неоптимальной электрофизиологических ввода от клетки фидера. Независимо от причины могут быть, мы предпочитаем трансплантации клеток в неонатальной Неокортекс судьба анализ, а не в vitro дифференциации.

Для большинства экспериментов трансплантации, мы рекомендуем плавающей на DD0 как минимум двух 10-см не сторонник тканевой культуры блюд каждый содержащий 7,5 x 105 mESCs в 10 мл N2/KSR (7,5 x 104 клеток/мл; общий объем 20 мл). Вместе обе пластины обычно принесут 8-12 х 106 клеток после EB диссоциация на DD3, из которых 5.4 x 106 клеток может использоваться для семян двух 6-ну тканевые культуры рассматриваются пластины (50 000 клеток/см2; приблизительно 110 см2 всего). По DD8 каждая пластина 6-Ну дает примерно 5-7 x 107 клетки, которые затем могут быть использованы для заполнения еще трех до пяти 6-ну пластины на плотности 250.000 клеток/см2 (требуется в общей сложности 4.05 x 107 клеток в случае трех 6-а плиты или 6,75 x 107 клеток в случае пяти 6-ну пластины). По DD14 каждый 6-ну плиты обычно даст 1-2,5 х 106 mCherry или GFP-выражая клетки. В зависимости от потребностей эксперимента мы плавали минимум 7,5 x 105 mESCs для мелких иммуногистохимия анализ свыше 6 x 106 mESCs для больших трансплантации проектов.

Наиболее важные шаги протокола поддержание mESCs в состоянии плюрипотентных до начала дифференциации и посадки/диссоциации шаг на DD3. Если клетки были сохранены правильно и посадки/диссоциация на DD3 делается тщательно, дифференциация обычно будет успешным. Только стволовые клетки, которые появляются здоровые и должны быть использованы для дифференциации. Если EBs не образуют между DD0-3 или образуют несколько, маленькие, асимметричные органы, дифференциация скорее всего будет неудачной. Кроме того во время EB диссоциация на DD3, EB следует тщательно контролировать пока больше не видимые глазом, чтобы избежать продолжительного воздействия содержащих клеток диссоциации регент не трипсина.

Представленные в настоящем документе результаты были получены в оптимизированных условиях с использованием реагентов, контролем качества. Это важно, к сведению, поскольку у нас иногда трудности достижения надежного Nkx2.1 индукции и расширение, mCherry и репортер экспрессия гена GFP. Основываясь на нашем опыте, мы считаем, что лот для лота изменчивость скорее счетов FBS для этих изменений. Таким образом это разумно для тестирования различных много FBS для определения, которые работают лучше всего для поддержания mESCs. Хотя мы не использовали систему 2i/LIF (сыворотка свободный носитель, содержащий MEK ингибитор PD03259010 и ГСК 3α/β ингибитор CHIR99021), вполне возможно, что сыворотка бесплатная mESC условий может привести к более последовательные результаты. Мы протестировали не, однако, эта гипотеза и нет данных о том, затрагивает ли использование сыворотки бесплатная mESC СМИ дифференциация mESCs в МГЕ как предшественники. Кроме того, не забудьте использовать свежие факторы роста, когда это возможно, aliquoting их для одноместного размещения. В зависимости от пользователя плотность клеток может потребоваться увеличить для достижения адекватного ячейку выживания, особенно на этапе посадки на DD3.

Интернейронов имеют замечательную способность выжить, миграции и интеграции в хост цепь после трансплантации. Таким образом, этот протокол может использоваться для трансплантации межнейронного прекурсоров в эпилептические мыши и другие модели неврологических и нервно-психических заболеваний (см. Саутвэлл и др. 32 и33 Тайсон и Андерсон для обзоров межнейронного ячейки на основе терапии). Например в недавнем исследовании Дониган и др. 34 обогащенные населения PV и Цин SST для трансплантации в мышиной модели шизофрении. Они обнаружили, что PV и SST обогащенный трансплантации производятся различные эффекты на поведение мыши, PV обогащенный населения, нормализации endophenotypes шизофрении, что они изучают.

В последние годы система transposon PiggyBac использовался для достижения стабильной выражение трансгенов в ряде систем. Мы использовали эту систему быстро и легко создавать стабильно выражая доксициклин индуцибельной Мирна конструкции для изучения роли конкретных генов в процессе разработки межнейронного. Мы также с использованием этой технологии для создания двойной репортер mESC линий, которые выражают channelrhodopsin-2 (ChR2) optogenetically диск mESC производные интернейронов или DREADD рецептор технологии, чтобы включить или выключить пересаженные клетки en masse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарны Цин Сюй для разработки Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP двойной репортер mESC линии, а также Дженнифер Тайсон, Асиф Маруф и Тим Петрос для их ранние работы на оказание помощи в разработке этого протокола. Мы также благодарим Чоп потока цитометрии ядро для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана NIH R01 MH066912 (SA) и F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Нейробиологии выпуск 130 мозга мышь межнейронного дифференциация коры культуры клеток стволовые клетки трансплантация
Дифференциация мышиных эмбриональных стволовых клеток в корковых межнейронного прекурсоров
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tischfield, D. J., Anderson, S. A.… More

Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter