Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Bu iletişim kuralı kortikal interneuron ataları ve sonrası Mitotik interneuron öncüleri fare embriyonik kök değiştirilmiş bir embryoid vücut monolayer yöntemi kullanarak hücre oluşturmak için bir yöntem açıklanır. Bu ataları/hareketlenme öncesi ilk belirtiler kullanılan vitro olabilir fluorescently sıralanmış ve kader tayini çalışmak için yenidoğan yeni korteksimiz içine nakledilen veya tedavi uygulamalarında kullanılan.

Abstract

GABAergic kortikal interneurons heterojen bir nüfus eksitatör piramidal nöronların çıkışını düzenleyen hem de piramidal nöron topluluklar çıkışlarını eşitleme kritik rol oynarlar hücre vardır. İnterneuron işlevinde açıkları nöropsikiyatrik bozukluklar, şizofreni, otizm ve epilepsi gibi çeşitli karıştığı olmuştur. Embriyonik kök hücrelerden kortikal interneurons türetme sadece kendi geliştirme ve fonksiyon incelenmesi için izin verir, ama kortikal interneuron ile ilgili bozukluklar patogenezinde temel moleküler mekanizmaları görmemizi sağlar. İnterneurons da hayatta, göç ve bütünleşmek içine ana bilgisayar kortikal devresi sonrası nakli, yapım onları kullanmak için ideal aday hücre tabanlı terapiler için olağanüstü kapasitesine sahip. Burada, bir ölçeklenebilir, yüksek verimli, değiştirilmiş embryoid vücut monolayer yöntemi interneuron ataları Nkx2.1 ifade etmek ve onların döl fare embriyonik kök hücreler (mESCs) üzerinden türetme için mevcut. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift muhabir mESC satırını kullanarak, Nkx2.1 ataları veya onların Lhx6 ifade sonrası Mitotik döl olabilir (FACS) sıralama Floresans aktif hücre ile izole ve daha sonra aşağı akım uygulamaları bir dizi kullanılacaktır. Ayrıca parvalbumin (PV) veya somatostatin için (SST) interneuron alt grupları, hangi-ebilmek var olmak yararlı kader tayini yönlerini çalışmak için veya kullanmak için alt grubu vitaminlerle zenginleştirilmiş interneuron yararlanacak terapötik uygulamalarda zenginleştirmek için yöntemler sağlar nakillerine.

Introduction

Fareler ve insanlar içinde kabaca tüm kortikal inhibitör interneurons (CIns) yarısı nerede medial ganglionic hazretleri (MGE) bilinen bir geçici subcortical yapısı içinde kaynaklanan neuroepithelial ataları, CIns ve diğer nöronal ve gliyal alt gruplar transkripsiyon faktörü Nkx2.11,2hızlı. CIn alt gruplar veya alt türlerinden kesişen morfolojik, nörokimyasal, Elektrofizyolojik ve bağlantı özellikleri3,4tarafından tanımlanır. MGE elde edilen CIns gruplandırılabilir çoğunlukla üst üste alt gruplar PV veya SST, hangi ilişkilendirir belirli Elektrofizyolojik ve bağlantı eğilimler5ile ifade onların ifade dayalı. İşlev bozukluğu interneurons, özellikle o PV alt grubu içinde birden çok nöropsikiyatrik bozukluklar ve hastalıklar6,7' karıştığı olmuştur. Bu yöntem genel amacı Mitotik ataları kök hücre kaynaklı ve göçmen öncüleri PV veya SST CIn kader kortikal interneuron biyoloji okuyan ve kullanılmak üzere hücre tabanlı terapiler için zenginleştirilmiş üretmektir.

İnterneuron ataları Nkx2.1 ifade etmek ve onların döl mESCs gelen türetme ölçeklenebilir ve yüksek verimli bir yöntem geliştirdik. Bir Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP kullanarak çift muhabir mESC kaplamak8, Nkx2.1 ataları ya da onların Lhx6 ifade sonrası Mitotik döl FACS yolu ile izole ve daha sonra aşağı akım uygulamaları bir dizi kullanılacaktır. Sinyal yolları bir dizi, kültür süresi ve neurogenesis modu manipüle ederek, biz fluorescently etiketli interneuron öncüleri aşağı akım uygulamaları bir dizi için uygun milyonlarca alabilirsiniz.

MESCs9,10,11,12,13,14, Wnt üzerinde dayanır bizim yöntem MGE benzeri ataları oluşturmak için birkaç yöntem mevcut olmasına rağmen antagonist XAV-939, Foxg1/Nkx2.1 telencephalic ataları ortak ifade oluşturma özellikle verimli. Buna ek olarak, interneuron ataları veya onların sonrası Mitotik Lhx6 ifade döl çift muhabir sistemimiz üzerinden seçin yeteneği büyük ölçüde farklı ataları ve onların döl üretmek için kapasite artırır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Bu protokol için açıklanan çift muhabir mESC hattı (sande@mail.med.upenn.edu) istek üzerine sağlanmaktadır.

1. medyası hazırlama

Not: tüm medya hücre kültüründe kullanmadan önce 37 ° c sıcak.

  1. Fare embriyonik Fibroblast (MEF) medya (hazırlığı 500 mL)
    1. Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) ve bir 500 mL 0,22 µm gözenek filtre ünitesi filtreden 449 ml 50 mL fetal sığır serum (FBS) ekleyin.
    2. 1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg/mL) filtrasyon sonra ekleyin. 1 ay veya aliquot ve ≤ dükkanında 4 ° C'de medya saklamak-20 ° c
  2. N2 medya (hazırlığı 500 mL)
    1. 5 mL L-alanin-L-glutamin ekleyin (100 x) ve 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) 489.5 ml DMEM: Besin karışımı F-12 (DMEM/F-12) ve 500 mL 0,22 µm gözenek filtre ünitesi filtreden.
    2. 1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg/mL) ve 5 mL N2 ek-B filtrasyon sonra ekleyin. Medya 4 ° c ilâ 1 ay boyunca karanlıkta saklayın.
  3. (500 mL hazırlığı) serum-Alerjik büyüme orta (KSR)
    1. 75 mL serum-Alerjik orta ek, 5 mL L-glutamin ekleyin (100 x), 5 mL MEM sigara-esansiyel Amino asitler (MEM-NEAA) (100 x), ve 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) 413.5 mL sigara-glutamin içeren DMEM ve filtre 500 mL 0,22 µm gözenek filtre birimi üzerinden.
    2. 1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg/mL) filtrasyon sonra ekleyin. Medya 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.
  4. Fare embriyonik kök hücre medya (hazırlığı 500 mL)
    1. 75 mL kök hücre sınıf FBS, 5 mL MEM-NEAA ekleyin (100 x), 5 mL L-glutamin (100 x), ve 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) 413.5 mL sigara-glutamin içeren DMEM ve filtre 500 mL 0,22 µm gözenek filtre birimi üzerinden.
    2. 1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg/mL) filtrasyon sonra ekleyin. Medya 4 ° C'de 1 ay veya aliquot ve ≤ mağazasında için karanlıkta saklamak-20 ° c

2. Kültür mESCs

  1. Plaka mitotically etkin olmayan MEF besleyici hücreler MEF medya doku kültürü üzerine 3-4 x 104 hücreleri/cm2tabak tedavi. En az 12 h onları mESCs kaplama daha önce bir hücre kültür kuluçka ≥ % 95 bağıl nem ve % 5 CO2 37 ° C'de yerleşmek izin verir. Hemen değil kullandıysanız, her 3 günde MEF ortamı değiştirin. MEFs kaplama 7 gün içinde kullanılmayan eğer atın.
  2. MESCs (1-4 x 104 hücreleri/cm2yoğunluk aralığı) MEF plakaları fare lösemi inhibitör faktör (mLIF) (1000 U/mL) içeren mESC medya ekleyin. ≥ % 95 bağıl nem ve % 5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  3. Geçiş tripsin-EDTA (% 0.05 tripsin) kullanarak mESCs (1:5-1:10) çanak olur sonra ~ % 70-80 birleşmesi veya koloniler dokunmaya başlıyor. Bu genellikle 2 günde ortaya çıkar, ancak ilk kaplama yoğunluğu bağlı olarak 4 veya 5 gün sürebilir.
  4. MESCs mESC orta pluripotency tutmak için MEF besleyici katmandaki korumak.
  5. Farklılaşma başlamadan önce en az bir kez üzerine jelatin kaplı plakaları olmadan MEFs sulandırmak için MEFs hücreleri geçiş.
    1. % 0.1 ekleyerek jelatin kaplı plakalar fosfat tamponlu tuz (PBS) ile Ca2 +/Mg2 + bir doku kültürü tedavi çanak içinde jelatin hazırlamak ve en az 1 h. plaka 1.5-2 x 106 hücreler/10 cm tabak için 37 ° C'de bırakarak (2.7-3.6 x 104 hücre/cm2) ve hücre farklılaşması başlamadan önce 2 gün boyunca genişletmek izin verir.

3. mESCs MGE benzeri Telencephalic ataları doğru ayırt

  1. Farklılaşma gün (DD) 0 "hücreleri float" =
    1. MESCs büyüdü sonra jelatin kaplı levha 2 gündür medya Aspire edin ve PBS olmadan Ca2 +/Mg2 +bir kez hücrelerle yıkayın. Yeterli tripsin-plaka (tipik olarak 4 mL tripsin-EDTA bir 10 cm doku kültürü yemek için) yüzeyine kapak ve geri içine ≥95% bağıl nem ve % 5 CO2 37 ° C'de kuluçka makinesi 4 dk için hücreleri yerleştirmek için EDTA (% 0.05 tripsin) ekleyin.
    2. 4 dk sonra mESC medya ile 2 kez birimi kullanan tripsin-EDTA gidermek. Hücreleri bir uygun ölçekli santrifüj tüpü aktarmak ve hücreleri 200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi. 5 dk sonra tüpü çıkarması ve medya Pelet bozmadan Aspire edin. BMP inhibitörü LDN-193189 içeren Pelet 1 ml KSR:N2 medya (1:1) resuspend (250 nM) ve Wnt inhibitörü XAV-939 (10 µM).
    3. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonu ölçmek. LDN-193189 içeren KSR:N2 medya (1:1) 75.000 hücre/mL ekleyerek olarak embryoid organları (EBs) hücreleri büyüyen Başlat (250 nM) ve XAV-939 (10 µM) yapışık olmayan doku kültürü yemekleri. ≥ % 95 bağıl nem ve % 5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  2. DD1 üzerinde "kaplama doku kültürü tedavi yemekleri ile Poli-L-lizin (10 µg/mL PBS ile Ca2 +/Mg2 +) tarafından bir gecede açılış" hücre (O/N) ≥ % 95 bağıl nem ile 37 ° C'de veya en az 1 h için hazırlayın.
  3. DD2, Poli-L-lizin Aspire edin ve laminin (10 µg/mL PBS ile Ca2 +/Mg2 +) ile plakalar ceket O/N ≥ % 95 bağıl nem ile 37 ° C'de.
    Not: O/N optimal, gibi küçük ise 2 h yeterli olabilir. Tabak diğer gün kullanılmazsa, laminin Aspire edin, PBS ile Ca2 +/Mg2 +değiştirin ve 4 ° C'de 2 hafta için saklamak.
  4. DD3 ("Kara hücreleri")
    1. EB ayrılma işlemine başlamadan önce laminin Aspire edin ve tabakaları bana izin tamamen kuru bir doku kültürü Hood. Parlak veya gözle görülür ıslak görünen plakaları kullanmayın. EBs medya ile 15 mL tüp ve 15 g x veya EBs pelleted kadar 3-4 dk santrifüj içine aktarın.
  5. Medya Aspire edin ve 3 mL Dnaz içeren hücre dekolmanı çözümü ekleyin (2 U/mL) ve ≥ % 95 bağıl nem ile 37 ° C'de kuluçkaya ve % 5 CO2 15 dakika süreyle yavaşça EB ayrılma yardım için tüp her 3 dakikada fiske.
  6. EBs artık görünür veya 15dk geçen kez Dnaz içeren 6 mL KSR:N2 (1:1) eklemek (1 U/mL) ve 200 x g de 5 dk santrifüj.
  7. KSR:N2 (1:1) LDN-193189 içeren hücrelerde plaka (250 nM), XAV-939 (10 µM) ve ROCK inhibitörü Y-27632 (10 µM) 4.5-5 x 104 hücreleri/cm2.

4. SST zenginleştirici Protokolü: "DD12 GFP yüksek Sonic Kirpi (SHH)" (Adım 3.7 devamı)

  1. DD5 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) ve SSH (50 ng/mL).
  2. Gün 8 (Adım 4.4) yeniden kaplama için doku kültürü tabak hazırlamak 3.2-3.3 adımlarda açıklanan yönergeleri kullanarak.
  3. DD7 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) ve ŞŞŞ (50 ng/mL).
  4. DD8 üzerinde hücreleri yeniden plaka.
    Not: Bu adım gerekli değildir, ancak hücreleri yeniden kaplama erken farklılaşmış, istenmeyen hücre tipleri azaltabilir. Yeniden kaplama aynı zamanda aşağı akım immunohistokimyasal analizleri yapmak zor hücre topları keser ve sonraki zaman noktalarda FACS verimliliğini artırır.
    1. Hücreleri yeniden plaka, plaka ile tripsin-EDTA (% 0.05 tripsin) hücrelerden ≥95% bağıl nem ve % 5 CO237 ° C'de 5 min için ayırmak için. KSR:N2 ile 2 kez birimi kullanan tripsin-EDTA gidermek ve 5 dakika süreyle 200 x g, santrifüj filtre hücreleri herhangi bir kümeleri kaldırmak için 40 µm filtre tüpünden. FGF-2 içeren hücreler 250.000 hücreler/cm2 N2/KSR (1:1)'de yeniden plaka (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) ve Y-27632 (10 µM) ŞŞŞ ile (50 ng/mL).
      Not: Bunun yerine, karar DD8 sayfasındaki hücreleri yeniden plaka değil yaptıysanız, medya ŞŞŞ içeren KSR:N2 ile değiştirmek (50 ng/mL) DD12 DD7 her 2 gün ve IGF-1 eklemeye devam edin (20 ng/mL) ve FGF-2 (10 ng/mL) DD9 kadar.
  5. DD10 üzerinde medya ŞŞŞ içeren KSR:N2 ile değiştirmek (50 ng/mL).
  6. DD12 üzerinde SST alt için zenginleştirilmiş hücreleri elde etmek için FACS Lhx6::GFP belirlemek için kullanın-sadece hücreleri ifade.
    1. Hücreleri ayırmak için bir sigara tripsin içeren hücre-ayrılma reaktif tripsin-EDTA yerine kullanın. Hücreleri bir kez PBS olmadan Ca2 +/Mg2 +ile yıkayın. Dnaz içeren önceden ısıtılmış tripsin sigara içeren hücre-ayrılma reaktif ekleyin (2 U/mL) hücreleri. Kuluçka makinesi 10-30 dk ya kadar hücreleri bağlantısız ≥95% bağıl nem ve % 5 CO2 37 ° C'de yer onları. Yavaşça plakaları her 5 dk ayrılma yardım için dokunun.
      Not: DD11-12 kültürler için sadece 10-15 dk gerekli olabilir. DD15-16 kültürler için 30 dakika veya daha fazla tam ayrılma için gerekli olabilir.
    2. Hücreleri tamamen tabağını kaldırdı, standart protokolleri kullanarak FACS izolasyon için ilerlemek veya diğer aşağı akım analizleri hücrelerdeki kullanmak.

5. PV zenginleştirici Protokolü: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi"--dan adım 3.7 (devamı)

  1. DD5 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL) ve IGF-1 (20 ng/mL).
  2. DD8 yeniden kaplama için doku kültürü tabak hazırlamak (Adım 4.4) kullanma yönergeleri özetlenen adımlar 3.2-3.3.
  3. DD7 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL) ve IGF-1 (20 ng/mL).
  4. DD8 üzerinde hücreleri aşağıdaki istisnalar 4.4. adımda açıklandığı gibi yeniden plaka: hücreleri yeniden kaplama, ŞŞŞ ile smoothened agonist yerine (SAG; 30 nM) ve atipik PKC inhibitörü (aPKCi; 2 µM) ekleyin. Birlikte, yeniden hassasiyette medya ele alındığında şimdi N2/KSR (1:1) FGF-2 içeren (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM) ve aPKCi (2 µM).
  5. DD10 üzerinde medya aPKCi (2 µM) içeren KSR:N2 ile değiştirin.
  6. DD11
    Not: Bu noktada, Nkx2.1::mCherry+ hücreleri PV CIns olmak için zenginleştirilmiş.
    1. 4.6. adımda belirtilen aynı iletişim kuralını kullanarak FACS için plaka hücrelerden ayırmak. Karar daha sonra bir farklılaşma gün Nkx2.1::mCherry+ hücreleri toplamak için bu adımı dikkate almayın.
  7. DD12 üzerinde medya aPKCi (2 µM) içeren KSR:N2 ile değiştirin. DD14 üzerinde medya aPKCi (2 µM) içeren KSR:N2 ile değiştirin. DD16 üzerinde medya aPKCi (2 µM) içeren KSR:N2 ile değiştirin. DD17 üzerinde 4.6. adımda belirtilen aynı iletişim kuralını kullanarak Nkx2.1::mCherry+ hücreleri toplamak.

6. PV zenginleştirici Protokolü: "DD17 mCherry düşük ŞŞŞ" (Adım 3.7 devamı)

  1. DD5 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL) ve IGF-1 (20 ng/mL). DD7 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL) ve IGF-1 (20 ng/mL).
  2. DD9 üzerinde medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirin. Bu noktadan itibaren hiçbir ek büyüme faktörleri gereklidir.
    1. 2 günde DD17 hücrelerdeyse hasat kadar medya değiştirmeye devam.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu raporda açıklanan iletişim kuralı bizim yayımlanmış protokolleri15,16,17 değiştirilmiş bir versiyonu ve Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift-muhabir mESC hattımız ile kullanım için optimize edilmiştir. DD0-5 DD8 yeniden kaplama ile birlikte, Wnt inhibitörü XAV-939 ekleyerek neyin yukarı tüm DAPI + çekirdeği kültüründe % 50'si de Nkx2.1 (şekil 1A, B) ifade eden sağlam Nkx2.1 indüksiyon elde etmek. MCherry ve GFP gazetecilere immünhistokimya net ifade Nkx2.1 pozitif immunoreactivity (şekil 1A) bölgeleri içinde gösterir. FACS canlı hücre yerel muhabir kullanarak gösterir hücre dört nüfus açıkça ayrılmış olabilir: (1) GFP/mCherry çift negatif hücreleri, (2) mCherry hücreleri, (3) yalnızca GFP ifade hücreleri ve (4) GFP/mCherry çift ifade hücreleri ( ifade yalnızca Şekil 1 c). Bu satırı kullanarak, ataları küçük bir kısmını mCherry muhabir DD8-9 etrafında açmak başlar. MCherry seviyeleri DD12-13 arasında zirve ve ataları hücre döngüsünün çıkın ve sonrası Mitotik Lhx6::GFP + interneuron öncüleri (şekil 1 d) üretmek gibi sürekli düşüş. Buna bağlı olarak, DD9-10 ve tepeler arasında Lhx6::GFP muhabir açar DD13-14 (şekil 1 d) çevresinde. Her ne kadar Lhx6::GFP hücre toplam sayısı kültüründe artmaya devam ediyor, yüzde muhtemelen diğer soy yayılması nedeniyle yok. Süresiz olarak Lhx6 stabil MGE elde edilen olgun kortikal interneurons18,19' ifade edilir beri bir kez Lhx6::GFP + muhabir ifade, bu tespit kalır. Nkx2.1 ve Lhx6 ifade olmasına rağmen büyük ölçüde içinde fare ön üst üste, Nkx2.1::mCherry ve kültür hücrelerinde ortak ifade Lhx6::GFP geçici bir nüfusu vardır. Çift etiketli hücrelerin çoğu Nkx2.1 protein (Tyson ve Anderson, yayınlanmamış) algılanabilir seviyede ifade değil gibi bu en azından kısmen perdurance bir Nkx2.1 ifade, normal süre ötesinde mCherry muhabir kaynaklanmaktadır. Lhx6 muhabir ve kiraz/Nkx2.1 protein hızlı devam hücreleri striatal interneurons20olabilir. Ancak, bizim canlı görüntüleme çalışmaları üzerinde bağlı olarak, bir pencere var yaklaşık 18 h neyin zaman uyumlu, yeni sonrası Mitotik öncüleri Nkx2.1::mCherry ve Lhx6::GFP ifade izole olabilir (Tischfield Anderson, yayınlanmamış ve Tischfield ve ark gördüm 17). böylece, Nkx2.1::mCherry ve Lhx6::GFP Çift Kişilik pozitif hücrelerinin herhangi bir iletişim kuralı sırasında toplayarak, bir nüfus ağırlıklı olarak hücre döngüsü içinde yaklaşık 18 h birbirlerinin bölgeden çıkış yaptılar hücre elde etmek mümkün olmuştur. Nkx2.1::mCherry ve Lhx6::GFP aksine bu-sadece hücreleri, çeşitli türde ataları ve öncüleri, sırasıyla değişen birthdates temsil ifade.

Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift-muhabir mESC satır için SST-kaderde interneurons zenginleştirmek için kullanılabilir. Genel olarak, ŞŞŞ kültürler için ekleme ve GFP + toplama SST alt için hücreleri (örneğin, DD12) ayrımında önceki zaman noktalarda zenginleştiriyor. Bizim gözlem dayalı, biz DD5 veya DD8 ŞŞŞ eklenip eklenmeyeceğini bağlı olarak SST:PV oranı önemli bir fark görmedim (veri gösterilmez). ŞŞŞ ekleyerek (50 ng/mL) DD8-12 ve salt GFP ifade hücre nakli, biz ortalama SST:PV CIns (şekil 2A)15,177:1 oranı elde etmek. ŞŞŞ ve zamanın kültür etkileri bizim çift-muhabir mESC satırını kullanarak interneuron kaderi hakkında daha ayrıntılı bilgi için bkz: Tyson vd. 15

İçin PV-kaderde CIns zenginleştirmek için ŞŞŞ kültür ortamından göz ardı edilmelidir. Not, Mitotik ataları21, ifadesinde Nkx2.1 korumak sinyal ŞŞŞ şartı ile tutarlı ŞŞŞ sinyal bu kültürlerde eksojen ŞŞŞ antagonisti cyclopamine ortadan kaldırır sinyal ŞŞŞ beri eklenen olmadan var Nkx2.1 ifade15. Hücreleri yeniden DD8 üzerinde kaplama ise, ancak, bu endojen ŞŞŞ kaldırıldı, böyle o SAG (30 nM) medyaya DD8-10'dan Nkx2.1 ifade ve CIns üretimi korumak için eklenmelidir. Bizim önceki çalışma gösterdi ki kültür şartlarından ŞŞŞ stopaj tarafından ve Nkx2.1::mCherry+ hücrelerin DD17 üzerinde sıralama, PV:SST hücre ~2.6:1 oranında (şekil 2B)15alınamadı. SST aksine daha önceki aşamalarında ve eksojen ŞŞŞ huzurunda zenginleştirilmiş, alt türlerinden birini kültür süresi arttı ve eksojen ŞŞŞ eksikliği için PV alt türlerinden15zenginleştiriyor. Daha yeni bir çalışmada, bulduğumuz o aPKCi bizim "MGE" protokolü için önemli ölçüde uygulanan siklin D217, bir işaretleyici ara progenitör hücre22hızlı Nkx2.1::mCherry ataları kısmını artırır. SST ataları ventrikül yüzey23Radyal ataları öncelikle kaynaklanan ise bu protokolü varyasyon ara ataları öncelikle CIns PV ifade kaynaklanan bizim bulma dayanıyordu. Bulduğumuz zaman sıralanmış ve neonatal fare yeni korteksimiz nakledilen, bu ataları büyük ölçüde PV alt türlerinden üretmek için önyargılı vardır. APKCi DD8-11'den ekleme ve sonra Nkx2.1::mCherry hücreleri sıralama, PV:SST alt türlerinden (şekil 2C)175.8:1 oranı elde etmek başardık. PV alt türleri için daha da zenginleştirmek için aynı zamanda aPCKi DD8-17 huzurunda yetiştirilen Nkx2.1::mCherry hücreleri izole ettim. Ancak, biz de DD11 PV alt türlerinden (şekil 2B) oluşturulan yüzdesi marjinal bir artış rağmen elde etmek başardık ötesinde PV:SST oranında bir artış elde ettin değil. Bu iletişim kurallarının herbiri için akış çizelgeleri şekil 3' te yer alır. Immunostaining fare beyinliler 30 gün sonrası organ nakli anti-PV, anti-SST ve (Lhx6::GFP + hücre tanımlaması geliştirmek için) anti-GFP antikorlar gösterir Lhx6::GFP + hücre desenleri PV ve SST ifade ile olgun Morfolojik özellikleri sergilemek vivo karşılıkları akin to (şekil 4 ve şekil 5).

Bir CIn farklılaşma başarılı görünür olup olmadığını belirlemede yardımcı olmak için biz normal değişkenliği (şekil 6, Şekil 7, şekil 8) göstermek için iletişim kuralı her aşamasında bir dizi resmi hazırladık. Biz de başarısız bir farklılaşma DD4 üzerinde nasıl görüneceğini gösteren bir rakam içerir (Şekil 9). Genel olarak, başarısız saptamaları seviyesinin düşük (az % 10) Nkx2.1 ifade ve Nkx2.1::mCherry ve Lhx6::GFP indüksiyon yaklaşık % 1 veya daha az oranlarda ortaya çıkarır.

Figure 1
Şekil 1: Nkx2.1::mCherry ve Lhx6::GFP interneuron öncüleri nesil. (A)gösterildi burada kültüründen bir farklılaşma gün 12 (DD12) Nkx2.1, Nkx2.1::mCherry (RFP) ve Lhx6::GFP (GFP) için immunostaining temsilcisi görüntülerdir. Not Bu görüntüler aynı görüş alanı kanallardan örtüşmez. Nkx2.1 DD12, kültür ifade DAPI + çekirdeği ortalama yüzdesini (B) miktar (n = 3 bağımsız saptamaları). (C) temsilcisi FACS arsa bizim çift muhabir mESC satırını kullanarak ayrılmış olabilir dört farklı hücre popülasyonlarının gösteren. X ekseni üzerinde mCherry olduğunu ve GFP y ekseni üzerinde olduğunu unutmayın. Bu nedenle, en iyi doğru kutusunda mCherry/GFP-çift pozitif hücreleri temsil eder. (D) saat ders Nkx2.1::mCherry ve Lhx6::GFP indüksiyon DD6-16 salt mCherry ifade, salt GFP ifade veya mCherry/GFP ortak ifade hücre kültüründe yüzdesi olarak ifade edilir. Bu yüzdeleri ŞŞŞ huzurunda bir SST zenginleştirici iletişim kuralı sırasında yetiştirilen hücrelerden elde edilmiştir ve ortalamalar 3 bağımsız saptamaları temsil eder. Hata çubukları (b) ve (D) temsil SEM ölçek çubuk 150 µm (A) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Kültür koşulları manipülasyon differentially PV için zenginleştirir-SST-kaderde karşı mESC kortikal interneurons türetilmiş. (A)yüzde, PV +, SST + ve PV- / SST-interneurons ne zaman elde DD12, ŞŞŞ huzurunda yetiştirilen salt GFP ifade hücreleri (50 ng/mL) yenidoğan yeni korteksimiz DD5-12 den nakledilen ve 30 gün sonrası nakli analiz. (B) yüzde, PV +, SST + ve PV- / SST-interneurons elde edilen DD17, sadece mCherry ifade olmadan ek ŞŞŞ yenidoğan yeni korteksimiz nakledilen ve 30 gün analiz sonrası nakli yetiştirilen hücrelerin zaman. (C) yüzde, PV +, SST + ve PV- / SST-interneurons ne zaman elde DD11, SAG huzurunda yetiştirilen salt mCherry ifade hücreleri (30 nM; DD8-10) ve aPKCi (2 µM; DD8-11) yenidoğan yeni korteksimiz nakledilen ve 30 gün sonrası nakli analiz. (D) yüzde, PV +, SST + ve PV- / SST-interneurons ne zaman elde DD17, SAG huzurunda yetiştirilen salt mCherry ifade hücreleri (30 nM) yenidoğan yeni korteksimiz nakledilen DD8-10 ve aPKCi (2 µM) DD8-17 ve 30 gün analiz sonrası nakli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Bu çalışmada açıklanan farklı PV - ve SST-zenginleştirici protokolleri gösteren akış çizelgeleri. (A)tüm iletişim kuralları için giden adımları DD0-5 de dahil olmak üzere farklılaşma başlangıcı aynıdır. Tüm hücreleri N2:KSR (1:1) embryoid organları BMP-inhibitörü LDN-193189 ve Wnt inhibitörü XAV-939 ile DD0-3 olarak yetişir. DD3 üzerinde hücreleri "LDN-193189, XAV-939 ve ROCK inhibitörü Y-27632 içeren N2:KSR (1:1) indi". SST-alt için zenginleştirmek ŞŞŞ DD5-12 den eklenir. Alternatif olarak, deneyim, ŞŞŞ DD5 DD8 karşı dan eklenmesi itibaren oluşturulan PV:SST türlerinden oranı önemli ölçüde etkilemez beri ŞŞŞ DD8-12 den eklenir. Önceki sürümleri Protokolü'nün (Tyson ve arkbkz. 15) DD8 yeniden kaplama bir adım dahil değildir ve bunun yerine medya DD5 üzerinde eksojen ŞŞŞ ile desteklenmiştir. Bu iletişim kuralı daha sonra yeniden hassasiyette basamakta DD8 ŞŞŞ, ikisi de önemli ölçüde PV:SST oranı alter getirilmesi ile birlikte dahil etmek için değiştirilmiş. Bu "yüksek-ŞŞŞ" iletişim kuralında, huzurunda eksojen ŞŞŞ yetiştirilen Lhx6::GFP + DD12 üzerinde aşağı akım uygulamalarda kullanmak izole FACS hücrelerdir. (B) "düşük-ŞŞŞ" PV-protokol eksojen ŞŞŞ yanı sıra DD8 yeniden hassasiyette basamakta göz ardı edilir. Bunun yerine, Nkx2.1::mCherry+ DD17 üzerinde aşağı akım uygulamalarda kullanmak izole FACS hücrelerdir. (C) için "+ aPKCi" PV protokolü, aPKCi DD8-10 SAG birlikte eklenir ve yalnızca aPKCi DD10 ileriye eklendi. DD11 veya DD17, Nkx2.1::mCherry aşağı akım uygulamalarda kullanmak izole FACS hücrelerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Lhx6::GFP + hücreler 30 gün sonrası organ nakli yenidoğan yeni korteksimiz içine PV ve SST immunostaining. (A)yüksek güç görüntü bir SST-ifade, Lhx6::GFP + hücre 30 gün sonrası nakli yenidoğan yeni korteksimiz içine. Dört görüntüleri her sütun içinde tek kanal Lhx6::GFP, PV ve SST ifade ile 3 kanallı birleştirilen görüntünün altındaki görüntülerdir. Üst paneldeki gösterildiği gibi bu Lhx6::GFP + nöron birden çok işlem olgun bir Morfoloji müstehcen ayrıntılandırdığı. (B) yüksek güç görüntü iki PV ifade sonrası 30 gün Lhx6::GFP + hücre nakli. (C) yüksek güç görüntü SST- / PV-çift negatif, Lhx6::GFP + hücre. Bu hücre birden çok işlem tam farklılaşma ve kortikal entegrasyonu ile tutarlı ayrıntılandırdığı rağmen bu hücre açıkça PV veya SST hızlı değil. Not bir çekirdek PV + Lhx6::GFP + hücresinin yanındaki ama o değil üst üste. Ölçek çubukları 50 µm (A-C) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Orta ve düşük güç PV, SST ve Lhx6::GFP protein ifade görüntülerini 30 gün sonrası nakli içine yenidoğan yeni korteksimiz. (A)orta güç görüntüsü fare yeni korteksimiz 30 Lhx6::GFP + hücreler 30 gün sonrası organ nakli içeren bir bölge. Bu hücreler kullanarak PV Protokolü (+ aPKCi DD8-11; yetiştirilmiştir FACS yalıtmak ve Nkx2.1::mCherry+ DD11 üzerinde nakli). Burada görülen 30 hücrelerinin 16 PV hızlı, 4 SST ifade ve PV de SST 10 hızlı. (B) düşük güç görüntü çok sayıda, içeren fare yeni korteksimiz bölgesinin iyi farklılaşmış Lhx6::GFP + hücreler 30 gün sonrası organ nakli. Korteks akan Lhx6::GFP + işlemleri bolluk unutmayın. Ara sıra hücreleri de entegre ve süreçleri ile olgun bir fenotip tutarlı ayrıntılı için göründükleri Hipokampus bulunur. Ölçek çubuğu = 50 µm (A); 550 µm (B). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: fare embriyonik fibroblast besleyici katman ve farklılaşmamış kök hücreler Normal görünümünü. (A)gösterildi burada 4 X ve 10 X büyütme aydınlık alan fotoğraf bizim fare embriyonik fibroblast (MEF) Besleyici tipik görünümünü Katmanlar 24 saat sonra kaplama gösteren vardır. (B) burada bizim fare tipik görünümünü embriyonik kök hücreler (mESCs) 2 gün sonra MEF besleyiciler üzerine kaplama gösterilir. Koloniler parlak bir çevre ve eliptik veya Oval görünüşte olduğunu unutmayın. Koloniler bu parlak çevre kaybeder veya dışa projeksiyonları göndermek başlar bunlar hücreleri ayırt işaretlerdir. (C) gösterildi burada mESCs 1 ve 2 gün sonra yeniden jelatin kaplı yemekleri MEF besleyiciler farklılaşma başlamadan önce dışarı sulandırmak için kaplama vardır. Not kök hücre jelatin üzerinde önemli ölçüde 48 saat sonra genişletin ve parlak bir çevre ile oval bir görünüm yeniden almak başlar. Ölçek çubuğu = 4 X 100 µm ve 10 X resim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: fare embriyonik kök hücre görünümünü farklılaşma günlerde 1'den 7. (A) bir gün sonra yüzen, kök hücreleri görülebilir oluşturan küçük embryoid bedenler (EBs). İkinci gün tarafından EBs büyümüş önemli ölçüde. Not Bazı EBs arada sıkışmış ve hücre daha büyük kümeler kurdu. Bu olumsuz yönde farklılaşma etkiler bulamıyorum. 3 gün sonra EBs daha büyük büyümüş ve bazı artık onları aracılığıyla ışık iletimi. Arka plan hücre artıkları görmek için normaldir. (B) gösterildi burada kök hücre farklılaşması günde 4 iniş sonra 24 saat (DD4) vardır. Hücreleri yoğunluğu unutmayın. Birçok küçük oluşum, farklılaşma devam ederken hangi-ecek artmak genişletmeye başladı. Burada dikkat hücreleri bile boyunca yayılmış küçük siyah noktalar ile renklendirilir. Hücreleri parlak veya homojen görülen iseniz, bu anormal farklılaşma işarettir. (C) tarafından DD5 hücreleri çoğalırlar ve sinirsel rozet şeklinde devam etmiştir. Hücrelerin çoğu uzun, ince süreçleri genişletmiştir. (D) DD7 tarafından hücreleri Konfluent olmalıdır. Neyin geniş, düz, multinucleated hücreleri (muhtemelen ependymal veya gliyal hücreler) dairesel adalara sinirsel ataları tabakası içinde oluşturmak bir "İsviçre peyniri" model görmek normaldir. Zaman zaman hücre yoğunluğu normalden daha yüksek olduğu zaman, bu "İsviçre peyniri" desen geliştirme değil, orta resimdeki gösterildiği gibi yapar. Farklılaşma bağlı olarak, bu sinir indüksiyon etkileyebilir. 4 x ve 10 x büyütme oranını gösterir. Ölçek çubuğu = 4 X 100 µm ve 10 X resim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: gün 9'dan 14 farklılaşma görünümünü. (A)tek hücreleri bir gün sonra yeniden kaplama görüntülenir. Sinirsel ataları tipik bipolar görünümlerini unutmayın. Birkaç diğer infiltrating hücre tipleri ile homojen bir kültürdür. Bu aşama için uygun yoğunluğudur. (B) DD11 tarafından hücreleri monolayer büyüdü. Daha önceki aşamaları ayrımında, büyük benzer "yumurta gibi" çok çekirdekli hücreler boyunca serpiştirilmiş görülebilir. (C) DD13 tarafından hücrelerin prolifere devam etmiştir. Onlar şimdi küçük tepecikler şekillendirme görülebilir. Birçok "yumurta gibi" hala mevcut boyunca hücrelerdir. Bu noktadan itibaren kültür daha büyük büyüyen Höyük dışında sadece birkaç değişiklik gösterecektir. 4 X, 10Xx, ve 20 X büyütme oranını gösterir. Ölçek çubuğu 100 µm 4 X ve 10 X resim ve ölçek çubuğu = 20 X Fotoğraflar 50 µm =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9: günde 4 başarısız bir farklılaşma görünümünü. DD4 Protokolü'nün en zor adımlardan birini takip çünkü ayırt etme başarısını değerlendirmek açısından önemli: DD3 inişte. DD4 tarafından hücreleri embryoid vücutlarından ayrışmış sonra kurtarmak için 24 saat oldu. Burada görüldüğü gibi parlak ve homojen görünen hücrelerin çoğu vardır. Boyunca serpiştirilmiş boyunca yayılmış küçük siyah noktalar ile koyu bir görünüme sahip normal görünüyor ara sıra hücrelerdir. Buna ek olarak, (gibi alt sol panelinde görülebilir) büyük düz hücreleri anormal farklılaşma işaret etmektedir. Alt sağ panelde hücre (sarı ok) en az üç küçük grupları hatalı farklılaşma, eksik EB ayrılma veya hücre kültür plaka yüzeyine zavallı bağlılık gösteren küçük embryoid bedenler olarak görünür. Bu görüntüleri gösterilenlerle aksine tasvir şekil 7Biçinde sağlıklı, normal hücrelere DD4 görünüyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yöntem J1 kaynaklı mESCs (SCRC-1010) desenlendirme son derece etkili olmakla birlikte, diğer mESC çizgileri ve klonal yalıtır değişken başarı yaşadım. Örneğin, Foxg1::venus mESCs (EB3 kaynaklı; Danjo vd. 13) yanıt kötü bu protokolü ve Foxg1 indüksiyon DD12 tarafından genellikle sırasına % 1-2 olur. Tam olarak anlamıyorum nedeniyle, aynı anda (JQ27 denir) Bu protokol için açıklanan satır olarak izole edildi (JQ59 denir) başka bir Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift muhabir klon üretir az %1 yetiştirilen Nkx2.1 ifade hücreleri Aynı koşullar altında. Üst çizgi (J1; ATCC SCRC-1010), ancak, bu protokol için de yanıt verir ve Nkx2.1 ifade hücreleri üzerinde DD12 bu şekil 1Badımında gösterilen benzer oranlarda üretir. Gerekirse, XAV-939 ve ŞŞŞ/SAG konsantrasyonları farklılaşma koşulları satır satır bazında optimize etmek için ayarlanabilir. Ancak, diğer mESC satırları MGE benzeri ataları ayırt etmek için bu iletişim kuralını kullanan bizim deneyim sınırlıdır.

Bizim Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift muhabir mESC satırıyla ilgili olarak tüm Nkx2.1 + hücre mCherry hızlı. Her ne kadar hemen hemen bütün mCherry + hücre Nkx2.1 protein hızlı, muhabir ifade Nkx2.1 protein ifade, özellikle farklılaşma (DD7-9) erken aşamalarında gerisinde kalmaktadır. Kesir mCherry giderek hızlı Nkx2.1 + hücre farklılaşması ders boyunca artar. En yüksek düzeyde (~ DD12-14) mCherry tüm Nkx2.1 ataları17ifade yaklaşık % 30 dile getirdi. Ayrıca, sürücü mCherry ifade için kullanılan aynı bakteriyel yapay kromozomu Cre recombinase transgenik fareler24Nkx2.1-ifade etki alanlarında sürücü için kullanılmıştır. Bu farelerde Cre-ifade Nkx2.1 ifade hücreleri MGE çoğu sırt bölgesinin içinde zayıf ve kader-eşleme bu fare ile büyük ölçüde bu bölge25oluşturulacak bilinen altında etiket SST ifade CIns ortaya çıktı, 26,27,28. Ancak, bu tutarsızlıklar rağmen GFP veya mCherry ifade hücreleri milyonlarca ile sadece birkaç saat FACS ayrılmış olabilir.

Bu tekniğin iki ana avantajı vardır. İlk olarak, Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift-muhabir mESC hattımız ile birleştirildiğinde, PV veya SST-kaderde kortikal interneuron alt türlerinden olmak için zenginleştirilmiş interneuron öncüleri çok sayıda elde etmek mümkündür. İkinci ana avantajı hangi sayıda interneuron hücreleri elde edilebilir kaderde göreli kolaylıkla olmasıdır. MGE ataları ve neurons ayırt etmek için çeşitli diğer değiştirilmiş EB teknikler mevcut olmasına rağmen bu iletişim kuralları genellikle Wnt inhibitör molekülleri Dkk113,14,29gibi kullanımı güveniyor. Biz Foxg1 ve Nkx2.1 ifade15tarafından kanıtlanan Wnt inhibitörü XAV-939 pallidal telencephalic ataları, üretimi büyük ölçüde artırır bulduk.

Daha önce belirtildiği gibi MGE benzeri ataları mESCs oluşturmak için birkaç yöntem mevcut. Watanabe vd. 14 mESCs üzerinden telencephalic farklılaşma alan yeniden yapisan bir yüzey kaplama tarafından takip bir serum serbest süspansiyon kültür yöntem geliştirmek için ilk olmanın tarafından öncülük etmiştir. Wnt ve Nodal antagonistleri, Dkk1 ve LeftyA, sırasıyla, verimli bir şekilde mESCs erken nöroektodermal soy13sürdü buldular. Bu kültürler ŞŞŞ uygulayarak, onlar ortak ifade Nkx2.1/Foxg1 kültür ki tüm hücrelerinin % 5-15 arasında gözlenen ve MGE benzeri ataları13kabul edilebilir. Ancak, birçok çalışma gelmek için temel atma sırasında bu çalışmada MGE ataları yalıtmak veya belirli CIn alt türlerinden zenginleştirmek için bir yol yoktu.

Birkaç yıl sonra Danjo vd. 13 ventral telencephalic dokuların mESC elde edilen alt özellikleri elde etmek için çeşitli büyüme faktörleri, belirli ŞŞŞ, zamanlanmış yönetim ile birlikte aynı serum serbest süspansiyon kültür yöntemi kullanılır. Dkk1 tedavi tüm hücreleri % 45-68'i arasında Foxg1::venus muhabir13ifade kültüründe sonuçlandı sonra Foxg1::venus muhabir satırını kullanarak, o ŞŞŞ yönetim DD3-12 den buldular. Foxg1::venus + nüfus, içinde hücre yaklaşık % 32 Nkx2.113dile getirdi. ŞŞŞ SAG için yerine ve Fgf8 ekleyerek, daha fazla Nkx2.1 ataları Foxg1::venus + nüfusun yaklaşık % 4113içinde kısmını arttırmak. Kader için denetlesinler ne zaman bu hücreler yaklaşık % 17 SST, % 21 PV, %18 NPY ve % 8 calretinin alt türlerinden13üretti. Ancak, bu çalışmada CGE MGE kaynaklı CIn kaderi karşı belirtmek için bir yöntem tarif ederken, seçmeli olarak PV veya SST alt türlerinden zenginleştirmek için bir yöntem tarif değil.

Ertesi yıl, Cambray vd. 11 bir serum-Alerjik monolayer DD5 üzerinde yeniden kaplama ile çalışma aktivin farklılaşması üzerine etkisi ve fare ve insan ESCs elde telencephalic sinirsel öncüleri kimliği için kullanılan yöntem. Bu çalışmada onların iletişim kuralında oluşturulan Nkx2.1 hücre yüzdesi rapor vermedi rağmen onlar hücre kültüründe yaklaşık % 54 Nestin/Foxg1 (5 gün ücretsiz medya kültürünün 2 gün ek tarafından takip serum büyüme DD2 ortak ifade raporu sonra yeniden kaplama)11. Aynı zamanda aktivin eklenmesiyle, hücrelerin % ~ 55 testin ve bu hücreler kortikal interneurons calretinin ifade çoğunluğu üretmek Kaudal ganglionic Hazretleri benzeri hücreleri temsil edebileceğini belirten CouptfII, ortak ifade bildirilmiştir 11. Nitekim, kültür (13 gün genel) 8 gün hücrelerinin % 39 hücrelerinin % 59 GABA/Bill-tübülin11ortak hızlı bulundu iken calretinin/Bill-tübülin, ortak ifade etmek için bulundu. Bu çalışmada üretimin PV veya SST alt türlerinden incelemek değil.

Kullanarak yeniden değiştirilmiş bir EB yöntemi, Chen vd. 12 öğeleri izleyin ve kök hücre elde edilen MGE benzeri hücreler12arındırmak için kullanılabilir o MGE özgü artırıcı gösterdi. Bu çalışmada, farklı kültür koşulları etkisini mESCs yönlendirilmiş saptamaları MGE benzeri ataları Lhx6::GFP muhabir satırını kullanarak içine sırasında karşılaştırıldığında; Bu el yazması açıklanan Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift-muhabir satırı için üst satır olarak hizmet aynı çizgi. Onlar için kültür Dkk1 ekleyerek DD0-3, koşulları takip yukarı, SAG, ek tarafından gösterdi ~ kültür tüm hücrelerin % 10 ifade Lhx6::GFP12. Ayrıca bu Danjo vd tarafından açıklanan Foxg1::venus satırına uygulanan aynı iletişim kuralını bulmuşlar 12, Foxg1::venus muhabir ifade tüm hücreleri yaklaşık % 37 sonuçlandı. Lhx6::GFP hücreleri transplante vivo içindeiken, CIn alt tür işaretleri aşağıdaki ortalama oranlarda görülmektedir: % 22 PV, % 58 SST ve % 16'npy12.

Daha yakın zamanlarda, diğer gruplar doğrudan CIns belirtmek için lineage tanımlama transkripsiyon faktörleri zorla ifade kullanılır. Belki de bu ilk gösteri Petros vd tarafından yapıldı. Doksisiklin indüklenebilir organizatörü Nkx2.1 ifade Ainv15 mESCs içinde bir Lhx6::GFP bakteriyel yapay kromozomu içerecek şekilde değiştirilmiş sürücü eskiden 10 . Bu çalışmada kullanılan kültür koşullar geçerli el yazması ama XAV-93910ek olmadan açıklananlara benzer. Ancak, kötü anlaşılır nedeniyle, daha düşük bir yüzde Lhx6::GFP + hücre gözlendi bu el yazması10dakika sonra açıklanan J1 Lhx6::GFP üst satırı kullanırken göre aynı farklılaşma koşullar altında. Foxg1 benzer düzeyde elde rağmen Nkx2.1 toplam sayısı ılımlı bir azalma oldu ifade (Toplam % bilinmeyen), ile hayır hücreleri Lhx6::GFP muhabir10ifade tüm hücrelerin % 2 den büyük. Bu çalışmada çeşitli ESC satırları ve sorunları arasında ESC satırları bu aslında protokolleri geliştirmek için kullanılan farklı farklılaşma iletişim kuralları uygulamak çalışırken bu araştırmacılar yüzü mevcut doğal farkları vurgulamaktadır.

Kullanarak bir zarif yaklaşım, Au vd. 9 transkripsiyon faktörleri sıralı zorla ifade belirli alt türlerinden kortikal interneurons Watanabe vd tarafından geliştirilen aynı ventral telencephalic farklılaşma paradigması kullanarak oluşturmak için kullanılan 14 Foxg1 +, Nkx2.1 + ve kültüründe üretilen Olig2 + öncüleri kesin yüzdeler rapor değil iken, onlar tüm hücreler kültür yaklaşık % 50'si GABAergic nöronlar9içine ayrıştırılan devlet. 11 gün sonrası farklılaşma EBs ayrışmış ve E13.5 MGE ana bilgisayar embriyo9nakledilmektedir. Küçük bir yüzdesi bu (az % 1) nerede olduğunu kendi Dlx5/6-eGFP muhabir tarafından tanımlanan ve için kader9analiz korteksin içine MGE göç. Yazarlar, PV, SST ve onların seçilmiş zorla indüksiyon strateji9dayalı CGE benzeri kader yüzdelerini çeşitli görülmektedir. İlginçtir, transkripsiyon faktörü Lmo3 ifadesi ile onlar ortalama yaklaşık % 57 PV, % 21 SST ve % 15 CGE kaynaklı alt türlerinden gözlenen (SST- / reelin + ya da VIP-tek +)9. SST alt türlerinden gözlenen en büyük yüzdesi yaklaşık % 32 SST, % 35 PV ve % 25 CGE kaynaklı alt türlerinden9üretilen bir Nkx2.1/Dlx2 GOF satırını kullanarak elde edildi.

2015 yılında, Colasante vd. 30 beş transkripsiyon faktörleri (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5 ve Lhx6)--dan GAD67-GFP muhabir fareler fibroblastlar içinde zorla ifade GABAergic gibi CIns tüm hücrelerin % 15 dönüştürülmüş gösterdi. Dikkat çekici, bu hücreler yaklaşık yüzde 90'ını PV, yalnızca ile nadir hücreleri SST30ifade ifade etmek için gitti. Her ne kadar mESCs için bu yöntem uygulanmadı, insan iPSCs ile tüm hücreleri yaklaşık % 30'u GABAergic kimlik30kabul nerede tahmin edilmiştir kullanılmıştır.

Şekil 2' de gösterildiği gibi PV veya SST CIns zenginleştirilmiş nüfus oluşturmak için birkaç yolu vardır. PV-protokolü kullanarak aPKCi en önemli avantajları DD17 protokolü üzerinden hücreleri bir daha fazla sayıda izole, hücre canlılığı ve kültür süresi vardır. Biz şekil 1' de veri DD17 indüksiyon düzeyleri için görünmüyor rağmen orada yaklaşık iki katı kadar mCherry + hücre DD11 olduğu gibi DD17 (veri gösterilmez). Daha fazla sayıda hücre nakli için toplarken bulabileceğimizi hücreleri (aşağıya bakın) başlayan faydalı olduğunu, yaklaşık 30-%50 hücre olduğundan enjeksiyon için zenginleştirme sürecinde kayıp. Ayrıca, hücreleri daha çok sayıda kısa FACS süreleri de buzda hücrelerdir süreyi sınırlar ve toplam maliyeti düşürür elde edilebilir. Muhtemelen kiraz + hücreler daha yüksek bir yüzdesi çünkü ataları, kültür (örneğin, DD11) daha önceki aşamalarında hücrelerden DD17 hücrelere ekimi yenidoğan yeni korteksimiz içine sonra karşılaştırıldığında daha fazla hayatta kalma sergi. Hücrelerin çok sayıda gerektiğinde, örneğin epilepsi, tedavi etmek için hücre transplantasyonu durumunda daha büyük başlangıç nüfus ve büyük canlılık olması önemli bir avantajı var.

Şekil 2' de, protokol bağlı olarak tasvir Lhx6::GFP + hücre yaklaşık % 25-39 30 gün sonrası nakli PV veya SST protein ile rutin immünhistokimya algılanabilir seviyede hızlı değil analiz. Genel olarak, bu PV- / SST-hücreleri ifade GABA yanı sıra Sox6, bir işaretleyici kortikal interneurons MGE kaynaklı (bkz: Tyson vd. 15, Tischfield vd. 17)., PV - az % 1 / SST - Lhx6::GFP + hücre calretinin, reelin veya peptit Y gibi diğer interneuron alt gruplar hızlı işaretleri (veri gösterilmez). Bu arasında göstermiştir vivo içinde kader Haritalama çalışmaları için benzer ~ MGE elde edilen interneurons % 15-25 PV veya SST23,25,31hızlı değil. Ne zaman Nkx2.1::mCherry+ ya da Lhx6::GFP + hücreleri izole ve sıçan kortikal besleyiciler vitrokaplama, bulduk ~ 40-%70 sonra 28 gün içinde kültür PV - analiz Lhx6::GFP + hücre / SST-, bu da olumlu leke çoğunluğu ile SST ifade ediyorum. Bu artış, PV- / özellikle olgun PV ifade veya besleyici hücrelerden suboptimal Elektrofizyolojik giriş için durum olabilir olarak SST-hücreleri mevcut vivo içindebir dışsal maturational sinyal yokluğu nedeniyle olabilir. Nedeni ne olursa olsun, kader vitro yerine analiz farklılaşması için yenidoğan yeni korteksimiz içine hücre nakli tercih ederim.

Çoğu nakli deneyler için en az 10 cm yapışık olmayan doku kültürü tabağı DD0 üzerinde yüzen içeren her 7.5 x 105 mESCs 10 ml N2/KSR öneririz (7,5 x 104 hücre/mL; 20 mL Toplam hacim). Birlikte, her iki tabak genellikle 8-12 x 106 hücre EB ayrılma DD3 hangi 5.4 x 10 /6 hücre iki 6-iyi doku kültürü tedavi tabak (50.000 hücreleri/cm2; yaklaşık 110 cm2 toplam) tohum için kullanılabilir üzerinde sonra ortaya çıkarır. DD8 tarafından her 6-şey plaka yaklaşık 5-7 x daha sonra beş 6-şey tabak (gerektiren 4.05 x 107 hücreleri üç 6-şey durumunda toplam 250.000 hücreler/cm2 yoğunluğu adlı ek bir üç temel için kullanılabilir 107 hücreleri verir. plakalar veya 6.75 x 107 hücreleri beş 6-şey tabak durumunda). DD14 tarafından her 6-şey plaka genellikle 1-2. 5 x 106 mCherry veya hücreleri GFP ifade verecektir. Deneme kullanımı gereksinimlerine bağlı olarak, en az 7,5 x 105 mESCs 6 x 106 mESCs büyük nakli projeler için yukarı için küçük ölçekli immünhistokimya analizleri için satışa çıkardı.

Protokolü'nün en önemli adımlar başlangıçta farklılaşma öncesi pluripotent durumunu ve DD3 açılış/ayrılma basamakta mESCs korumak. Hücreleri bakımı düzgün yapıldı mı ve iniş/ayrılma DD3 üzerinde dikkatle yapılır, farklılaşma genellikle başarılı olur. Yalnızca kök sağlıklı görünür ve farklılaşma için kullanılması gereken hücreler. EBs DD0-3 arasında oluşturmak veya birden fazla form için başarısız olursa, küçük, asimetrik organları, farklılaşma başarısız olma olasılığı yüksektir. Ayrıca, EB ayrılma DD3 sırasında EB'ın dikkatle artık görünür kadar sigara tripsin içeren hücre-ayrılma regent güneşe maruz önlemek için göz tarafından takip edilmelidir.

Sonuçları bu raporda sunulan kalite kontrollü reaktifler kullanarak en iyi duruma getirilmiş koşullarda elde edilmiştir. Biz zaman zaman sağlam Nkx2.1 indüksiyon ulaşmada zorluk beri nota ve uzantısı, mCherry ve GFP muhabir ifade tarafından bu önemlidir. Bizim deneyime dayalı, biz o çok çok değişkenlik bu değişikliklerin FBS olasılıkla hesaplarının inanıyoruz. Bu nedenle, FBS hangi en iyi mESCs korumak için çalışır belirlemek için farklı bir sürü test etmek akıllıca olacaktır. Her ne kadar biz-si olmak değil kullanılmış 2i/LIF sistem (serum-Alerjik orta MEK inhibitörü PD03259010 ve GSK-3α/β engelleyici CHIR99021 içeren), serum-Alerjik mESC koşulları daha tutarlı sonuçlar doğurabilir mümkündür. Ancak, bu hipotezi test etmedim ve mESC serum-Ücretsiz medya kullanımı mESCs farklılaşma MGE benzeri ataları içine etkileyip olarak hiç veri yok. Ayrıca, taze büyüme faktörleri mümkün olduğunda aliquoting tarafından kullandığınızdan emin olun Tek Kişilik Kullanım için bunları. Kullanıcı bağlı olarak hücre yoğunluğu DD3 açılış basamakta sırasında özellikle yeterli hücre yaşam elde etmek için arttırılması gerekebilir.

İnterneurons hayatta, göç ve ana bilgisayar-devreleri sonrası nakli entegre olağanüstü kapasitesine sahiptir. Bu nedenle, bu iletişim kuralını interneuron öncüleri epileptik fare modelleri ve nörolojik ve nöropsikiyatrik hastalığın diğer modelleri nakli için kullanılan (bkz: Southwell vd. 32 ve Tyson ve Anderson33 yorum yapılmamış interneuron hücre için terapileri temel). Örneğin, bir son çalışmada Donegan vd. 34 zenginleştirilmiş PV ve SST CIns olasılığını şizofreni bir fare modeli içine nakli için. PV ve SST üretilen nakli fare davranışı üzerinde farklı etkileri ders çalışıyorduk şizofreni endophenotypes normalize zenginleştirilmiş PV nüfus ile zenginleştirilmiş buldular.

Son yıllarda PiggyBac transposon sistem istikrarlı ifade transgenes sistemleri bir dizi elde etmek için kullanılmıştır. Biz-si olmak kullanılmış bu sistem hızla ve kolayca stabil interneuron geliştirme sırasında belirli genlere rolünün çalışmaya Doksisiklin indüklenebilir miRNA yapıları ifade oluşturmak için. Ayrıca çift muhabir channelrhodopsin-2 (ChR2) optogenetically için hızlı mESC satırları oluşturmak için bu teknolojiyi kullanarak sürücü mESC interneurons türetilmiş veya DREADD reseptör teknoloji transplante açıp hücreleri topluca.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu protokolü geliştirmeye yardımcı erken çalışmaları için Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP çift muhabir mESC çizgi gibi Jennifer Tyson, Asif Maroof ve Tim Petros geliştirmek için Qing Xu için minnettarız. Biz de CHOP Akış Sitometresi çekirdek teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser bir NIH R01 MH066912 (SA) ve F30 MH105045-02 (DT) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Neuroscience sayı: 130 beyin fare interneuron farklılaşma korteks hücre kültürü kök hücre nakli
Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tischfield, D. J., Anderson, S. A.… More

Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter