Summary
Knorpel und Haut Analoga wurden Bioprinted mit einem Nanocellulose-Alginat-basierten Bioink. Die Bioinks wurden vor dem Druck über einen einzigen Schritt passive Mischeinheit cellularized. Die Konstrukte wurden demonstriert werden gleichmäßig cellularized, haben hohe Rentabilität und günstige Marker der Differenzierung aufweisen.
Abstract
Bioprinting ist eine leistungsfähige Technik für die schnelle und reproduzierbare Herstellung von Konstrukte für Tissue engineering-Anwendungen. In dieser Studie wurden die Knorpel und Haut Analoga nach Bioink Pre-cellularization nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik hergestellt. Diese Technik wurde entwickelt mit dem Ziel, die Arbeitsschritte bei der Vermischung von eine Zellsuspension in einem hochviskosen Bioink zu vereinfachen. Die Auflösung der Filamente hinterlegt durch Bioprinting erfordert die Sicherstellung der Einheitlichkeit in der Zelle Verteilung vor dem Druck zu vermeiden, die Ablagerung von Regionen ohne Zellen oder Aufbewahrung von großzellige Klumpen, die die Nadel verstopfen können. Wir zeigen die Fähigkeit, rasch eine Zellsuspension mit einem Bioink vor der Bioprinting von Knorpel und Haut Analoga zu mischen. Beide Gewebe-Analoga konnte bis zu 4 Wochen kultiviert werden. Histologische Analyse ergab Zellviabilität und Ablagerung von Gewebe spezifische extrazelluläre Matrix (ECM) Marker wie Glykosaminoglykane (GAGs) und Kollagen ich jeweils.
Introduction
Dreidimensionale (3D) Bioprinting Technologie geworden in den letzten Jahren besser zugänglich für Forscher, so dass die Technik für die Herstellung von Gewebe Analoga häufiger genutzt werden. Bioprinting verspricht, biomedizinischen Forschung zu revolutionieren, indem erleichtern die schnelle und wiederholbare Herstellung von vielfältigen Gewebe Konstrukte. Die Crux der Bioprinting Technologie liegt in der Fähigkeit, genau zu steuern, die Ablagerung von Biomaterialien (bekannt als Bioinks) in drei Dimensionen. Dies ermöglicht die Erzeugung von komplexen Gerüsten mit unterschiedlichen Regionen von Matrix Zusammensetzungen, bioaktive Faktoren und Zellen, die genauer native Gewebestruktur rekapitulieren können.
Bioprinting ist für die Herstellung von Konstruktionen für viele Gewebe Anwendungen einschließlich Knorpel1, Haut2, Muskel3und Knochen4verwendet worden. Diese Gewebe sind attraktiv für Bioprinting durch ihre intrinsische gekerbten Mikro-Architekturen, die Reprise über Schicht für Schicht Ablagerung geeignet sind. Insbesondere besitzt Haut eine wohldefinierte mehrschichtige Struktur5, geeignet für die Herstellung durch Layer-by-Layer Deposition Techniken wie Bioprinting. Darüber hinaus Bioprinting kann genutzt werden, um Konstrukte zu generieren, die die notwendigen anatomischen Dimensionen besitzen und Formen, um das Gewebe zu reparieren defekt. Biomaterialien mit patientenspezifischen Größe und Form6 generieren kann damit beginnen, die Nachfrage nach teilweise Reparaturen von vielen Geweben einschließlich aber nicht beschränkt auf Knochendefekten, Knorpelschäden und deren Umfang von variiert Hautläsionen Patient zu Patient.
In dieser Studie wurden zwei Gewebe-Analoga (Gelenkknorpel und Haut) durch die Bioprinting pre-cellularized Bioinks hergestellt. Gewährleistung angemessener Mischung von Bioink mit Zellsuspension, die einheitliche Zelle Verteilung sicherstellen kann, während die Erhaltung der Zellviabilität kann eine Herausforderung sein. Bioinks geeignet für Bioprinting über Extrusion sind oft hoch viskosen und erfordern daher umfangreiche mischen, um eine homogene Mischung zu gewährleisten. Mechanische Schäden an den Zellen kann unter harten mischen Bedingungen auftreten und nachteilige Auswirkungen Lebensfähigkeit. Studien haben gezeigt, dass die meisten Zelltod beim Inkjet-Druck während der Zubereitung wie das Mischen von7,8auftritt. Während herkömmliche Vermischung mit Agitation9 für niedrigviskose Bioinks geeignet für Inkjet-Druck10ausreichend sein kann, ist Vermischung von Zellen in eine hohe Viskosität Bioink besser geeignet für Extrusion Bioprinting schwieriger. Adressierung dieses Bedürfnis, ist die Verwendung von Mischdüsen für die Beimischung von Bioinks während der Druck Prozess11populärer geworden. Diese Armaturen wurden auch weit verbreitet in der Mikrofluidik-Forschung genutzt, wo das Mischen von Flüssigkeiten mit niedrigen Reynolds-Zahl wichtiger12ist. Die Nutzung von ein kontinuierliche Mischprozess eine Zellsuspension in eine Bioink Mischung würde Gleichförmigkeit während des Druckvorgangs ermöglichen. Jedoch da Zellsuspensionen niedrigen Viskosität im Vergleich zu einem Bioink besitzen, werden Schwierigkeiten ergeben sich bei der Verhinderung der Sedimentation der Zellen während der Druck Prozess9,13,14. Alternativ kann die Vermischung von Zellen in einem Bioink vor dem Druck dieses Problem anzugehen.
Zur Minimierung von Zelltod während der Mischung in eine Bioink entwickelten wir ein Verfahren auf der Grundlage einer passiven Mischanlage Zellen mit einer Bioink in die minimale Anzahl der Schritte zu verschmelzen. Der chaotische Mischung erzeugt durch die Strömung der Materialien durch die Mischeinheit ist ausreichend, um reproduzierbar Mischung zwei Komponenten zusammen15,16. Diese Methode wurde in erster Linie entwickelt, um die Vermischung von jedem Zellsuspension mit jedem Bioink, geeignet für Extrusion Bioprinting zu vereinfachen. Die Anzahl der Schritte in den Mischprozess wurde minimiert, um User-to-User-Variante beim Mischen zu beseitigen. Übermäßige mischen Schritte kann zeitaufwendig und gilt nicht für alle Bioinks, besonders wenn Zellen beteiligt sind. Sekundäre, wollten wir einen Mischvorgang zu entwickeln, war eigenständige Sterilität bewahren und Probenverlust zu minimieren.
In dieser Handschrift zeigen wir die Vermischung von eine Zellsuspension mit einem Bioink mit einem passiven Einheit Mischtechnik, die minimiert Handhabung und führt zu hohen Zelle Lebensfähigkeit und gleichmäßige Verteilung. Diese pre-cellularized Bioinks sind dann genutzt, um Stimmmuster Knorpel oder Haut zu konstruieren, mit ein oder zwei Zelltypen, bzw., die für bis zu 6 Wochen kultiviert werden. Der Bioink verwendet ist ein Alginat-Nanocellulose Mischung, die Eignung für Bioprinting1zuvor gezeigt hat.
Protocol
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Chalmers University Humanforschung Ethikkommission.
Hinweis: Alle Schritte müssen in einem sterilen Biosafety Schrank ausgeführt werden.
1. Vorbereitung von Verbrauchsmaterialien, Bioink und Zellen
- Erhalten zwei Spritzen, eine Spritze (Abbildung 1(ein) ist für die Zellsuspension, während die andere Spritze für die Bioink (Abbildung 1b) ist.
- Erhalten Sie eine sterile passive Mischeinheit (Abbildung 1c), die mit dual Spritzen über eine Luer-Lock-Verbindung gekoppelt werden kann.
- Erhalten Sie eine Dosiereinheit (Abbildung 1-d), die ein Volumen von zwei sterile Spritzen gleichzeitig mit kontrollierter Geschwindigkeit linear austragen kann.
Hinweis: Das Mischungsverhältnis verwendet in dieser Studie beträgt 10:1. Verwenden Sie daher eine 12 mL Spritze und eine 1 mL Spritze je nach Bedarf vom Referat 10:1 mischen. - Erhalten Sie eine sterile Patrone (Abbildung 1e) und sterile weiblich-weiblich Luer Lock Anschluss direkt gemischt Bioink und Zelle Aussetzung in.
- Zu erhalten Sie oder bereiten Sie die Bioink für die Mischung mit einem Zellsuspension.
Hinweis: In diesem Protokoll war ein Nanocellulose/Alginat-basierte Bioink genutzt. Dieses Bioink ist durch die Zugabe einer sterilen 100 mM CaCl2 -Lösung post drucken vernetzt. - Zellen mit einer 0,5 % Trypsin/EDTA-Lösung zu lösen und die Gesamtzahl der Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung Methode17zählen.
Hinweis: In diesem Protokoll wurden menschliche Fibroblasten eingesetzt. - Bestimmen Sie, welche Zelldichte in das endgültige gedruckten Konstrukt gewünscht wird. Berechnen Sie mit Hilfe der folgenden Gleichungen die Konzentration der geernteten Zellen, die verdünnt werden muss, um dieses Ziel letzte Zelle Dichte zu erreichen.
Hinweis: In diesem Protokoll wurde eine endgültige Zelldichte von 5 x 106 Zellen/mL eingesetzt.- Wählen Sie eine gewünschte Zelle Konzentration für die Experimente: C-Zellen (Zellen/mL).
- Berechnen Sie die Höhe der Bioink notwendig, VBioink, bezogen auf die Gesamtzahl Konstrukte gewünscht:
VBioink = Vkonstruieren × Nkonstruierte
Hinweis: zum Beispiel ist die Lautstärke des Bioink pro Konstrukt 100 µL. Wenn 30 Konstrukte gedruckt werden, dann ist das Bioink Volumen benötigt 3 mL. - Berechnen Sie die Anzahl der Zellen benötigt:
NZellen = CZelle (1,1 × VBiolink) - Aufschwemmen der Zellen (N-Zellen) in 1/10th das Volumen der Bioink:
VZellsuspension = 0,1 × VBiolink
Hinweis: zum Beispiel wenn VBioink = 3 mL, dann VZellsuspension = 0,1 × 3 mL = 0,3 mL
2. Mischen der Zellsuspension und Bioink
- Übertragen Sie die Zellsuspension in die Zelle Aussetzung Spritze.
- Übertragen Sie der Bioink auf eine andere Spritze oder erhalten Sie eine Spritze mit der Bioink zu.
- Ziehen Sie den Spritzenkolben Bioink zurück und legen Sie die Spritze in der Dosiereinheit. Positionieren Sie das Gerät senkrecht mit dem Luer Lock Anschluss nach oben (Abbildung 1-f1).
- Ziehen Sie den Kolben der Spritze Zelle zurück auf eine ähnliche Länge als die Bioink Spritze und stecken Sie in die Dosiereinheit (Abbildung 1f2).
- Die Mischeinheit zuordnen Sie beide Spritzen durch Verdrehen Luer Lock Konnektoren (Abbildung 1f3).
- Entlüften Sie das Mischsystem durch Drücken auf die Dosiereinheit, die Luft in der Spritze zu extrudieren. Stoppen Sie die Grundierung vor der Lösung der Luer-Lock (Abbildung 1g4) zu erreichen.
- Nach dem Grundieren, legen der Füllung Kartusche bis zum Ende der Mischeinheit über den Luer Lock-Anschluss (Abbildung 1g5). Stellen Sie sicher, dass unten vor der Anlage befindet sich die Kolben in der Füllung Patrone.
- Komprimieren Sie langsam (Abbildung 1h6) die Dosiereinheit um die Bioink und Zelle Aussetzung in die Patrone (Abbildung 1i7) vermischen.
- Drücken Sie den Kolben in die Füllung Patrone nach unten mit einer sterilen Pipettieren Spitze, die Bioink-Zelle-Mischung nach dem Mischen zu kontaktieren. Halten Sie die Abgabe bis komprimiert, um sicherzustellen, dass die Zelle/Bioink-Mischung zurück in die Mischeinheit nicht extrudiert wird.
- Verschließen der Patrone und klopfen Sie leicht auf die Arbeitsfläche, um eventuell vorhandene Luftbläschen an die Spitze der Kartusche (Kolbenende) bewegen.
Hinweis: An dieser Stelle ist die Zelle/Bioink Mischung druckfertig. Den folgenden Abschnitten werden spezifische Anwendungen und Druckverfahren werden.
3. Ermittlung der Zellviabilität unter Verwendung einer Mischanlage im Vergleich zu manuellen Spatel mischen
- Lösen von menschlichen Fibroblasten (Abschnitt 7) mit 0,5 % Trypsin/EDTA-Lösung am Zusammenfluss von 80 %, die Anzahl und Aufschwemmen in Kulturmedium bei ausreichender Zelldichte, eine Endkonzentration nach dem Mischen mit der Bioink zu erreichen (01:10 Zellen: Bioink-Verhältnis) von 5 x 10 6 Zellen/mL.
- Mischen Sie Zellen, in die Bioink mit entweder die Passive Einheit Mischtechnik (Schritt2) oder per Spachtel die Wirkung beider Techniken im Zellviabilität bewerten.
- Die Bioink mit der Passive Einheit Mischtechnik 1, 2 oder 3 Mal vor der Abgabe in eine Form zur Vernetzung mit 100 mM CaCl2verschmelzen Sie Zellen.
Hinweis: Um zusätzliche Mischungen durchzuführen, mischen Sie die Zelle/Bioink direkt in eine Spritze anstatt einer Patrone. Dann die Mischung durch die Mischeinheit nach dem vorherigen Protokoll, aber ohne die Zelle Spritze Komponente remix. - Eine separate Bioink mit manuelle mechanische mischen über einem Spatel für Laufzeiten von 30, 60 oder 90 S. Transfer die Mischungen (für jede Mischzeit) in eine Form zur Vernetzung mit 100 mM CaCl2verschmelzen Sie Zellen.
- Übertragen Sie die Proben auf einen gut Teller nach Abschluss der Vernetzung und Kultur unter Standardbedingungen.
- Nach 1 Tag voller Kultur, waschen die Konstrukten (n = 3-4 pro Gruppe) in serumfreien Zellkulturmedium für 30 min. Fleck der Zellen in die Konstrukte mit einer Färbelösung (4 µM Calcein AM, 1 µM Interkalation Homodimer-1) für 30 min.
- Zwei weitere Male zu waschen, und die Proben in serumfreien Zellkulturmedium für insgesamt 1 h bei 37 ° c inkubieren
4. Bioprinting der Knorpel Analoga mit einem einzigen Zelltyp
- Zeichnen Sie ein 3D-Modell des gewünschten Gewebes analog. Umwandeln einer Datei Gcode für Bioprinting und laden Sie die Datei Gcode auf dem Bioprinter1.
Hinweis: In diesem Protokoll wurde eine quadratische Struktur mit Maße 4,8 x 4,8 x 0,9 mm3 als STL-Datei exportiert. Eine Gcode-Datei wurde von der Gitterstruktur mit folgenden Einstellungen generiert: Schichtdicke, 0,3 mm; Füllung Muster, geradlinig; Ausfachung Dichte, 25 %; 10 mm/s Geschwindigkeit. - Isolieren Sie und Tiefgefrieren Sie primären menschlichen nasale Knorpelzellen (hNC) von Patienten nach dem referenzierten Protokoll Nr.1.
- Tauen Sie auf und erweitern Sie kryokonservierten hNCs und einmal in der Monolayer Kultur mit standard Nährmedium bei 37 ° C. Zellen am Zusammenfluss von 80-90 % mit 0,5 % Trypsin/EDTA-Lösung zu lösen und zählen mit einem Trypan blau Ausgrenzung Protokoll. Alle Experimente wurden mit hNCs in der Passage 2 durchgeführt.
- Aufschwemmen der hNCs 100 x 106 Zellen/ml innerhalb von 300 µL Kulturmedium mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Penicillin-Streptomycin und 50 µg/mL Ascorbinsäure, in Vorbereitung für die Mischung mit den Bioink ergänzt.
- Mischung die hNC-Zellsuspension in einem Nanocellulose/Alginat basiert Bioink folgenden die Passive mischen Einheit Protokoll im Verhältnis 10:1 Bioink:cell Federung, eine endgültige Zellkonzentration von 9 x 106 Zellen/mL zu erhalten.
- Sicherstellen Sie, dass die Bioprinter über UV-Exposition und wischen sich mit 70 % Ethanol sterilisiert wird. Sterilität zu erhalten, indem man in eine laminare Strömung Kabinett.
- Die Kartuschen mit den Bioink/Zelle Aussetzung Mischungen sterile drucken Düsen beimessen und in die Bioprinter einfügen.
- Kalibrieren Sie den Bioprinter entweder manuell oder durch die Protokolle für den Drucker spezifisch.
- Stimmmuster der Gitter-strukturiert, Zelle-beladenen Konstrukte, die mit den folgenden Parametern Druck: 25G konische Düse mit einem Druck von 25 kPa. Stimmmuster zellfreie Konstrukte (gemischt mit Zelle Medium enthält keine Zellen) als Kontrolle.
- Vernetzen Sie die Konstrukte durch Hinzufügen einer Ionenlösung 100 mm CaCl2 für 5 min. Spülen die Konstrukte zu und inkubieren Sie in Kulturmedium unter standard Kulturbedingungen (37 ° C, 5 % CO2und 95 % Relative Luftfeuchtigkeit). Wechseln Sie das Medium jeden zweiten oder dritten Tag.
- Sammeln Sie Proben zur histologischen Untersuchung bei 2 und 4 Wochen. Führen Sie die Proben für die GAG-Produktion mit Alcian Bläue18zu Flecken.
5. Bioprinting des Haut-Analoga mit zwei Zelltypen
- Zeichnen Sie ein 3D-Modell des gewünschten Gewebes analoge und umwandeln in eine Datei Gcode für Bioprinting. Laden Sie die Gcode-Datei auf die Bioprinter.
Hinweis: In diesem Protokoll wurde eine quadratische Struktur mit Maße 4,8 x 4,8 x 0,9 mm3 als STL-Datei exportiert. Dann eine Gcode-Datei von der Gitterstruktur mit folgenden Einstellungen generiert wurde: Schichtdicke, 0,3 mm; Füllung Muster, geradlinig; Ausfachung Dichte, 25 %; 10 mm/s Geschwindigkeit. - Bereiten Sie die Zellen zum Mischen in der Bioink für Bioprinting. Für die Herstellung von Haut-Analoga wurden zwei Zelltypen eingesetzt. Die zwei Zelltypen wurden in die Bioink und Bioprinting gemischt.
- Erhalten Sie primär HDF. Pflegen Sie diese Zellen in DMEM Wachstumsmedien ergänzt mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Penicillin-Streptomycin und 50 µg/mL Ascorbinsäure. Zellen am Zusammenfluss von 80-90 % mit 0,5 % Trypsin/EDTA Lösung und Graf zu lösen.
- Isolieren Sie und Tiefgefrieren Sie primäre hNC von Patienten nach dem referenzierten Protokoll Nr.1. Auftauen und kryokonservierten hNCs in Monolayer Kultur zu erweitern. Zellen am Zusammenfluss von 80-90 % mit 0,5 % Trypsin/EDTA Lösung und Graf zu lösen.
- Beide Zelltypen 100 x 106 Zellen/ml innerhalb von Wachstumsmedien aufzuwirbeln. Mischen Sie die Zellsuspensionen zusammen im Verhältnis 1:1, eine totale Endkonzentration von 100 x 106 Zellen/mL in 300 µL der Medien zu erreichen.
- Mischung 50: 50-Zellsuspension HDF und hNC in einem Nanocellulose/Alginat basiert Bioink folgenden die Passive mischen Einheit Protokoll im Verhältnis 10:1 Bioink:cell Federung, eine endgültige Zellkonzentration von 9 x 106 Zellen/mL zu erhalten.
- Sicherstellen Sie, dass die Bioprinter sterilisiert wird oder sich in einem Laminar-Flow Kabinett befindet zu Sterilität.
- Die Kartuschen mit den Bioink/Zelle Aussetzung Mischungen sterile drucken Düsen beimessen und in die Bioprinter einfügen.
- Kalibrieren der Bioprinter entweder manuell oder die Protokolle für den Drucker spezifisch.
- Stimmmuster der Gitter-strukturiert, Zelle-beladenen Konstrukte, die mit den folgenden Parametern Druck: 25G konische Düse mit einem Druck von 25 kPa. Stimmmuster zellfreie Konstrukte (gemischt mit Zelle Medium enthält keine Zellen) als Kontrolle.
- Vernetzen Sie die Konstrukte durch Hinzufügen einer Ionenlösung 100 mm CaCl2 für 5 min. Spülen die Konstrukte zu und inkubieren Sie in Kulturmedium unter standard Kulturbedingungen (37 ° C, 5 % CO2und 95 % Relative Luftfeuchtigkeit). Wechseln Sie das Medium jeden zweiten oder dritten Tag.
- Sammeln Sie Proben zur histologischen Untersuchung bei 2 und 4 Wochen. Färben Sie die Proben für Kollagen ich Produktion mit einem Masson trichrome Fleck19.
Representative Results
Ergebnisse in dieser Handschrift sind in zwei Abschnitte unterteilt. Zunächst wurde die Zellviabilität nach dem Mischen mit der mechanischen Methode oder die passive Mischeinheit analysiert. Als nächstes wurden die Knorpel und Haut Konstrukte kultiviert und für entsprechenden histologischen Marker analysiert.
Zelle Verteilung erschien in beiden Fällen homogen. Die Aktion der Vermischung von Hand mit einem Spatel (Abbildung 2b) hat jedoch mehr Varianz als Vermischung mit einer passiven Mischanlage (Abbildung 2eine). Umfang, Geschwindigkeit und Mischtechnik mit einem Spatel ist stark abhängig von der Benutzer. Allerdings mischen Zellen in einem Bioink mit einer passiven Mischanlage standardisiert mischen und Variation in Chargen minimiert. Darüber hinaus die 30, 60 und 90 s mischen Zeit Mai für das Mischen von einer großen Menge von Zellen in eine große Menge an Bioink nicht ausreichen. Strenger mischen durch Vermischung mit einem Spatel kann erforderlich sein. Im Vergleich dazu unter Verwendung einer passiven Mischanlage besser behält das Mischungsverhältnis der Zellen, um Bioink während mischen und sorgt dafür, dass eine homogene Durchmischung erfolgt. Darüber hinaus ist Probenverlust ein Anliegen mit traditionellen mischen Techniken wo kann Bioink in den Petrischalen, Röhren und mixing-Tools aufgrund ihrer hohen Viskosität zurückgelassen werden. Die Zellviabilität war hoch zum Mischen mit einer Mischanlage (> 90 %) 1, 2 oder 3 Mal. Wenn der passive Mischeinheit genutzt wurde, nahm das Mischen ca. 1 min langsam mischen konstanter Geschwindigkeit. Während mit einem Spatel mischen hohe Rentabilität ausgestellt nach dem Mischen für 30 und 60 s, mehr als 90 s mischen führte zu einem deutlichen Rückgang der Rentabilität im Vergleich zu den anderen Fraktionen (77,9 ± 14 %, p < 0,05) (Abbildung 2c). Dies ist möglicherweise aufgrund übermäßigen mischen, die die Zellen schädigt. Langfristige lebenden/Toten Färbung nach 14 Tagen und 28 Tagen der Kultur ist in ergänzende Abbildung1dargestellt. Zellen beginnen, bis zum Tag 14, Verbreitung und verteilen sich hoch am 28. Tag und gute Lebensfähigkeit anzugeben.
Nach Kultur wurden Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga durch Histologie analysiert. Analyse der Knorpel Konstrukte am Tag 0, 14 und 28 zeigt eine Zunahme der Quantität und Abdeckung der GAGs wie gezeigt durch eine Alcian blau Fleck (Abbildung 3A-3_c). Das Fehlen des Flecks ist am Tag 0, bemerkt, während am Tag 14 Färbung auf Standorte proximal zu den Zellen beschränkt ist. Jedoch am 28. Tag der Kultur Alcian blau in das Konstrukt, demonstrieren die Bildung einer Chondrocytic ECM gefunden. Bioprinted Haut Konstrukte wurden durch histologische Färbung des Kollagens ich unter Verwendung eines Masson Trichrome Fleck (Abbildung 3-d-3f) analysiert. Ähnlich wie bei der Knorpel-Konstrukte, ausgestellt Tag 0 Proben keine Ablagerung von Kollagen. Bis zum Tag 14 der Kultur wurden erhebliche Ablagerungen von Kollagen um die Zellen und entlang der Oberfläche des Konstrukts festgestellt. Dies wurde verstärkt durch Tag 28, wie dicht Kollagen Schichten auf der Oberfläche Konstrukt und innerhalb der Großteil gefunden wurden.
Abbildung 1 : Passive Einheit Mischsystem. (ein) 1 mL Spritze für Zellsuspension, (b) 12 mL Spritze mit Bioink, (c) Dosiereinheit, passive Mischeinheit (d), (e) Füllung Patrone, (f) die Montage der Bioink Spritze (1) und Zelle Aussetzung Spritze (2) in der Dosiereinheit, Befestigung der passiven Mischeinrichtung zum Jahresende sowohl Spritzen (3), (g) Befestigung des weiblich-weiblich Luer Lock Stecker (4) und Anlage der Füllung Patrone (5) schließt die Versammlung, (h ) komprimieren die Dosiereinheit um die Rührschüssel (6), (ich) prime weiterhin drücken Sie auf die Dosiereinheit zu mischen die Zellsuspension mit den Bioink und in die Füllung Patrone (7) zu verzichten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Zelle Lebensfähigkeit Bilder und Analyse. Repräsentative Bilder zeigen live (grün) und menschlichen Fibroblasten Toten (rot) nach dem Mischen mit der Einheit 1, 2 oder 3 Mischzeiten Passive (ein) oder Spachtel für 30, 60 oder 90 Sekunden (b) und 3D Culture für 1 Tag. Bilder bei 4 X Vergrößerung angezeigt werden. Maßstabsleisten zeigen 200 µm. (c) Prozent durchschnittliche Rentabilität von menschlichen Fibroblasten nach dem Mischen mit der Passive Einheit oder Spachtel und 3D Culture für 1 Tag zu mischen. Fehlerbalken zeigen, Mittelwert, Standardabweichung * 0,005. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Gewebe spezifische extrazelluläre Matrix Deposition. Bioprinted Knorpel Konstrukte gebeizt für Glykosaminoglykane Nutzung Alcian blau an (einen) Tag 0, (b) 14 und (c) 28. Bilder mit 5 X Vergrößerung. Bioprinted Haut Konstrukte für Kollagen ich mit Masson Trichrome (d) am Tag 0, (e) 14, gebeizt und (f), 28. Bilder mit 5 X Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Zusätzliche Abbildung1: Zellviabilität an Tag 14 (ein) und 28 (b). Maßstabsleiste beträgt 200 µm, grün bezieht sich Zellen Leben, rot auf abgestorbenen Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Wie in diesem Manuskript gezeigt hat, waren pre-cellularized Bioinks Bioprinted zu fabrizieren entweder Knorpel oder Haut Analoga, die für bis zu 4 Wochen gezüchtet wurden. Zellviabilität nach dem Mischen mit der Passive Einheit Mischtechnik war höher als die herkömmliche Vermischung. Darüber hinaus ist die Vereinfachung der der Mischprozess mit Mischeinrichtung minimiert die Anzahl der Schritte Handhabung und ermöglicht eine bessere Konsistenz in das Ausmaß der Vermischung. Letztendlich führt dies zu besseren Reproduzierbarkeit in beiden Zelle Verteilung innerhalb der Bioink und über Konstrukte und experimentellen Gruppen. Ablagerung von Gewebe spezifische ECM-Komponenten wie GAGs und Kollagen wurde ich für den Knorpel und Haut Analoga, jeweils nach 4 Wochen der Kultur beobachtet. Dies zeigt die Flexibilität die Mischtechnik und die gewählten Konstrukt Geometrie, verschiedene Gewebe Ziele zu fabrizieren. Die Herstellung von Knorpel und Haut Analoga ausgestellt die Flexibilität der Nutzung einer Nanocellulose-Alginat-Bioink und die Bioprinting-Technik für verschiedene technische Gewebe Ziele. Wir besprechen zwei Bestandteile der Studie unten: (1) die Passive Einheit Technik und (2) das Verhalten von Zellen innerhalb von Knorpel und Haut Analoga mischen.
Die Entwicklung und die Optimierung der Technik für die Vermischung von eine Zellsuspension in einer Bioink war von höchster Bedeutung für die Herstellung von diese Konstrukte. Im Gegensatz zu traditionellen niedrigviskos Hydrogel Materialien führte die hohe Viskosität der Bioinks zu Schwierigkeiten bei der Pre-cellularization von einem Bioink vor dem Druck. Als Alternative zur traditionellen Methode der Zelle Einbeziehung in ein Bioink ein Protokoll für die einstufige mischen eine Zellsuspension in eine zähflüssige Bioink entwickelt und diskutiert. Darüber hinaus wurde die praktische Anwendung dieser Mischtechnik in der Herstellung von Gewebe Konstrukte bewertet. Dieser Schritt mischen Ansatz hat mehrere Vorteile gegenüber traditionellen Techniken enthalten kontrollierte mischen Mischungsverhältnis, Minimierung der Schubspannungen hoch und unregelmäßig, und ein geschlossenes System, Probe zu beseitigen mischen Schiffe schließen. Es gibt jedoch einige wichtige Schritte in diese Technik, um dessen Vorteile gegenüber traditionellen Methoden für die Zelle/Bioink Mischung zu gewährleisten. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen in der Zelle-Spritze ausgesetzt sind und gut vor dem Mischen gemischt. Zu groß für eine zeitliche Lücke zwischen der Aufhebung und der Transfer der Zellen in der Spritze und ab kann der Mischprozess Zellen zu sedimentieren, wodurch unebene mischen und Verteilung in einem gedruckten Filament führt. Sedimentation ist beobachteten, einfache Umkehrung (2-3 Mal) der die passive mischen Montage unmittelbar vor dem Mischen ausreichen, um die Zellen Aufschwemmen und gewährleisten eine gleichmäßige Verteilung vor dem mischen. Es ist auch wichtig, dass Luftblasen in die Spritzen beseitigt sind oder minimiert vor um sicherzustellen, dass das Mischungsverhältnis konstant bleibt. Wenn größere Luftblasen in der Patrone Bioink vor dem Mischen zu bleiben, empfiehlt es sich, dass die Lösung durch die Mischeinheit eine zusätzliche Zeit ausgeführt werden, um gute Durchmischung zu gewährleisten. Wenn Luftblasen verbleiben, kann sanfte klopfen der Druck Patrone/Spritze verbleibenden Luftblasen verdrängen. Darüber hinaus Wenn mehrere Material Mischung (mehrere mischen Einheiten oder Materialien) für komplexere Konstrukte erforderlich ist, müssen die Konzentrationen von Bioinks/Zellsuspensionen gemischt werden angepasst werden, um sicherzustellen, dass nach Verdünnung durch Mischen, die richtige Endkonzentration wird noch erreicht.
Im Vergleich zu anderen Mischtechniken ist die passive Mischeinheit einen neuartigen Ansatz zur Bioinks cellularize. Im Gegensatz zu anderen mischen Techniken wie dual Spritze mischen und unter Rühren mit einem Spatel oder einem anderen Werkzeug ermöglicht die passive Mischeinheit mehr Kohärenz bei der Mischung für Chargen und Benutzer. Die Art der manuellen mischen Techniken wie ein Spachtel mischen, führt zu mehr User-to-User-Variante in Umfang und Preis des Mischens. Darüber hinaus haben geschlossene Systeme wie die Passive Einheit und dual Spritze mischen mischen wenig bis gar keine Probenverlust im Vergleich zum Handbuch mischen in einer Petrischale oder Rohr.
Beide Gewebe-Analoga hergestellt in diesem Manuskript bestand aus einer einzigen Art von Bioink und ein oder zwei Zelltypen. Jedoch möglicherweise die Bioprinting der Gewebe-Analoga, die Architekturen, die Regionen unterschiedliche Bioinks mit unterschiedlichen Zelltypen enthalten bestehen notwendig für die Herstellung von mehr physiologische Gewebe Konstrukte20,21, 22. Spezialisierter Bioinks mit einzigartigen Kompositionen oder Funktionalitäten durch das Mischen von mehreren Arten von bestehenden Bioinks zusammen, um materialübergreifenden Bioinks erstellen, die unterschiedliche Kompositionen oder Funktionalitäten23erzeugt werden, 24. Dies ist besonders wichtig bei Übergangsregionen Gewebe wie Haut, subkutane Schicht oder der Knorpel Region eines Gewebes Knochen wo ein Gefälle von Bioink Zusammensetzung25,26 Entwicklung gewährleisten kann notwendig sein, möglicherweise Diese kritischen Regionen in nativen Gewebe27gefunden. Darüber hinaus könnte eine Mischeinheit genutzt werden, um in Wachstumsfaktoren und Morphogens in der Bioinks vor dem Bioprinting mischen. Die Beseitigung von Probenverlust mit geschlossenen Mischsystem ist attraktiv für den Einsatz von teuren und niedrige Konzentration bioaktive Faktoren, wo kann eine Änderung auf ihre Endkonzentration innerhalb der Bioprinted-Konstrukt Probenverlust ergeben, insbesondere dann, wenn Gradienten sind beteiligt.
Eine Einschränkung mit jedem Mischtechnik, einschließlich die Passive Einheit in dieser Studie verwendeten mischen ist das Risiko von Schäden an mechanisch empfindlichen Zelltypen. Zum Beispiel solche Stammzellen isoliert von induzierten pluripotenten Stammzellen, Knochenmark oder Embryo sind anfälliger für Beschädigungen28,29. Der Akt des Mischens vermittelt abnorme mechanische Belastungen auf die Zellen durch die Scherkräfte an den Mischprozess beteiligt, und sie müssen gegeneinander abgewogen werden, um Rentabilität30zu bewahren. Während die Verwendung von primäre Fibroblasten und Chondrozyten in dieser Studie gute Lebensfähigkeit (Abbildung 2) geführt, sind weitere Studien notwendig, um sicher mischen Preise und Quoten für empfindlichere Zelltypen zu bestimmen. Bis dahin empfiehlt es sich, dass die Vermischung durchgeführt werden, unter einer konstanten langsamen Rate um Rentabilität zu maximieren. Darüber hinaus war die Zelldichte in dieser Studie ausgewählt basierend auf früheren Studien1bestimmt. Diese Zelldichte möglicherweise nicht ideal für alle Zelltypen.Vor allem führen Mischung Zellen mit einer höheren Konzentration erhöhte Zell-Zell-Kontakten, die Lebensfähigkeit der Zellen und Gewebe Bildung31,32verbessern können. In ähnlicher Weise könnte die passive Mischeinheit auf mischen Zelle Sphäroide oder andere Zelle Aggregate33 in Bioinks anwendbar.
Wie vorgeschlagen und gezeigt in dieser Studie eine Passive Einheit Mischsystem eine zähflüssige Bioink schnell eine Zellsuspension verschmelzen kann. Während das Risiko für mechanische Schäden an den Zellen noch bleibt, ermöglicht der Ansatz mehr Kohärenz bei der Vermischung innerhalb einer einzigen Studie und Benutzern. Pre-cellularized Bioinks unter Verwendung dieses Ansatzes wurden verwendet, um beide Knorpel zu fabrizieren und Hautpflege-Analoga, die für bis zu 4 Wochen kultiviert wurden, und Ablagerung von Gewebe spezifische ECM Marker demonstriert. Zukünftige Studien konzentrieren sich auf die Nutzung der passiven Einheit Mischsystem um spezialisierte Bioinks aus standardisierten Bioinks für die Herstellung von komplexen Gewebe Analoga zu mischen.
Disclosures
Die Autoren dieser Handschrift sind Mitarbeiter von CELLINK LLC.
Acknowledgments
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STARTINK Kit | CELLINK | SK0001 | Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure |
| Live/Dead Kit | Life Technologies | L3224 | Kit for the analysis of cell viability after mixing |
| Masson's Trichrome | Sigma Aldrich | HT15-1KT | Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs |
| Alcian Blue | Sigma Aldrich | B8438-250ML | Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs |
| INKREDIBLE+ bioprinter | CELLINK | Gen1+ | Printer utilized in the study |
| DMEM with Glutamax | Thermofisher | 10566016 | Media for culture of the cells |
| 10% fetal bovine serum | Thermofisher | A3160402 | Media supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | Media supplement |
| live cell imaging solution | thermofisher | A14291DJ | component utilized using live/dead imaging |
| inverted microscope | Olympus | IX73 | microscope utilized |
| a digital color camera | Olympus | XC10 | microscope camera utilized |
| cellSens imaging software | Olympus | n/a | stock software with the microscope |
| ImageJ | NIH | n/a | open source image analysis software |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | n/a | software for statistical analysis |
| Slic3r software (v1.2.9) | Slic3r | n/a | open-source software to convert .stl file to gcode |
| primary adult human dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | cell source for fibroblasts |
References
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