Summary
Análogos de cartílago y piel fueron bioprinted utilizando un alginato de nanocellulose base de bioink. El bioinks se cellularized antes de la impresión a través de una unidad de mezcla pasiva solo paso. Las construcciones fueron demostradas ser uniformemente cellularized, alta viabilidad, y exhiben marcadores favorables de la diferenciación.
Abstract
Bioprinting es una técnica poderosa para la fabricación rápida y reproducible de las construcciones para usos de la ingeniería del tejido. En este estudio, cartílago y piel análogos fueron fabricados después de pre-cellularization de bioink utilizando un pasivo novela mezcla técnica de la unidad. Esta técnica se desarrolló con el objetivo de simplificar los pasos necesarios para la mezcla de una suspensión celular en un bioink altamente viscoso. La resolución de filamentos depositado a través de bioprinting exige el aseguramiento de la uniformidad en la distribución de la célula antes de la impresión para evitar la deposición de las regiones sin células o la retención de grupos de células grandes que pueden obstruir la aguja. Demostramos la capacidad para mezclar rápidamente una suspensión con una bioink antes de bioprinting de análogos de cartílago y piel. Ambos análogos de tejidos podrían ser cultivados hasta por 4 semanas. El análisis histológico demostró la viabilidad celular y la acumulación de marcadores específicos matriz extracelular (ECM) de tejido tales como colágeno y glucosaminoglicanos (GAGs) respectivamente.
Introduction
En los últimos años, la tecnología tridimensional (3D) bioprinting se ha convertido en más accesible a los investigadores, lo que permite la técnica para ser utilizados más ampliamente para la fabricación de análogos del tejido. Bioprinting promete revolucionar la investigación biomédica, facilitando la fabricación rápida y repetible de tejido multifacético construcciones. El quid de la tecnología de bioprinting reside en la capacidad de controlar con precisión la deposición de biomateriales (conocido como bioinks) en tres dimensiones. Esto permite la generación de complejos andamiajes con regiones distintas composiciones de matriz, factores bioactivos y células que con mayor precisión pueden recapitular la estructura del tejido nativo.
Bioprinting se ha utilizado para la fabricación de construcciones para muchas aplicaciones de tejidos como cartílago1piel2, músculo3y hueso4. Estos tejidos son atractivos para bioprinting debido a sus intrínsecas estriados micro arquitecturas que son adecuados para recapitulación mediante deposición de capa por capa. En particular, la piel posee una estructura de varias capas bien definidas5, que es conveniente para la fabricación mediante técnicas de deposición de capa por capa como bioprinting. Además, bioprinting pueden ser utilizados para generar estructuras que poseen las dimensiones anatómicas necesarias y defecto de formas para reparar el tejido. La capacidad para generar biomateriales con el tamaño y la forma de específico para cada paciente6 puede comenzar a abordar la demanda de reparaciones parciales de muchos tejidos incluyendo pero no limitado a defectos óseos, cartílago daños y lesiones de piel cuyo alcance varía de paciente a paciente.
En este estudio, dos análogos de tejidos (piel y cartílago articular) fueron fabricados por la bioprinting de bioinks pre-cellularized. Asegurar la mezcla adecuada de un bioink con suspensión de células que puede garantizar la distribución uniforme de la célula mientras que preserva la viabilidad de las células puede ser un desafío. Bioinks convenientes para bioprinting vía extrusión son a menudo altamente viscosos y por lo tanto requieren extensa mezcla para asegurar una mezcla homogénea. Daño mecánico a las células puede ocurrir bajo duras condiciones de mezcla y afectar negativamente la viabilidad. Los estudios han demostrado que la mayoría la muerte celular durante el proceso de impresión de inyección de tinta se produce durante la preparación como la mezcla de7,8. Tradicional mezcla con agitación9 puede ser suficiente para bioinks de baja viscosidad conveniente para impresión de inyección de tinta10, mezcla de células en un bioink de alta viscosidad más conveniente para el bioprinting de extrusión es más difícil. Abordar esta necesidad, el uso de boquillas de mezcla se ha convertido en más popular para la mezcla de bioinks durante la impresión de proceso11. Estos mezcladores han utilizado ampliamente en la investigación de microfluidos, donde la mezcla de fluidos con bajo número de Reynolds es importante12. La utilización de un proceso continuo de mezcla para mezclar una suspensión en un bioink permitiría uniformidad durante el proceso de impresión. Sin embargo, puesto suspensiones celulares poseen baja viscosidad en comparación con un bioink, a dificultades en la prevención de la sedimentación de las células durante el proceso impresión9,13,14. Por otra parte, la mezcla de células en un bioink antes de la impresión puede abordar este tema.
Para reducir la muerte celular durante el licuado en un bioink, hemos desarrollado una técnica basada en una unidad mezcladora pasiva a las células se funden en un bioink en el mínimo número de pasos. La mezcla caótica generada por el flujo de los materiales a través de la unidad de mezcla es suficiente para reproducible mezcla dos componentes juntos15,16. Este método fue desarrollado principalmente para simplificar la mezcla de cualquier suspensión celular con cualquier bioink que conveniente para bioprinting de extrusión. Se minimizó el número de pasos en el proceso de mezcla para eliminar el usuario variación en la mezcla. Pasos mezcla excesiva pueden ser desperdiciador de tiempo y no es aplicable a todos los bioinks, particularmente cuando se trata de las células. Secundaria, el objetivo fue desarrollar un proceso de mezcla que fue autónomo tanto preservar la esterilidad y minimizar la pérdida de muestra.
En este manuscrito, nos demuestran la mezcla de una suspensión con un bioink con una pasiva técnica unidad que minimiza el manejo y resultados en la celda alta viabilidad y uniforme distribución de la mezcla. Estas bioinks pre-cellularized se utilizan entonces para bioprint piel o cartílago construir con uno o dos tipos de células, respectivamente que se cultivan hasta por 6 semanas. El bioink utilizado es una mezcla de alginato-nanocellulose, que previamente ha demostrado idoneidad para bioprinting1.
Protocol
Este protocolo sigue las directrices del Comité de ética de investigación humana de la Universidad de Chalmers.
Nota: Todas las medidas deben realizarse dentro de un gabinete de bioseguridad estéril.
1. preparación de las células, Bioink y consumibles
- Obtener dos jeringas, una jeringa (figura 1a) es para la suspensión de células, mientras que la otra jeringa es para bioink (figura 1b).
- Obtener una unidad mezcladora pasiva estéril (figura 1c) que puede acoplarse con jeringas duales a través de una conexión de la cerradura de Luer.
- Obtener una unidad de dispensación (figura 1d) que puede sacar un volumen de dos jeringas estériles simultáneamente a una velocidad controlada.
Nota: La proporción de mezcla utilizada en este estudio es de 10:1. Por lo tanto, utilizar una jeringa de 12 mL y una jeringa de 1 mL como requerido por la unidad de mezcla 10:1. - Obtener un cartucho estéril (figura 1e) y un estéril conector de cierre Luer hembra-hembra mezclado directamente la suspensión bioink y celular en.
- Obtener o preparar el bioink para la mezcla con una suspensión.
Nota: En el presente Protocolo, se utilizó un bioink de nanocellulose/alginato basado. Este bioink es reticulado por adición de una solución estéril 100 mM CaCl2 post impresión. - Separar las células usando una solución de tripsina/EDTA 0.5% y cuente el número total de células mediante la exclusión azul de tripano método17.
Nota: En este protocolo, se utilizaron fibroblastos humanos. - Determinar qué densidad celular se desea en la construcción final del impresa. Calcular utilizando las siguientes ecuaciones la concentración de las células cosechadas que debe diluirse para lograr esta densidad de célula final de destino.
Nota: En el presente Protocolo, se utilizó una densidad de célula final de 5 x 106 células/mL.- Seleccione una concentración de células deseada para los experimentos: Ccelular (células/mL).
- Calcular la cantidad de bioink necesario, Vbioink, basado en el número total de construcciones deseado:
Vbioink = Vconstruir × NContructs
Nota: por ejemplo, el volumen de bioink por construir es 100 μl. Si se imprimen 30 construcciones, el volumen de bioink necesario es de 3 mL. - Calcular el número de células necesarias:
Nlas células = Ccelda (1,1 × Vbiolink) - Resuspender las células (las célulasde N) en 1/10th el volumen de la bioink:
Vsuspensión de la célula = 0,1 × Vbiolink
Nota: por ejemplo, si Vbioink = 3 mL, entonces Vsuspensión de la célula = 0,1 × 3 mL = 0.3 mL
2. mezcla de la suspensión celular y Bioink
- Transferir la suspensión de células en la jeringa de suspensión celular.
- Transferencia de la bioink a otra jeringa u obtener una jeringa que contiene la bioink.
- Tire hacia atrás el émbolo de la jeringa bioink e Inserte la jeringa en la unidad dispensadora. Coloque la unidad verticalmente con el conector de cierre Luer hacia arriba (figura 1f1).
- Tire hacia atrás el émbolo de la jeringa de la célula a una longitud similar como la jeringa bioink e inserte en la unidad dosificadora (f2de lafigura 1).
- Coloque dos jeringas en la unidad de mezcla girando los conectores de la cerradura de Luer (f3de lafigura 1).
- Cebe el sistema de mezcla empujando la unidad dispensadora para sacar el aire en la jeringa. Detener la imprimación antes de la solución llegando a la cerradura de Luer (1 de figurag4).
- Después de preparar, colocar el cartucho de relleno hasta el final de la unidad de mezcla mediante el conector de cierre Luer (1 de figurag5). Asegúrese que el émbolo en el cartucho de relleno en la parte inferior antes de la fijación.
- Comprimir lentamente (figura 1h6) la unidad dispensadora para mezclar la suspensión bioink y cell en el cartucho (figura 1i7).
- Empujar el émbolo del cartucho de relleno hacia abajo con una punta de la pipeta estéril en contacto con la mezcla de bioink célula después de la mezcla. Mantener la dosificación hasta compactarse para que la mezcla de células/bioink no se saca en la unidad de mezcla.
- La tapa del cartucho y golpee suavemente sobre la superficie de trabajo para mover cualquier burbuja de aire en la parte superior del cartucho (extremo del pistón).
Nota: En este punto, la mezcla celular/bioink está lista para la impresión. Las siguientes secciones esbozarán aplicaciones específicas y procedimientos de impresión.
3. determinación de la viabilidad de las células usando una unidad de mezcla en comparación con espátula Manual de mezcla
- Fibroblastos humanos (paso 7) con una solución de tripsina/EDTA 0.5% en 80% confluencia de separar, contar el número y resuspender en medio de cultivo a la densidad de células suficiente para lograr una concentración final después de mezclar con la bioink (1:10 cociente celular: bioink) de 5 x 10 6 células/mL.
- Mezcla de células en el bioink usando el pasivo ya sea mezcla técnica de la unidad (paso 2) o a través de la espátula para evaluar el efecto de ambas técnicas sobre la viabilidad celular.
- Las células se funden el bioink usando la voz pasiva mezcla técnica de la unidad 1, 2, o 3 veces antes de la distribución en un molde para el cross-linking con 100 mM de CaCl2.
Nota: Para realizar mezclas adicionales, mezcle el celular/bioink directamente en una jeringa en lugar de un cartucho. Entonces remix la mezcla a través de la unidad de mezcla siguiendo el protocolo anterior pero sin el componente de la jeringa de la célula. - Las células se mezclan en un bioink separado usando mecánica manual de mezcla mediante una espátula durante períodos de 30, 60 o 90 s. transferencia de las mezclas (por cada mezcla tiempo) en un molde para el cross-linking con 100 mM CaCl2.
- Transferir las muestras a una placa bien después de la finalización del cross-linking y cultivo bajo condiciones estándar.
- Después de 1 día de la cultura, lave las construcciones (n = 3-4 por grupo) en medio de cultivo celular sin suero durante 30 minutos la mancha las células en las construcciones con una solución de tinción (4 μm calceína AM, 1 homodímero de etidio μm-1) durante 30 minutos.
- Lavar dos veces más e incubar las muestras en medio de cultivo celular sin suero para un total de 1 h a 37 ° C.
4. Bioprinting de análogos de cartílago con un solo tipo de células
- Dibujar un modelo 3D del tejido deseado analógico. Convertir un archivo de Gcode para bioprinting y cargar el archivo de Gcode en el bioprinter1.
Nota: En este protocolo, una estructura cuadrada con dimensiones 4.8 x 4.8 x 0,9 mm3 fue exportada como un archivo STL. Se genera un archivo de Gcode de la estructura del enrejado usando los siguientes valores: espesor de la capa, de 0,3 mm; patrón de relleno, rectilínea; densidad de relleno, 25%; velocidad, 10 mm/seg. - Aislar y criopreservar condrocitos nasal humano primario (hNC) de los pacientes siguiendo el protocolo de referencia1.
- Descongelar y expanda hNCs criopreservados y, una vez en cultivo monocapa utilizando el estándar medio de cultivo a 37 ° C. Separar las células en la confluencia de 80-90% con una solución de tripsina/EDTA 0.5% y cuenta con un protocolo de exclusión azul de tripano. Todos los experimentos se realizaron utilizando hNCs en el paso 2.
- Resuspender el hNCs en 100 x 106 células/mL en 300 μL de medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal 10%, 1% de penicilina-estreptomicina y 50 μg/mL el ácido ascórbico, en preparación para la mezcla con la bioink.
- Mezcla la suspensión de células de hNC en un alginato de nanocellulose base bioink siguiente pasivo protocolo de unidad en una proporción de 10:1 bioink:cell suspensión para obtener una concentración celular final de 9 x 106 células/mL de mezcla.
- Asegúrese de que el bioprinter es esterilizada a través de la exposición Ultravioleta y limpie abajo con etanol al 70%. Mantener la esterilidad mediante la colocación en una cabina de flujo laminar de gabinete.
- Instale boquillas de impresión estériles a los cartuchos que contienen las mezclas de suspensión celular bioink e inserte en el bioprinter.
- Calibrar el bioprinter ya sea manualmente o por los protocolos específicos a la impresora.
- Bioprint la estructura de enrejado, construcciones cargadas de celulares usando los siguientes parámetros de impresión: boquilla cónica de 25G a una presión de 25 kPa. Bioprint celular libre de construcciones (mezcladas con medio celular no células) como control.
- Enlazará las construcciones mediante la adición de una solución iónica de 100 mM CaCl2 5 minutos enjuague los constructos e incubar en medio de cultivo bajo condiciones de cultivo estándar (37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad relativa). Cambiar los medios de comunicación cada segundo o tercer día.
- Recoger muestras para análisis histológico en las semanas 2 y 4. Mancha de las muestras para la producción de mordaza con una mancha azul de Alcian18.
5. Bioprinting de piel análogos con dos tipos de células
- Dibujar un modelo 3D del tejido deseado analógico y convertirlos a un archivo Gcode para bioprinting. Cargue el archivo de Gcode en el bioprinter.
Nota: En este protocolo, una estructura cuadrada con dimensiones 4.8 x 4.8 x 0,9 mm3 fue exportada como un archivo STL. Entonces se genera un archivo de Gcode de la estructura del enrejado usando los siguientes valores: espesor de la capa, de 0,3 mm; patrón de relleno, rectilínea; densidad de relleno, 25%; velocidad, 10 mm/seg. - Preparar las células para mezclar en el bioink para bioprinting. Para la fabricación de análogos de la piel, se utilizaron dos tipos de células. Se mezclan los dos tipos celulares en el bioink y bioprinting.
- Obtener el principal HDF. Mantener estas células en medios de cultivo DMEM suplementados con 10% suero fetal bovino, penicilina-estreptomicina de 1% y 50 μg/mL de ácido ascórbico. Separar las células en la confluencia de 80-90% con una solución de tripsina/EDTA 0.5% y la cuenta.
- Aislar y criopreservar hNC primaria de pacientes siguiendo el protocolo de referencia1. Descongelar y ampliar hNCs criopreservados en cultivo monocapa. Separar las células en la confluencia de 80-90% con una solución de tripsina/EDTA 0.5% y la cuenta.
- Agite ambos tipos de células en 100 x 106 células/mL en medios de cultivo. Mezclar las suspensiones celulares juntos en una proporción de 1:1 para alcanzar una concentración final del total de 100 x 106 células/mL en 300 μL de medios de comunicación.
- Mezcla la suspensión de células de 50: 50 de HDF y hNC en un alginato de nanocellulose base bioink siguiente pasivo protocolo de unidad en una proporción de 10:1 bioink:cell suspensión para obtener una concentración celular final de 9 x 106 células/mL de mezcla.
- Asegúrese de que el bioprinter se esteriliza o se coloca en un flujo laminar gabinete para mantener la esterilidad.
- Instale boquillas de impresión estériles a los cartuchos que contienen las mezclas de suspensión celular bioink e inserte en el bioprinter.
- Calibrar el bioprinter ya sea manualmente o los protocolos específicos a la impresora.
- Bioprint la estructura de enrejado, construcciones cargadas de celulares usando los siguientes parámetros de impresión: boquilla cónica de 25G a una presión de 25 kPa. Bioprint celular libre de construcciones (mezcladas con medio celular no células) como control.
- Enlazará las construcciones mediante la adición de una solución iónica de 100 mM CaCl2 5 minutos enjuague los constructos e incubar en medio de cultivo bajo condiciones de cultivo estándar (37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad relativa). Cambiar los medios de comunicación cada segundo o tercer día.
- Recoger muestras para análisis histológico en las semanas 2 y 4. Las muestras de colágeno de la mancha I producción de Tricrómico de Masson19.
Representative Results
Resultados en este manuscrito se dividen en dos secciones. En primer lugar, la viabilidad celular fue analizada la mezcla con el método mecánico o la unidad mezcla de pasiva. A continuación, las construcciones de cartílago y piel fueron cultivadas y analizadas para marcadores histológicos pertinentes.
Distribución de células aparece homogénea en ambos casos. Sin embargo, la acción de mezclar a mano con una espátula (figura 2b) tiene más varianza que mezcla con una unidad mezcladora pasiva (figura 2a). La medida, la velocidad y la técnica de mezcla con una espátula es altamente dependiente en el usuario. Sin embargo, mezcla de células en un bioink con una unidad de mezcla pasiva normaliza la mezcla y reduce al mínimo variación entre lotes. Además, los 30, 60 y 90 s mezcla tiempo mayo no ser suficiente para la mezcla de una gran cantidad de células en una gran cantidad de bioink. Se puede mezclar más rigurosa con la mezcla con una espátula. En comparación, una unidad mezcla de pasiva mejor mantiene la proporción de las células a bioink durante el licuado y asegura que se realiza una mezcla homogénea. Además, pérdida de la muestra es una preocupación con las técnicas tradicionales de mezcla donde bioink puede ser dejado en platos de Petri, tubos y herramientas de mezcla debido a su alta viscosidad. La viabilidad celular fue alta para la mezcla con una unidad de mezcla (> 90%) 1, 2 o 3 veces. Cuando se utilizó la unidad mezcla de pasiva, mezcla tomó aproximadamente 1 min a un ritmo lento de mezclado constante. Mientras mezcla con una espátula exhibieron alta viabilidad después de mezclar para 30 y 60 s, más de 90 s de la mezcla resultó en una disminución significativa en viabilidad en comparación con los otros grupos (77,9 ± 14%, p < 0.05) (figura 2c). Esto puede ser debido a excesivo mezclado que causa daño a las células. Vivo/muerto a largo plazo manchas después de 14 días y 28 días de cultivo se muestran en la figura 1 complementaria. Las células comienzan a separarse por día 14 y están muy repartidas al día 28 e indican buena viabilidad.
Después de la cultura, análogos de tejido de cartílago y piel fueron analizados a través de la histología. Análisis de los constructos de cartílago a los días 0, 14 y 28 muestran un aumento en la cantidad y cobertura de garantías, como se demuestra a través de una mancha azul de Alcian (a-3_cde lafigura 3). La ausencia de la mancha se nota en el día 0, mientras que en el día 14 la coloración está limitada a lugares próximos a las células. Sin embargo, al día 28 de la cultura, el azul de Alcian se encuentra a lo largo de la construcción, demostrando la formación de un chondrocytic ECM. Bioprinted construcciones de piel fueron analizadas a través de la tinción histológica de colágeno que utiliza Tricrómico de Masson (figura 3d-3f). Similar a las construcciones de cartílago, las muestras del día 0 no exhibieron ninguna deposición del colágeno. Día 14 de la cultura, se observaron sustanciales depósitos de colágeno alrededor de las células y a lo largo de la superficie de la construcción. Esto fue reforzado por día 28, como se encontraron capas de colágeno denso en la superficie de la construcción y en la mayor parte.
Figura 1 : Unidad sistema de mezcla pasiva. (a) jeringa de 1 mL de suspensión celular, jeringa de 12 mL (b) con bioink, (c) unidad dispensadora, unidad de mezcla pasiva (d), (e) relleno de cartucho, (f) montaje de la célula y bioink jeringa (1) jeringa de suspensión (2) en la unidad dosificadora, accesorio de la unidad mezcla de pasiva con el fin de jeringas (3), (g) fijar el conector de cierre Luer hembra-hembra (4) y fijación del cartucho de relleno (5) completa el conjunto, (h ) comprimir la unidad dispensadora para preparar la mezcla (6), () continuar Presione hacia abajo la unidad dispensadora para mezclar la suspensión de células con el bioink y dispensar en el cartucho de relleno (7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Imágenes de viabilidad y análisis de la célula. Imágenes representativas que vivo (verde) y fibroblastos humanos muertos (rojo) después de mezclar con la voz pasiva, unidad 1, 2 o 3 tiempos de mezcla (una) o espátula para 30, 60 o 90 segundos (b) y la cultura 3D para 1 día. Se muestran imágenes con 4 aumentos. Barras de escala indican 200 μm. (c) porcentaje viabilidad promedio de fibroblastos humanos después de la mezcla con la voz pasiva mezcla unidad o espátula y cultura 3D para 1 día. Barras de error muestran la desviación estándar de la media, * 0.005. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: deposición de matriz extracelular específica de tejido. Construcciones de cartílago de Bioprinted mancharon para glucosaminoglicanos utilizando Alcian azul en (un) día 0, (b) 14 y (c) 28. Imágenes capturadas con 5 aumentos. Bioprinted construcciones de piel manchadas para colágeno utilizando TRICROMICA de Masson (d) día 0, (e) 14 y (f) 28. Imágenes capturadas con 5 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 1 complementaria: viabilidad celular en el día 14 (a) y 28 (b). Barra de escala es 200 μm, verde se refiere a las células en vivo, rojo se refiere a las células muertas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Como se demuestra en este manuscrito, bioinks pre-cellularized fueron bioprinted para fabricar cualquier cartílago o análogos que fueron cultivados durante 4 semanas la piel. Viabilidad celular después de la mezcla usando la voz pasiva técnica unidad de mezcla fue mayor que los métodos tradicionales de mezcla. Además, la simplificación del proceso de fusión utilizando la unidad de mezcla minimiza el número de pasos de manejar y permite mejor consistencia en la medida de la mezcla. En última instancia, esto resulta en mejor reproducibilidad en tanto distribución de células dentro de la bioink y a través de constructos y grupos experimentales. Deposición de tejido específico ECM componentes como colágeno y GAGs me observó para el cartílago y la piel análogos, respectivamente después de 4 semanas de la cultura. Esto indica que la flexibilidad de la técnica de mezcla y la geometría de construcción solicitadas para fabricar objetivos de diferentes tejidos. La fabricación de análogos de cartílago y piel había expuesta la flexibilidad de ambos el uso de la técnica bioprinting y un bioink de nanocellulose-alginato para objetivos distintos tejidos ingeniería. Hablaremos de dos componentes del estudio a continuación: (1) la voz pasiva mezcla unidad técnica y (2) el comportamiento de las células de cartílago y piel análogos.
El desarrollo y la optimización de una técnica para la mezcla de una suspensión en un bioink era primordial para la fabricación de estas construcciones. A diferencia de los materiales de hidrogel tradicional de baja viscosidad, alta viscosidad de la bioinks dio lugar a dificultad en pre-cellularization de un bioink antes de la impresión. Como alternativa al tradicional método de incorporación de la célula en un bioink, un protocolo para la mezcla de un solo paso de una suspensión en un bioink viscoso fue desarrollado y discutido. Además, se evaluó la aplicación práctica de esta técnica de mezcla en la fabricación de estructuras de tejido. Este enfoque de mezcla de un solo paso tiene varias ventajas sobre la tradicional mezcla técnicas incluidas controlada proporción de mezcla, minimización de tensiones de cizallamiento irregular y alta, y un sistema cerrado para eliminar la muestra cierre en recipientes. Sin embargo, hay varios pasos fundamentales en esta técnica para asegurar sus ventajas sobre los métodos tradicionales para el celular/bioink de mezcla. Es importante garantizar que las células en la jeringa de la célula son suspendidas y bien mezcladas antes de la fusión. Demasiado grande de un espacio de tiempo entre el levantamiento y traslado de las células en la jeringa y comenzar el proceso de mezcla puede causar las células del sedimento, que dará como resultado en la mezcla irregular y distribución en un filamento impreso. Si la sedimentación es observada, simple inversión (2 - 3 veces) de la Asamblea de unidad mezcladora pasiva inmediatamente antes de la mezcla es suficiente para resuspender las células y garantizar una distribución uniforme antes de licuar. Pero también es importante que las burbujas de aire en las jeringas se eliminan o minimizan antes de asegurar que la proporción de la mezcla permanece constante. Si las burbujas de aire grandes permanecen en el cartucho de bioink antes de la mezcla, se recomienda que la solución se ejecute a través de la unidad de mezcla un tiempo adicional para asegurar una mezcla completa. Si quedan burbujas de aire, tocando suave de la jeringa/cartucho de impresión puede desplazar las burbujas de aire residual. Además, si varios materiales de fusión (varios mezcla unidades o materiales) es necesario para construcciones más complejas, las concentraciones de las suspensiones de bioinks de la célula que se mezcla deben ajustarse para asegurarse de que después de diluir a través de la fusión, el correcto concentración final todavía se consigue.
En comparación con otras técnicas de fusión, la unidad mezcla de pasiva es un nuevo enfoque de cellularize bioinks. A diferencia de otras técnicas de mezcla como doble jeringa de mezcla, o revolviendo con una espátula u otra herramienta, la unidad de mezcla pasiva permite mayor consistencia en la mezcla de lotes y los usuarios. La naturaleza de las técnicas de mezcla manual, como una espátula de mezcla, se traduce en una mayor variación de usuario a usuario en la medida de y velocidad de mezcla. Además, los sistemas cerrados como el pasivo mezcla de unidad y jeringa dual que mezcla no tienen poca a ninguna pérdida de muestra en comparación con el manual de mezcla dentro de una caja de Petri o un tubo.
Ambos análogos de tejido fabricados en este manuscrito consistió en un solo tipo de bioink y uno o dos tipos de células. Sin embargo, el bioprinting de análogos de tejidos que consisten en arquitecturas que contienen regiones de distintos bioinks con los tipos de células diferentes puede ser necesario para la fabricación de tejidos fisiológicos más de construcciones20,21, 22. Más especializada bioinks con composiciones únicas o funciones pueden ser generadas a través de la mezcla de varios tipos de bioinks existentes para crear bioinks multimateriales que tienen distintas composiciones o funcionalidades23, 24. Esto puede ser particularmente importante en las regiones de transición de tejido como la piel a la capa subcutánea o el cartílago al hueso de la región del tejido donde sean necesario para garantizar el desarrollo de un gradiente de bioink composición25,26 estas regiones críticas encontradas los tejidos indígenas27. Además, podría utilizarse una unidad de mezcla para mezclar en factores de crecimiento y morfógenos en la bioinks antes de bioprinting. La eliminación de pérdida de muestra con el sistema cerrado de mezcla es atractiva para el uso de factores bioactivos caro y baja concentración, donde la pérdida de la muestra puede resultar en un cambio a su concentración final en la construcción de bioprinted, particularmente cuando los gradientes están involucrados.
Una limitación con cualquier técnica de mezcla, incluyendo el pasivo mezcla unidad utilizada en este estudio, es el riesgo de daño a los tipos de células mecánicamente sensibles. Aislados por ejemplo, estas células de la médula ósea o embrión o células madre pluripotentes inducidas son más susceptibles a daños mecánicos28,29. El acto de mezclar imparte tensiones mecánicas anormales en las células debido a las fuerzas de cizalla en el proceso de mezcla, y debe ser equilibrados para preservar la viabilidad30. Mientras que el uso de fibroblastos primarios y condrocitos en este estudio resultó en buena viabilidad (figura 2), más estudios son necesarios determinar tasas de mezcla seguras y ratios para tipos más sensibles de la célula. Hasta entonces, se recomienda que la mezcla se realiza bajo un ritmo lento constante para maximizar la viabilidad. Además, la densidad celular elegida en este estudio se determinó con base en estudios previos1. Esta densidad celular puede no ser ideal para todos los tipos de la célula.En particular, mezcla de células a una concentración más alta puede resultar en contactos célula mayor que pueden mejorar la viabilidad de las células y tejidos formación31,32. En una vena similar, la unidad mezcla de pasiva podría ser aplicable a mezcla esferoides celulares u otros agregados de la célula del33 en bioinks.
Como propuesto y demostrado en este estudio, un pasivo sistema de unidad de mezcla rápidamente puede mezclar una suspensión en un bioink viscoso. Mientras que todavía sigue existiendo el riesgo de daño mecánico a las células, el enfoque permite mayor consistencia en la mezcla dentro de un estudio individual y a través de los usuarios. Pre-cellularized bioinks utilizando este método se utilizaron para fabricar ambos cartílagos y análogos que fueron cultivados hasta por 4 semanas y demostraron la deposición de marcadores específicos de ECM de tejido de la piel. Futuros estudios se centrarán en la utilización de la voz pasiva sistema de unidad para bioinks especializados de bioinks estandardizado para la fabricación de análogos de tejidos más complejos de mezcla de mezcla.
Disclosures
Los autores de este manuscrito son empleados de CELLINK LLC.
Acknowledgments
Los autores no tienen ninguna agradecimientos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STARTINK Kit | CELLINK | SK0001 | Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure |
| Live/Dead Kit | Life Technologies | L3224 | Kit for the analysis of cell viability after mixing |
| Masson's Trichrome | Sigma Aldrich | HT15-1KT | Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs |
| Alcian Blue | Sigma Aldrich | B8438-250ML | Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs |
| INKREDIBLE+ bioprinter | CELLINK | Gen1+ | Printer utilized in the study |
| DMEM with Glutamax | Thermofisher | 10566016 | Media for culture of the cells |
| 10% fetal bovine serum | Thermofisher | A3160402 | Media supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | Media supplement |
| live cell imaging solution | thermofisher | A14291DJ | component utilized using live/dead imaging |
| inverted microscope | Olympus | IX73 | microscope utilized |
| a digital color camera | Olympus | XC10 | microscope camera utilized |
| cellSens imaging software | Olympus | n/a | stock software with the microscope |
| ImageJ | NIH | n/a | open source image analysis software |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | n/a | software for statistical analysis |
| Slic3r software (v1.2.9) | Slic3r | n/a | open-source software to convert .stl file to gcode |
| primary adult human dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | cell source for fibroblasts |
References
- Avila, H. M., Schwarz, S., Rotter, N., Gatenholm, P. 3D bioprinting of human chondrocyte-laden nanocellulose hydrogels for patient-specific auricular cartilage regeneration. Bioprinting. 1, 22-35 (2016).
- Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Eng Part C Methods. 20 (6), 473-484 (2013).
- Costantini, M., et al. Microfluidic-enhanced 3D bioprinting of aligned myoblast-laden hydrogels leads to functionally organized myofibers in vitro and in vivo. Biomaterials. 131, 98-110 (2017).
- Fedorovich, N. E., et al. Biofabrication of Osteochondral Tissue Equivalents by Printing Topologically Defined, Cell-Laden Hydrogel Scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 18 (1), 33-44 (2011).
- Vijayavenkataraman, S., Lu, W. F., Fuh, J. Y. H. 3D bioprinting of skin: a state-of-the-art review on modelling, materials, and processes. Biofabrication. 8 (3), 032001 (2016).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P. W., Grijpma, D. W., Kellomäki, M. A review of rapid prototyping techniques for tissue engineering purposes. Ann Med. 40 (4), 268-280 (2008).
- Xu, T., Jin, J., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing of viable mammalian cells. Biomaterials. 26 (1), 93-99 (2005).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Bioeng. 106 (6), 963-969 (2010).
- Parsa, S., Gupta, M., Loizeau, F., Cheung, K. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).
- Derby, B. Inkjet printing of functional and structural materials: fluid property requirements, feature stability, and resolution. Annu Rev Mater Res. 40, 395-414 (2010).
- Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Adv Mater. 28 (4), 677-684 (2016).
- Ober, T. J., Foresti, D., Lewis, J. A. Active mixing of complex fluids at the microscale. Proc Natl Acad Sci. 112 (40), 12293-12298 (2015).
- Shabnam, P., Madhuja, G., Frédéric, L., Karen, C. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnol Bioeng. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Niu, X., Lee, Y. -K. Efficient spatial-temporal chaotic mixing in microchannels. J Micromech Microeng. 13 (3), 454 (2003).
- Liu, R. H., et al. Passive mixing in a three-dimensional serpentine microchannel. J Microelectromech Syst. 9 (2), 190-197 (2000).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr protoc immunol. , A3. B. 1-A3. B (2001).
- Scott, J., Dorling, J. Differential staining of acid glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) by alcian blue in salt solutions. Histochem Cell Biol. 5 (3), 221-233 (1965).
- Garvey, W. Modified elastic tissue-Masson trichrome stain. Stain technol. 59 (4), 213-216 (1984).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. -M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- KÖpf, M., Campos, D. F. D., Blaeser, A., Sen, K. S., Fischer, H. A tailored three-dimensionally printable agarose-collagen blend allows encapsulation, spreading, and attachment of human umbilical artery smooth muscle cells. Biofabrication. 8 (2), 025011 (2016).
- Gurkan, U. A., et al. Engineering anisotropic biomimetic fibrocartilage microenvironment by bioprinting mesenchymal stem cells in nanoliter gel droplets. Mol Pharm. 11 (7), 2151-2159 (2014).
- Ma, Y., Ji, Y., Huang, G., Ling, K., Zhang, X., Xu, F. Bioprinting 3D cell-laden hydrogel microarray for screening human periodontal ligament stem cell response to extracellular matrix. Biofabrication. 7 (4), 044105 (2015).
- Lu, H. H., Thomopoulos, S. Functional attachment of soft tissues to bone: development, healing, and tissue engineering. Annu Rev Biomed Eng. 15, 201-226 (2013).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2011).
- Parisi-Amon, A., Mulyasasmita, W., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-Engineered Injectable Hydrogel to Improve Retention of Transplanted Adipose-Derived Stem Cells. Adv Healthc Mater. 2 (3), 428-432 (2013).
- Qiu, X., De Jesus, J., Pennell, M., Troiani, M., Haun, J. B. Microfluidic device for mechanical dissociation of cancer cell aggregates into single cells. Lab Chip. 15 (1), 339-350 (2015).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14 (5), 633-640 (2002).
- Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
