Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها

Published: August 31, 2017 doi: 10.3791/56374
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو علامة على وجه التحديد وعزل الحمض النووي الفيروسي من الخلايا المصابة لتحديد خصائص البروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة بشكل انتقائي.

Abstract

والهدف من هذا البروتوكول هو عزل فيروس الحلأ البسيط من النوع 1 (هامبورغ-1) الحمض النووي من الخلايا المصابة لتحديد المرتبطة الفيروسية والبروتينات الخلوية بالكتلة قياس الطيف الكتلي. على الرغم من أن البروتينات التي تتفاعل مع الجينوم الفيروسي تضطلع بأدوار رئيسية في تحديد نتيجة العدوى، تحليلاً شاملا للبروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة لم يكن ممكناً سابقا. هنا نظهر أسلوب يتيح لتنقية مباشرة من هامبورغ-1 مورثات من الخلايا المصابة. تكرار الحمض النووي الفيروسي هو المسمى بشكل انتقائي مع تعديل النيوكليوتيدات التي تحتوي على مجموعة وظيفية ألكاين. الحمض النووي المسمى هو ثم على وجه التحديد ولا رجعة فيه معلم عن طريق إلحاق التساهمية أزيد البيوتين عن طريق لنحاس (I)-حفز أزيد-ألكاين سيكلواديتيون أو انقر فوق رد. هو تنقية الحمض النووي معلم البيوتين في الخرز المغلفة ستريبتافيدين والبروتينات المرتبطة التيد وحددها الكتلي. يتيح هذا الأسلوب بالاستهداف الانتقائي والعزلة من هامبورغ-1 النسخ المتماثل شوك أو الجينوم كله من البيئات البيولوجية المعقدة. وعلاوة على ذلك، سوف تسمح التكيف مع هذا النهج للتحقيق في الجوانب المختلفة للإصابة هيربيسفيرال، فضلا عن فحص مورثات فيروسات الحمض النووي الأخرى.

Introduction

فيروسات لديها قدرة محدودة على الاضطلاع بالمهام الأساسية، وذلك يعتمد على عوامل المضيف لتسهيل الجوانب الحرجة للإصابة بما في ذلك التعبير المورثات الفيروسية والنسخ المتماثل، إصلاح، وممارسو والنقل. وكثيراً ما تزاد أنشطة هذه العوامل المضيفة بالبروتينات المرمزة فيروسي. وبالإضافة إلى ذلك، يجب تجنب الفيروسات الكشف والتدخل بالاستجابات الخلوية للعدوى الفيروسية. ولذلك، تملي التفاعلات المضيف الفيروس نتيجة الإصابة. من الأهمية بمكان هو فهم كيفية تغير فيروسات البيئة الخلوية تكييف الآلية الخلوية لتسهيل عمليات الفيروسية. أهمية خاصة هو تحديد العوامل والعمليات التي تعمل على الجينوم الفيروسي طوال دورة المعدية.

فيروس الحلأ البسيط من النوع 1 (هامبورغ-1) هو مزدوج تقطعت الحمض النووي الفيروس الذي يصيب نسبة كبيرة من السكان. خلال الساعة الأولى من الإصابة، يدخل الجينوم الفيروسي النواة، حيث تستتبعه تتالي أمر التعبير المورثات الفيروسية في التنسيق مع النسخ المتماثل (فدنا) من الحمض النووي الفيروسي1. في النواة، جينومات تخضع لضوابط تنظيمية جينية والخضوع لإصلاح واقترانها، ويتم تعبئتها في كابسيدس، حيث يتم إنتاج فيريونس ذرية الأولى خلال أقل من ست ساعات. التقييم الشامل للبروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة طوال فترة الإصابة سترسي الأساس للتحقيق في تفاصيل العمليات التي تعمل على الجينوم الفيروسي، وسوف توفر نظرة ثاقبة العوامل الفيروسية والخلوية التي الجزيئية يشاركون في مراحل مختلفة من العدوى.

وتشمل الأساليب السابقة لتحقيق العوامل المضيفة المعنية في العدوى الفيروسية تقارب تنقية البروتينات الفيروسية لتحليل البروتينات الخلوية المرتبطة بها2،3،،من45 , 6 , 7 , 8 , 9-هذه الاختبارات كانت مفيدة للتعرف على العوامل الخلوية التي ينطوي عليها في الردود المضادة للفيروسات المضيفة، فضلا عن تعديل الكروماتين الفيروسية، والتعبير الجيني، وإصلاح الحمض النووي. ومع ذلك، من الصعب التأكد من ما إذا كانت التفاعلات تعتمد على الرابطة مع فدنا، والبروتيوميات فقط توفير نظرة ثاقبة التفاعلات التي تحدث كدالة لعامل فيروسية معينة. وقد استخدمت إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة) لتحديد حيث ربط محددة من البروتينات الفيروسية والخلوية للجينوم الفيروسي10،،من1112،،من1314 , 15 والتهجين في الموقع نيون (الأسماك) جنبا إلى جنب مع إيمونوسيتوتشيميستري وقد مكن تصور العوامل الخلوية التي كولوكاليزي مع، فدنا16،،من1718 19 , 20-تتيح هذه الاختبارات للتحليل المكاني والزماني. ومع ذلك، تشمل القيود الحاجة إلى أجسام مضادة محددة للغاية، وحساسية محدودة، والحاجة إلى ثاقبة الفيروس المضيف التفاعلات السابقة. ولذلك قمنا بتطوير أسلوب يقوم على إيبوند (عزل البروتينات على الحمض النووي الوليدة)21 والمصابين أنيبوند (إيبوند الأصلية المعجل)22 للتسمية بشكل انتقائي وتنقية فدنا من الخلايا لتحديد غير منحازة للجينوم الفيروسي البروتينات المرتبطة بالطيف الكتلي. إيبوند كان مفيداً لتحقيق ديناميات شوكة الخلوية النسخ المتماثل.

لتنقية الانتقائي للجينوم الفيروسي من الخلايا المصابة، تكرار فدنا هو المسمى مع اثينيل تعديل نوكليوسدس، 5-اثينيل-2´-ديوكسيوريديني (إيدو) أو 5-اثينيل-2´-ديوكسيسيتيديني (EdC) (الشكل 1)، تليها التساهمية انقر اقتران لأزيد البيوتين عن طريق الكيمياء تيسيرا لتنقية خطوة واحدة من الجينوم الفيروسي والبروتينات المرتبطة بها على الخرز streptavidin المغلفة (الشكل 2). الأهم من ذلك، تنفذ العدوى في الخلايا الثابتة، التي لم تشارك في تكرار الحمض النووي الخلوي لتمكين العلامات المحددة من فدنا. وعلاوة على ذلك، هامبورغ-1 العدوى يؤدي دورة الخلية اعتقال ويحول دون تكرار الحمض النووي الخلوي23،24. الفيروسات يمكن بريلابيليد قبل الإصابة للتحليل البروتينات المرتبطة بالجينوم الفيروسية الواردة (الشكل 1A) أو المسمى أثناء النسخ المتماثل للحمض النووي للتحليل البروتينات المرتبطة بالمركب حديثا فدنا (الشكل 1B) 25-وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التحليل تشيس نبض التحقيق في طبيعة البروتينات المرتبطة بالنسخ المتماثل الفيروسية شوك (الشكل 1)26. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تساهمي مترافق تعديل اثينيل فدنا إلى فلوروفوري للتحقيق المكاني لديناميات البروتين (الشكل 2A و الشكل 3). تصوير يسمح للتصور مباشرة من فدنا وهو نهج مجانية للتحقق التفاعلات فدنا بالبروتين، ويمكن تكييفها لتعقب الجينوم الفيروسي في جميع أنحاء العدوى. ونحن نتوقع أن هذه النهج يمكن تعديله أيضا لدراسة أي جانب من الإصابة هيربيسفيرال، بما في ذلك الكمون وتنشيطها، ودراسة أخرى فيروسات الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، وضع العلامات مع أردين 5-اثينيل (الاتحاد الأوروبي) قد تسمح لتحليل الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-خلية ثقافة والعدوى الفيروسية، ووسم الصادرات ( الشكل 1)

البروتوكول التالي ينطوي على العمل مع الفيروسات. يرجى الرجوع إلى المؤسسة الخاصة بك ' s بروتوكولات السلامة البيولوجية فيما يتعلق بالمناولة الآمنة للفيروسات وغيرها من العناصر البيولوجية. هذا البروتوكول كان أقرها "المجلس الاستعراض المؤسسي" لجامعة بيتسبرغ.

  1. تريبسينيزي المتلاقية 150 سم 2 زراعة الأنسجة قارورة من الخلايا لجنة نهر الميكونج-5 ونقل الخلايا إلى 2 سم 600 لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 100 مل دميم بالإضافة إلى 10% FBS. احتضان عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO 2 لمدة 3-4 أيام للوصول إلى مرحلة كونفلوينسي وثابتة. ويتضمن طبق 2 سم 600 المتلاقية ~ 7 × 10 7 الخلايا. إعداد لوحة 1 لكل شرط ولوحة 1 لكل عنصر تحكم السلبية المقابلة.
    ملاحظة: يجب أن تصل إلى الخلايا في المرحلة ثابتة تحول دون تكرار الحمض النووي الخلوي لضمان أن فدنا الوحيد هو المسمى وتنقيته في الخطوات اللاحقة-
    ملاحظة: كل عينة يتطلب من المجاملة غير مسمى مراقبة سلبية أعدت باستخدام نفس ظروف الإصابة والنقطة الزمنية دون الإضافة لتنمية الصادرات-
    ملاحظة: بتقليص نسخة من هذه التجربة ينبغي أن يتم بالتوازي لاختبار لوسم الحمض الخلوي بالتصوير باستخدام نمو الخلايا القابلة للمقارنة، العدوى، تنمية الصادرات وسم الشروط، والوقت النقاط (راجع الخطوة 2)-
  2. تمييع 7 × 10 8 1 HSV بفو في 7 مل تريسبوفيريد الباردة المالحة (تبس). إزالة النمو المتوسطة وتخزينها في 37 درجة مئوية. لتصيب، إضافة 7 مل الفيروس المخفف للخلايا 5 لجنة نهر الميكونج والصخور ح 1 في درجة حرارة الغرفة. الامتزاز التالي، إزالة العدوى وشطف مع درجة حرارة الغرفة 50 مل TBS واستبدال المتوسطة النمو الأصلي. احتضان عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO 2. هذه الخطوة ينبغي أن يتم لكل حالة تجريبية والمراقبة السلبية.
    ملاحظة: العلامات زيادة الصادرات يمكن تحقيقه باستخدام HSV 1 طفرات المعيبة للتعبير عن دوتباسي الفيروسية (الجين UL50) و/أو glycosylase اليوراسيل (الجين UL2). هامبورغ-1 دوتباسي خصوصية الركازة منخفضة، ويمكن إنقاص تفعيل عدة 25 ، النظير نوكليوزيد 27-
  3. تسمية الجينوم الفيروسي مع تنمية الصادرات. اتبع التوجيهات للتسمية الواردة الجينوم (1.3.1.)، تكرار الجينوم (1.3.2.)، أو النسخ المتماثل الفيروسية شوك (1.3.3.)-
    ملاحظة: الخطوة الوحيدة 1.3.1 أو 1.3.2 1.3.3 ينبغي أن يتم اعتماداً على ما إذا كانت جينومات واردة، جينومات منسوخة أو شوك النسخ المتماثل يتم تحليلها في الخطوات اللاحقة، على التوالي.
    ملاحظة: إيدو أو إيدو ارا و يمكن أن تكون بديلاً لتنمية الصادرات. وينبغي رصد سمية النظير نوكليوزيد والتقليل إلى أدنى حد. بريلابيليد
    1. استخدام الأرصدة الاضطلاع بالعدوى في الخطوة 1.2 والمتابعة إلى الخطوة 2 أو 3 ضمن ح 4 نشر العدوى (hpi) للتحقيق في فدنا unreplicated ( الشكل 1A).
      ملاحظة: تعد الفيروسات بريلابيليد الأسهم باستخدام البروتوكول هو موضح سابقا 25. يجب أن يتم تمرير مخزونات الفيروس عن طريق عمود G-25 لإزالة أي تنمية الصادرات المتبقية.
      2. تسمية
    2. فدنا النسخ المتماثل بإضافة 5-25 ميكرومتر تنمية الصادرات إلى مستنبت الخلية من الخلايا المصابة بالنسبة 2-4 ح ( الشكل 1B). قبل إضافة، تضعف المؤسسة في 1 مل متوسط نمو.
    3. إلى تسمية النسخ المتماثل الفيروسية شوك، بعد حدوث النسخ المتماثل فدنا (≥ 4 hpi)، تسمية نبض تكرار فدنا مع 5-25 ميكرومتر تنمية الصادرات لمدة 5-20 دقيقة. لمطاردة، شطف 3 x مع تشيس المتوسطة التي تحتوي على 25-100 ميكرومتر 2´deoxycytidine (ديوكسيك)، واحتضان ثم حضور المتوسطة تشيس لمدة 20-40 إضافية دقيقة ( الشكل 1).
      ملاحظة: يجب أن اكويليبراتيد المتوسطة النبض ومطاردة إلى 37 درجة مئوية و 5% CO 2 قبل الاستخدام.
      ملاحظة: لإجراء التجارب على مطاردة نبض، من المهم النظر في مقدار الوقت الذي يستغرقه نوكليوسدس لدخول الخلية وتكون فوسفوريلاتيد قبل كان يمكن إدراجها في تكرار الحمض النووي. وهذا يجب أن يحدد تجريبيا.
      ملاحظة: لتحديد دقة نبض التجارب تشيس، حساب معدل النسخ المتماثل الفيروسية الظروف التجريبية المستخدمة. وهذا يمكن تحديده من خلال PCR الكمي للجينوم الفيروسي أثناء خطوة مفردة نمو وقت دورة 26-
      ملاحظة: للتصوير الجينوم الفيروسي المتابعة إلى الخطوة 2 وتطهير الجينوم الفيروسي المضي قدما إلى الخطوة 3-

2. تصوير لتنمية الصادرات المسمى الحمض النووي ( الشكل 2A)

ملاحظة: أنه من المفيد إجراء تصوير بالترادف مع أسلوب تنقية الجينوم الفيروسي للتأكد من أنه لن يتم تسمية الحمض الخلوي في التجارب. يمكن أيضا استخدام التصوير لتصور طبيعة المسمى فدنا، والتحقق من صحة البيانات البروتيوميات. وترد أمثلة للحمض الخلوي الصبغي الخلوي والفيروسية تلطيخ أنماط في الشكل 3-

  1. الاضطلاع بالعدوى، ووسم الصادرات كما هو مبين في الخطوة 1 باستثناء استخدام تقليص الشروط في كوفيرسليبس في طبق استنبات الأنسجة 12-جيدا يحتوي على 1 مل متوسط نمو.
    2. بارافورمالدهيد
  2. الخلايا الإصلاح مع 1 مل 3.7% في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 15 دقيقة في الرايت بعد التثبيت، خلايا شطف x 2 مع 1 مل 3% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني.
    تحذير: يمكن أن يسبب بارافورمالدهيد إصابة خطيرة أو الدائمة. اتباع احتياطات السلامة-
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا ويمكن تخزين كوفيرسليبس في 4 درجات مئوية في الغسيل الثانية لمدة 3 أيام-
  3. بيرميبيليزي الخلايا مع 1 مل بيرميبيليزيشن المخزن المؤقت [انظر الجدول للمواد] لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بينما هزاز.
  4. شطف مع 1 مل من جيش صرب البوسنة 3%، ومن ثم كتلة مع 1 مل 3% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بينما هزاز.
  5. إضافة 1 مل من رد فعل فوق كوكتيل [انظر الجدول للمواد] إلى كوفيرسليبس تساهمي متزاوجة أليكسا فلور 488 المسمى أزيد لتنمية الصادرات الحمض النووي. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع هزاز. نضح وشطف مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  6. وصمة عار الحمض الخلوي مع 1 مل إضعاف 1:2,000 هويشت في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بينما هزاز. نضح وشطف مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    7. الفلورة غير المباشرة
  7. وصمة عار مع الأجسام المضادة الابتدائي والثانوي وفقا لمعيار البروتوكولات 25-
    ملاحظة: فدنا المسمى كولوكاليزيس مع ICP8 أو ICP4، أو UL42، والمسمى الخلوية كولوكاليزيس الحمض النووي مع وصمة عار هويشت.
  8. جبل كوفيرسليبس على الشرائح والصور الخلايا باستخدام مجهر الأسفار.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع.

3. تنقية فدنا و "البروتينات المرتبطة"

ملاحظة: عدة جوانب من هذا البروتوكول وقد تم تكييف من يونغ et al. 22
ملاحظة: ينبغي مبردة كافة المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة على الجليد قبل الاستخدام وجميع الخطوات ينبغي أن تنفذ على الجليد، ما لم يبين خلاف ذلك.

  1. حصاد الأنوية.
    ملاحظة: قبل عزلة نوى، يمكن استخدام فورمالدهايد للبروتينات التشعب للحمض النووي. ثم يمكن استخدامها يغسل شروطا أكثر صرامة خلال تنقية الحمض النووي على الخرز المغلفة ستريبتافيدين. للجمهورية التشيكيةراجع شروط أوسلينكينج ويغسل Sirbu et al. 21-
    1. استبدال المتوسطة النمو مع 20 مل المخزن المؤقت للاستخراج أنوية (NEB) واحتضانها لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية مع هزاز عرضية. الأنوية سوف تصبح مرئية في المجهر.
    2. نوى كشط من لوحة باستخدام مكشطة الخلية ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 درجات مئوية بيليه النوى، وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: تريبان تلطيخ الأزرق يمكن استخدامها للتحقق من عزل نواة من خلايا-
    3. برفق إزاحة بيليه النووية في برنامج تلفزيوني، نقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل، 10 مل وبيليه من سينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 ° "جيم تماما" إزالة برنامج تلفزيوني-
      ملاحظة: يمكن أن تجمد الأنوية والبروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً عند هذه النقطة. للقيام بذلك، ريسوسبيند برفق بيليه النووية في 500 ميليلتر تجميد المخزن المؤقت واحتضان الأنبوب في حمام جليد جاف إيثانول. تخزين نويات المجمدة في-80 درجة مئوية. قبل الاستخدام، إذابة النوى في درجة حرارة الغرفة، ونقل بسرعة إلى الجليد، وإضافة 10 مل برنامج تلفزيوني، روك برفق للمزيج، بيليه بالطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 درجات مئوية، وإزالة برنامج تلفزيوني. تجميد الأنوية قد يؤدي انخفاض الغلة.
  2. أزيد البيوتين تساهمي المتقارنة لتنمية الصادرات المسمى فدنا-
    1. ريسوسبيند بيليه النووية في 10 مل انقر فوق رد فعل مزيج [انظر الجدول للمواد] بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات مع بيبيت 10 مل.
      ملاحظة: من المهم أن يتم إضافة الكواشف المدرجة في مزيج فوق الرد بالترتيب الموضح.
    2. تدوير ح 1 في 4 درجات مئوية. بينما تناوب إعداد والبرد والمخازن المؤقتة B1، B2، و B3 [انظر الجدول للمواد].
    3. نوى بيليه من سينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 ° "جيم تماما" إزالة انقر فوق خلط رد فعل ويغسل بيليه بلطف ريسوسبيندينج في 10 مل برنامج تلفزيوني وسينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 ° C.
    4. بلطف ريسوسبيند بيليه النووية في 1 مل برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب [ميكروفوج] 1.5 مل استخدام تلميح ماصة كبيرة وتتحمل. بيليه الأنوية سينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 2,500 س ز في 4 ° "جيم تماما" إزالة برنامج تلفزيوني وفلاش التجميد في النيتروجين السائل-
      ملاحظة: يمكن مؤقتاً في البروتوكول في هذه المرحلة ويمكن تخزين نويات المجمدة في-80 درجة مئوية. تجميد ذوبان الجليد يساعد على تحلل اللاحقة مع ذلك فمن المستحسن أن تكون نواة فلاش مجمدة حتى عند الشروع في "الخطوة 3، 3" في نفس اليوم-
  3. النوى، وتجزئة الحمض النووي- ذوبان الجليد الأنوية على الجليد
    1. وريسوسبيند في 500 ميليلتر B1 المخزن المؤقت قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تبني على الجليد ل 45 دقيقة
    2. عينات سنكيت 6 مرات لمدة 30 ثانية كل في السعة 40% باستخدام مسبار ميكروتيب 3 مم. وضع العينات في الثلج لمدة 30 ثانية بين النبضات. بعد سونيكاتيون، يجب أن تظهر عينات واضحة ولا غائم.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون الأمثل الظروف سونيكاتيون سونيكاتورس الفردية. للحصول على إرشادات مفصلة حول كيفية تحسين ظروف sonication تشير إلى ليونغ et al. 22-
    3. بيليه الحطام خلية من سينتريفوجينج في 14,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. وينبغي تقليص حجم بيليه. تصفية المادة طافية من خلال 100 ميكرومتر خلية مصفاة والإبقاء التدفق من خلال-
    4. إضافة 500 ميليلتر B2 المخزن المؤقت للمادة طافية المصفاة. 900 ميليلتر من هذه العينة التي ستستخدم في خطوة 3.4.2.
    5. أخذ قاسمة لكل شرط لعزل الحمض النووي (50 ميكروليتر أو حجم 1/20)، وإضافة 50 ميليلتر 2 × حل الحزب الديمقراطي الصربي bicarb [انظر الجدول للمواد]. المضي قدما في البروتوكول عزل الحمض النووي (3.6 خطوة)-
    6. تأخذ قاسمة لكل شرط لإدخال البروتين (50 ميكروليتر أو حجم 1/20) وإضافة 50 ميليلتر 2 × لايملي عينة المخزن المؤقت، وتجميد في النتروجين السائل وتخزينها في-80 درجة استخدام جيم في خطوة 3.5.6.
  4. بيوتينيلاتيد ربط الحمض النووي ل streptavidin المغلفة الخرز.
    1. الخرز إعداد T1 ستريبتافيدين المغناطيسي بنقل 300 ميليلتر من الملاط حبة إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب. إعداد أنبوب واحد من الخرز كل عينة. أغسل حبات x 3 مع 1 مل B2 العازلة من فورتيكسينج ريسوسبيند، وتطبيق مغناطيس لفصل الخرز، ويسفط في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي-
      ملاحظة: الأمثل ملزمة نتيجة الظروف في الغلة مكبر وخلفية الحد الأدنى الملزم. تبين تجريبيا أن الخرز المغناطيسي Streptavidin T1 لديها قدرة ملزمة أكبر بكثير من الخرز [اغروس]، فضلا عن الخرز ستريبتافيدين الأخرى، وأقل الخلفية ملزمة من الخرز C1 ستريبتافيدين ( الشكل 4A ).
    2. ميليلتر إضافة 900 من عينة من الخطوة 3.3.4. الخرز غسلها وتدوير بين عشية وضحاها في 4 ° C.
      ملاحظة: لا دوامة الخرز حالما تتم إضافة نموذج لهم.
      ملاحظة: إذا كان يتم عزل كميات كبيرة من الحمض النووي أو البروتين في مراقبة سلبية غير مسمى، هذه الخطوة يمكن تقليل من بين عشية وضحاها إلى ح 4 للحد من الربط الخلفية.
  5. تغسل الخرز والوت فدنا والبروتينات المرتبطة.
    ملاحظة: من المستحسن استخدام تلميحات التصفية للخطوات المتبقية.
    1. مكان العينات إلى رف أنبوب مغناطيسي [ميكروفوج]، إزالة المادة طافية، ريسوسبيند برفق في 1 مل B2 المخزن المؤقت، استدارة عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5
    2. ثلاث مرات تكرار الخطوة 3.5.1.
    3. وضع العينات في رف أنبوب مغناطيسي [ميكروفوج] وإزالة المادة طافية ولطف ريسوسبيند في 1 مل B3 المخزن المؤقت، وتدوير عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5
    4. نقل 100 ميليلتر حبة خليط (حجم ال 1/10) إلى أنبوب جديد لعزل الحمض النووي منضم. ينطبق هذا الأنبوب بالمغناطيس وإزالة المادة طافية، ريسوسبيند الخرز في 100 ميليلتر 1 × حل الحزب الديمقراطي الصربي-bicarb والمضي قدما في البروتوكول عزل الحمض النووي (3.6 خطوة)-
    5. تطبيق الأنبوب الذي يحتوي على خليط حبة ميليلتر 900 المتبقية من الخطوة 3.5.3. للمغناطيس، قم بإزالة المادة طافية، وريسوسبيند الخرز في 50 ميليلتر 2 × لايملي عينة المخزن المؤقت الوت البروتين والحمض النووي-البروتين المجمعات.
    6. عينات يغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ودوامه، تدور في [ميكروفوج] بسرعة وتطبق المغناطيس. نقل النذرة بأنابيب جديدة، وتجميد فلاش، ومخزن في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: استخدام غطاء تأمين لضمان أن لا البوب أنابيب فتح أثناء الغليان.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً في البروتوكول في هذه المرحلة، ويمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية لعدة أسابيع.
    7. تحليل عينات البروتين بالأزرق أخذ تلطيخ النشاف الغربية أو الكتلي بإجراءات قياسية 25. يتم إظهار النتائج الممثلة في الشكل 4 و الشكل 5-
      ملاحظة: لتحديد ما إذا كان العائد بروتين كافية الكتلي، ميليلتر 7.5 لكل عينة من يستخدمها لتحليل الأزرق أخذ تلطيخ والمرتبطة ميليلتر 7.5 النشاف الغربية الجينوم الفيروسي الممثل البروتين (ICP4، ICP8، أو UL42). نفس الحجم من ليساتيس من الخطوة 3.3.6. يتم تشغيل جنبا إلى جنب مع إلى مراقبة مستويات البروتين الإدخال. ثم يتم تحليل العينة المتبقية (35 ميليلتر) بوسائل قياس الطيف الكتلي كما هو موضح سابقا 25-
  6. عزل الحمض النووي
    1. احتضان العينات المأخوذة من الخطوات 3.3.5. و 3.5.4. عند 65 درجة مئوية ل 4-16 h. إزالة عينة من الخرز المغناطيسي، إذا لزم الأمر.
    2. استخراج عينات مع 150 ميليلتر الفينول: كلوروفورم: إيسواميل الكحول (PCI) ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد.
    3. استخراج PCI المتبقية مع 100 ميليلتر يدتا تريس (TE) وإضافة المرحلة المائية إلى أنبوب جديد.
    4. استخراج عينات مع 200 ميليلتر كلوروفورم: إيسواميل الكحول (24:1).
    5. تنقية المرحلة المائية باستخدام أدوات تنقية PCR وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s-
      ملاحظة: سوف تتحول مؤشر الرقم الهيدروجيني في المخزن المؤقت PB الأرجواني عندما تضاف إلى العينة. إضافة 10 آند #181؛ ل م 3 نواك pH 5.0 انخفاض الرقم الهيدروجيني للعينة.
    6. تركيز "الحمض النووي تحديد" باستخدام فلوروميتير.
      ملاحظة: هذا البروتوكول عادة ينتج 100-400 نانوغرام حبة زمنياً الحمض النووي. الحمض النووي لا ينبغي الكشف عنها في النذرة التحكم السلبية التي لم يتم إضافة تنمية الصادرات في "الخطوة 1-3"-
    7. الحمض النووي يمكن أن تكون مخزنة في ربط الحمض النووي منخفض الأنبوبة في 4 أو-20 درجة مئوية، ويمكن استخدامها لبكر في الوقت الحقيقي أو تحليل تسلسل إنتاجية عالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأنجز استخدام الكيمياء انقر لتنقية الحمض النووي من الخلايا أولاً ب أسلوب إيبوند21. وغرض إيبوند لتنقية شوك الخلوية النسخ المتماثل للتعرف على البروتينات المرتبطة بها. أننا قد تكيفت هذه التقنية لدراسة تفاعلات البروتين فدنا على وجه التحديد أثناء الإصابة. التلاعب بالنهج المتبع في التسمية الجينوم الفيروسي مع تنمية الصادرات (الشكل 1)، جنبا إلى جنب مع العدوى المتزامنة، سمح للعزل الانتقائي والتحقيق من السكان منفصلة من فدنا. هامبورغ-1 "الحمض النووي" يسمى مع تنمية الصادرات (الشكل 1) لتسهيل التساهمية مرفق فلوروفوري للتصوير أو البيوتين لتنقية (الشكل 2). ويمكن بريلابيليد قبل الإصابة للتحليل البروتينات المرتبطة بالجينوم الواردة (الشكل 1A) الفيروس أو المسمى أثناء النسخ المتماثل للحمض النووي للتحليل البروتينات المرتبطة بالمركب حديثا فدنا (الشكل 1B)25. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التحليل تشيس نبض التحقيق في طبيعة البروتينات المرتبطة بالنسخ المتماثل الفيروسية شوك (الشكل 1)26. يمكن تصور الحمض النووي داخل الخلايا لتوفير المعلومات المكانية حول الطبيعة المسمى الحمض النووي، وتقديم الدعم للتفاعلات التي تم تحديدها بالبروتين فدنا (الشكل 3). أخذت معا، تسمح البروتوكولات المذكورة هنا التحقيق البروتين البشري في جوانب متعددة من الإصابة الإنتاجي لتوفير نظرة ثاقبة التغيرات الحيوية التي تحدث في جينومات هامبورغ-1. كذلك يمكن تكييف هذه النهج التحقيق في اختفاء وإعادة التنشيط، بحث تعمل المرتبطة بطفرات الفيروسية، ودراسة أخرى فيروسات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي.

وكانت جوانب من هذا الأسلوب تنقية البروتين مقتبسة من يونغ وآخرون. 22-هنا تحسنا كبيرا لتطهير المؤسسة المسماة الحمض النووي هو استخدام الخرز Streptavidin T1 بدلاً من الخرز [اغروس] المغلفة ستريبتافيدين. لتحسين تنقية الحمض النووي، تم اختبار عدة أنواع من الخرز المغلفة ستريبتافيدين للربط غير محدد عند الإصابة قد أجريت في غياب تنمية الصادرات ومن أجل استرداد البروتين أقصى حضور تنمية الصادرات (الشكل 4 أ). لهذه التجارب، النشاف الغربية نفذت للبروتين ملزمة فدنا ICP4. تنقية أجريت على Streptavidin T1 الخرز أدت إلى أقل قدر من الخلفية ملزمة في غياب تنمية الصادرات وانتعاش البروتين أقصى حضور تنمية الصادرات.

يمكن التعرف على البروتينات المرتبطة فدنا بطرق البروتين البشري بما في ذلك النشاف الغربية والطيف الكتلي. النشاف الغربية يمكن استخدامها للتحقيق في ديناميات التفاعلات المعروفة ويمكن استخدامها الكتلي كنهج غير متحيز لتحديد البروتينات فدنا رواية المرتبطة. مثال من البروتين العائد كما هو موضح دالة لوسم الصادرات المتزايدة في الشكل 4B. تشويه سمعة، بدلاً من نمط النطاقات واضح، يحتفل عادة قبل Blue أخذ تلطيخ. هذا الأرجح نظراً لوجود الحمض النووي الموجودة في العينة البروتين، أو لأن هناك وفرة بروتين. من المهم أيضا أن نلاحظ أن الحافز النحاس المستخدمة في رد فعل فوق يمكن أن يسبب التحلل الجزئي للبروتين والأحماض النووية،من2829. من النشاف الغربية، وتكتشف مستويات مماثلة من ICP4 عادة في الواتس (الخطوة 3.5.5.) بعد تنقيتها فدنا التي وصفت لمدة 60 دقيقة مع تنمية الصادرات كتلك الموجودة في نفس الكمية من عينة إدخال إعداد من ليستاتيس النووية (الخطوة 3.3.6.). يمكن استخدام هذه المعلومات كدليل لتحديد ما إذا كان الانتعاش كافية لإرسال العينة المتبقية للتحليل الشامل والمطيافيه.

يمكن أن تنفذ نانو اللوني السائل بالترادف الطيف الكتلي (LC-MS/MS) كما هو موضح سابقا من25 إلى تحديد البروتينات المرتبطة بتنقية فدنا. ويتم تحليل البيانات LC-MS/MS بمقارنة قيم العدد الطيفية (SpC) بين العينة التجريبية المسمى تنمية الصادرات والسيطرة السلبية غير مسمى المقابلة. وتعتبر البروتينات إثراء في العينة التجريبية على أساس المعايير التالية: 1) البروتين لديه على الأقل خمس تهم الطيفية (SpC) في العينة التجريبية، 2) البروتين لم يتم الكشف عن في عنصر التحكم أو إثراء للسيطرة بأربعة إضعاف على الأقل استناداً إلى تقسيم القيم توافق آراء ساو باولو، و 3) البروتين هو إثراء للسيطرة في replicates البيولوجي اثنين أو أكثر. عامل تطبيع وفرة الطيفية (نساف: Equation 1 ) يمكن استخدامها لمراعاة الاختلافات في الوزن الجزيئي (ميغاواط) والبروتين إجمالي العائد. هذه المعادلة يحدد الوفرة النسبية للبروتينات الفردية داخل عينة ويسمح بإجراء مقارنة مباشرة لهذين الشرطين التجريبية المختلفة التي يتم تنقيتها كميات مختلفة من فدنا (على سبيل المثال، مقارنة الجينوم الفيروسي الإدخال ( الشكل 1A) لنسخ مورثات (الشكل 1B)).

هناك طرق متعددة للبروتين إثراء البيانات الحالية. وتشمل بعض الأمثلة على المخططات الدائرية والمخططات متداخل وشبكات التفاعل البروتين. يمكن استخدام المخططات الدائرية لتوضيح نسبة البروتينات المحددة التي هي معروفة لتعمل في عملية بيولوجية معينة (الشكل 5A). ومع ذلك، يمكن أن تنشأ مشاكل عندما يكون البروتين واحد أكثر من الوظيفة البيولوجية، وهو كثيرا ما يحدث. كما أن من الصعب مقارنة البيانات عبر مختلف المخططات الدائرية. مخططات فين هي مفيدة لإظهار العلاقات بين البروتينات المحددة بموجب شروط تجريبية مختلفة، ولكن لا توفر أية معلومات فنية حول البروتينات المحددة (الشكل 5 (ب)). شبكات التفاعل البروتين تصوير توضيح مرئي من التفاعلات المحتملة بين البروتينات التي تم تحديدها وتقديم معلومات حول أنواع العمليات البيولوجية التي تشارك (الشكل 5). وتتوفر العديد من الموارد على الإنترنت لرسم خرائط تفاعلات البروتين البروتين المتوقعة بما في ذلك سلسلة (أداة البحث "استرجاع تتفاعل" الجينات/البروتينات)30. أدوات الإنترنت عموما مجهزة للتعامل مع البيانات البروتيوميات من مختلف الأنواع وتوفر معلومات قيمة حول المضيف البروتينات المشاركة في الميكانيكا الجينوم الفيروسي. ومع ذلك، البروتينات الفيروسية عموما غير مدرجة في قواعد البيانات، والتي يمكن أن تؤدي إلى تعقيد التحليل. ولذلك، من المهم النظر في الاستنتاجات الرئيسية التي يود المرء أن ينقل عند البت في كيفية تقديم البيانات البروتيوميات.

Figure 1
الشكل 1:أونج > النهج لتسمية "الحمض النووي" هامبورغ-1- (أ) أن الاعتداء حالة الفيروس واردة، ويستريح لجنة نهر الميكونج-5 خلايا في ز0 مصابون بريلابيليد هامبورغ-1 والجينوم هي جزيئي في أقل من 4 hpi لدراسة الحمض النووي الفيروسي unreplicated. (ب) للاعتداء في الحالة تكرار الفيروس والخلايا لجنة نهر الميكونج-5 من المصابين غير مسمى هامبورغ-1 وتنمية الصادرات (نجوم البرتقالي) إضافة إلى متوسط نمو الخلايا المصابة والمحتضنة ح 2-4 بعد بدء تكرار الحمض النووي الفيروسي (hpi إيه فور). (ج) أن الاعتداء شوك النسخ المتماثل الفيروسية، إصابة الخلايا هي نبض المسمى مع تنمية الصادرات لشوك النسخ المتماثل 5-20 دقيقة ثم يمكن أن يكون مطاردا مع ديوكسيك. تنمية الصادرات المسمى الحمض النووي هو اللون البرتقالي. وقد تم تعديل هذا الرقم من ديمبووسكي وديلوكا25. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الإجراءات المبينة في هذه الورقة لتحليل لتنمية الصادرات المسمى الحمض النووي- (أ) موجزاً لطريقة تصوير تنمية الصادرات المسمى الحمض النووي. يتم تمثيل الحمض النووي المعلمة باللون الأخضر. (ب) الخطوط العريضة لطريقة تنقية وتحليل المتلقين للمعلومات لتنمية الصادرات المسمى فدنا. وقد تم تعديل هذا الرقم من ديمبووسكي وديلوكا25. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: "التصور لتنمية الصادرات" المسمى الحمض النووي- الخلايا المصابة، والمسمى، وتصويرها كما هو موضح في الشكل 1 ، و الشكل 2. تظهر الصور التمثيلية المسماة الحمض النووي الخلوية والفيروسية. كولوكاليزيس الحمض الخلوي مع هويشت وصمة عار وفدنا مع ICP4. شريط المقياس: تم تعديل الشكل µm.This 5 من ديمبووسكي وديلوكا25 وديمبووسكي et al. 26- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : نتائج تنقية البروتين الممثل. (أ) مقارنة بين الغلة البروتين عندما كانت تنفذ خطوات تنقية إلى استخدام عدة أنواع مختلفة من الخرز streptavidin المغلفة. الإصابة نفذ حضور تنمية الصادرات (+) للمقارنة بين الغلة البروتين، أو في غياب تنمية الصادرات (-) لمقارنة الربط الخلفية. الالتهابات ووسم الصادرات نفذت كما هو موضح في الشكل 1 باء وكانت تنقية الحمض النووي-البروتين المجمعات وفقا للخطوات المبينة في الشكل 2 استخدام كميات مماثلة من أنواع مختلفة من الخرز streptavidin المغلفة. أعلى اللوحة: مقارنة بين الغلة البروتين بعد تنقية على streptavidin مغلفة بالخرز [اغروس] أو M-280 ستريبتافيدين. لوحة أسفل: مقارنة بين الغلة البروتين بعد تنقيتها في M-270 ستريبتافيدين، M-280، Streptavidin C1 أو T1 ستريبتافيدين. النشاف الغربية نفذ بجسم مضاد ضد البروتين الفيروسي ICP4. ويرد ICP4 المنقي في الممر الأول للمقارنة. كان يتطلب التعرض أطول من اللوحة السفلية للاحتفال كثافة مماثلة ل ICP4 في الممرات "280" كما هو الحال في أعلى اللوحة. وتظهر نتائج (ب) تنقية البروتين الممثل كدالة للوقت لتنمية الصادرات وسم. الالتهابات ووسم الصادرات نفذت كما هو موضح في الشكل 1 باء وكانت تنقية الحمض النووي-البروتين المجمعات وفقا للخطوات المبينة في الشكل 2 استخدام الخرز T1 ستريبتافيدين. وسم الصادرات أجرى 0، 20، 40، أو 60 دقيقة وأخذ الأزرق تلطيخ (أعلى) وتظهر النتائج (أسفل) النشاف الغربية. النشاف الغربية نفذ بأجسام مضادة محددة ل ICP4، أو UL42، أو جابده. تم أخذ العينة النذرة من الخطوة 3.5.5. ومن الخطوة 3.3.6. يشير السهم إلى streptavidin، بينما يشير ل سلم البروتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
5 الرقم: أمثلة على طرق مختلفة لتقديم البيانات البروتيوميات. المخططات الدائرية (A) تلخيص البروتينات التي حددتها الكتلي للبروتين الواتس المرتبطة بالجينوم الفيروسي تنقيته في 6 hpi. تشير القيم إلى عدد البروتينات المحددة لكل فئة وظيفية. T تشير إلى العدد الإجمالي للبروتينات المحددة. وتشير الألوان إلى الفئات التالية: اللون الأرجواني-تجهيز الجيش الملكي النيبالي، أحمر-النسخ، الأخضر-الكروماتين يعيد البناء والنقل النووي أورانج-تكرار الحمض النووي، والأصفر-والبط البري-سيتوسكيليتون، أزرق داكن-HSV البروتينات الهيكلية ورمادي-أخرى/غير معروف. (ب) مخططات متداخل تصور تداخل البروتينات المحددة المراد إقرانها مع الجينوم الفيروسي في 6 أو 8 أو 12 hpi. (ج) تعيين سلسلة يصور البروتينات المخصب على شوك الفيروسية النسخ المتماثل بعد دقيقة 5 نبض تنمية الصادرات. البروتينات البشرية أثري إضعاف بالمقارنة مع سيطرة سلبية غير مسمى تظهر في خريطة التفاعل الوظيفي، والتي تم إنشاؤها باستخدام السلسلة30 مع إعدادات البيانات لعرض التفاعلات ثقة عالية فقط. واستخدمت أسماء الجينات لخريطة التفاعلات. وتشير إلى دوائر البروتينات تلك الوظيفة في نفس العملية البيولوجية. تم تعديل هذا الرقم من ديمبووسكي وديلوكا25 وديمبووسكي et al. 26- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويشمل هذا البروتوكول العديد من الخطوات التي، إذا لم تتبع بدقة، يمكن أن يؤدي إنتاج البروتين انخفاضا كبيرا أو تلوث بالحمض الخلوي. من الأهمية بمكان أن يتم استخدام الخلايا ثابتة لجميع التجارب لضمان أن الحمض الخلوي لا المسمى وتنقيته. هذا يمكن تأكيد عدم وجود بولمرس الحمض الخلوي في العينة البروتين لأن هامبورغ-1 لا تستخدم بوليميريز الحمض الخلوي لتركيب الجينوم. خلال تنمية الصادرات وسم ونوى حصاد الخطوات، ينبغي متداخلة العينات التأكد من أن يتم معالجة كل منهما على قدم المساواة. خلال خطوات تنقية، ينبغي الحرص لا للتلاعب بنوي من بيبيتينج كثيرا. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تفسخ سابق لأوانه النوى، فضلا عن فقدان عينة بسبب إصرارها على الجانبين من نصائح بيبيت. وعلاوة على ذلك، خطوة سونيكيشن ينبغي أن يكون الأمثل للفرد سونيكاتورس ويجب تيتراتيد كمية الخرز المغلفة ستريبتافيدين المستخدمة لربط البيوتين للعائد الأمثل من البروتين.

يمكن عدة تعديلات على هذا البروتوكول وتشمل استخدام أنواع مختلفة من الفيروسات أو أنواع الخلايا أو إضافة خطوة للبروتين التشعب للحمض النووي. عند اختيار نوع خلية لاستخدامها للتحقيق البروتين البشري، من المهم التحقق من توافر قاعدة تسلسل البروتين لهذه الأنواع. الافتقار إلى الموارد البروتيوميات وسوف تحد بشكل كبير المصب تحليل بيانات البروتين. قيد آخر هو الحاجة إلى عدد كبير من الخلايا، ولذلك قد يكون من الصعب ﻹعداد كافية من الخلايا الابتدائية، مثل الخلايا العصبية، لهذه التجربة. ينبغي أن يكون هذا الأسلوب متوافق مع فيروسات الحمض النووي الريبي أو أخرى طالما أن العدوى الفيروسية لا تعتمد على تكرار الحمض النووي الخلوي. وعلاوة على ذلك، سيكون من المثير للاهتمام أن استكشاف التغيرات في البروتين الحمض النووي من التفاعلات التي تحدث في طفرات هامبورغ-1. آخر تعديل لهذا البروتوكول يمكن أن تكون إضافة خطوة crosslinking فورمالدهايد قبل عزلة نوى، مما يسمح بشروط أكثر صرامة من المياه والصرف الصحي خلال تنقية21. إضافة فورمالدهايد لن تؤثر على القدرة على جني النوى ولكن قد ينتج البروتين انخفض المحصول بسبب صعوبة عكس crosslinks أثناء شطف البروتين.

النتائج من هذا البروتوكول تمثل متوسط حالة الحمض النووي الفيروسي التي يجري بحثها. ولذلك، من الصعب التمييز بين حالة المجمعات معا على جزيئات الحمض النووي نفسه أو منفصلة. فدنا وصف الأساليب الموصوفة هنا في تركيبة مع التصوير عالية الدقة يمكن استخدامها للتحقق من البيانات البروتيوميات وقد تساعد على التمييز بين مختلف قطاعات السكان المسمى الحمض النووي داخل خلية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام رقاقة seq كمتابعة لأسلوب لتحديد مواقع محددة من البروتينات في الجينوم الفيروسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونعترف هانا فوكس للحصول على مساعدة في إعداد هذه المخطوطة. أيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح R01AI030612.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MRC-5 cells ATCC CCL-171
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-082 Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM  (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate
600 cm2 tissue culture dish Thermo Fisher Scientific 166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1 stock Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best
Sephadex G-25  column (PD-10 Desalting Column) GE Healthcare 17085101
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) Sigma-Aldrich T511307 Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C 
2´-deoxycytidine (deoxyC) Sigma-Aldrich D3897 Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C 
Nuclear Extraction Buffer (NEB) Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)
Cell scraper Bellco glass 7731-22000 Autoclave before use
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
PBS, pH 7.2 (10x) 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) Fisher Scientific C489 Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month
(+) Sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use
Biotin azide Invitrogen B10184 Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year 
Click Reaction Mix Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)  
Complete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001 Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer
Freezing buffer Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor)
Buffer B1 Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B2 Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B3 Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe Sonics VCX 130
Cell strainer Falcon 352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Life Technologies 65601
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Mini-Tube Rotator Fisher Scientific 260750F
2x Laemmli sample buffer Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4  °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.
Cap locks for 1.5 mL tube Fisher Scientific NC9679153
Standard western blotting reagents
NOVEX Colloidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025
12-well tissue culture dish Corning 3513
Coverslips Fisher Scientific 12-545-100 Autoclave before use
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-5
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 3.7% in 1x PBS before use
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605 Prepare 3% in 1x PBS
Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) Sigma-Aldrich T8787 Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS
Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Molecular Probes C10337 Prepare according to manufactorer's protocol
Hoechst 33342 Life Technologies H1399 Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year
Mouse anti-ICP8 primary antibody Abcam ab20194 Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) Abcam ab19311 Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody Life Technologies a11005 Use a 1:500 dilution in 1x PBS
Immu-mount Thermo Fisher Scientific 9990402
2x SDS-bicarb solution 2% SDS, 200 mM NaHCO3
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark
chloroform:isoamyl alcohol Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
3 M sodium acetate pH 5.2
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32851
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
Fluorescence microscope equipped with imaging software
Microcentrifuge for 1.5 mL tubes
Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes
Cell culture incubator
Biosafety cabinet
Heat blocks 65 °C and 95 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
  2. Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
  3. Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
  4. Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
  5. Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
  6. Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
  7. Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
  8. Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
  9. Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
  10. Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
  11. Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
  12. Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
  13. Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
  14. Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
  15. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
  16. Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
  17. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
  18. Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
  19. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
  20. Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
  21. Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
  22. Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
  23. Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
  24. Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
  25. Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
  26. Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
  27. Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
  28. Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
  29. Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
  30. Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).

Tags

علم المناعة، مسألة 126، فيروس الحلأ البسيط (HSV)، وعزل البروتينات على الوليدة الحمض النووي (إيبوند)، تسارع الأصلي إيبوند (أنيبوند)، علم الأحياء المجهرية، والبيولوجيا الجزيئية، وعلم الفيروسات، عزل الحمض النووي، انقر فوق الكيمياء، الكتلي، الجينوم الفيروسي، وتكرار الحمض النووي ، عزل أنوية
تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dembowski, J. A., Deluca, N. A.… More

Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (126), e56374, doi:10.3791/56374 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter