Summary
Målet med denne protokol er specifikt tag og selektivt isolere viral DNA fra inficerede celler til karakterisering af virale genom forbundet proteiner.
Abstract
Målet med denne protokol er for at isolere herpes simplex virustype 1 (HSV-1) DNA fra inficerede celler til identifikation af forbundet viral og cellulær proteiner af masse massespektrometri. Selv om proteiner, der interagerer med viral genomer spiller vigtige roller i afgøre udfaldet af infektion, var en omfattende analyse af virale genom forbundet proteiner ikke tidligere muligt. Her viser vi en metode, der muliggør direkte rensning af HSV-1 genomer fra inficerede celler. Replikerende viral DNA er selektivt mærket med modificerede nukleotider, der indeholder en alkyn funktionelle gruppe. Mærket DNA er så specifikt og uigenkaldeligt markeret via den kovalente fastgørelse af biotin indeholder via en kobber (I)-katalyseret indeholder-alkyn cycloaddition eller klik reaktion. Biotin-mærkede DNA er renset på streptavidin-belagte perler og tilknyttede proteiner er elueret og identificeret ved massespektrometri. Denne metode gør det muligt for selektiv målretning og isolation af HSV-1 replikation gafler eller hele genomer fra komplekse biologiske miljøer. Derudover tilpasning af denne tilgang vil gøre det muligt for undersøgelse af forskellige aspekter af herpesviral infektion, samt undersøgelse af genomer af andre DNA virus.
Introduction
Virus har en begrænset kapacitet til at udføre væsentlige funktioner og derfor afhænge af host faktorer til at lette kritiske aspekter af infektioner herunder virale Gen-ekspression, replikering, reparation, rekombination og transport. Aktiviteterne i disse vært faktorer er ofte forstærket af viralt kodede proteiner. Derudover skal virus undgå afsløring og indblanding af cellulære svar til viral infektion. Derfor, virus værtssammenspil diktere resultatet af infektion. Altafgørende forståelse af hvordan virus ændrer den cellulære miljø for at tilpasse den cellulære maskiner for at lette viral processer. Af særlig interesse er at identificere hvilke faktorer og processer, handle på viral genomer i hele den smitsomme cyklus.
Herpes simplex virustype 1 (HSV-1) er en dobbelt strandede DNA-virus, der inficerer en betydelig del af den menneskelige befolkning. Inden for den første time af infektion træder det virale genom atomkernen, hvor en bestilt kaskade af viral genekspression ensues i koordination med viral DNA (vDNA) replikering1. I kernen, genomer er underlagt epigenetisk regulering, gennemgå reparation og rekombination, og er pakket ind i capsids, således at de første afkom virioner produceres i mindre end seks timer. Den omfattende evaluering af virale genom forbundet proteiner i løbet af infektion vil lægge fundamentet for at undersøge de molekylære detaljer af processer, der fungerer på viral genomer, og vil give indblik i hvilke viral og cellulær faktorer er involveret i forskellige stadier af infektion.
Tidligere metoder til undersøgelse af vært faktorer involveret i viral infektion omfatter affinitet rensning af virale proteiner til analyse af tilknyttede cellulære proteiner2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. disse assays har været medvirkende til identifikation af cellulære faktorer involveret i vært antiviral svar samt viral kromatin modifikation, genekspression, og DNA reparation. Det er imidlertid vanskeligt at fastslå, om interaktioner afhænger af foreningen med vDNA, og proteomics kun giver indsigt i samspil, der opstår som en funktion af en specifik viral faktor. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) er blevet brugt til at identificere, hvor specifikke viral og cellulær proteiner binder til viral genomer10,11,12,13,14 , 15 og fluorescerende in situ hybridisering (FISH) kombineret med immuncytokemi har aktiveret visualisering af cellulære faktorer, der colocalize med vDNA16,17,18, 19 , 20. disse assays mulighed for rumlige og tidsmæssige analyse. Dog omfatter begrænsninger behovet for meget specifikke antistoffer, begrænset følsomhed og behovet for tidligere indsigt i virus værtssammenspil. Vi har derfor udviklet en metode baseret på iPOND (isolation af proteiner på spirende DNA)21 og aniPOND (accelereret indfødte iPOND)22 til selektivt etiket og rense vDNA fra inficerede celler til objektiv identifikation af virale genom tilknyttede proteiner af massespektrometri. iPOND har været medvirkende til undersøgelse af cellulære replikation gaffel dynamics.
Til selektiv rensning af viral genomer fra inficerede celler er replikere vDNA mærket med ethynyl modificeret Nukleosider, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) eller 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (figur 1), efterfulgt af kovalent konjugation at biotin indeholder via Klik på kemi til at lette trinvist rensning af viral genomer og tilknyttede proteiner på streptavidin-belagte perler (figur 2B). Vigtigere, er infektioner udført i stationære celler, som ikke er involveret i cellulære DNA-replikation at aktivere særlige mærkning af vDNA. Derudover HSV-1 infektion forårsager celle cyklus anholdelse og hæmmer cellulære DNA replikation23,24. Virus kan prelabeled før infektionen til analyse af proteiner forbundet med indgående viral genomer (figur 1A) eller mærket under DNA replikation til analyse af proteiner forbundet med nyligt syntetiserede vDNA (figur 1B) 25. Desuden puls chase analyse kan bruges til at undersøge karakteren af proteiner forbundet med viral replikation gafler (figur 1 c)26. Derudover kan ethynyl-modificerede vDNA kovalent konjugeret med et fluorophore for fysisk undersøgelse af protein dynamics (figur 2A og figur 3). Imaging giver mulighed for direkte visualisering af vDNA og er en gratis tilgang til validering af vDNA-protein interaktioner, og kan tilpasses til at holde styr på viral genomer hele infektion. Vi forventer, at disse metoder kan ændres yderligere, at studere ethvert aspekt af herpesviral infektion, herunder ventetid og reaktivering, og til at studere andre DNA virus. Desuden kan mærkning med 5-ethynyl uridine (EU) tillade til analyse af RNA viral genomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cellekultur, virusinfektion og EdC mærkning ( figur 1)
følgende protokol omfatter arbejde med virus. Der henvises til din institution ' s bio-sikkerhed protokoller vedrørende sikker håndtering af vira og andre biologiske agenser. Denne protokol blev godkendt af det institutionelle Review Board af University of Pittsburgh.
- Trypsinize en sammenflydende 150 cm 2 vævskultur kolbe af MRC-5 celler og overføre cellerne til en 600 cm 2 vævskultur plade indeholdende 100 mL DMEM plus 10% FBS. Der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO 2 til 3-4 dage at nå confluency og stationære fase. En sammenflydende 600 cm 2 fad indeholder ~ 7 x 10 7 celler. Forberede 1 plade for hver betingelse og 1 plade for hver tilhørende negativ kontrol.
Bemærk: Celler skal nå den stationære fase for at hæmme cellulære DNA-replikation for at sikre, at kun vDNA er mærket og renset i efterfølgende trin.
Bemærk: Hver prøve kræver en gratis umærket negativ kontrol udarbejdet ved hjælp af den samme infektion betingelser og tidspunkt uden tilsætning af EdC.
Bemærk: A skaleres ned version af dette eksperiment gennemføres sideløbende at teste for mærkning af cellulære DNA af imaging ved hjælp af sammenlignelige cellevækst, infektion, EdC mærkning betingelser, og tid punkter (Se trin 2). - Fortyndes 7 x 10 8 PFU HSV-1 i 7 mL kold Tris-Buffered saltvand (TBS). Fjerne vækstmediet og opbevar ved 37 ° C. At inficere, tilføje 7 mL fortyndet virus til MRC-5 celler og rock i 1 time ved stuetemperatur. Følgende adsorption, fjerne inokulum, skylles med 50 mL stuetemperatur TBS og erstatte det oprindelige vækstmedium. Der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO 2. Dette trin skal udføres for hver eksperimentelle tilstand og negativ kontrol.
Bemærk: Øget EdC mærkning kan opnås ved hjælp af HSV-1 mutanter defekt for udtryk for den virale dUTPase (UL50 gen) og/eller uracil glycosylase (UL2 gen). HSV-1 dUTPase har lav substrat specificitet og kan mindske aktivering af flere nucleoside analoger 25 , 27. - Etiket viral genomer med EdC. Følg anvisningerne for at mærke indgående genomer (1.3.1.), replikerende genomer (1.3.2.) eller viral replikation gafler (1.3.3.).
Bemærk: Kun skridt 1.3.1, 1.3.2 eller 1.3.3 bør foretages, afhængigt af om indgående genomer, replikerede genomer eller replikering gafler er analyseres i efterfølgende trin, hhv.
Bemærk: EdU eller f-ara EdU kan erstattes for EdC. Toksiciteten af nucleoside analoger bør overvåges og minimeret.- Brug prelabeled bestande at gennemføre infektion i trin 1.2 og gå videre til trin 2 eller 3 inden for 4 h efter infektion (hpi) for at undersøge unreplicated vDNA ( figur 1A).
Bemærk: Forberede prelabeled virus bestande ved hjælp af de tidligere beskrevne protokol 25. Viruslagrene skal være passeret en G-25 kolonne til at fjerne enhver resterende EdC. - Mærke replicerer vDNA ved at tilføje 5-25 µM EdC til cellekulturmedium af inficerede celler for 2-4 h ( figur 1B). Før du tilføjer, fortyndes EdC i 1 mL af vækstmediet.
- Til at mærke virusreplikation gafler, efter debut af vDNA replikation (≥ 4 hpi), puls etiket replikere vDNA med 5-25 µM EdC i 5-20 min. For at jage, skyl 3 x med chase medium indeholdende 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC), og derefter inkuberes i overværelse af chase medium for en yderligere 20-40 min ( figur 1 c).
Bemærk: Pulse og chase medium bør være ekvilibreres til 37 ° C og 5% CO 2 før brug.
Bemærk: For puls chase eksperimenter er det vigtigt at overveje, hvor lang tid det tager for Nukleosider at komme ind i cellen og blive fosforyleret før de kan indarbejdes i replikerende DNA. Dette skal bestemmes empirisk.
Bemærk: For at bestemme opløsning af pulse chase eksperimenter, beregne viral replikation sats på eksperimentelle betingelser anvendes. Dette kan bestemmes ved kvantitativ PCR af viral genomer under et enkelt skridt vækst tid kursus 26.
Bemærk: For imaging viral genomer gå videre til trin 2 og til rensning af viral genomer fortsætter til trin 3.
- Brug prelabeled bestande at gennemføre infektion i trin 1.2 og gå videre til trin 2 eller 3 inden for 4 h efter infektion (hpi) for at undersøge unreplicated vDNA ( figur 1A).
2. Billeddannelse af EdC mærket DNA ( figur 2A)
NOTE: det er nyttigt at foretage imaging i tandem med den virale genom rensning metode til at kontrollere, at cellulære DNA ikke er mærket i eksperimenter. Imaging kan også bruges til at visualisere arten af mærket vDNA og validere proteomics data. Eksempler på cellulært og viral DNA farvning mønstre er vist i figur 3.
- Udføre infektioner og EdC mærkning som angivet i trin 1 undtagen ved hjælp af skaleret ned betingelser på coverslips i en 12-godt vævskultur parabol indeholdende 1 mL af vækstmediet.
- Fix celler med 1 mL 3,7% PARAFORMALDEHYD i 1 x PBS for 15 min på RT. Efter fiksering, skyl celler 2 x med 1 mL 3% BSA i PBS.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD kan forårsage alvorlig eller permanent skade. Følg sikkerhedsforanstaltninger.
Bemærk: Protokollen kan stå i pause her og coverslips kan opbevares ved 4 ° C i den anden vask i op til 3 dage. - Permeabilize celler med 1 mL permeabilization buffer [Se Tabel af materialer] i 20 min. ved stuetemperatur mens vuggende.
- Skylles med 1 mL 3% BSA og derefter blok med 1 mL 3% BSA i PBS i 30 min. ved stuetemperatur mens vuggende.
- Tilsættes 1 mL af klik reaktion cocktail [Se Tabel af materialer] til coverslips til kovalent konjugat Alexa Fluor 488 indeholder til EdC mærket DNA. Inkuber ved stuetemperatur i 30 min. mens vuggende. Opsug og skylles to gange med 1 mL PBS.
- Plet cellulære DNA med 1 mL af en 1:2,000 fortynding af Hoechst i PBS i 30 min. ved stuetemperatur mens vuggende. Opsug og skylles to gange med 1 mL PBS.
- Plet med primære og sekundære antistoffer efter standarden indirekte immunfluorescens protokoller 25.
Bemærk: Mærket vDNA colocalizes med ICP8, ICP4 eller UL42 og mærket cellulære DNA colocalizes med Hoechst pletten. - Montere coverslips på dias og billed celler ved hjælp af et fluorescens mikroskop.
Bemærk: Dias kan opbevares ved 4 ° C i flere uger.
3. Rensning af vDNA og tilknyttede proteiner
Bemærk: flere aspekter af denne protokol er blevet tilpasset fra Leung et al. 22
Bemærk: alle buffere og reagenser skal nedkøles på is før brug og alle trin skal udføres på is, medmindre andet er angivet.
- Høst kerner.
Bemærk: Før isolation af kerner, formaldehyd kan anvendes til bitmapgenkendelse proteiner til DNA. Strengere vask betingelser kan derefter bruges under DNA oprensning på streptavidin-belagte perler. For crosslinking og vask betingelser se Sirbu et al. 21.- erstatte vækstmediet med 20 mL ekstraktionsbuffer kerner (NEB), og der inkuberes i 20 min. ved 4 ° C med lejlighedsvise vuggende. Kerner bliver synlige i mikroskopet.
- Skrab kerner fra pladen ved hjælp af en celle skraber og overførsel til en 50 mL konisk slange. Der centrifugeres i 10 min på 2.500 x g ved 4 ° C til pellet kerner, supernatanten.
Bemærk: Trypan blå farvning kan bruges til at kontrollere isolering af kerner fra celler. - Forsigtigt løsne den nukleare pellet i 10 mL PBS, overførsel til en 15 mL konisk slange, og pellet ved centrifugering i 10 min på 2.500 x g på 4 ° C. helt Fjern PBS.
Bemærk: Kerner kan fryses og protokollen kan afbrydes midlertidigt på dette punkt. Det gør du forsigtigt resuspenderes nukleare i 500 µL frysning buffer og inkuberes røret i isbad ethanol/tør. Gemme frosne kerner ved-80 ° C. Før brug, tø kerner ved stuetemperatur, hurtigt overføre til is, der tilsættes 10 mL PBS, rock forsigtigt at blande, pellet ved centrifugering i 10 min på 2.500 x g ved 4 ° C, og helt fjerne PBS. Frysning kerner kan resultere i reducerede udbyttet.
- Kovalent konjugat biotin-indeholder til EdC mærket vDNA.
- Resuspend nukleare toerstoffet i 10 mL Klik reaktion mix [Se Tabel af materialer] ved forsigtigt pipettering op og ned 5 gange med en 10 mL pipette.
Bemærk: Det er vigtigt, at de reagenser, der er inkluderet i klik-mastermix er tilføjet i den angivne rækkefølge. - Roterer i 1 time ved 4 ° C. Mens roterende forberede og chill buffere B1, B2 og B3 [Se Tabel af materialer].
- Pellet kerner ved centrifugering i 10 min på 2.500 x g på 4 ° C. helt Fjern Klik mastermix og vaske pellet ved forsigtigt resuspending i 10 mL PBS og centrifugering i 10 min på 2.500 x g ved 4 ° C.
- Forsigtigt resuspend nukleare pellet i 1 mL PBS og overførsel til en 1,5 mL mikrofuge rør ved hjælp af en stor boring pipette tip. Pellet kerner ved centrifugering i 10 min på 2.500 x g på 4 ° C. helt Fjern PBS og flash fryse i flydende nitrogen.
Bemærk: Protokollen kan være midlertidigt på dette tidspunkt og frosset kerner kan opbevares ved-80 ° C. Frys thaw hjælper med efterfølgende lysis, så det anbefales at kerner er flash frosset selv når fortsætter til trin 3.3 på samme dag.
- Resuspend nukleare toerstoffet i 10 mL Klik reaktion mix [Se Tabel af materialer] ved forsigtigt pipettering op og ned 5 gange med en 10 mL pipette.
- Lyse kerner og fragment DNA.
- Tø kerner på is og resuspend i 500 µL Buffer B1 af pipettering op og ned. Der inkuberes i isbad i 45 min.
- Sonicate prøver 6 gange til 30 s hver på 40% amplitude ved hjælp af en 3 mm microtip sonde. Prøveemner på isen for 30 s mellem pulser. Efter ultralydbehandling, prøver skal vises klar og ikke grumset.
Bemærk: Sonikering betingelser skal være optimeret til individuelle sonicators. For detaljerede instruktioner om, hvordan du optimerer sonikering betingelser henviser til Leung et al. 22. - pellet celle debris ved centrifugering ved 14.000 x g i 10 min. ved 4 ° C. Pellet størrelse bør falde betydeligt. Supernatanten filtreres på 100 µM celle si og bevare flow gennem.
- Tilføje 500 µL Buffer B2 til den filtrerede supernatanten. 900 µL af denne prøve vil blive brugt i trin 3.4.2.
- Tage en delprøve af hver betingelse for DNA isolation (50 µL eller 1/20th volumen) og der tilsættes 50 µL 2 x SDS-bicarb løsning [Se Tabel af materialer]. Gå videre til DNA isoleret protokol (trin 3.6).
- Tage en delprøve af hver tilstand for input protein (50 µL eller 1/20th volumen) og tilsæt 50 µL 2 x Laemmli prøvebuffer, fryse i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C. Brug taktfast 3.5.6.
- Binde biotinylated DNA til streptavidin belagt perler.
- Forberede Streptavidin T1 magnetiske perler ved at overføre 300 µL af perle gylle til en 1,5 mL mikrofuge tube. Forberede et rør af perler pr. prøve. Vask perler 3 x med 1 mL Buffer B2 ved vortexing til resuspend, anvende en magnet for at adskille perler og sugning wash buffer.
Bemærk: Optimeret bindende betingelser resultat i maksimeret udbytte og minimal baggrund bindende. Det blev eksperimentelt bestemmes, at Streptavidin T1 magnetiske perler har en betydeligt større bindende kapacitet end Agarosen perler, samt andre Streptavidin perler og mindre baggrund bindende end Streptavidin C1 perler ( figur 4A ). - Tilføje 900 µL af prøven fra trin 3.3.4. de vasket perler og rotere natten over ved 4 ° C.
Bemærk: Du må ikke vortex perler når prøven er føjet til dem.
Bemærk: Hvis betydelige mængder af DNA eller protein er isoleret i den umærkede negative kontrol, dette trin kan reduceres fra natten til 4 h at reducere baggrund bindende.
- Forberede Streptavidin T1 magnetiske perler ved at overføre 300 µL af perle gylle til en 1,5 mL mikrofuge tube. Forberede et rør af perler pr. prøve. Vask perler 3 x med 1 mL Buffer B2 ved vortexing til resuspend, anvende en magnet for at adskille perler og sugning wash buffer.
- Vaske perlerne og elueres vDNA og tilknyttede proteiner.
Bemærk: Det anbefales at bruge filter tips til de resterende trin.- Sted prøver i et magnetisk mikrofuge tube rack, Fjern supernatanten, forsigtigt resuspend i 1 mL Buffer B2, rotere ved 4 ° C i 5 min.
- Gentag trin 3.5.1 tre gange.
- Prøveemner i et magnetisk mikrofuge tube rack, Fjern supernatanten, forsigtigt resuspend i 1 mL Buffer B3, og rotere ved 4 ° C i 5 min.
- Overføres 100 µL perle blanding (1/10 th volumen) til en ny tube for bundne DNA isolation. Anvende dette rør til magneten, Fjern supernatanten, resuspend perler i 100 µL 1 x SDS-bicarb løsning og gå videre til DNA isoleret protokol (trin 3.6).
- Anvende rør indeholdende de resterende 900 µL perle blanding fra trin 3.5.3. til magnet, Fjern supernatanten, og pelleten perler i 50 µL 2 x Laemmli prøvebuffer at eluere proteiner og DNA-protein komplekser.
- Kog prøver ved 95 ° C i 15 min, vortex, hurtigt spin i mikrofuge, og anvende magnet. Overføre eluatet til en ny tube, flash fryse og opmagasinere henne ved-80 ° C.
Bemærk: Brug cap låse til at sikre, at rørene ikke pop åbne mens kogende.
Bemærk: Protokollen kan afbrydes midlertidigt på dette punkt og prøver kan opbevares ved-80 ° C i flere uger. - Analyze protein prøver af Coomassie blå farvning, western blotting eller massespektrometri af standardprocedurer 25. Repræsentative resultater er vist i figur 4 og figur 5.
Bemærk: For at afgøre, om protein udbytte er tilstrækkeligt for massespektrometri, 7,5 µL af hver prøve er anvendes til analyse af Coomassie blå farvning og 7,5 µL til western blotting af en repræsentativ virale genom forbundet protein (ICP4, ICP8 eller UL42). Det samme antal lysates fra trin 3.3.6. køres sammen til kontrol for input protein niveauer. Den resterende prøve (35 µL) er derefter analyseret af masse massespektrometri som tidligere beskrevet 25.
- DNA isoleret
- inkuberes prøver fra trin 3.3.5. og 3.5.4. 65 ° C i 4-16 h. Fjern prøve fra magnetiske perler, hvis nødvendigt.
- Uddrag prøver med 150 µL phenol: chloroform: isoamyl alkohol (PCI) og overføre den vandige fase til en ny tube.
- Uddrag den resterende PCI med 100 µL Tris-EDTA (TE) og tilføje den vandige fase til en ny tube.
- Uddrag prøver med 200 µL chloroform: isoamyl alkohol (24:1).
- Rense den vandige fase ved hjælp af PCR rensning Kit ifølge producenten ' s protokol.
Bemærk: pH-indikator i Buffer PB bliver lilla når tilsættes prøven. Tilføje 10 & #181; L 3M NaOAc pH 5,0 til at sænke pH i prøven. - Bestemmer DNA koncentration ved hjælp af en fluorometer.
Bemærk: Denne protokol giver typisk 100-400 ng perle-bundne DNA. Ingen DNA bør kunne påvises i eluatet af den negative kontrol, EdC ikke blev tilføjet i trin 1.3. - DNA kan være gemt i en lav DNA-bindende tube 4 eller -20 ° C og kan anvendes til real-time PCR eller høj overførselshastighed sekventering analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brugen af klik kemi til oprensning af DNA fra celler blev først udført af den iPOND metode21. Formålet med iPOND er at rense cellulære replikation gafler til identifikation af tilknyttede proteiner. Vi har tilpasset denne teknik til at studere specifikt vDNA protein interaktioner under infektion. Manipulation af tilgang til label viral genomer med EdC (figur 1), kombineret med synkroniserede infektioner, har tilladt til selektiv isolering og undersøgelse af adskilte populationer af vDNA. HSV-1 DNA er mærket med EdC (figur 1) at lette kovalente vedhæftet fil til en fluorophore for imaging eller biotin til rensning (figur 2). Virus kan prelabeled før infektionen til analyse af proteiner forbundet med indgående genomer (figur 1A) eller mærket under DNA replikation til analyse af proteiner forbundet med nyligt syntetiserede vDNA (figur 1B)25. Desuden kan pulsen chase analyse bruges til at undersøge karakteren af proteiner forbundet med viral replikation gafler (figur 1 c)26. DNA kan visualiseres i cellerne til at give geografisk information om arten af det mærkede DNA og støtte for identificerede vDNA-protein interaktioner (figur 3). Taget sammen, mulighed de protokoller er beskrevet her for proteom undersøgelse af flere aspekter af produktive infektion at give indsigt i dynamiske forandringer, der sker på HSV-1 genomer. Disse tilgange kan tilpasses yderligere for at undersøge ventetid og reaktivering, at undersøge fænotyper forbundet med viral mutanter og studere andre DNA- og RNA-virus.
Aspekter af dette protein oprensning metode blev tilpasset fra Leung mfl. 22. her en stor forbedring for rensning af EdC mærket DNA er brugen af Streptavidin T1 perler i stedet for streptavidin-belagt Agarosen perler. For at optimere DNA oprensning, blev flere typer af streptavidin-belagte perler testet for uspecifik bindende når infektion blev udført i mangel af EdC og for maksimal protein opsving i overværelse af EdC (figur 4A). For disse eksperimenter, blev western blotting udført for vDNA bindende protein ICP4. Purifications udført på Streptavidin T1 perler resulterede i det mindste beløb af baggrund bindende i mangel af EdC og maksimale protein opsving i overværelse af EdC.
Proteiner er forbundet med vDNA kan identificeres ved proteom metoder herunder western blotting og massespektrometri. Western blotting kan bruges til at undersøge dynamikken i kendte interaktioner og massespektrometri kan bruges som en fordomsfri tilgang til at identificere nye vDNA forbundet proteiner. Et eksempel på protein fremstilles som en funktion af stigende EdC mærkning er vist i figur 4B. En smøre, snarere end et klart banding mønster er normalt observeret ved Coomassie blå farvning. Dette er sandsynligvis, fordi der er DNA i protein prøven, eller fordi der er en overflod af protein. Det er også vigtigt at bemærke, at kobber katalysator bruges i klik reaktion kan forårsage delvise nedbrydning af proteiner og nukleinsyrer28,29. Ved western blotting opdages lignende niveauer af ICP4 typisk i eluater (trin 3.5.5.) efter rensning af vDNA, der var mærket i 60 min. med EdC som det findes i den samme mængde af input prøve, der tilberedes fra nukleare lystates (trin 3.3.6.). Disse oplysninger kan bruges som en guide til at afgøre, om inddrivelse er tilstrækkelig til at sende den resterende prøve til massespektrometrisk analyse.
Nano væskekromatografi med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) kan foretages som beskrevet tidligere25 for at identificere proteiner forbundet med renset vDNA. LC-MS/MS data analyseres ved at sammenligne spektrale tælle (SpC) værdier mellem EdC-mærket eksperimentelle prøven og den tilsvarende umærkede negative kontrol. Proteiner kan anses for at være beriget med eksperimentelle prøven baseret på følgende kriterier: 1) protein har mindst 5 spektrale tæller (SpC) i eksperimentel prøven, 2) protein er ikke registreret i kontrolelementet eller er beriget kontrol af mindst fire gange baseret på dividere SpC værdier og 3) protein er beriget over kontrolelementet i to eller flere biologiske replikater. Den normaliserede spektrale overflod faktor (NSAF: 
) kan bruges for at tage højde for forskellene i molekylvægt (MW) og total protein udbytte. Denne ligning bestemmer den relative forekomst af individuelle proteiner i en stikprøve og giver mulighed for en direkte sammenligning af to forskellige forsøgsbetingelser, hvor forskellige mængder af vDNA er renset (for eksempel, sammenligne input viral genomer ( Figur 1A) til replikeret genomer (figur 1B)).
Der er flere måder at præsentere protein berigelse data. Nogle eksempler kan nævnes cirkeldiagrammer, Venn-diagrammer og protein interaktion netværk. Cirkeldiagrammer kan bruges til at illustrere andelen af proteiner identificeret, der er kendt for at fungere i en specifik biologisk proces (figur 5A). Dog kan der opstå problemer, når et protein har mere end en biologisk funktion, som det ofte er tilfældet. Det er også vanskeligt at sammenligne data på tværs af forskellige cirkeldiagrammer. Venn-diagrammer er nyttige til at vise relationer mellem proteiner identificeret under forskellige forsøgsbetingelser, men giver ikke nogen funktionel oplysninger om proteiner identificeret (figur 5B). Protein interaktion netværk skildre en visuel illustration af potentielle vekselvirkninger mellem identificerede proteiner og give oplysninger om typerne af biologiske processer, der er involveret (figur 5 c). Adskillige online ressourcer er tilgængelige for kortlægning forudsagte protein-protein interaktioner herunder streng (søgeværktøj for hentning af interagerende gener/proteiner)30. Online-værktøjer er generelt udstyret til at håndtere proteomics data fra en række forskellige arter og give værdifulde oplysninger om værten proteiner involveret i virale genom mekanik. Dog er virale proteiner generelt ikke inkluderet i databaser, som kan komplicere analyse. Det er derfor vigtigt at overveje de store konklusioner man gerne vil formidle når de beslutter, hvordan man skulle præsentere proteomics data.
Figur 1:Ong > tilgange til etiketten HSV-1 DNA. (A) til assay tilstand af indgående virus, hvilende MRC-5 celler i G0 er smittet med prelabeled HSV-1 og genomer er analyseret på mindre end 4 hpi at studere unreplicated viral DNA. (B) at assay delstaten replikeret virus, MRC-5 celler er inficeret med umærkede HSV-1 og EdC (orange stjerner) er føjet til vækstmediet af inficerede celler og inkuberes i 2-4 h efter udbrud af viral DNA replikation (≥4 hpi). (C) at assay virusreplikation gafler, inficerede celler er puls mærket med EdC for 5-20 min. replikering gafler kan derefter være jaget med deoxyC. EdC mærket DNA er orange. Dette tal er blevet ændret fra Dembowski og DeLuca25. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Procedurer, der beskrives i dette dokument for analyse af EdC mærket DNA. (A) en skitse af metoden for billeddannelse EdC mærket DNA. Tagged DNA er repræsenteret i grønt. (B) en beskrivelse af metoden til rensning og downstream analyse af EdC mærket vDNA. Dette tal er blevet ændret fra Dembowski og DeLuca25. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Visualisering af EdC mærket DNA. Celler var inficeret, mærket og afbildet som beskrevet i figur 1 og figur 2. Repræsentative billeder af mærket cellulære og viral DNA er vist. Cellulære DNA colocalizes med Hoechst pletten og vDNA med ICP4. Skalalinjen: 5 µm.This figur blev ændret fra Dembowski og DeLuca25 og Dembowski et al. 26. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentant protein oprensning resultater. (A) sammenligning af protein udbytte når rensning foranstaltninger blev gennemført ved hjælp af flere forskellige typer af streptavidin belagt perler. Infektion blev gennemført under tilstedeværelse af EdC (+) til at sammenligne protein udbytte eller i mangel af EdC (-) til at sammenligne baggrund bindende. Infektioner og EdC mærkning blev udført som beskrevet i figur 1B og DNA-protein komplekser blev renset efter trinene i figur 2B ved hjælp af sammenlignelige mængder af forskellige slags streptavidin belagt perler. Toppanelet: sammenligning af protein udbytte efter rensning på streptavidin belagt Agarosen perler eller Streptavidin M-280. Bundpanelet: sammenligning af protein udbytte efter rensning på Streptavidin M-270, M-280, Streptavidin C1 eller Streptavidin T1. Western blotting blev udført med et antistof mod viral proteinet ICP4. Renset ICP4 er vist i den første lane til sammenligning. Længere eksponering af bundpanelet var forpligtet til at overholde en lignende intensiteten af ICP4 i vognbaner "280" som i toppanelet. (B) repræsentative protein oprensning resultater som en funktion af tid af EdC mærkning er vist. Infektioner og EdC mærkning blev udført som beskrevet i figur 1B og DNA-protein komplekser blev renset efter trinene i figur 2B ved hjælp af Streptavidin T1 perler. EdC mærkning blev udført til 0, 20, 40 eller 60 min og Coomassie blå farvning (øverst) og western blotting (nederst) resultater er vist. Western blotting blev udført med antistoffer specifikke for ICP4, UL42 eller GAPDH. Eluatet prøven blev taget fra trin 3.5.5. og lysate fra trin 3.3.6. Pilen angiver streptavidin, mens L angiver protein stigen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Eksempler på forskellige måder at fremstille data i proteomics. (A) Pie diagrammer opsummere proteiner, der blev identificeret ved massespektrometri af proteiner eluater forbundet med viral genomer renset på 6 hpi. Værdier angiver antallet af proteiner identificeres for de enkelte funktionelle kategorier. T angiver det samlede antal proteiner identificeret. Farverne angiver følgende kategorier: lilla - RNA forarbejdning, rød - transskription, grøn - kromatin remodeling, orange - DNA-replikation, gule - nuklear transport, krikand - cytoskeleton, mørkeblå - HSV strukturelle proteiner og grå - anden/ukendt. (B) Venn-diagrammer skildrer overlapningen af proteiner identificeret til at være forbundet med viral genomer på 6, 8 eller 12 hpi. (C) en streng kort skildrer proteiner beriget på virusreplikation gafler efter en 5 min EdC puls. Humane proteiner beriget af 5-fold i forhold til den umærkede negative kontrol er vist i funktionel interaktion kort, der blev genereret ved hjælp af streng30 med indstillinger til at vise kun høj genkendelsessikkerhed interaktioner. Gen navne blev brugt til at knytte interaktioner. Cirkler angive proteiner der fungerer i den samme biologiske proces. Dette tal blev ændret fra Dembowski og DeLuca25 og Dembowski et al. 26. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol omfatter flere trin, som, hvis ikke fulgt nøje, kan medføre betydeligt reduceret protein udbytte eller kontaminering med cellulære DNA. Det er afgørende at stationære celler anvendes til alle eksperimenter for at cellulære DNA ikke er mærket og renset. Dette kan bekræftes ved manglen på cellulære DNA polymeraser i eksemplet protein fordi HSV-1 ikke udnytte cellulære DNA polymerase for genom syntese. Under EdC mærkning og kerner høst trin, bør prøver fordeles til at sikre, at alle behandles lige. Under rensning skridt, bør det sikres ikke at manipulere kerner af pipettering for meget. Dette kan føre til for tidlig lysering af kerner samt prøve svind, der skyldes stikning til siderne af pipette tips. Derudover sonikering skridt bør være optimeret til individuelle sonicators og mængden af streptavidin-belagte perler bruges til biotin bindende bør titreres for optimal protein udbytte.
Flere ændringer kan ske til denne protokol og omfatter brug af forskellige vira eller celletyper eller tilføjelse af et trin til bitmapgenkendelse protein til DNA. Når du vælger en celletype til brug for proteom undersøgelse, er det vigtigt at kontrollere, om tilgængeligheden af et protein sequence database for denne art. Manglende proteomics ressourcer vil i betydelig grad begrænse downstream analyse af protein data. En anden begrænsning er behovet for et stort antal celler, derfor kan det være svært at forberede nok primærelementer, såsom neuroner, til dette eksperiment. Denne metode bør være kompatible med andre DNA eller RNA-virus, så længe den virusinfektion ikke afhænger af cellulære DNA-replikation. Det ville endvidere være interessant at undersøge ændringer i DNA-protein interaktioner, der forekommer i HSV-1 mutanter. En anden ændring til denne protokol kunne være tilføjelsen af en formaldehyd crosslinking skridt før isolation af cellekerner, som giver mulighed for strengere vask betingelser under rensning21. Tilsætning af formaldehyd påvirker ikke evnen til at høste kerner men kan resultere i nedsat protein udbytte på grund af difficultly vende krydsbindinger under protein eluering.
Resultater fra denne protokol repræsenterer den gennemsnitlige tilstand af viral DNA undersøges. Derfor er det vanskeligt at skelne hvis komplekser er sammen på de samme eller separate DNA molekyler. vDNA mærkning metoder, der beskrives her i kombination med høj opløsning billedbehandling kan bruges til at kontrollere proteomics data og kan bidrage til at skelne mellem forskellige populationer af mærket DNA i en celle. Derudover kunne ChIP-seq bruges som en opfølgning af metode til at identificere de specifikke lokationer af proteiner på den virale genom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi anerkender Hannah Fox for hjælp ved udarbejdelsen af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af NIH give R01AI030612.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
- Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
- Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
- Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
- Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
- Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
- Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
- Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
- Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
- Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
- Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
- Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
- Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
- Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
- Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
- Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
- Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
- Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
- Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
- Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
- Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
- Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
- Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
- Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
- Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
- Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
- Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).
