Summary
이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.
Abstract
이 프로토콜의 목표를 포진 심 플렉스 바이러스 타입-1 (HSV-1)의 식별에 감염 된 세포에서 DNA 관련 바이러스 이며 여 세포질 단백질 질량 분석. 바이러스 성 유전자와 상호 작용 하는 단백질 감염의 결과 결정에 있는 주요 역할 비록 바이러스 성 게놈 관련 단백질의 포괄적인 분석 이전 가능 되지 않았습니다. 여기 감염 된 세포에서 HSV-1 유전자의 직접 정화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다. 바이러스 성 DNA 복제 alkyne 기능 그룹을 포함 하는 수정 된 세포핵으로 선택적으로 표시 됩니다. 레이블이 지정 된 DNA는 다음 구체적으로 그리고 돌이킬 수 태그 biotin 통해 구리 (I) 아 지 드의 공유 첨부 파일을 통해-아 지 드 alkyne cycloaddition 또는 클릭 반응 촉매. Biotin 태그 DNA streptavidin 입히는 구슬에 정화와 관련 된 단백질은 eluted 질량 분석에 의해 확인 된. 이 메서드는 선택적 대상 지정 및 HSV-1 복제 포크 또는 복잡 한 생물 학적 환경에서 전체 게놈의 격리 수 있습니다. 또한,이 방법의 적응은 herpesviral 감염의 다양 한 측면의 다른 DNA 바이러스의 유전자 검사의 수사 허용 하 고 있습니다.
Introduction
바이러스는 필수적인 기능을 수행 하 고 따라서 감염 바이러스 성 유전자 발현, 복제, 복구, 재결합, 전송 등의 중요 한 측면을 촉진 하기 위하여 호스트 요소에 따라 제한 된 용량을가지고. 이러한 호스트 요인의 활동은 종종 virally 인코딩된 단백질에 의해 증강 된다. 또한, 바이러스 성 감염에 세포질 응답에 의해 바이러스 탐지 및 방해를 피해 야 한다. 따라서, 바이러스 호스트 상호 작용은 감염의 결과 지정합니다. 파라마운트의 중요성 이해 어떻게 바이러스 바이러스 성 프로세스를 촉진 하기 위하여 세포질 기계에 맞게 셀룰러 환경 변경. 특히 관심의 어떤 요소와 프로세스 행동 전염 성 주기에 걸쳐 바이러스 성 게놈에 식별 됩니다.
헤 르 페 스의 단순 바이러스 타입 1 (HSV-1)는 더블 좌초 인간의 인구의 상당한 비율을 감염 하는 DNA 바이러스입니다. 감염의 첫 번째 시간, 바이러스 성 게놈은 핵, 바이러스 성 유전자 발현의 순서 캐스케이드 바이러스 DNA (vDNA) 복제1조정에서 ensues 들어간다. 핵에서 게놈 epigenetic 규정이 적용, 수리 및 재결합, 받을 있으며 첫 번째 자손 virions 6 시간 미만 생산 되도록 capsids,으로 패키징 됩니다. 감염의 과정을 통해 관련 된 바이러스 성 게놈 단백질의 종합 평가 하는 바이러스 성 게놈에 행동 하 고 있는 바이러스 및 세포질 요인에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다. 프로세스의 분자 세부 조사를 기초 누워 것입니다. 감염의 다양 한 단계에 포함 된다입니다.
바이러스 성 감염에 관련 된 호스트 요인의 조사에 대 한 이전 방법 포함 관련된 세포 단백질2,3,,45 의 분석에 대 한 바이러스 성 단백질의 친 화력 정화 , 6 , 7 , 8 , 9. 이러한 분석 수단이 포함 된 세포질 요인의 식별에 대 한 호스트 항 바이러스 응답 뿐만 아니라 바이러스 chromatin 수정, 유전자 발현 및 DNA 복구. 그러나, 그것은 상호 작용 vDNA, 연관에 따라 달라 집니다 그리고 proteomics 특정 바이러스 성 요인의 기능으로 발생 하는 상호 작용에 대 한 통찰력을 제공 여부를 확인 하기가 어렵습니다. Chromatin immunoprecipitation (칩) 특정 바이러스 및 세포질 단백질 바이러스 성 게놈10,11,12,,1314 바인딩할 식별 하는 데 사용 되었습니다. , 15 그리고 형광 성 제자리 교 잡 (물고기) immunocytochemistry와 함께 vDNA16,,1718, 와 colocalize 세포 요소의 시각화 수 있게 되었습니다. 19 , 20.이 분석 실험 공간 및 시간 분석에 대 한 허용. 그러나, 한계는 매우 구체적인 항 체, 제한 된 감도 및 이전 통찰력 바이러스 호스트 상호 작용에 대 한 필요성에 대 한 필요성을 포함합니다. 우리는 따라서 iPOND (초기 DNA에 단백질의 격리)21 에 따라 방법을 개발 및 선택적으로 레이블을 지정 하 고 정화에서 vDNA aniPOND (가속된 네이티브 iPOND)22 감염 바이러스 성 게놈의 편견된 식별에 대 한 셀 관련된 단백질 질량 분석에 의해입니다. iPOND 세포 복제 포크 역학 조사에 대 한 수단이 되었습니다.
감염 된 세포에서 바이러스 성 게놈의 선택적 정화에 대 한 수정 ethynyl nucleosides, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (듀) 또는 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (그림 1), 다음 화학식으로 표시 됩니다 vDNA 복제 통해 biotin 아 지 드를 활용 한 단계 바이러스 성 게놈 및 streptavidin 입히는 구슬 (그림 2B)에 관련 된 단백질의 정화를 촉진 하기 위하여 화학을 클릭 합니다. 중요 한 것은, 감염 vDNA의 특정 라벨 수 있도록 세포 DNA 복제에 종사 하지 않습니다 고정 된 셀에서 수행 됩니다. 또한, HSV-1 감염 세포 주기 검거 원인과 세포 DNA 복제23,24를 억제 합니다. 바이러스를 들어오는 바이러스 성 게놈 (그림 1A)와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 감염 전에 prelabeled 또는 새로 합성된 vDNA (그림 1B)와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 DNA 복제 하는 동안 표시 수 있습니다. 25. 또한, 펄스 체이스 분석 바이러스 성 복제 포크 (그림 1C)26와 관련 된 단백질의 특성을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, ethynyl 수정 vDNA 단백질 역동성 (그림 2A 및 그림 3)의 공간을 위해 fluorophore를 covalently 활용 될 수 있습니다. 이미징은 vDNA의 직접적인 시각화에 대 한 허용 및 vDNA-단백질 상호 작용의 유효성 검사에 대 한 무료 접근 이며 감염을 통해 바이러스 성 게놈을 추적 하기 위해 적용할 수 있습니다. 우리 예상 대기 시간 및 재 조직를 포함 하 여 herpesviral 감염의 어떤 양상 든 지 공부 하 고 다른 DNA 바이러스 연구를 이러한 접근 더 수정 될 수 있습니다. 또한, 5-ethynyl uridine로 (EU) RNA 바이러스 성 게놈의 분석에 대 한 허용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 세포 배양, 바이러스 성 감염 및 EdC 라벨 ( 그림 1)
다음 프로토콜 작업 바이러스를 포함. 학교를 참조 하십시오 ' 바이러스 및 다른 생물 학적 에이전트의 안전한 취급에 관한 s 바이오 안전 프로토콜. 이 프로토콜의 피츠버그 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.
- MRC-5 셀 confluent 150 cm 2 조직 배양 플라스 크를 trypsinize 하 고 600 cm 2 조직 문화 접시 100ml DMEM 플러스 10%를 포함 하는 셀 전송 FBS. Confluency 및 고정 단계를 도달 하기 위하여 3-4 일의 5% CO 2의 37 ° C에서 품 어. Confluent 600 cm 2 접시 7을 ~ 10 7 셀에 포함 되어 있습니다. 각 조건에 대해 1 접시와 각 해당 부정적인 컨트롤 1 접시 준비.
참고: 셀 그 유일한 vDNA를 분류 하 고 이후 단계에서 정화 되도록 세포 DNA 복제를 억제 하는 고정 단계에 도달 해야 합니다.
참고: 각 샘플 필요 합니다 무료로 동일한 감염 조건 및 EdC의 추가 없이 시간 포인트를 사용 하 여 준비 하는 부정적인 컨트롤 레이블 없음.
참고:이 실험의 버전을 축소 하는 A 실행 되어야 한다 유사한 세포 성장, 감염, EdC 조건, 라벨을 사용 하 여 이미징에 의해 세포 DNA의 라벨에 대 한 테스트 및 포인트를 시간에 (단계 2 참조). - 7 x 10 8 PFU HSV-1 7 mL에 희석 찬 Tris-Buffered 염 분 (TBS). 성장 매체를 제거 하 고 37 ° c.에 저장 감염, MRC-5 셀을 실 온에서 1 h 바위 7 mL 희석된 바이러스를 추가 합니다. 흡착, 다음 inoculum을 제거 하 고 50 mL 실내 온도 TBS, 린스 원래 성장 매체를 대체. 5% CO 2의 37 ° C에서 품 어. 각 실험 조건 및 부정적인 제어를 위해이 단계를 실시 한다.
참고: 증가 EdC 라벨 얻을 수 바이러스 성 dUTPase (UL50 유전자) uracil glycosylase (UL2 유전자)의 표현에 대 한 결함이 HSV-1 돌연변이 사용 하 여. HSV-1 dUTPase는 낮은 기질 특이성 및 여러 nucleoside 아날로그 25 , 27의 활성화를 줄일 수 있다. - 레이블 EdC와 바이러스 성 게놈입니다. 들어오는 게놈 (1.3.1.), 유전자 (1.3.2.), 또는 바이러스 성 복제 포크 (1.3.3) 복제를 지시를 따릅니다.
참고: 유일한 단계 1.3.1, 1.3.2, 또는 1.3.3 실행 되어야 한다 있는지 여부에 따라 들어오는 게놈, 복제 된 유전자, 또는 복제 포크 후속 단계에 각각 분석.
참고: 듀 또는 f-아 듀 EdC에 교체하실 수 있습니다. Nucleoside 아날로그의 독성 모니터링 하 고 최소화 해야 합니다. - 사용
- prelabeled 감염 단계 1.2에서 수행 하 고 2 단계로 진행 하는 주식 또는 3 4 h 이내 게시물 감염 (hpi) 복제 되지 않은 vDNA ( 그림 1A)를 조사 하.
참고: 앞에서 설명한 프로토콜 25를 사용 하 여 주식 prelabeled 바이러스를 준비 합니다. 바이러스 주식 어떤 잔여 EdC를 제거 하려면 G-25 열을 통과 해야 합니다. - 5-25 µ M를 추가 하 여 복제 vDNA 라벨 2-4 h ( 그림 1B)에 감염 된 세포의 세포 배양에 EdC. 추가 하기 전에, 성장 매체의 1 mL에 EdC 희석.
- VDNA 복제의 발병 후 바이러스 성 복제 포크를 (≥ 4 hpi), 5-25 µ M와 vDNA 복제 펄스 레이블 EdC 5-20 분. 추격, 체이스 매체 포함 하는 25-100 µ M 2´deoxycytidine와 3 배를 씻어 (deoxyC), 및 다음 추가 20-40 분 ( 그림 1C) 체이스 매체의 품 어.
참고: 펄스와 체이스 매체를 사용 하기 전에 37 ° C, 5% CO 2 equilibrated 한다.
참고: 펄스 추적 실험, 그것은 입력 하는 셀 고 DNA 복제에 포함 될 수 있습니다 전에 phosphorylated nucleosides 하는 데 걸리는 시간을 고려 하는 것이 중요. 이 실험적으로 결정 되어야 합니다.
참고: 펄스 체이스 실험의 해상도 확인 하려면 사용 하는 실험 조건 하에서 바이러스 성 복제 속도 계산 합니다. 이는 한 단계 성장 시간 코스 26 동안 바이러스 성 게놈의 양이 많은 PCR에 의해 결정 될 수 있다.
참고: 바이러스 성 게놈을 이미징에 대 한 2 단계를 진행 하 고 바이러스 성 게놈의 정화에 대 한 3 단계를 진행.
2. EdC의 영상 DNA ( 그림 2A) 라는
참고: 그것은 영상에에서 세포질 DNA 실험에 표시 되지 않는 확인 하려면 바이러스 성 게놈 정화 방법으로 수행 하는 데 유용. 영상 또한 레이블된 vDNA의 특성을 시각화 하 고 proteomics 데이터 유효성 검사를 사용할 수 있습니다. 패턴을 얼룩이 지는 세포와 바이러스 성 DNA의 예는 그림 3에 나와 있습니다.
- 감염 수행 및 성장 매체의 1 mL를 포함 하는 12 음 조직 문화 접시에 coverslips에 조건 EdC 라벨을 사용 하 여 제외 하 고 1 단계에서에서 표시 된 대로 축소.
- 1 mL 3.7%와 수정 셀 paraformaldehyde 실시간에 15 분 동안 1 x PBS에서 고정, 후 린스 세포를 PBS에서 1 mL 3 %BSA 2 x.
주의: Paraformaldehyde 심각한 또는 영구적인 부상을 일으킬 수 있습니다. 안전 예방 조치를 따르십시오.
참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 및 coverslips 두 번째 세척에 4 ° C에서 최대 3 일 동안 저장할 수 있습니다. - 1 mL permeabilization 버퍼와 세포를 permeabilize [참조 테이블의 자료] 락을 하는 동안 실 온에서 20 분.
- 흔들어 3 %BSA 한 다음 실 온에서 30 분 PBS에 1 mL 3 %BSA 블록 1 mL로 씻어.
- 칵테일 클릭 반응의 1 개 mL를 추가 [참조 테이블의 자료] covalently 알 렉 사 Fluor 488 켤레를 coverslips에 EdC에 아 지 드 라는 DNA. 락을 하는 동안 30 분 동안 실 온에서 품 어. 발음 및 1 mL의 PBS로 두 번 씻어.
- 락을 하는 동안 실 온에서 30 분 PBS에 Hoechst의 1:2,000 희석의 1 mL와 함께 얼룩 세포질 DNA. 발음 및 1 mL의 PBS로 두 번 씻어.
- 얼룩 표준 차 및 2 차 항 체와 간접 면역 형광 검사 프로토콜 25.
참고: 레이블된 vDNA colocalizes ICP8, ICP4, 또는 UL42 및 세포 라는 DNA Hoechst 얼룩과 colocalizes. - 슬라이드에 coverslips를 탑재 하 고 형광 현미경을 사용 하 여 셀을 이미지.
참고: 슬라이드 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 몇 주 동안.
3. VDNA와 관련 된 단백질의 정화
참고:이 프로토콜의 몇 가지 측면에서 양조위 외 적응 되었습니다 22
참고: 모든 버퍼 및 시 약은 사용 하기 전에 얼음에 냉장 해야 하 고 모든 단계 실행 되어야 한다 얼음에 달리 명시 하지 않는 한.
- 핵 수확.
참고: 핵의 격리, 하기 전에 포름알데히드 crosslink 단백질 DNA 사용할 수 있습니다. 더 엄격한 세척 조건 다음 streptavidin 입히는 구슬에 DNA 정화 하는 동안 사용할 수 있습니다. Cr에 대 한osslinking와 세척 조건 참조 Sirbu 외. 21.- 20 mL 핵 추출 버퍼 (코)와 성장 매체를 대체 하 고 가끔 락 4 ° C에서 20 분 동안 품 어. 핵 현미경에 표시 될 것입니다.
- 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 접시에서 핵을 긁 고 50 mL 원뿔 튜브에 전송. 작은 핵, 삭제는 상쾌한 하 4 ° C에서 2500 x g에서 10 분 원심 분리기.
참고: Trypan 푸른 얼룩 세포에서 핵의 절연을 확인을 사용할 수 있습니다. - 부드럽게 10 ml PBS, 15 mL 원뿔 튜브에 핵 펠 릿을 꺼내 려 하 고 4 ° C. 완전히 제거 PBS에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 의해 펠 렛.
참고: 핵 얼 수 있다 고 프로토콜은이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다. 이렇게 하려면 부드럽게 500에서 핵 펠 릿을 resuspend µ L 고정 버퍼 및 에탄올/드라이 아이스 목욕 튜브를 품 어. -80 ° c.에 언된 핵 저장 사용 하기 전에, 핵 실 온에서 해 동 하 고 신속 하 게 얼음, 10 mL PBS, 혼합, 4 ° C에서 2500 x g에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 펠 렛을 부드럽게 록 추가 전송 완전히 PBS를 제거 합니다. 감소 된 수확량 귀 착될 지도 모른다 핵 동결.
- 아 지 biotin-covalently 어원이 드 EdC 표시 vDNA.
- 10 mL 클릭 반응에서 핵 펠 릿 혼합 [참조 테이블의 자료] 부드럽게 위아래로 pipetting으로 5 번 10ml 피펫으로 resuspend
- .
참고: 그것은 중요 한 클릭 반응 혼합에 포함 시 약 표시 된 순서로 추가 됩니다. - 1 h 4 ° c.에 대 한 회전 회전 하는 동안 준비 하 고 버퍼 B1, B2 및 B3 [재료의 표 참조] 진정.
- 4 ° C. 완전히 제거에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 여 펠 릿 핵 반응 혼합을 클릭 하 고 부드럽게 10 mL PBS에에서 resuspending 및 4에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 펠 릿을 세척 ° c.
- 부드럽게 1 mL PBS에서에서 핵 펠 릿과 큰 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 1.5 mL microfuge 관에 resuspend. 2500 x 4 ° C. 완전히 제거 PBS에서 g와 플래시 동결 액체 질소에에서 10 분 동안 centrifuging 여 핵을 펠 렛.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다이 시점에서 하 고 얼어붙은 핵 핵 될 플래시 단계 3.3 같은 날에 진행 하는 경우에 동결 하는 것이 좋습니다 그래서-80 ° c. 동결 해 동 수 후속 세포에 저장 될 수 있다.
- 얼음에 핵을 녹여 고 아래로 pipetting으로 버퍼 B1 500 µ L에서 resuspend. 45 분에 대 한 얼음에 품 어
- Sonicate 샘플 6 회 30 s 각 40% 진폭 3mm microtip 프로브를 사용 하 여. 30 대 한 얼음에 견본을 두 펄스 사이 s. 쥡니다, 샘플 표시 명확 하 고, 아니 흐린.
참고: 쥡니다 조건 개별 sonicators에 대 한 최적화 되어야 합니다. 쥡니다 조건을 최적화 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 참조 렁 외. 22. - centrifuging 14000 x g 4 ° c.에서 10 분에 의해 세포 파편을 펠 렛 펠 릿 크기는 크게 감소 한다. 100 µ M 셀 스 트레이너를 통해는 상쾌한을 필터링 하 고 유지를 통해 흐름.
- 추가 500 µ L이이 샘플의 필터링 된 상쾌한. 900 µ L 버퍼 B2 단계 3.4.2에서에서 사용 됩니다.
- DNA 절연 (50 µ L 또는 1/20 볼륨)에 대 한 각 상태의 약 수 고 추가 SDS-중 탄산 솔루션 x 50 µ L 2 [재료의 표 참조]. DNA 격리 프로토콜 (단계 3.6) 진행.
- 입력된 단백질 (50 µ L 또는 1/20 볼륨)에 대 한 각 상태의 약 수 Laemmli 샘플 버퍼 x 50 µ L 2를 추가, 액체 질소에서 냉동 고-80에서 저장 ° C. 사용 단계 3.5.6에서에서.
- . 샘플 당 구슬의 1 개의 관을 준비 합니다. 워시 비즈 1 mL 버퍼 B2 resuspend에 vortexing, 자석 구슬, 분리를 적용 하 고 발음 워시 버퍼와 함께 3 x.
참고: 최적화 조건 결과 최대화 항복에 최소한의 배경 바인딩 바인딩. 그것은 실험적으로 Streptavidin T1 자석 구슬 agarose 구슬, 뿐만 아니라 다른 Streptavidin 구슬 보다 갈수록 배경 바인딩 Streptavidin C1 비즈 보다 상당히 큰 바인딩 능력을가지고 결정 했다 ( 그림 4A ).
참고: 샘플은 그들에 게 추가 되 면 소용돌이 구슬 하지 마십시오.
참고: 경우 상당한 양의 DNA 또는 단백질 레이블이 없는 부정적인 제어에 격리 되어,이 단계에서에서 줄일 수 있습니다 하룻밤을 줄이기 위해 배경 바인딩 4 h.
참고:이 좋습니다 나머지 단계에 대 한 필터 팁을 사용 하 여.
- 반복 단계 3.5.1 세 번.
- 마그네틱 microfuge 관 랙 샘플, 상쾌한 제거, 부드럽게 1 ml 버퍼 B3, resuspend 놓고 5 분의 4 ° C에서 회전
- 전송 100 µ L 혼합물 (1/10 번째 볼륨) 바인딩된 DNA 분리에 대 한 새로운 튜브 구슬. 자석에이 튜브를 적용, 상쾌한 제거, SDS-중 탄산 솔루션 x 100 µ L 1에에서 구슬 resuspend 및 DNA 격리 프로토콜 (단계 3.6) 진행.
- 단계 3.5.3에서에서 나머지 900 µ L 비드 혼합물을 포함 하는 튜브 적용. 자석, 상쾌한, 제거 및 단백질 및 DNA 단백질 복합물을 elute Laemmli 샘플 버퍼 x 50 µ L 2에에서 구슬 resuspend.
- 종 샘플에서 95 ° C 15 분, 소용돌이, 빠르고 microfuge에 회전 자석 적용. 새로운 튜브, 플래시 동결, 그리고-80에 게 eluate 전송 ° c.
참고: 사용 모자 자물쇠 튜브 팝업 하지 않습니다 보장 하기 위해 끓는 동안 열.
참고: 프로토콜은이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다 및 샘플 몇 주 동안-80 ° C에 저장 될 수 있습니다. - Coomassie 파란 얼룩, 부 럽, 또는 표준 절차 25 질량 분석 분석 단백질 견본. 대표 결과 그림 4 및 그림 5에 표시 됩니다.
참고: 단백질 수율 질량 분석에 대 한 충분 한 인지를 확인 하려면 각 샘플의 7.5 µ L은 분석 Coomassie 블루 얼룩 및 사용 대표적인 바이러스 성 게놈의 서 부 럽 대 7.5 µ L 관련 단백질 (ICP4, ICP8, 또는 UL42). 단계의 3.3.6 lysates의 같은 볼륨. 입력된 단백질 수준에 대 한 제어와 함께 실행 됩니다. 나머지 샘플 (35 µ L) 질량 분석 후 분석 앞에서 설명한 25.
- 단계 3.3.5에서에서 샘플을 품 어. 및 3.5.4. 필요한 경우 4-16 h. 제거 65 ° C에서 자석 구슬에서 샘플.
- 150 µ L 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (PCI)와 샘플을 추출 하 고 새 튜브를 수성 단계 전송.
- 100 µ L와 나머지 PCI 추출 트리 스-EDTA (테) 새로운 튜브에 수성 단계 추가.
- 200 µ L 클로 프롬: isoamyl 알콜 (24:1)와 샘플 추출.
- 정화 수성 단계 제조 업체에 따라 PCR 정화 키트를 사용 하 여 ' s 프로토콜.
참고: 버퍼 샌드위치에 pH 표시기 샘플에 추가 될 때 자주색 돌 것 이다. 추가 10 & #181. L 3 M NaOAc pH 5.0 샘플의 pH 감소. - 결정 DNA 농도 fluorometer를 사용 하 여.
참고:이 프로토콜은 일반적으로 100-400 ng 비드 바인딩된 DNA 생성합니다. 아니 DNA는 EdC 1.3 단계에서에서 추가 되지 않은 부정적인 컨트롤의 eluate에서 감지 해야 합니다. - DNA 낮은 DNA 바인딩에 저장할 수 있습니다 4 또는-20 ° C에서 튜브와 실시간 PCR 또는 높은 처리량 시퀀싱 분석에 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
세포에서 DNA의 정화에 대 한 클릭 화학을 사용 하 여 먼저 iPOND 메서드21에 의해 달성 되었다. IPOND의 목적은 정화 관련된 단백질의 id에 대 한 세포 복제 포크입니다. 우리는 특별히 감염 시 vDNA 단백질 상호 작용 연구에이 기술을 적응 시켰다. EdC (그림 1)와 함께 동기화 된 감염, 바이러스 성 게놈을 접근의 조작 선택적 분리와 vDNA의 별도 인구 조사에 대 한 허용 했다. HSV-1 DNA 이미징 fluorophore 또는 biotin 정화 (그림 2)에 대 한 공유 첨부 파일을 촉진 하기 위하여 EdC (그림 1)으로 표시 됩니다. 바이러스 들어오는 게놈 (그림 1A)와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 감염 전에 prelabeled 하거나 새로 합성된 vDNA (그림 1B)25와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 DNA 복제 하는 동안 표시 될 수 있습니다. 또한, 펄스 체이스 분석 바이러스 성 복제 포크 (그림 1C)26와 관련 된 단백질의 특성을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. DNA는 확인 된 vDNA-단백질 상호 작용 (그림 3)에 대 한 레이블이 DNA와 지원의 성격에 대 한 공간 정보를 제공 하는 세포 내에서 구상 될 수 있다. 함께 찍은, 여기에 설명 된 프로토콜을 허용 생산적인 감염의 여러 측면의 proteomic 조사 HSV-1 유전자에 발생 하는 동적 변화에 대 한 통찰력을 제공 하. 이러한 접근 대기 시간 및 재 활성화, 바이러스 성 돌연변이와 관련 된 고기를 확인 하 고 다른 DNA와 RNA 바이러스 연구를 조사 하 더 적응 될 수 있었다.
이 단백질 정화 방법의 측면에서 양조위 외적응 했다. 22. 여기 주요 개선 EdC의 정화 라는 DNA에는 streptavidin 입히는 agarose 구슬 대신 Streptavidin T1 구슬의 사용. DNA 정제를 최적화 하려면 streptavidin 입히는 구슬의 여러 종류 감염 edc와 최대 단백질 복구 EdC (그림 4A)의 존재에 대 한 부재에 수행 되었다 일반적인 바인딩에 대 한 테스트 되었습니다. 이 실험에 대 한 서 부 럽 실행 되었다 vDNA 바인딩 단백질 ICP4에 대 한. 담긴 구슬 배경에서의 바인딩 EdC와 EdC 존재 최대 단백질 복구의 부재 최소 금액 결과 Streptavidin T1에 실행.
VDNA와 관련 된 단백질은 서 부 럽 고 질량 분석 등 proteomic 방법으로 확인할 수 있습니다. 알려진된 상호 작용의 역학 조사를 사용할 수 있습니다 서 부 럽 고 질량 분석 소설 vDNA 관련 된 단백질을 확인 하는 공평한 접근 방식으로 사용할 수 있습니다. 단백질의 예로 그림 4B에서 증가 EdC 라벨의 기능 같이 얻을 수 있습니다. 명확한 밴딩 패턴 보다는 얼룩은 얼룩 Coomassie 블루 일반적으로 관찰 된다. 이것은 가능성이 있기 때문에 단백질 견본에 DNA 또는 단백질의 풍부 때문 에입니다. 그것은 또한 중요 클릭 반응에 사용 된 구리 촉매 단백질 및 핵 산28,29의 부분 저하 될 수 있습니다. 서양 blotting에 의해 ICP4의 정화 입력된 샘플 핵 lystates (단계 3.3.6.)에서 준비의 동일한 금액을 현재로 EdC와 60 분에 대 한 분류는 vDNA의 후 있다 (단계 3.5.5.)에서 일반적으로 감지 됩니다. 복구 대량 spectrometric 분석에 대 한 나머지 샘플을 보낼 수 있는 충분 한 인지를 결정 하는 가이드로이 정보를 사용할 수 있습니다.
앞에서 설명한 단백질 정화 vDNA와 관련 된 식별 하25 나노 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)와 밖으로 수행할 수 있습니다. LC-MS/MS 데이터 EdC 라는 실험 샘플 및 해당 레이블이 없는 부정적인 제어 사이의 스펙트럼 수 (SpC) 값을 비교 하 여 분석 된다. 다음 기준에 따라 실험 샘플에서 농축 단백질 간주 됩니다: 1) 단백질 실험 샘플에 있는 적어도 5 스펙트럼 계산 (SpC), 2) 단백질 컨트롤에서 인식 되지 않습니다 또는 적어도 four-fold 컨트롤에 의해 농축입니다 SpC 값, 그리고 3 분할에 따라) 단백질은 두 개 이상의 생물 복제에 컨트롤 위에 풍성 하 게. 정규화 된 스펙트럼 풍부한 요소 (NSAF: 
) 분자량 (MW)에 총 단백질 수율 차이 대 한 계정에 사용할 수 있습니다. 이 방정식 샘플 내에서 개별 단백질의 관계 되는 풍부를 결정 하 고 두 개의 다른 실험 조건 (예: 입력된 바이러스 성 게놈 (비교 다른 양의 vDNA이 순화 된다의 직접적인 비교에 대 한 수 그림 1A) 복제 게놈 (그림 1B)).
단백질 농축 데이터를 제시 하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 몇 가지 예로 파이 차트, 벤 다이어그램, 및 단백질 상호 작용 네트워크 있습니다. 원형 차트 (그림 5A) 특정 생물 학적 과정에 있는 식별 하는 단백질의 비율을 설명 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, 하나의 단백질이 경우 하나 이상의 생물 학적 기능 문제가 발생할 수 있습니다. 또한 다른 원형 차트에서 데이터를 비교 하기가 어렵습니다. 벤 다이어그램은 다른 실험 조건 하에서 확인 된 단백질 간의 관계를 보여 주기 위해 유용 하지만 단백질 발견 (그림 5B)에 대 한 기능 정보를 제공 하지 않습니다. 단백질 상호 작용 네트워크 확인 된 단백질 간의 잠재적인 상호 작용의 시각적 그림을 묘사 하 고는 생물 학적 프로세스의 형식에 대 한 정보 제공 관련 (그림 5C). 여러 온라인 리소스 매핑 문자열 (검색 상호 작용 유전자/단백질에 대 한 검색 도구)30을 포함 한 예측된 단백질-단백질 상호 작용에 대 한 사용할 수 있습니다. 온라인 도구는 일반적으로 다양 한 종에서에서 단백질 데이터를 처리 하 여 바이러스 성 게놈 역학에 관련 된 호스트 단백질에 대 한 유용한 정보를 제공 장착 됩니다. 그러나, 바이러스 성 단백질은 일반적으로에 포함 되지 데이터베이스, 분석을 복잡 하 게 수 있습니다. 따라서, 그것은 하나 단백질 데이터를 표시 하는 방법을 결정할 때 전달 하고자 하는 주요 결론을 고려 하는 것이 중요입니다.
그림 1:옹 > 레이블 HSV-1 DNA 접근. (A) 들어오는 바이러스, MRC 5 휴식의 상태를 분석 결과를 G0 에 셀 prelabeled HSV-1에 감염 및 게놈 복제 되지 않은 바이러스 성 DNA를 공부 하기 보다는 더 적은 4 hpi에서 분석 됩니다. (B)의 상태를 분석 결과를 복제 바이러스, MRC-5 셀 레이블이 HSV-1에 감염 되며 EdC (오렌지 별) 감염 된 세포의 성장 매체에 추가 되 고 바이러스 성 DNA 복제 (≥4 hpi)의 발병 후 2-4 h에 대 한 인 큐베이 팅. (C) 시험의 바이러스 성 복제 포크에 감염 세포 펄스 deoxyC와 5-20 분 복제 포크를 쫓아 수 다음에 대 한 EdC와 함께 표시 됩니다. EdC DNA 분류는 오렌지입니다. 이 그림은 Dembowski와 델 루카 예요25에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 분석 EdC의 DNA 라는이 문서에서 설명 하는 절차. (A) 이미징 방법의 개요 EdC DNA를 표시. 태그 DNA는 녹색으로 표시 됩니다. (B) 정화에 대 한 방법의 개요 및 EdC의 다운스트림 분석 vDNA 분류. 이 그림은 Dembowski와 델 루카 예요25에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 시각화의 EdC 라는 DNA. 셀, 감염 했다, 및 그림 1 에 설명 된 대로 몇 군데와 그림 2. 레이블이 지정 된 세포 및 바이러스 성 DNA의 대표 이미지 표시 됩니다. 세포질 DNA Hoechst 얼룩 및 ICP4와 vDNA colocalizes. 눈금 막대: 5 µm.This 그림 Dembowski와 델 루카 예요25 Dembowski 외 에서 수정 된 26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 대표적인 단백질 정화 결과. (A) 정화 단계 streptavidin 입히는 구슬의 여러 종류를 사용 하 여 실시 했다 단백질의 비교. 감염은 단백질 수율 비교 EdC (+) 존재 또는 배경 바인딩 비교 EdC (-)의 부재에서 실시 됐다. 감염 및 EdC 라벨 실시 했다 그림 1B 에 설명 된 대로 그리고 DNA 단백질 복합물은 유사한 양의 streptavidin 입히는 구슬의 다른 종류를 사용 하 여 그림 2B 에 설명 된 단계에 따라 정화 했다. 상단 패널: 후 정화 streptavidin에 코팅 agarose 구슬 또는 Streptavidin M-280 단백질의 비교. 하단 패널: Streptavidin M-270에 정화 후 단백질의 비교 M-280, Streptavidin C1, 또는 Streptavidin T1. 서 부 럽 ICP4 바이러스 성 단백질에 대 한 항 체와 함께 실시 됐다. 순화 된 ICP4 비교에 대 한 첫 번째 차선에 표시 됩니다. 하단 패널의 더 긴 노출 상단 패널에서 "280" 차선에서 ICP4의 비슷한 강도 관찰 해야 했다. (B) 대표 단백질 정화 결과 EdC 라벨의 시간의 기능으로 표시 됩니다. 감염 및 EdC 라벨 실시 했다 그림 1B 에 설명 된 대로 그리고 DNA 단백질 복합물 Streptavidin T1 비즈를 사용 하 여 그림 2B 에 설명 된 단계에 따라 정화 했다. 0, 20, 40, 또는 60 분 및 Coomassie 파란 얼룩 (위)에 실행 되었다 EdC 라벨 고 서 부 더 럽 히 (아래) 결과 표시 됩니다. 서 부 럽 실행 되었다 특정 항 체와 ICP4, UL42, 또는 GAPDH. Eluate 샘플 단계 3.5.5에서에서 찍은. 그리고 단계의 3.3.6 lysate. 화살표가 나타냅니다 streptavidin, L 단백질 사다리를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 단백질 데이터를 제시 하는 다른 방법의 예. (A) 원형 차트 요약 단백질 단백질 있다 바이러스 성 게놈 6 hpi에서 정화와 관련 된의 질량 분석에 의해 확인 되었다. 값 각 기능 범주에 대 한 식별 하는 단백질의 수를 나타냅니다. T는 확인 된 단백질의 총 수를 나타냅니다. 색상 표시는 다음과 같은 카테고리: chromatin 개장, 오렌지-DNA 복제, 황색-핵 전송, 청록-골격, 진한 파란색-HSV 구조 단백질, 및 회색-기타/알 수 없는-RNA 가공, 빨간색-전사, 녹색-보라색. (B) 6, 8, 또는 12 hpi 바이러스 성 유전자와 관련 된 것으로 확인 된 단백질의 오버랩을 묘사 하는 벤 다이어그램. (C) A 문자열 지도 묘사 EdC 펄스 5 분 후에 바이러스 성 복제 포크 농축 단백질. 5-fold 농축 인간의 단백질에 비해 레이블이 없는 부정적인 제어만 높은 신뢰 상호 작용을 표시 하려면 데이터 설정 문자열30 을 사용 하 여 생성 된 기능 상호 작용 지도에 표시 됩니다. 유전자 이름 상호 작용을 매핑하는 데 사용 되었다. 동그라미 단백질 같은 생물 학적 과정에 있는 기능을 나타냅니다. 이 그림 Dembowski와 델 루카 예요25 Dembowski 외 에서 수정 된 26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에는 여러 단계를 신중 하 게 따르지 않으면 크게 감소 단백질 수확량 또는 세포질 DNA로 오염 될 수 있습니다 포함 되어 있습니다. 그것은 중요 한 세포질 DNA는 하지 표시 하 고 정화 고정 셀 모든 실험을 위해 사용 됩니다. 이것은 단백질 견본에 세포질 DNA polymerases의 부재에 의해 HSV-1 게놈 종합을 위한 세포질 DNA 중 합 효소를 사용 하지 않습니다 때문에 확인할 수 있습니다. EdC 라벨 및 수확 단계 핵, 샘플은 각각 동등 하 게 처리 되도록 정열 한다. 정화 단계 하지 너무 많이 pipetting으로 핵을 조작에 배려를가지고 한다. 이 핵, 피펫으로 팁의 측면에 집착으로 샘플 손실의 조 lysis로 이어질 수 있습니다. 또한, 쥡니다 단계 개별 sonicators에 대 한 최적화 되어야 합니다 및 biotin 바인딩에 사용 되는 streptavidin 입히는 구슬의 양을 최적의 단백질 생산량에 대 한 적정 한다.
몇 가지 수정이이 프로토콜을 만들 수 있습니다 고 crosslink 단백질 dna 단계 추가 또는 다른 바이러스 또는 세포 유형 사용을 포함 합니다. Proteomic 조사에 사용할 셀 형식을 선택할 때 그것은 그 종에 대 한 단백질 시퀀스 데이터베이스의 가용성을 확인 하는 것이 중요. Proteomics 자원의 부족 크게 단백질 데이터의 다운스트림 분석을 제한 합니다. 또 다른 한계는 많은 수의 셀에 대 한 필요, 따라서 그것은이 실험에 대 한 충분 한 기본 세포 뉴런 등 준비 하기 어려울 수 있습니다. 이 방법으로 바이러스 감염 세포 DNA 복제에 의존 하지 않는 다른 DNA 또는 RNA 바이러스와 호환 해야 합니다. 또한, 그것은 HSV-1 돌연변이에서 발생 하는 DNA 단백질 상호 작용의 변화를 탐구 하는 재미 있는 것입니다. 또 다른 수정이이 프로토콜을 허용 것이 더 엄격한 세척 조건 정화21중 핵의 격리 하기 전에 포름알데히드 가교 단계 추가 될 수 있습니다. 포 름 알 데히드의 추가 핵을 수확 하는 기능에는 영향을 미치지 않습니다 하지만 감소 단백질 수율 성사 crosslinks 단백질 차입 중 반전으로 인해 발생할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 결과 바이러스 성 DNA 검사 중인의 평균 상태를 나타냅니다. 따라서, 단지 함께에 있다면 동일 하거나 별도 DNA 분자를 구별 하기가 어렵습니다. 높은 해상도 이미지와 함께에서 여기에 설명 된 메서드를 표시 하는 vDNA 단백질 데이터를 확인 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 셀 내에서 레이블이 DNA의 다른 인구 사이 구별 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 칩 seq는 바이러스 성 게놈에 단백질의 특정 위치를 식별 하는 메서드를 후속으로 사용 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는이 원고 준비에 대 한 도움 한 나 폭스를 인정합니다. 이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 R01AI030612를 부여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
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