Summary
O objetivo do presente protocolo é especificamente tag e seletivamente isolar o DNA viral de células infectadas para caracterização de proteínas do genoma viral associada.
Abstract
O objetivo do presente protocolo é de isolar o vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1) de DNA de células infectadas para a identificação de associado viral e proteínas celulares por espectrometria de massa. Apesar de proteínas que interagem com genomas virais desempenham papéis importantes na determinação do resultado da infecção, uma análise abrangente das proteínas do genoma viral associado não foi anteriormente possível. Aqui vamos demonstrar um método que permite a purificação direta do HSV-1 genomas de células infectadas. Replicação de DNA viral seletivamente é rotulado com nucleotídeos modificados que contêm um grupo funcional de alquino. Rotulado de DNA é então especificamente e irreversivelmente com a tag através a ligação covalente de azida de biotina, através de um de cobre (I)-catalisada reação de cicloadição ou clique azida-alquino. Biotina-tag DNA purified em grânulos streptavidin-revestido e proteínas associadas são eluídas e identificadas por espectrometria de massa. Este método permite a seleção de alvos e isolamento de forquilhas de replicação do HSV-1 ou toda genomas de ambientes biológicos complexos. Além disso, a adaptação desta abordagem permitirá para a investigação de vários aspectos da infecção herpética, bem como o exame dos genomas de outros vírus de DNA.
Introduction
Vírus têm uma capacidade limitada para realizar funções essenciais e, portanto, dependem de fatores do hospedeiro para facilitar os aspectos críticos da infecção, incluindo transporte, replicação, reparo, recombinação e expressão gênica viral. As atividades desses fatores do hospedeiro são, muitas vezes acentuadas por proteínas virally codificadas. Além disso, o vírus devem evitar deteção e interferência por respostas celulares à infecção viral. Portanto, interações hospedeiro de vírus ditam o resultado da infecção. De suma importância é entender como vírus alteram o ambiente celular para adaptar-se a maquinaria celular para facilitar processos virais. De particular interesse é identificar quais fatores e processos atuam sobre genomas virais durante todo o ciclo infeccioso.
Vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1) é que uma dupla encalhado DNA vírus que infecta uma parte substancial da população humana. Dentro da primeira hora de infecção, o genoma viral entra no núcleo, onde uma cascata ordenada da expressão dos genes virais resulta em coordenação com viral de replicação de DNA (vDNA)1. No núcleo, genomas estão sujeitos a regulamento epigenético, passam por reparo e recombinação, em são empacotados em capsids, tal que o primeiros virions descendentes são produzidos dentro de menos de seis horas. A avaliação abrangente das proteínas do genoma viral associada ao longo do curso da infecção vai estabelecer as bases para investigar os detalhes moleculares de processos que agem sobre genomas virais e irão fornecer insights sobre quais fatores virais e celulares estão envolvidas em vários estágios de infecção.
Métodos anteriores para a investigação de fatores do hospedeiro envolvidos na infecção viral incluem purificação da afinidade das proteínas virais para a análise de proteínas celulares associados2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. estes ensaios têm sido fundamentais para a identificação de fatores celulares envolvidos em respostas antiviral de acolhimento, bem como a modificação de cromatina viral, expressão gênica, e reparo do DNA. No entanto, é difícil verificar se interações dependem da associação com vDNA e proteomics apenas fornecer insights sobre as interações que ocorrem em função de um fator viral específico. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) tem sido utilizada para identificar onde as proteínas virais e celulares específicas bind para genomas virais10,11,12,13,14 , 15 e hibridização fluorescente in situ (FISH) combinado com imunocitoquímica permitiu a visualização de fatores celulares que colocalize com vDNA16,17,18, 19 , 20. estes ensaios permitem análise espacial e temporal. No entanto, as limitações incluem a necessidade de anticorpos altamente específicos, sensibilidade limitada e a necessidade de anterior insight interações hospedeiro de vírus. Portanto, desenvolvemos um método baseado na iPOND (isolamento de proteínas DNA nascente)21 e aniPOND (iPOND nativo acelerada)22 para seletivamente rotular e purificar vDNA de infectados células para a imparcial identificação do genoma viral proteínas associadas por espectrometria de massa. iPOND tem sido fundamental para a investigação da dinâmica do garfo de replicação celular.
Para a purificação seletiva de genomas virais de células infectadas, replicar vDNA é rotulado com nucleosídeos ethynyl modificado, 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) ou 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (Figura 1), seguido por ligações covalentes conjugação de azida de biotina, através do clique em química para facilitar a purificação de única etapa de genomas virais e proteínas associadas em grânulos streptavidin-revestido (Figura 2B). Importante, infecções são realizadas em células estacionárias, que não estão envolvidas na replicação do DNA celular para permitir a rotulagem específica de vDNA. Além disso, a infecção HSV-1 faz com que a detenção do ciclo celular e inibe de23,de replicação de DNA celular24. Vírus podem ser prelabeled antes da infecção para a análise de proteínas associadas com entrada genomas virais (figura 1A) ou rotulado durante a replicação do DNA para a análise de proteínas associadas com vDNA recém sintetizado (figura 1B) 25. Além disso, a análise de perseguição do pulso pode ser usado para investigar a natureza das proteínas associadas com replicação viral garfos (Figura 1)26. Além disso, ethynyl-modificado vDNA pode ser covalentemente conjugado com um fluoróforo para investigação espacial da dinâmica da proteína (Figura 2A e Figura 3). Imagem permite a visualização directa de vDNA é uma abordagem complementar para a validação das interações da proteína-vDNA e pode ser adaptada para controlar genomas virais durante a infecção. Nós antecipamos que essas abordagens podem ser mais modificadas para estudar qualquer aspecto da infecção herpética, incluindo latência e reativação e estudar outros vírus de DNA. Além disso, etiquetando com uridina 5-ethynyl (UE) pode permitir para a análise do genoma viral de RNA.
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Protocol
1. cultura celular, infecção Viral e rotulação de EdC ( Figura 1)
o seguinte protocolo envolve trabalhar com vírus. Por favor, consulte sua instituição ' protocolos de biossegurança s sobre manipulação segura de vírus e outros agentes biológicos. Este protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Pittsburgh.
- Trypsinize um frasco de cultura de tecidos confluente 150 cm 2 de MRC-5 células e as células de transferência para uma placa de cultura de tecido de 2 600 cm contendo 100 mL DMEM acrescido de 10% FBS. Incube a 37 ° C, na presença de 5% de CO 2 para 3-4 dias para chegar a fase estacionária e Confluencia. Um prato de 2 cm de 600 confluente contém ~ 7 x 10 7 células. Preparar 1 para cada condição e 1 chapa para cada controle negativo correspondente.
Nota: Células devem alcançar a fase estacionária para inibir a replicação do DNA celular para garantir que apenas vDNA é rotulado e purificada em etapas subsequentes.
Nota: Cada amostra requer uma cortesia unlabeled controlo negativo preparado usando as mesmas condições de infecção e ponto de tempo sem a adição de EdC.
Nota: A escala versão desta experiência deve ser efectuada em tandem para testar para a rotulagem do DNA celular por imagem utilizando o crescimento de células comparáveis, infecção, EdC rotulando as condições e pontos (consulte a etapa 2). - Diluir 7 x 10 8 PFU HSV-1 em 7 mL salina de carbono frio (TBS). Remover o meio de crescimento e armazenar a 37 ° C. Para infectar, adicione o 7 mL vírus diluído para MRC-5 células e rock por 1h à temperatura ambiente. Após a adsorção, remover o inóculo, enxaguar com 50 mL temperatura TBS e substituir o original meio de crescimento. Incube a 37 ° C, na presença de 5% de CO 2. Esta etapa deve ser efectuada para cada condição experimental e controlo negativo.
Nota: Rotulagem de EdC aumento pode ser conseguido usando mutantes de HSV-1 defeituosos para a expressão do dUTPase viral (gene UL50) e/ou glycosylase uracil (UL2 gene). HSV-1 dUTPase tem baixa especificidade e pode diminuir a ativação de diversos nucleosídeos análogos 25 , 27. - Genomas virais de rótulo com EdC. Siga as instruções para rotular os genomas de entrada (1.3.1.), replicação de genomas (1.3.2.), ou forquilhas de replicação viral (1.3.3)..
Nota: Só passo 1.3.1, 1.3.2 ou 1.3.3 deve ser realizado dependendo se entrada genomas, genomas replicadas ou forquilhas de replicação devem ser analisados em etapas subsequentes, respectivamente.
Nota: EdU ou f-ara EdU pode ser substituído por EdC. A toxicidade de análogos de nucleosídeos deve ser monitorizada e minimizada.- Uso prelabeled ações para realizar a infecção na etapa 1.2 e vá para a etapa 2 ou 3 dentro de 4h pós infecção (hpi) para investigar replicada vDNA ( figura 1A).
Nota: Prepare o vírus prelabeled ações usando o protocolo descrito anteriormente, 25. Reservas de vírus devem ser passadas através de uma coluna de G-25 para remover qualquer residual EdC. - Etiqueta vDNA replicação pela adição de 5-25 µM EdC para o meio de cultura celular de células infectadas para 2-4 h ( figura 1B). Antes de adicionar, diluir EdC em 1 mL de meio de crescimento.
- Para rotular as forquilhas de replicação viral, após o início da replicação vDNA (≥ 4 hpi), etiqueta de pulso replicando vDNA com 5-25 µM EdC para 5 a 20 min. Para perseguir, lavar 3x com meio de perseguição contendo 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC) e então incubar na presença de meio de perseguição por um adicional 20-40 min ( Figura 1).
Nota: Pulso e chase médio deve ser incubado a 37 ° C e 5% CO 2 antes do uso.
Nota: Para experiências de perseguição do pulso, é importante considerar a quantidade de tempo que leva para nucleosídeos entrar na célula e ser phosphorylated antes que eles podem ser incorporados em replicação de DNA. Isso deve ser determinado empiricamente.
Nota: Para determinar a resolução de experimentos de perseguição de pulso, calcule a taxa de replicação viral nas condições experimentais utilizadas. Isto pode ser determinado por PCR quantitativo de genomas virais durante uma única etapa crescimento tempo curso 26.
Nota: Para imagens de genomas virais prosseguir para a etapa 2 e para a purificação de genomas virais prossiga para o passo 3.
- Uso prelabeled ações para realizar a infecção na etapa 1.2 e vá para a etapa 2 ou 3 dentro de 4h pós infecção (hpi) para investigar replicada vDNA ( figura 1A).
2. Imagem de EdC rotulado de DNA ( Figura 2A)
Nota: é útil realizar imagens em conjunto com o método de purificação do genoma viral para verificar que o DNA celular não é rotulado em experimentos. Imagem também pode ser usada para visualizar a natureza de vDNA etiquetado e validar dados de proteômica. Exemplos de DNA viral e celular, os padrões de coloração são mostrados na Figura 3.
- Realizar infecções e EdC rotulando como indicado na etapa 1, exceto usando reduzidas condições em lamelas em um prato de cultura de tecidos de 12 poços contendo 1 mL de meio de cultura.
- Correção de células com 1 mL 3,7% paraformaldeído em 1X PBS por 15 min no RT Após a fixação, enxaguar células 2x com 1ml 3% BSA em PBS.
Cuidado: Paraformaldehyde pode causar lesões graves ou permanentes. Siga as precauções de segurança.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e lamelas podem ser armazenadas a 4 ° C, na segunda lavagem por até 3 dias. - Permeabilize células com 1 mL de tampão de permeabilização [ver Tabela de materiais] por 20 min à temperatura ambiente enquanto balançando.
- Enxaguar com 1 mL de BSA 3% e, em seguida, bloco com BSA de 3% 1 mL de PBS durante 30 min à temperatura ambiente enquanto balançando.
- Adicione 1 mL da reação clique cocktail [ver Tabela de materiais] para lamelas covalentemente conjugar Alexa Fluor 488 azida de EdC rotulado de DNA. Incube a temperatura ambiente por 30 min, enquanto balançando. Aspirar e lavar duas vezes com 1 mL de PBS.
- Mancha DNA celular com 1 mL de uma diluição de 1:2,000 de Hoechst em PBS durante 30 min à temperatura ambiente enquanto balançando. Aspirar e lavar duas vezes com 1 mL de PBS.
- Mancha com anticorpos primários e secundários, de acordo com o padrão de imunofluorescência indirecta protocolos 25.
Nota: VDNA rotulado colocalizes com ICP8, ICP4 ou UL42 e rotulado celular DNA colocalizes com mancha de Hoechst. - Montar lamelas em slides e imagem células usando um microscópio de fluorescência.
Nota: Slides podem ser armazenadas a 4 ° C durante várias semanas.
3. Purificação de proteínas associadas e vDNA
Nota: vários aspectos deste protocolo foram adaptados de Leung et al. 22
Nota: todos os buffers e reagentes devem ser refrigerados no gelo antes da utilização e todas as etapas devem ser realizadas no gelo salvo indicação em contrário.
- Colheita núcleos.
Nota: Antes de isolamento dos núcleos, formaldeído pode ser usado para a ligação cruzada proteínas para o DNA. Condições mais rigorosas de lavagem podem ser usadas durante a purificação de DNA em grânulos streptavidin-revestido. Para crcondições osslinking e lavagem ver Sirbu et al 21.- substituir o meio de cultura com 20 mL de solução tampão de núcleos (NEB) e incube por 20 min a 4 ° C, com ocasionais de balanço. Núcleos se tornará visíveis no microscópio.
- Raspar núcleos da placa usando um raspador de célula e transfira para um tubo cónico de 50 mL. Centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C para núcleos de Pelotas, descartar o sobrenadante.
Nota: Trypan coloração azul pode ser usado para verificar o isolamento dos núcleos de células. - Suavemente desalojar a pelota nuclear em 10 mL de PBS, transferir para um tubo cônico de 15 mL, pelota e por centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente remover PBS.
Nota: Núcleos podem ser congelados e o protocolo pode ser interrompido neste ponto. Para fazer isso, delicadamente Ressuspender o nuclear em 500 µ l de congelamento do buffer e incubar o tubo em um banho de gelo seco-etanol. Armazenar os núcleos congelados a-80 ° C. Antes da utilização, descongelar núcleos à temperatura ambiente, transferir rapidamente de gelo, adicionar 10 mL de PBS, pedra delicadamente para misturar, pelota por centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C e remover completamente a PBS. Núcleos de congelamento pode resultar em rendimento reduzido.
- Covalentemente conjugado biotina-azida de EdC rotulado vDNA.
- Ressuspender o pellet nuclear na reação de 10ml clique misturar [ver Tabela de materiais] suavemente pipetando acima e para baixo 5 vezes com uma pipeta de 10 mL.
Nota: É importante que os reagentes incluídos no mix clique reação são adicionados na ordem indicada. - Rode durante 1h a 4 ° C. Enquanto roda preparar e relaxar Buffers B1, B2 e B3 [ver Tabela de materiais].
- Núcleos de pelota por centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente remover clique em mistura de reação e lavar o sedimento por suavemente resuspending em 10 mL de PBS e centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C.
- Suavemente resuspenda o pellet nuclear em 1 mL de PBS e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando a ponta da pipeta um grande furo. Núcleos de pelotas por centrifugação durante 10 minutos a 2.500 x g a 4 ° C. completamente remover PBS e congelamento flash em azoto líquido.
Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e núcleos congelados podem ser armazenados no-80 ° C. Freeze degelo ajuda com Lise subsequente, por isso é recomendado que os núcleos ser flash congelado mesmo quando avançar para o passo 3.3 no mesmo dia.
- Ressuspender o pellet nuclear na reação de 10ml clique misturar [ver Tabela de materiais] suavemente pipetando acima e para baixo 5 vezes com uma pipeta de 10 mL.
- Lyse núcleos e fragmento de DNA.
- Descongelar núcleos no gelo e ressuspender em 500 µ l de Buffer B1 pipetando para cima e para baixo. Incubar no gelo por 45 min.
- Sonicate amostras 6 vezes por 30 s cada em amplitude de 40%, usando uma sonda de microtip de 3 mm. Colocar as amostras no gelo por 30 s entre pulsos. Depois sonication, amostras devem aparecer, claro, não nublado.
Nota: Condições Sonication devem ser otimizadas para sonicators individuais. Para obter instruções detalhadas sobre como otimizar condições sonication referir Leung et al. 22. - os restos da célula de pelotas por centrifugação a 14.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. O tamanho da pelota deve diminuir substancialmente. Filtrar o sobrenadante através de filtro de célula 100 µM e manter o fluxo através de.
- Adicionar 500 µ l tampão B2 a filtrada sobrenadante. 900 µ l desta amostra será usado na etapa 3.4.2.
- Tomar uma alíquota de cada condição para isolamento de DNA (50 µ l ou volume 1/20th) e adicionar 50 µ l 2 x solução de SDS-bicarbonato [ver Tabela de materiais]. Prossiga para o protocolo de isolamento de DNA (passo 3.6).
- Tomar uma alíquota de cada condição para a entrada da proteína (50 µ l ou volume 1/20th) e adicionar 50 µ l 2 x amortecedor da amostra Laemmli, congelamento em nitrogênio líquido e armazene a -80 ° C. utilizar na etapa 3.5.6.
- Bind biotinilado DNA para streptavidin revestido grânulos.
- Preparar Streptavidin T1 grânulos magnéticos Transferindo 300 µ l de chorume grânulo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Prepare um tubo de grânulos por amostra. Lavagem de contas 3 x 1 ml de tampão B2 num Vortex para Ressuspender, aplicando um ímã para separar as contas, e aspirando o tampão de lavagem.
Nota: Otimizado resultado de condições no rendimento maximizado e vinculação de fundo mínimo de vinculação. Determinou-se experimentalmente que grânulos magnéticos Streptavidin T1 têm uma capacidade de ligação significativamente maior do que grânulos de agarose, bem como outros grânulos de estreptavidina e menos fundo vinculação do Streptavidin C1 grânulos ( Figura 4A ). - Adicionar 900 µ l da amostra da etapa 3.3.4. aos talões lavados e rodar durante a noite a 4 ° C.
Nota: Fazer grânulos de vórtice não, uma vez que a amostra é adicionada a eles.
Nota: Se uma quantidade significativa de DNA ou proteína está isolada no controle negativo sem rótulo, esta etapa pode ser reduzida de durante a noite a 4 h para reduzir a ligação fundo.
- Preparar Streptavidin T1 grânulos magnéticos Transferindo 300 µ l de chorume grânulo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Prepare um tubo de grânulos por amostra. Lavagem de contas 3 x 1 ml de tampão B2 num Vortex para Ressuspender, aplicando um ímã para separar as contas, e aspirando o tampão de lavagem.
- Lave grânulos e eluir vDNA e proteínas associadas.
Nota: É recomendável usar filtro dicas para as etapas restantes.- Amostras de lugar em uma cremalheira do tubo de microcentrífuga magnético, remover sobrenadante, Ressuspender delicadamente em 1 mL de tampão B2, rode a 4 ° C por 5 min.
- Repita o passo 3.5.1 três vezes.
- Colocar as amostras em um rack de tubo de microcentrífuga magnético, remover o sobrenadante, delicadamente Resuspenda em 1 mL de tampão B3 e rode a 4 ° C por 5 min.
- Mistura de grânulo transferir 100 µ l (volume de 1/10 th) para um tubo novo para isolamento de DNA acoplado. Aplicar este tubo ao ímã, remover o sobrenadante, resuspenda grânulos em 100 µ l 1 x solução de SDS-bicarbonato e prossiga para o protocolo de isolamento de DNA (passo 3.6).
- Aplicar o tubo contendo a mistura de grânulo de 900 µ l restantes da etapa 3.5.3. ao ímã, remover o sobrenadante e ressuspender grânulos em 50 µ l 2 x Laemmli tampão de amostra para eluir proteínas e complexos DNA-proteína.
- Amostras de ferver a 95 ° C por 15 min, vortex, rapidamente girar a microcentrífuga e aplicar o ímã. Eluato de transferência para um novo tubo, congelamento flash e loja a -80 ° C.
Nota: Bloqueios de tampão de uso para assegurar que os tubos não pop abrir enquanto ferver.
Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C durante várias semanas. - Analisar amostras da proteína por azul de Coomassie mancha, mancha ocidental ou espectrometria de massa por procedimentos padrão 25. Resultados representativos são mostrados na Figura 4 e Figura 5.
Nota: Para determinar se o rendimento de proteína é suficiente para espectrometria de massa, 7,5 µ l de cada amostra é usado para análise pela coloração de azul de Coomassie e 7,5 µ l para a mancha ocidental de um representante do genoma viral associada da proteína (ICP4, ICP8 ou UL42). O mesmo volume de lysates da etapa 3.3.6. são executados ao lado de Controlarar para níveis de entrada de proteínas. A amostra restante (35 µ l) é então analisada por massa espectrometria conforme descrito anteriormente 25.
- Isolamento de DNA
- incubar as amostras da escadaria 3.3.5. e 3.5.4. a 65 ° C para 4-16 h Remove uma amostra de grânulos magnéticos, se necessário.
- Extrair amostras com álcool de fenol: clorofórmio: isoamílico 150 µ l (PCI) e transferir a fase aquosa para um tubo novo.
- Extrair o restante PCI com 100 µ l Tris-EDTA (TE) e adicionar a fase aquosa para um tubo novo.
- Extrair amostras com álcool de clorofórmio: isoamílico 200 µ l (24:1).
- Purificar a fase aquosa, usando o Kit de purificação de PCR de acordo com o fabricante ' protocolo de s.
Nota: O indicador de pH em Buffer PB ficará roxo quando adicionado à amostra. Adicionar 10 & #181; PH de NaOAc 3M L 5.0 para diminuir o pH da amostra. - Concentração de DNA determinar usando um dados.
Nota: Este protocolo normalmente rende 100-400 ng grânulo-ligado DNA. Sem DNA deve ser detectado no eluído do controlo negativo no qual EdC não foi adicionado na etapa 1.3. - DNA pode ser armazenado em uma baixa ligação DNA tube 4 ou - 20 ° C e pode ser usado para PCR em tempo real ou a análise do sequenciamento de alto rendimento.
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Representative Results
O uso da química clique para a purificação do DNA de células primeiro foi realizado pelo iPOND método21. O objetivo do iPOND é purificar forquilhas de replicação celular, para a identificação de proteínas associadas. Nós adaptamos essa técnica para estudar especificamente as interações da proteína vDNA durante a infecção. Manipulação da abordagem de rotular genomas virais com EdC (Figura 1), combinadas com infecções sincronizadas, permitiu o isolamento seletivo e investigação de populações isoladas de vDNA. DNA de HSV-1 é rotulado com EdC (Figura 1) para facilitar a ligação covalente com um fluoróforo para a imagem latente ou biotina para purificação (Figura 2). Vírus podem ser prelabeled antes da infecção para a análise de proteínas associadas com genomas de entrada (figura 1A) ou rotulado durante a replicação do DNA para a análise de proteínas associadas com vDNA recém sintetizado (figura 1B)25. Além disso, a análise de perseguição do pulso pode ser usado para investigar a natureza das proteínas associadas com replicação viral garfos (Figura 1)26. DNA pode ser visualizado dentro das células para fornecer informação espacial sobre a natureza do DNA etiquetadas e suporte para identificados vDNA-interações da proteína (Figura 3). Tomados em conjunto, os protocolos descritos aqui permitem a investigação de proteomic dos vários aspectos da infecção produtiva para fornecer insights sobre mudanças dinâmicas que ocorrem em genomas de HSV-1. Essas abordagens poderiam ser ainda mais adaptadas para investigar a latência e reativação, para examinar os fenótipos associados com mutantes virais e estudar outros vírus de DNA e RNA.
Aspectos desse método de purificação de proteínas foram adaptados de Leung et al. 22. aqui uma grande melhoria para a purificação de EdC rotulado de DNA é o uso de grânulos Streptavidin T1 em vez de grânulos de agarose streptavidin-revestido. Para otimizar a purificação de DNA, vários tipos de grânulos revestidos streptavidin foram testados para ligação não específica quando a infecção foi executada na ausência de EdC e para a recuperação máxima de proteína na presença de EdC (Figura 4A). Para estas experiências, mancha ocidental foi realizado para a proteína de ligação de vDNA ICP4. Purificações realizadas em Streptavidin T1 grânulos resultaram em menos quantidade de vinculação do plano de fundo na ausência de EdC e a recuperação máxima de proteína na presença de EdC.
Proteínas associadas com vDNA podem ser identificadas por métodos de proteomic incluindo mancha ocidental e espectrometria de massa. Mancha ocidental pode ser usado para investigar a dinâmica das interacções conhecidas e espectrometria de massa pode ser usada como uma abordagem imparcial para identificar proteínas vDNA romance associado. Um exemplo de proteína rendimento como uma função de crescente EdC rotulagem é mostrada na Figura 4B. Um esfregaço, ao invés de um padrão de faixas claro, geralmente é observado pela coloração de azul de Coomassie. Isto é provável porque há DNA presente na amostra de proteínas ou porque há uma abundância de proteínas. Também é importante notar que o catalisador de cobre usado na reação de clique pode causar degradação parcial de proteínas e ácidos nucleicos28,29. Pela mancha ocidental, níveis semelhantes de ICP4 normalmente são detectados em eluídos (etapa 3.5.5.) após a purificação de vDNA que foi rotulado por 60 min com EdC como presente na mesma quantidade de entrada amostra preparada a partir de lystates nuclear (etapa 3.3.6.). Esta informação pode ser usada como um guia para determinar se a recuperação é suficiente para enviar a amostra restante para análise de espectrometria de massa.
Nano cromatografia líquida com espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) pode ser realizada conforme descrito anteriormente,25 para identificar as proteínas associadas com vDNA purificado. Dados de LC-MS/MS são analisados comparando valores de contagem espectral (SpC) entre a amostra experimental EdC-rotulados e o correspondente controle negativo sem rótulo. As proteínas são consideradas para ser enriquecido na amostra experimental com base nos seguintes critérios: 1) proteína tem pelo menos 5 contagens espectrais (SpC) na amostra experimental, 2) proteína não é detectada no controle ou é enriquecida sobre o controle pelo menos quatro vezes com base na divisão SpC valores e 3) a proteína é enriquecida sobre o controle em dois ou mais réplicas biológicas. O fator de abundância espectral normalizado (NSAF: 
) pode ser usado para compensar diferenças de peso molecular (MW) e rendimento de proteína total. Esta equação determina a abundância relativa de proteínas individuais dentro de uma amostra e permite a comparação direta de duas diferentes condições experimentais em que quantidades diferentes de vDNA são purificadas (por exemplo, comparando (entrada de genomas virais Figura 1A) a replicada genomas (figura 1B)).
Existem várias maneiras de apresentar dados de enriquecimento de proteína. Alguns exemplos incluem gráficos, diagramas de Venn e redes de interação de proteínas. Gráficos de pizza pode ser usados para ilustrar a proporção de proteínas identificadas que são conhecidos para funcionar em um processo biológico específico (Figura 5A). No entanto, podem surgir problemas quando uma proteína tem mais de uma função biológica, que é frequentemente o caso. Também é difícil comparar dados entre diferentes gráficos de pizza. Diagramas de Venn são úteis para demonstrar as relações entre proteínas identificadas nas diferentes condições experimentais, mas não fornecem qualquer informação funcional sobre as proteínas identificadas (Figura 5B). Redes de interação proteína retratar uma ilustração visual de potenciais interações entre proteínas identificadas e fornecer informações sobre os tipos de processos biológicos que estão envolvidos (Figura 5). Vários recursos on-line estão disponíveis para mapear as interações da proteína-proteína predita incluindo STRING (ferramenta de pesquisa para as recuperação de interação Genes/proteínas)30. Ferramentas on-line geralmente estão equipadas para lidar com dados de proteômica de uma variedade de espécies e fornecer informações valiosas sobre acolhimento proteínas envolvidas na mecânica do genoma viral. No entanto, proteínas virais geralmente não são incluídas em bases de dados, que podem complicar a análise. Portanto, é importante considerar as conclusões principais uma gostaria de transmitir ao decidir como apresentar dados de proteômica.
Figura 1:ONG > abordagens para rótulo DNA HSV-1. (A) a ensaiar o estado da entrada vírus, descansando MRC-5 células em G0 estão infectadas com o HSV-1 prelabeled e genomas são doseados em menos de 4 hpi para estudar o DNA viral replicada. (B) a ensaiar o estado de replicados vírus, MRC-5 células são infectadas com HSV-1 sem rótulo e EdC (estrelas laranja) é adicionado ao meio de crescimento de células infectadas e incubada durante 2-4 h após o início da replicação do DNA viral (hpi ≥4). (C) a ensaiar as forquilhas de replicação viral, infectava células são rotulado com EdC para forquilhas de replicação de 5 a 20 min. em seguida podem ser perseguidas com deoxyC de pulso. EdC rotulado DNA é laranja. Esta figura foi modificada de Dembowski e DeLuca25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Procedimentos descritos neste artigo para análise de EdC rotulado DNA. (A), um esboço do método para a imagem latente EdC rotulado de DNA. ADN etiquetado é representado em verde. (B) um esboço do método para a purificação e análise a jusante de EdC rotulado vDNA. Esta figura foi modificada de Dembowski e DeLuca25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visualização de EdC rotulado DNA. As células foram infectadas, rotuladas e cuja imagem conforme descrito na Figura 1 e Figura 2. Imagens representativas do DNA viral e celular etiquetado são mostradas. DNA celular colocalizes com mancha de Hoechst e vDNA com ICP4. Barra de escala: 5 µm.This figura foi modificado de Dembowski e DeLuca25 e Dembowski et al 26. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Resultados de purificação de proteínas representativa. (A) comparação de rendimento de proteína quando as etapas de purificação foram realizadas usando vários tipos diferentes de miçangas cobertas com estreptavidina. Infecção foi realizada na presença de EdC (+) para comparar o rendimento de proteína, ou na ausência de EdC (-) para comparar a vinculação do plano de fundo. Infecções e EdC rotulagem foram realizados conforme descrito na figura 1B e complexos DNA-proteína foram purificados de acordo com as etapas descritas na Figura 2B usando quantidades comparáveis de tipos diferentes de grânulos cobertas com estreptavidina. Painel superior: comparação de rendimento de proteína depois de purificação na streptavidin revestido grânulos de agarose ou Streptavidin M-280. Painel inferior: comparação de rendimento de proteína após a purificação na Streptavidin M-270, M-280, Streptavidin C1 ou Streptavidin T1. Mancha ocidental foi realizado com um anticorpo contra a proteína viral ICP4. ICP4 purificado é mostrado a primeira pista para comparação. Uma exposição mais longa do painel inferior era necessário para observar uma intensidade semelhante de ICP4 nas pistas "280", como no painel superior. (B) proteína representante purificação resultados em função do tempo de EdC rotulagem são mostrados. Infecções e EdC rotulagem foram realizados conforme descrito na figura 1B e complexos DNA-proteína foram purificados de acordo com as etapas descritas na Figura 2B usando grânulos Streptavidin T1. EdC rotulagem foi realizado para 0, 20, 40, ou 60 min e azul de Coomassie coloração (topo) e mancha ocidental (inferior) resultados são mostrados. Mancha ocidental foi realizado com anticorpos específicos para GAPDH, UL42 ou ICP4. Foi colhida a amostra de eluato da etapa 3.5.5. e lisado de passo 3.3.6. A seta indica estreptavidina, enquanto L indica escada de proteína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exemplos de maneiras diferentes para apresentar dados de proteomics. Gráficos de pizza (A) resumem as proteínas que foram identificadas por espectrometria de massa de eluídos proteína associada com genomas virais purificadas no hpi 6. Valores indicam o número de proteínas identificadas para cada categoria funcional. T indica o número total de proteínas identificadas. As cores indicam as seguintes categorias: roxo - processamento do RNA, vermelho - transcrição, verde - remodelamento da cromatina, transporte nuclear laranja - replicação do DNA, amarelo -, proteínas estruturais do HSV - citoesqueleto, obscuridade-azul - verde-azulado e cinza - outra/desconhecida. (B) diagramas de Venn retratam a sobreposição das proteínas identificado para ser associado com genomas virais em 6, 8 ou 12 hpi. (C) A sequência de caracteres mapa retrata proteínas enriquecidas em forquilhas de replicação viral após um pulso de EdC de 5 min. Enriquecido por 5-fold de proteínas humanas em comparação com o controle negativo sem rótulo são mostrados no mapa de interação funcional, que foi gerado usando a sequência30 com configurações de dados para exibir interações apenas alta confiança. Gene nomes foram usados para mapear as interações. Círculos indicam essa função no mesmo processo biológico. Esta figura foi modificada de Dembowski e DeLuca25 e Dembowski et al 26. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo inclui várias etapas que, se não seguido com atenção, podem resultar em rendimento de proteína significativamente reduzida ou contaminação com o DNA celular. É fundamental que células fixas são utilizadas para todas as experiências para garantir que o DNA celular não é rotulado e purificado. Isto pode ser confirmado pela ausência de polimerases de DNA celulares na amostra de proteína porque HSV-1 não utiliza DNA-polimerase celular para a síntese do genoma. Durante EdC rotulagem e núcleos etapas de colheita, as amostras devem ser desconcertadas para garantir que cada um seja processado igualmente. Durante as etapas de purificação, tenha cuidado para não manipular núcleos pipetando demais. Isso pode levar a Lise prematura dos núcleos, bem como perda de amostra devido a degola para os lados de pontas de pipeta. Além disso, a etapa de sonication deve ser otimizada para sonicators individuais e a quantidade de grânulos streptavidin-revestido usado para ligação de biotina deverá ser titulada para rendimento de proteína ideal.
Diversas modificações podem ser feitas para este protocolo e incluem o uso de vírus diferentes ou tipos de células ou a adição de uma etapa a proteína de ligação cruzada para DNA. Ao escolher um tipo de célula para usar proteomic investigação, é importante verificar a disponibilidade de um banco de dados sequência de proteína para essa espécie. A falta de recursos de proteomics limitará significativamente a jusante análise de dados de proteínas. Outra limitação é a necessidade de um grande número de células, portanto pode ser difícil de preparar o suficiente as células primárias, tais como os neurônios, para este experimento. Este método deve ser compatível com outros vírus de DNA ou RNA, enquanto a infecção viral não depende de replicação do DNA celular. Além disso, seria interessante explorar mudanças nas interações DNA-proteína que ocorrem em mutantes de HSV-1. Outra modificação para esse protocolo poderia ser a adição de uma etapa de reticulação de formaldeído antes de isolamento dos núcleos, o que permitiria mais rigorosas condições de lavagem durante a purificação21. A adição de formaldeído não afetará a capacidade de colheita núcleos mas pode resultar em rendimento de proteína diminuiu por causa de difìcil invertendo as referências cruzadas durante a eluição de proteína.
Os resultados do presente protocolo representam o estado médio do ADN viral, a ser examinado. Portanto, é difícil distinguir se complexos são juntos sobre as mesmas ou diferentes moléculas de DNA. vDNA rotulagem métodos descritos aqui em combinação com imagens de alta resolução pode ser usado para verificar dados de proteômica e pode ajudar a distinguir entre diferentes populações de DNA etiquetada dentro de uma célula. Além disso, o ChIP-seq poderia ser usado como um método de seguimento para identificar os locais específicos de proteínas no genoma viral.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Reconhecemos a Hannah Fox pela ajuda na preparação deste manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01AI030612.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
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