Summary
Målet med detta protokoll är specifikt tagga och selektivt isolera virus-DNA från infekterade celler för karakterisering av virusgenom associerade proteiner.
Abstract
Målet med detta protokoll är för att isolera herpes simplex virustyp 1 (HSV-1) DNA från infekterade celler för identifiering av associerade viral och cellulära proteiner av mass spectrometry. Även proteiner som samverkar med virala genomer spelar stora roller i att bestämma resultatet av infektion, var en omfattande analys av virusgenom associerade proteiner inte tidigare genomförbart. Här visar vi en metod som möjliggör direkt rening av HSV-1 genomen från infekterade celler. Replikering av virus-DNA är selektivt märkt med modifierade nukleotider som innehåller en alkynen funktionell grupp. Märkt DNA är sedan specifikt och oåterkalleligt taggade via kovalenta fastsättning av biotin natriumazid via en koppar (I)-katalyseras natriumazid-alkynen cykloadditionen eller klicka reaktion. Biotin-taggade DNA renas på streptividin-belagda pärlor och associerade proteiner är elueras och identifieras med masspektrometri. Denna metod möjliggör selektiv inriktning och isolering av HSV-1 replikering gafflar eller hela genomen från komplexa biologiska miljöer. Dessutom tillåter anpassning av detta tillvägagångssätt för utredning av olika aspekter av herpesviral infektion, liksom granskningen av genomen hos andra DNA-virus.
Introduction
Virus har en begränsad förmåga att utföra grundläggande funktioner och därför beror på värd faktorer att underlätta kritiska aspekter på infektion inklusive viral genuttryck, replikering, reparation, rekombination och transport. Verksamheten i dessa värd faktorer är ofta förstärkta av viralt kodade proteiner. Dessutom måste virus undvika upptäckt och störningar av cellulära svar till virusinfektion. Därför diktera virus värd interaktioner resultatet av infektion. Av största vikt är att förstå hur virus förändrar den cellulära miljön för att anpassa det cellulära maskineriet för att underlätta virala processer. Av särskilt intresse är att identifiera vilka faktorer och processer agera på virala genomer hela smittsamma cykeln.
Herpes simplex virustyp 1 (HSV-1) är en dubbel strandsatta DNA-virus som infekterar en betydande del av den mänskliga befolkningen. Inom den första timmen av infektion in det virala genomet i kärnan, där en beställda kaskad av viral genuttryck inträder i samordning med viral DNA (vDNA) replikering1. I kärnan, genomen omfattas av epigenetisk reglering, genomgå reparation och rekombination och paketeras till förhoppningsvis, så att de första avkomman-virioner produceras inom mindre än sex timmar. Omfattande utvärdering av virusgenom associerade proteiner i hela loppet av infektion kommer att lägga grunden för att undersöka de molekylära detaljerna av processer som agera på virala genomer, och kommer att ge en inblick i vilka viral och cellulära faktorer är involverade i olika stadier av infektionen.
Tidigare metoder för utredning av värd faktorer inblandade i viral infektion inkluderar affinitet rening av virala proteiner för analys av associerade cellproteiner2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. dessa analyser har varit avgörande för identifiering av cellulära faktorer som är inblandade i värd antivirala svar, liksom viral kromatin modifiering, genuttryck, och DNA reparation. Det är dock svårt att få klarhet i huruvida interaktioner beror på föreningen med vDNA och proteomik endast ge inblick i interaktioner som inträffar som en funktion av en specifik viral faktor. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) har använts för att identifiera där specifika viral och cellulära proteiner binder till virala genomer10,11,12,13,14 , 15 och fluorescerande in situ hybridisering (FISH) kombinerat med immuncytokemi har möjliggjort visualisering av cellulära faktorer som colocalize vDNA16,17,18, 19 , 20. dessa analyser att rumsliga och tidsmässiga analys. Dock inkluderar begränsningar behovet av mycket specifika antikroppar, begränsad känslighet och behovet av tidigare insikt virus värd-interaktioner. Vi har därför utvecklat en metod baserad på iPOND (isolering av proteiner på begynnande DNA)21 och aniPOND (accelererad infödda iPOND)22 att selektivt etikett och rena vDNA från infekterade celler för objektiv identifiering av virusgenom associerade proteiner av masspektrometri. iPOND har varit avgörande för utredning av cellulära replikering gaffel dynamics.
För selektiv rening av virala arvsmassan från infekterade celler, är replikera vDNA märkt med ethynyl modified nukleosider, 5-ethynyl-2´-deoxiuridin (EdU) eller 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (figur 1), följt av kovalent Konjugation till biotin natriumazid via Klicka på kemi för att underlätta enda steg rening av virala arvsmassan och associerade proteiner på streptividin-belagda pärlor (figur 2B). Ännu viktigare, utförs infektioner i stationära celler, som inte är engagerade i cellulär DNA-replikation att aktivera särskilda märkning av vDNA. Dessutom HSV-1 infektion orsakar cellcykelarrest och hämmar cellernas DNA replication23,24. Virus kan företiketterade innan infektion för analys av proteiner associerade med inkommande virala arvsmassan (figur 1A) eller märkt under DNA-replikation för analys av proteiner associerade med nyligen synthesized vDNA (figur 1B) 25. Dessutom puls chase analys kan användas för att undersöka arten av proteiner associerade med virusreplikation gafflar (figur 1 c)26. Dessutom kan ethynyl-modifierat vDNA vara kovalent konjugerad till en fluorophore för rumsliga utredning av protein dynamics (figur 2A och figur 3). Imaging möjliggör direkt visualisering av vDNA är en gratis strategi för validering av vDNA-protein interaktioner och kan anpassas för att spåra virala genomer i hela infektion. Vi räknar med att dessa metoder kan ändras ytterligare att studera någon aspekt av herpesviral infektion, inklusive latens och reaktivering, och att studera andra DNA-virus. Dessutom kan märkning med 5-ethynyl uridin (EU) möjliggöra för analys av RNA virala arvsmassan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cellkultur, virusinfektion och EdC märkning ( figur 1)
följande protokoll innebär att arbeta med virus. Hänvisas till din institution ' s biosäkerhet protokoll angående säker hantering av virus och andra biologiska agens. Detta protokoll godkändes av den institutionella Review Board vid University of Pittsburgh.
- Trypsinize en konfluenta 150 cm 2 vävnadsodling kolv med MRC-5 celler och överföra cellerna till en 600 cm 2 vävnadsodling platta som innehåller 100 mL DMEM plus 10% FBS. Inkubera vid 37 ° C i närvaro av 5% CO 2 för 3-4 dagar för att nå confluency och stationär fas. En konfluenta 600 cm 2 maträtt innehåller ~ 7 x 10 7 celler. Förbereda 1 för varje villkor och 1 plåt för varje motsvarande negativ kontroll.
Obs: Celler måste nå den stationära fasen för att hämma cellulär DNA-replikation för att säkerställa att endast vDNA är märkt och renas i efterföljande steg.
Obs: Varje prov kräver en gratis omärkt negativ kontroll tillagas med samma infektion villkor och tidpunkt utan tillsats av EdC.
Obs: A nedskalad version av detta experiment bör genomföras parallellt testa för märkning av cellulära DNA av bildåtergivning med jämförbara celltillväxt, infektion, EdC märkning villkor, och tidpunkter (se steg 2). - Späda 7 x 10 8 PFU HSV-1 i 7 mL kallt Tris-Buffered Saline (TBS). Ta bort odlingsmedium och förvara vid 37 ° C. Infektera, lägga till 7 mL utspädd viruset i MRC-5 celler och rock för 1 h i rumstemperatur. Följande adsorption, bort inokulum, skölj med 50 mL rumstemperatur TBS och ersätta den ursprungliga odlingsmedium. Inkubera vid 37 ° C i närvaro av 5% CO 2. Detta steg bör genomföras för varje experimentella villkor och negativ kontroll.
Obs: Ökad EdC märkning kan uppnås med HSV-1 mutanter defekt av uttryck för den virala dUTPase (UL50 genen) eller uracil glykosylas (UL2 gen). HSV-1 dUTPase har låg substrat specificitet och kan minska aktivering av flera nukleosid analoger 25 , 27. - Etikett virala genomer med EdC. Följ anvisningarna för att märka inkommande genomen (1.3.1.), replikera genomen (1.3.2.), eller virusreplikation gafflar (1.3.3.).
Obs: Endast steg 1.3.1, 1.3.2 eller 1.3.3 bör utföras beroende på om inkommande genomen, replikerade genomen eller replikering gafflar som ska analyseras i efterföljande steg, respektive.
Obs: EdU eller f-ara EdU kan ersättas med EdC. Toxiciteten hos nukleosidnaiva analoger bör kontrolleras och minimeras.- Användning företiketterade bestånd utföra infektion i steg 1.2 och gå vidare till steg 2 eller 3 inom 4 h post infektion (hpi) för att undersöka unreplicated vDNA ( figur 1A).
Obs: Förbered företiketterade virus bestånd med hjälp av de tidigare beskrivna protokollet 25. Viruslagren måste skickas via en G-25 kolumnen ta bort eventuella kvarvarande EdC. - Etikett replikerande vDNA genom att lägga till 5-25 µM EdC till cellodlingsmedium av infekterade celler för 2-4 h ( figur 1B). Innan du lägger, späd EdC i 1 mL odlingsmedium.
- Att märka virusreplikation gafflar, efter debuten av vDNA replikering (≥ 4 hpi), puls label replikera vDNA med 5-25 µM EdC för 5-20 min. För att jaga, skölj 3 x med chase medium som innehåller 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC), och sedan Inkubera i närvaro av chase medium för en ytterligare 20-40 min ( figur 1 c).
Obs: Puls och chase medium bör vara utjämnad till 37 ° C och 5% CO 2 före användning.
Obs: För puls chase experiment, det är viktigt att tänka på hur lång tid det tar för nukleosider ange cellen och vara fosforyleras innan de kan införlivas i replikera DNA. Detta måste fastställas empiriskt.
Obs: För att avgöra upplösningen av puls chase experiment, beräkna virusreplikation under de experimentella förhållanden användas. Detta kan bestämmas genom kvantitativa PCR av virala genomer under en enda steg tillväxt tid kurs 26.
Obs: För imaging virala genomer gå vidare till steg 2 och för rening av virala arvsmassan vidare till steg 3.
- Användning företiketterade bestånd utföra infektion i steg 1.2 och gå vidare till steg 2 eller 3 inom 4 h post infektion (hpi) för att undersöka unreplicated vDNA ( figur 1A).
2. Avbildning av EdC märkt DNA ( figur 2A)
Obs: det är användbart att utföra imaging i tandem med den virala genomet reningsmetod att verifiera att cellulärt DNA inte är märkt med experiment. Imaging kan också användas för att visualisera arten av märkta vDNA och validera proteomik data. Exempel på cellulär och virala DNA färgning mönster visas i figur 3.
- Utföra infektioner och EdC märkning som anges i steg 1 utom använda nedskalad villkor på coverslips i en 12-väl vävnadsodling maträtt innehållande 1 mL odlingsmedium.
- Fix celler med 1 mL 3,7% PARAFORMALDEHYD i 1 x PBS för 15 min på RT. Efter fixering, skölj celler 2 x med 1 mL 3% BSA i PBS.
Varning: PARAFORMALDEHYD kan orsaka allvarliga eller permanent skada. Följ säkerhetsföreskrifter.
Obs: Protokollet kan pausas här och coverslips kan lagras vid 4 ° C i andra tvätten för upp till 3 dagar. - Permeabilize celler med 1 mL permeabilisering buffert [se Tabell för material] under 20 minuter vid rumstemperatur medan rocking.
- Skölj med 1 mL 3% BSA och sedan block med 1 mL 3% BSA i PBS i 30 min i rumstemperatur medan rocking.
- Tillsätt 1 mL Klicka reaktionen cocktail [se Tabell för material] till coverslips till kovalent konjugat Alexa Fluor 488 natriumazid till EdC märkt DNA. Odla i rumstemperatur i 30 min medan gunga. Aspirera och skölj två gånger med 1 mL PBS.
- Fläcken cellulär DNA med 1 mL av en 1:2,000 utspädning av Hoechst i PBS för 30 min i rumstemperatur medan gunga. Aspirera och skölj två gånger med 1 mL PBS.
- Fläcken med primära och sekundära antikroppar enligt standard indirekt immunofluorescens protokoll 25.
Obs: Märkt vDNA colocalizes med ICP8, ICP4 eller UL42 och märkt cellulär DNA colocalizes med Hoechst fläck. - Montera coverslips på diabilder och bild celler med fluorescens Mikroskop.
Obs: Bilder kan lagras vid 4 ° C i flera veckor.
3. Rening av vDNA och associerade proteiner
Obs: flera aspekter av detta protokoll har anpassats från Leung et al. 22
Obs: alla buffertar och reagenser ska kylas på is före användning och alla åtgärder ska utföras på is om inget annat anges.
- Skörda atomkärnor.
Obs: Före isolering av atomkärnor, formaldehyd kan användas till crosslink proteiner till DNA. Strängare tvätta villkor kan sedan användas under DNA rening på streptividin-belagda pärlor. För crosslinking och tvätta villkor se Sirbu o.a. 21.- ersätta odlingsmedium med 20 mL atomkärnor utvinning buffert (NEB) och inkubera i 20 minuter vid 4 ° C med enstaka gunga. Atomkärnor blir synliga i Mikroskop.
- Skrapa kärnor från plattan med hjälp av en cell-skrapa och överför till en 50 mL konisk tub. Centrifugera i 10 min vid 2 500 x g vid 4 ° C till pellet atomkärnor, Kassera supernatanten.
Obs: Trypan blå färgning kan användas för att kontrollera isoleringen av kärnor från celler. - Försiktigt rubba den nukleära pelleten i 10 mL PBS, överföring till en 15 mL koniska rör, och pellet genom centrifugering för 10 min vid 2 500 x g vid 4 ° C. helt ta bort PBS.
Obs: Atomkärnor kan frysas och protokollet kan pausas vid denna punkt. Till gör så, försiktigt Återsuspendera nukleära pelleten i 500 µL frysning buffert och Inkubera röret i en etanol/torr isbad. Förvaras fryst kärnor vid-80 ° C. Före användning, Tina kärnor vid rumstemperatur, snabbt överföra till is, tillsätt 10 mL PBS, rock försiktigt för att blanda, pellet genom centrifugering för 10 min vid 2 500 x g vid 4 ° C, och helt ta bort PBS. Frysa atomkärnor kan resultera i minskad avkastning.
- Kovalent konjugat biotin-natriumazid till EdC märkt vDNA.
- Omsuspendera nukleära pelleten i 10 mL Klicka reaktion blanda [se Tabell för material] genom att försiktigt upp och ner med 5 gånger med en 10 mL Pipettera.
Obs: Det är viktigt att de reagens som ingår i klick reaktion blandningen läggs i angiven ordning. - Rotera för 1h vid 4 ° C. Samtidigt vrida förbereda och chill buffertar B1, B2 och B3 [se Tabell för material].
- Pellet atomkärnor genom centrifugering för 10 min vid 2 500 x g vid 4 ° C. helt ta bort Klicka reaktionsblandning och tvätta pelleten av försiktigt omblandning i 10 mL PBS och centrifugering i 10 min vid 2 500 x g vid 4 ° C.
- Blandas försiktigt den nukleära pelleten i 1 mL PBS och överföring till ett 1,5 mL mikrofugrör med ett stort genomlopp pipettspetsen. Pellet atomkärnor genom centrifugering för 10 min 2 500 x g vid 4 ° C. helt ta bort PBS och flash frysa i flytande kväve.
Obs: Protokollet kan pausas vid denna punkt och frysta atomkärnor kan förvaras vid-80 ° C. frysa Tina hjälper till med efterföljande Lys så det rekommenderas att atomkärnor att flash frozen även när vidare till steg 3.3 samma dag.
- Omsuspendera nukleära pelleten i 10 mL Klicka reaktion blanda [se Tabell för material] genom att försiktigt upp och ner med 5 gånger med en 10 mL Pipettera.
- Lyse kärnor och fragment DNA.
- Tina kärnor på is och återsuspendera i 500 µL buffert B1 genom pipettering upp och ner. Inkubera på is för 45 min.
- Sonicate prover 6 gånger för 30 s varje på 40% amplitud med en 3 mm microtip sond. Placera prover på is för 30 s mellan pulser. Efter ultraljudsbehandling, prover ska visas tydligt, inte grumlig.
Obs: Ultraljudsbehandling villkor bör optimeras för enskilda sonicators. För detaljerade instruktioner om hur du optimerar ultraljudsbehandling villkor avse Leung et al. 22. - pellet cellfragment genom centrifugering vid 14 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Pelleten storleken bör minska avsevärt. Filtrera supernatanten genom 100 µM cell sil och behålla flödet genom.
- Lägga till 500 µL buffert B2 till den filtrerade supernatanten. 900 µL av detta urval kommer att användas i steg 3.4.2.
- Ta en alikvot av varje villkor för DNA isolering (50 µL eller 1/20th volym) och tillsätt 50 µL 2 x SDS-bicarb lösning [se Tabell för material]. Gå vidare till protokollet för DNA-isolering (steg 3.6).
- Ta en alikvot av varje villkor för ingående protein (50 µL eller 1/20th volym) och tillsätt 50 µL 2 x Laemmli prov buffert, frysa i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C. användning i steg 3.5.6.
- Bind biotinylerade DNA till streptividin belagda pärlor.
- Förbereda streptividin T1 magnetiska pärlor genom att överföra 300 µL av pärla flytgödsel till ett 1,5 mL mikrofugrör. Förbereda en tub pärlor per prov. Tvätta pärlor 3 x med 1 mL buffert B2 genom vortexa att resuspendera, tillämpa en magnet för att separera pärlorna och aspirera tvättbuffert.
Obs: Optimerad bindande villkor resultera i maximerad avkastning och minimal bakgrund bindande. Det bestämdes experimentellt att Streptavidin T1 magnetiska pärlor har en betydligt större bindande kapacitet än agaros pärlor, liksom andra streptividin pärlor, och mindre bakgrund bindande än Streptavidin C1 pärlor ( figur 4A ). - Lägga till 900 µL prov från steg 3.3.4. tvättade pärlorna och rotera övernattning på 4 ° C.
Obs: Använd inte vortex pärlor när provet läggs till dem.
Obs: Om betydande mängder DNA eller protein isoleras i den omärkta negativa kontrollen, detta steg kan minskas från övernattning till 4 h att minska bakgrunden bindande.
- Förbereda streptividin T1 magnetiska pärlor genom att överföra 300 µL av pärla flytgödsel till ett 1,5 mL mikrofugrör. Förbereda en tub pärlor per prov. Tvätta pärlor 3 x med 1 mL buffert B2 genom vortexa att resuspendera, tillämpa en magnet för att separera pärlorna och aspirera tvättbuffert.
- Tvätta pärlor och eluera vDNA och associerade proteiner.
Obs: Det rekommenderas att använda filter tips för de återstående stegen.- Plats prover i en magnetisk microfuge tube rack, ta bort supernatanten, Återsuspendera försiktigt i 1 mL buffert B2, rotera vid 4 ° C i 5 min.
- Upprepa steg 3.5.1 tre gånger.
- Placera proverna i en magnetisk microfuge tube rack, ta bort supernatanten, försiktigt Återsuspendera i 1 mL buffert B3, och rotera vid 4 ° C i 5 min.
- Överföra 100 µL pärla blandning (1/10 th volym) till en ny tub för bundna DNA isolering. Gäller denna tube magneten, ta bort supernatanten, Återsuspendera pärlor i 100 µL 1 x SDS-bicarb lösning och gå vidare till protokollet för DNA-isolering (steg 3.6).
- Applicera röret som innehåller den återstående 900 µL pärla från steg 3.5.3. att magneten, ta bort supernatanten och återsuspendera pärlor i 50 µL 2 x Laemmli prov buffert till eluera protein och DNA-proteinkomplex.
- Koka prover vid 95 ° C i 15 min, vortex, snabbt snurra i microfuge, och använda magnet. Överföra eluatet till en ny tub, flash frysa och förvaras vid -80 ° C.
Obs: Använd cap lås så att rören inte gör pop öppna under kokningen.
Obs: Protokollet kan pausas vid denna punkt och prover kan lagras vid-80 ° C i flera veckor. - Analysera protein prover av Coomassie blå färgning, western blotting eller masspektrometri av standardprocedurer 25. Representativa resultat visas i figur 4 och figur 5.
Obs: För att avgöra om protein kapacitet är tillräcklig för masspektrometri, används 7,5 µL av varje prov för analys av Coomassie blå färgning och 7,5 µL för western blotting av en representativ virusgenom associerade protein (ICP4, ICP8 eller UL42). Samma volym av lysates från steg 3.3.6. körs tillsammans med kontroll för ingående proteinnivåer. Återstående provet (35 µL) analyseras sedan av mass spectrometry som beskrivs tidigare 25.
- DNA isolering
- Inkubera proverna från steg 3.3.5. och 3.5.4. vid 65 ° C i 4-16 h. ta bort prov från magnetiska pärlor, om nödvändigt.
- Extrahera prover med 150 µL fenol: kloroform: isopentanol (PCI) och överföra vattenfasen till en ny tub.
- Extrahera den återstående PCI med 100 µL Tris-EDTA (TE) och lägga till vattenfasen till en ny tub.
- Extrahera prover med 200 µL kloroform: isopentanol (24:1).
- Rena vattenfasen med hjälp av PCR-rening Kit enligt tillverkaren ' s protokollet.
Obs: pH indikatorn i buffert PB blir lila när den läggs till i urvalet. Lägga till 10 & #181. L 3M NaOAc pH 5.0 att sänka pH-värdet i provet. - Bestämma DNA-koncentration med hjälp av en fluorometer.
Obs: Detta protokoll ger vanligtvis 100-400 ng pärla-bundna DNA. Ingen DNA bör upptäckas i eluatet av den negativa kontrollen som EdC inte lades till i steg 1.3. - DNA kan lagras i en låg DNA-bindande röret vid 4 eller -20 ° C och kan användas för realtids-PCR eller hög genomströmning sekvensering analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användning av Klicka kemi för rening av DNA från celler var först fulländat vid den iPOND metod21. Syftet med iPOND är att rena cellulära replikering gafflar för identifiering av associerade proteiner. Vi har anpassat denna teknik för att specifikt studera vDNA proteininteraktioner under infektion. Manipulation av metoden att märka virala genomer med EdC (figur 1), kombinerat med synkroniserade infektioner, har möjliggjort för selektiv isolering och utredning av separata populationer av vDNA. HSV-1 DNA är märkt med EdC (figur 1) att underlätta kovalent fäste på en fluorophore för avbildning eller biotin för rening (figur 2). Virus kan vara företiketterade innan infektion för analys av proteiner associerade med inkommande genomen (figur 1A) eller märkt under DNA-replikation för analys av proteiner associerade med nyligen synthesized vDNA (figur 1B)25. Pulse chase analys kan dessutom användas för att undersöka arten av proteiner associerade med virusreplikation gafflar (figur 1 c)26. DNA kan visualiseras i celler att tillhandahålla geografisk information om naturen av den märkta DNA och stöd för identifierade vDNA-protein interaktioner (figur 3). Sammantaget möjliggör de protokoll som beskrivs här proteomiska utredningen av flera aspekter av produktiv infektion att ge insikt i dynamiska förändringar som sker på HSV-1 genomen. Dessa metoder kan anpassas ytterligare för att undersöka latens och reaktivering, att undersöka fenotyper som är associerad med viral mutanter och att studera andra DNA och RNA virus.
Aspekter av detta protein reningsmetod anpassades från Leung et al. 22. här en stor förbättring för rening av EdC märkt DNA är användningen av Streptavidin T1 pärlor istället för streptividin-belagda agaros pärlor. För att optimera DNA rening, testades flera typer av streptividin-belagda pärlor för ospecifik bindning när infektion genomfördes i avsaknad av EdC och för maximal protein återvinning i närvaro av EdC (figur 4A). För dessa experiment genomfördes western blotting för det vDNA bindande proteinet ICP4. Reningar som utförs på Streptavidin T1 pärlor resulterade i den minsta mängden bakgrund bindande i avsaknad av EdC och maximal protein återvinning i närvaro av EdC.
Proteiner som är associerad med vDNA kan identifieras genom proteomiska metoder inklusive western blotting och masspektrometri. Western blotting kan användas för att undersöka dynamiken i kända interaktioner och masspektrometri kan användas som en objektiv metod för att identifiera roman vDNA associerade proteiner. Ett exempel på protein direktavkastning som en funktion av ökande EdC märkning visas i figur 4B. Ett utstryk, snarare än ett tydligt banding mönster, observeras vanligtvis av Coomassie blå färgning. Detta är sannolikt eftersom det finns DNA i protein provet eller eftersom det finns ett överflöd av protein. Det är också viktigt att notera att koppar katalysatorn används i Klicka reaktionen kan orsaka delvis nedbrytning av proteiner och nukleinsyror28,29. Av western blotting upptäcks liknande halter av ICP4 vanligtvis i eluat (steg 3.5.5.) efter rening av vDNA som var märkt för 60 min med EdC som förekommer i samma mängd ingående prov beredd från nukleära lystates (steg 3.3.6.). Denna information kan användas som en guide för att avgöra om återhämtningen är tillräcklig för att skicka massa spektrometriska återstående analysprovet.
Nano vätskekromatografi med tandem masspektrometri (LC-MS/MS) kan utföras som tidigare beskrivits25 för att identifiera proteiner som är associerad med renat vDNA. LC-MS/MS data analyseras genom att jämföra spektrala count (SpC) värden mellan EdC-märkt experimentella provet och den motsvarande omärkta negativa kontrollen. Proteiner anses vara berikad i experimentella provet baserat på följande kriterier: (1) protein har minst 5 spektrala räknas (SpC) i experimentella provet, 2) protein identifieras inte i kontrollen eller är berikad över kontrollen av minst fyrfaldigt baserat på dividera värden, SpC och 3) proteinet är berikat över kontrollen i två eller flera biologiska replikat. Den normaliserade spektrala överflöd faktorn (NSAF: 
) kan användas för att ta hänsyn till skillnader i molekylvikt (MW) och totalt protein avkastning. Denna ekvation bestämmer det relativa överflödet av enskilda proteiner inom ett prov och tillåter för direkt jämförelse av två olika experimentella förhållanden där olika mängder vDNA renas (till exempel jämföra input virala arvsmassan ( Figur 1A) att replikeras genomen (figur 1B)).
I området i närheten finns det flera sätt att presentera protein anrikning data. Några exempel är cirkeldiagram, Venndiagram och protein interaktion nätverk. Cirkeldiagram kan användas för att illustrera andelen av proteiner identifierats som är kända att fungera i en specifik biologisk process (figur 5A). Problem kan dock uppstå när ett protein har mer än en biologisk funktion, vilket ofta är fallet. Det är också svårt att jämföra data mellan olika cirkeldiagram. Venn-diagram är användbara för att visa relationer mellan proteiner identifierats under olika experimentella förhållanden, men ger inte någon funktionell information om proteiner identifierats (figur 5B). Protein interaktion nätverk skildra en visuell illustration av potentiella interaktioner mellan identifierade proteiner och ger information om typerna av biologiska processer som är inblandade (figur 5 c). Flera online-resurser finns tillgängliga för mappning förutspådda protein-protein interaktioner inklusive sträng (sökverktyg för hämtning av interagerar gener/proteiner)30. Online-verktyg är i allmänhet utrustade att hantera proteomik data från en mängd olika arter och ge värdefull information om värd-proteinerna som är inblandade i virala genomet mekanik. Virusproteiner ingår dock generellt inte i databaser, vilket kan komplicera analysen. Det är därför viktigt att beakta de stora slutsatser som man skulle vilja förmedla när man beslutar hur man presenterar proteomik data.
Figur 1:Ong > förhållningssätt till etikett HSV-1 DNA. (A) till assay tillståndet för inkommande virus, vilar MRC-5 celler i G0 är smittade med företiketterade HSV-1 och arvsmassan är analyseras på mindre än 4 hpi att studera unreplicated virus-DNA. (B) till assay delstaten replikeras viruset, MRC-5 celler är infekterade med omärkt HSV-1 och EdC (orange stjärnor) läggs till odlingsmedium av infekterade celler och inkuberas i 2-4 h efter debuten av DNA virusreplikation (≥4 hpi). (C) till assay virusreplikation gafflar, infekterade celler är puls märkt med EdC för 5-20 min. replikering gafflar kan sedan jagas med deoxyC. EdC märkt DNA är orange. Denna siffra har ändrats från Dembowski och DeLuca25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Förfaranden som beskrivs i detta dokument för analys av EdC märkt DNA. (A), en disposition av metoden för imaging EdC märkt DNA. Tagged DNA representeras i grönt. (B) en beskrivning av metoden för rening och efterföljande analys av EdC märkt vDNA. Denna siffra har ändrats från Dembowski och DeLuca25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Visualisering av EdC märkt DNA. Cellerna var infekterad, märkt och avbildas som beskrivs i figur 1 och figur 2. Representativa bilder av märkt cellulära och virala DNA visas. Cellulär DNA colocalizes med Hoechst fläcken och vDNA med ICP4. Skalstapeln: 5 µm.This figur ändrades från Dembowski och DeLuca25 och Dembowski o.a. 26. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa protein rening resultat. (A) jämförelse av protein avkastning när reningssteg genomfördes med hjälp av flera olika typer av streptividin belagda pärlor. Infektion har genomförts i närvaro av EdC (+) att jämföra protein avkastning eller i avsaknad av EdC (-) att jämföra bakgrund bindande. Infektioner och EdC märkning genomfördes som beskrivs i figur 1B och DNA-proteinkomplex var renas enligt stegen i figur 2B använder jämförbara mängder av olika typer av streptividin belagda pärlor. Övre panelen: jämförelse av protein avkastningen efter rening på streptividin belagda agaros pärlor eller streptividin M-280. Nedre panelen: jämförelse av protein avkastning efter rening på streptividin M-270, M-280, streptividin C1 eller Streptavidin T1. Western blotting genomfördes med en antikropp mot viral proteinet ICP4. Renade ICP4 visas i den första lanen för jämförelse. Längre exponering av bottenpanelen var skyldig att iaktta en liknande intensitet av ICP4 Lanes ”280” som i den övre panelen. (B) representativa protein rening resultaten som en funktion av tiden av EdC märkning visas. Infektioner och EdC märkning genomfördes som beskrivs i figur 1B och DNA-proteinkomplex var renas enligt stegen i figur 2B använder Streptavidin T1 pärlor. EdC märkning utfördes för 0, 20, 40 eller 60 min och Coomassie blå färgning (överst) och western blotting (nederst) resultaten visas. Western blotting utfördes med specifika antikroppar för ICP4, UL42 eller GAPDH. Eluatet provet togs från steg 3.5.5. och lysat från steg 3.3.6. Pilen visar streptividin, medan L visar protein stege. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Exempel på olika sätt att presentera proteomik data. (A) cirkeldiagram sammanfatta proteiner som identifierades av masspektrometri av protein eluat associerade med virala genomer renas på 6 hpi. Värden indikerar antalet proteiner identifierats för varje funktionell kategori. T anger det totala antalet proteiner identifierats. Färgerna anger följande kategorier: lila - RNA processing, röd - transkription, grön - kromatin remodeling, orange - DNA-replikation, gul - nukleära transporter, kricka - cytoskelettet, mörkblå - HSV strukturella proteiner och grå - övrigt/okänd. (B) Venndiagram skildra överlappningen av proteiner identifierats som ska associeras med virala genomer på 6, 8 eller 12 hpi. (C), en sträng karta skildrar proteiner anrikade på virusreplikation gafflar efter en 5 min EdC puls. Mänskliga proteiner berikas av 5 gånger jämfört med den namnlösa negativa kontrollen visas i funktionell interaktion kartan, som genererades med sträng30 med inställningar för att visa endast högt förtroende interaktioner. Gen namn användes för att mappa interaktioner. Cirklarna visar proteiner som fungerar i samma biologiska process. Denna siffra ändrades från Dembowski och DeLuca25 och Dembowski o.a. 26. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll omfattar flera steg om inte följs noggrant, kan resultera i betydligt reducerad protein avkastning eller kontaminering med cellulär DNA. Det är viktigt att stationära celler används för alla experiment att cellulärt DNA är inte märkt och renas. Detta kan bekräftas genom avsaknad av cellulär DNA-polymerases i protein provet eftersom HSV-1 inte använda cellulär DNA-polymeras för genomet syntes. Under EdC märkning och atomkärnor skörd steg, fördelas prover för att säkerställa att alla behandlas lika. Under reningssteg försiktig inte att manipulera atomkärnor genom pipettering alltför. Detta kan leda till för tidig lys av atomkärnor, liksom prov förlust på grund av fast vid sidorna av Pipettera tips. Dessutom steget ultraljudsbehandling bör optimeras för enskilda sonicators och mängden streptividin-belagda pärlor används för biotin bindande bör titreras för optimal protein avkastning.
Flera ändringar kan göras till detta protokoll och inkluderar användning av olika virus eller celltyper eller tillägg av ett steg till crosslink protein till DNA. När du väljer en cell du vill använda för proteomiska utredning, är det viktigt att kontrollera tillgängligheten för en protein sequence databas för arten. Brist på proteomik resurser kommer att betydligt begränsa nedströms analys av protein data. En annan begränsning är behovet av ett stort antal celler, därför kan det vara svårt att förbereda tillräckligt primära celler, neuroner, för detta experiment. Denna metod bör vara kompatibel med andra DNA eller RNA virus så länge virusinfektion inte beror på cellulär DNA-replikation. Dessutom skulle det vara intressant att undersöka förändringar i DNA-protein interaktioner som inträffar i HSV-1 mutanter. En annan ändring i detta protokoll kan vara tillsats av ett formaldehyd crosslinking steg före isolering av kärnor, som skulle tillåta strängare tvätta villkor under rening21. Tillägg av formaldehyd påverkar inte förmågan att skörda kärnor men kan resultera i minskad protein avkastning på grund av difficultly backning antipyridinantikropp under protein eluering.
Resultaten från detta protokoll representerar den genomsnittliga delstaten virala DNA undersöks. Därför är det svårt att skilja om komplex är tillsammans på samma eller separata DNA-molekylerna. vDNA märkning metoderna som beskrivs här i kombination med hög upplösning imaging kan användas för att kontrollera proteomik data och kan hjälpa till att skilja mellan olika populationer av märkt DNA i en cell. ChIP-seq kan dessutom användas som en uppföljning metod för att identifiera specifika platser av proteiner på det virala genomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner Hannah Fox för hjälp i utarbetandet av detta manuskript. Detta arbete stöds av NIH bevilja R01AI030612.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
- Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
- Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
- Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
- Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
- Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
- Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
- Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
- Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
- Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
- Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
- Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
- Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
- Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
- Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
- Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
- Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
- Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
- Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
- Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
- Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
- Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
- Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
- Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
- Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
- Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
- Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).
