Summary
该协议的目的是专门标记和有选择地分离病毒 DNA 从受感染的细胞, 以表征病毒基因组相关的蛋白质。
Abstract
该协议的目的是分离单纯疱疹病毒1型 (HSV-1) DNA 从感染的细胞, 以确定相关的病毒和细胞蛋白的质谱。尽管与病毒基因组相互作用的蛋白质在决定感染的结果方面起着重要作用, 但对病毒基因组相关蛋白的综合分析在以前是不可行的。在这里, 我们演示了一种方法, 能够直接纯化 HSV-1 基因组从受感染的细胞。复制病毒 DNA 有选择性地用含有炔烃功能基团的修饰核苷酸标记。然后通过铜 (I)-催化叠氮化-炔烃加或单击反应, 通过生物素叠氮化物的共价键, 对标记的 DNA 进行具体和不可逆转的标记。生物素标记的 DNA 是纯化亲和包覆的珠子和相关的蛋白质是洗和鉴定的质谱。这种方法使 HSV-1 复制叉或整个基因组在复杂的生物环境中有选择的目标和隔离。此外, 这种方法的适应将允许调查 herpesviral 感染的各个方面, 以及检查其他 DNA 病毒的基因组。
Introduction
病毒具有执行基本功能的能力有限, 因此取决于宿主因素, 以促进感染的关键方面, 包括病毒基因表达、复制、修复、重组和运输。这些寄主因素的活动通常由病毒编码的蛋白质增强。此外, 病毒必须避免对病毒感染的细胞反应进行检测和干扰。因此, 病毒宿主交互决定感染的结果。最重要的是了解病毒如何改变细胞环境, 以适应细胞的机器, 以促进病毒的过程。特别感兴趣的是确定哪些因素和过程对病毒基因组在整个感染周期中的作用。
单纯疱疹病毒1型 (HSV-1) 是一种双链 DNA 病毒, 感染了相当一部分人的人口。在感染的第一个小时内, 病毒基因组进入细胞核, 病毒基因表达的有序级联随后与病毒 DNA (vDNA) 复制1进行协调。在细胞核中, 基因组受后生调节, 经过修复和重组, 并被包装成衣, 这样, 第一个子代病毒在不到六小时内生产。在整个感染过程中, 对病毒基因组相关蛋白的综合评价将为研究病毒基因组过程的分子细节打下基础, 并将提供对病毒和细胞因子的洞察参与感染的各个阶段。
以前的方法调查病毒感染的寄主因素包括亲和纯化病毒蛋白的相关细胞蛋白的分析2,3,4,5,6,7,8,9. 这些检测方法有助于识别宿主抗病毒应答中涉及的细胞因子, 以及病毒染色质修饰、基因表达和 DNA 修复。然而, 很难确定相互作用是否依赖于与 vDNA 的关联, 蛋白质组学只提供对作为特定病毒因素的功能而发生的相互作用的洞察。染色质沉淀 (芯片) 已被用来确定特定的病毒和细胞蛋白绑定到病毒基因组10,11,12,13,14, 15和荧光原位杂交 (fish) 结合免疫细胞化学技术, 使 colocalize 与 vDNA16,17,18的单元格因子的可视化19,20. 这些化验结果可以进行时空分析。然而, 限制包括对高度特异的抗体的需要, 有限的灵敏度, 以及对病毒宿主相互作用之前的洞察力的需要。因此, 我们开发了一种基于 iPOND (在新生的 DNA 上分离蛋白质)21和 aniPOND (加速本机 iPOND)22的方法, 以有选择地标记和纯化感染细胞的 vDNA, 以无偏见地识别病毒基因组。相关蛋白的质谱。iPOND 对细胞复制叉动力学的研究起到了很重要的作用。
对于被感染细胞的病毒基因组的选择性纯化, 复制 vDNA 被标记为乙炔修饰的苷、5-乙炔-2´-脱氧 (教育) 或 5-乙炔-2´-脱氧 () (图 1), 其次是共价键结合到生物素叠氮化通过点击化学促进单步纯化病毒基因组和相关蛋白的亲和涂层珠子 (图 2B)。重要的是, 感染是在固定细胞中进行的, 它们不从事细胞 DNA 复制, 从而能够对 vDNA 进行特定的标记。此外, HSV-1 感染导致细胞周期阻滞和抑制细胞 DNA 复制23,24。病毒可在感染前 prelabeled, 用于分析与传入病毒基因组相关的蛋白质 (图 1A), 或在 DNA 复制过程中标记, 用于分析与新合成的 vDNA 相关的蛋白质 (图 1B)25. 此外, 脉冲追踪分析可用于研究与病毒复制叉 (图 1C)26相关的蛋白质的性质。此外, 乙炔修饰的 vDNA 可以共价键共轭到一个荧光的空间研究蛋白质动力学 (图 2A和图 3)。成像允许直接可视化的 vDNA, 是一个免费的方法来验证 vDNA-蛋白质相互作用, 并可以适应跟踪病毒基因组在整个感染。我们预计, 这些方法可以进一步修改, 以研究任何方面的 herpesviral 感染, 包括潜伏期和重新激活, 并研究其他 DNA 病毒。此外, 用 5-乙炔苷 (EU) 进行标记可以分析 RNA 病毒基因组。
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Protocol
1. 细胞培养、病毒感染和标记 ( 图 1 )
以下协议涉及使用病毒。有关安全处理病毒和其他生物制剂的问题, 请参阅您的机构和 #39 的生物安全协议。该议定书得到了匹兹堡大学机构审查委员会的批准.
- 处理一个汇合的 150 cm 2 组织培养 MRC-5 细胞的烧瓶, 并将细胞转移到 600 cm 2 组织培养板中, 其中含有100毫升 DMEM 加 10% FBS。孵育在37和 #176; C 在 5% CO 2 的存在下, 3-4 天到达70-100 和固定相。汇合的 600 cm 2 盘包含 ~ 7 x 10 7 单元格。为每个条件准备1板和1板为每个对应的阴性控制.
注意: 细胞必须到达固定阶段, 以抑制细胞 DNA 复制, 以确保只有 vDNA 在后续步骤中标记和纯化.
注: 每个样品都需要使用相同的感染条件和时间点, 而无需添加附加的无标记阴性对照.
注: 本实验的缩小版应串联进行, 以通过可比细胞生长、感染、标记条件和时间点的成像来测试细胞 DNA 的标记 (参见步骤 2). - 稀释 7 x 10 8 PFU HSV-1 在7毫升冷三缓冲盐水 (TBS)。37、#176 中移除培养基及贮存;为了感染, 在室温下将7毫升稀释的病毒添加到 MRC-5 细胞和岩石中1小时。吸附后, 去除接种, 用50毫升室温 TBS 冲洗, 取代原生长培养基。在 5% CO 2 的存在下孵育37和 #176; C。这一步应进行的每一个实验条件和负控制.
注: 使用 HSV-1 突变体的病毒 dUTPase (UL50 基因) 和/或嘧啶 glycosylase (UL2 基因) 的表达有缺陷, 可获得增加的氯乙烷标记。HSV-1 dUTPase 具有较低的基底特异性, 可减少几种核苷类似物的活化 25 , 27 。 - 标签的病毒基因组。按照指示来标记传入的基因组 (1.3.1), 复制基因组 (1.3.2), 或病毒复制叉 (1.3.3).
注意: 根据传入的基因组、复制的基因组或复制叉是否要分别在后续步骤中进行分析, 只能执行步骤1.3.1、1.3.2 或 1.3.3.
注: 可替代教育和教育。核苷类似物的毒性应加以监测和尽量减少。- 使用 prelabeled 库存在步骤1.2 中进行感染, 并在 4 h 后感染 (hpi) 内进行步骤2或 3, 以调查复制 vDNA ( 图 1A ).
注意: 使用前面描述的协议 25 准备 prelabeled 病毒储存。病毒储存必须通过一个 G-25 的专栏, 以消除任何残余的氯乙烷. - 标签复制 vDNA 通过添加 5-25 和 #181; M 对细胞培养培养基的感染细胞为 2-4 h ( 图 1B )。加入前, 稀释1毫升的生长培养基.
- 对病毒复制叉进行标记, 在 vDNA 复制 (#8805; 4 hpi) 后, 用 5-25 和 #181 复制 vDNA 的脉冲标签; M. 5-20 分钟追逐, 冲洗3x 与追逐媒介包含 25-100 和 #181; M 2 和 #180;d eoxycytidine (deoxyC), 然后孵育在追逐媒介面前为另外 20-40 min ( 图 1C ).
注: 脉冲和大通介质应平衡到37和 #176; C 和 5% CO 2 , 然后使用.
注意: 对于脉冲追逐实验, 重要的是要考虑到苷进入细胞和磷酸化前所需的时间, 才能将其纳入复制 DNA。这必须是经验主义地确定的.
注: 要确定脉冲追逐实验的分辨率, 在实验条件下计算病毒复制率。这可以通过定量 PCR 的病毒基因组在单步生长时间课程 26 .
注: 对于影像病毒基因组进行步骤2和纯化病毒基因组进行步骤 3.
- 使用 prelabeled 库存在步骤1.2 中进行感染, 并在 4 h 后感染 (hpi) 内进行步骤2或 3, 以调查复制 vDNA ( 图 1A ).
2。标记 DNA 的图像 ( 图 2A )
注意: 在与病毒基因组纯化方法同时进行成像, 以验证细胞 DNA 在实验中没有标记是有用的。成像也可以用来可视化的性质, 标记 vDNA 和验证蛋白质组数据。细胞和病毒 DNA 染色模式的例子如 图 3 所示.
- 执行步骤1中所示的感染和片标记, 但在包含1毫升生长培养基的12良好组织培养皿中使用缩放条件时除外.
- 在 RT 1x PBS 中, 用1毫升3.7% 甲醛固定电池15分钟。在固定后, 冲洗细胞2x 与1毫升 3% BSA 在 PBS.
警告: 甲醛可能导致严重或永久性的伤害。遵循安全防范措施.
注意: 协议可以在这里暂停, 片可以存储在4和 #176; C 在第二次洗涤3天. - 带 1 mL 性缓冲区的 Permeabilize 单元格 (请参见 材料表 ] 在摇晃时室温下为20分钟.
- 用1毫升 3% bsa 冲洗, 然后在 PBS 中用1毫升 3% bsa 在室温下以30分钟的温度进行清洗.
- 添加1毫升的点击反应鸡尾酒 [见 材料的表 ] 片到共价键共轭 Alexa 的488叠氮化物的标记 DNA。在室温下孵育30分钟的摇摆。用1毫升的 PBS 吸气和冲洗两次.
- 染色细胞 DNA 1 毫升 1:2, 000 稀释赫斯特在 PBS 为30分钟的室温, 而摇摆。用1毫升的 PBS 吸气和冲洗两次.
- 根据标准的间接免疫荧光协议对主要和次要抗体进行染色 25 .
注: 标记 vDNA colocalizes 与 ICP8, ICP4, 或 UL42 和标记细胞 DNA colocalizes 与赫斯特染色. - 使用荧光显微镜在幻灯片和图像单元上安装片.
注: 幻灯片可以存储在4和 #176; C 几个星期.
3。vDNA 及其相关蛋白的纯化
注意: 此协议的几个方面已从梁 et al. 中进行了改编 22
注意: 所有的缓冲器和试剂在使用前应冷藏在冰上, 除非另有说明, 所有步骤应在冰上进行.
- 收获核.
注: 在细胞核分离之前, 甲醛可用于将蛋白质与 DNA 交联。更严格的洗涤条件, 然后可以使用在 DNA 纯化的亲和涂层珠。crosslinking 和洗涤条件请参见 Sirbu et al. 21 .- 用20毫升核提取缓冲剂 (纳布) 取代生长培养基, 在4和 #176 中孵育20分钟; C. 偶尔摇摆。在显微镜下, 原子核会变得可见.
- 用刮板机将细胞核从板材上刮起, 转移到50毫升锥形管上。离心机10分钟在 2500 x g 在4和 #176; C 对颗粒核, 丢弃上清.
注意: 台盼蓝染色可用于验证细胞核与细胞的分离. - 在10毫升 pbs 中轻轻地将核小球取出, 转移到15毫升的锥形管, 并在4和 #176 上用离心10分钟, 在 2500 x g 处进行颗粒的移动; c. 完全删除 pbs.
注意: 原子核可以被冻结, 在这一点上可以暂停协议。要做到这一点, 轻轻地重500和 #181 的核颗粒; 冻结缓冲液, 在乙醇/干冰浴中孵育试管。将冷冻核储存在-80 和 #176;在使用前, 在室温下解冻细胞核, 迅速转移到冰上, 加入10毫升 pbs, 轻轻地混合, 在4和 #176 ° C 的 2500 x g 处进行离心10分钟的颗粒, 并完全去除 pbs。冷冻核可能导致产量下降.
- 共价共轭生物素-叠氮化为标记为 vDNA.
- 重在10毫升单击反应混合中的核颗粒 (参见 材料表 ), 用10毫升吸管轻轻移上下5次.
注意: 重要的是, 包括在点击反应混合的试剂被添加在指定的顺序. - 4 #176 旋转1h ° C。当旋转准备和冷却缓冲 B1, B2 和 B3 [请参阅 材料表 ].
- 球团核由离心为10分钟, 在 2500 x g 在4和 #176; c. 完全删除单击反应混合, 并通过轻轻溶液10毫升 PBS 和离心10分钟 2500 x g 在4和 #176, 清洗颗粒; c.
- 轻轻地重1毫升 PBS 中的核颗粒, 并使用大口径吸管尖端转移到1.5 毫升离心管。球团核由离心10分钟在 2500 x g 在4和 #176; c. 完全去除液态氮中的 PBS 和闪光冷冻.
注意: 该协议可以在这一点上暂停, 冻结的原子核可以储存在-80 和 #176; c. 冻结解冻有助于随后的裂解, 因此建议, 即使在同一天进行步骤 3.3, 核也被冻结.
- 重在10毫升单击反应混合中的核颗粒 (参见 材料表 ), 用10毫升吸管轻轻移上下5次.
- 溶解核和片段 DNA.
- 将500和 #181 的冰和重中的原子核解冻; 移向上和向下缓冲 B1。在冰上孵育45分钟.
- 几种样本的6倍, 三十年代每40% 振幅使用3毫米 mircotip 探头。在冰上放置样品三十年代在脉冲之间。超声后, 样品应清晰显示, 不浑浊.
注: 超声条件应针对个人 sonicators 进行优化。有关如何优化超声条件的详细说明, 请参阅梁 et al. 22 . - 颗粒细胞碎片的离心在 1.4万 x g 处为10分钟, 在4和 #176;颗粒大小应大幅度降低。过滤上清, 通过100和 #181; M 细胞过滤器, 并保持流经.
- 添加500和 #181; 对过滤后的上清液进行缓冲 B2. 900 和 #181; 此示例中的 l 将在步骤3.4.2 中使用.
- 分对每个条件进行 DNA 隔离 (50 和 #181; l 或 1/第二十卷) 并添加50和 #181; l 2x SDS-盐解决方案 [请参见 材料表 ]。继续执行 DNA 隔离协议 (步骤 3.6).
- 对输入蛋白质 (50 和 #181; l 或 1/第二十卷) 的每个条件进行分, 并添加50和 #181; l 2x Laemmli 样品缓冲液, 在液氮中冷冻, 在-80 和 #176 中贮存; c. 在步骤3.5.6 中使用.
- 将化的 DNA 绑定到亲和涂层的珠子.
- 通过转移300和 #181 的亲和 T1 磁珠; 在1.5 毫升离心管上进行珠浆的 L。每样都准备一管珠子。洗涤珠3x 与1毫升缓冲 B2 由涡流到重, 应用磁铁分离的珠子, 并吸取洗涤缓冲区.
注意: 优化的绑定条件导致最大收益率和最小背景绑定。实验证明, 亲和 T1 磁珠具有比琼脂糖珠更大的结合能力, 以及其他亲和珠, 比亲和 C1 珠更少的背景绑定 ( 图4A). - 添加900和 #181; 从步骤3.3.4 中抽取样品 L. 到被洗涤的珠子和隔夜在4和 #176 转动; C.
注: 在添加样品后不要涡流珠.
注意: 如果在未标记的负控制中分离出大量的 DNA 或蛋白质, 这一步可以从一夜之间减少到 4 h, 以减少背景绑定.
- 通过转移300和 #181 的亲和 T1 磁珠; 在1.5 毫升离心管上进行珠浆的 L。每样都准备一管珠子。洗涤珠3x 与1毫升缓冲 B2 由涡流到重, 应用磁铁分离的珠子, 并吸取洗涤缓冲区.
- 洗涤珠子和洗 vDNA 及相关蛋白.
注意: 建议对其余步骤使用筛选提示。- 将样品放入磁性离心管机架中, 取出上清, 在1毫升缓冲 B2 中轻轻重, 在4和 #176 旋转; C 为 5 min.
- 重复步骤3.5.1 三次.
- 将样品放入磁性离心管机架中, 取出上清, 在1毫升缓冲 B3 中轻轻重, 并在4和 #176 旋转; C 5 min.
- 传输100和 #181; L 珠混合物 (1/10 th 容量) 到一个新的管子为束缚的脱氧核糖核酸隔离。将此管应用于磁体, 取出上清, 重100和 #181 中的珠子; L 1x SDS-盐溶液, 并进行 DNA 隔离协议 (步骤 3.6).
- 应用包含剩余900和 #181 的管状物; 从台阶3.5.3 的珠混合物. 到磁铁, 去除上清, 和重珠在50和 #181; l 2x Laemmli 样品缓冲液洗蛋白和 DNA 蛋白复合物.
- 在95和 #176 中煮沸样品; C 为15分钟, 涡流, 快速旋转在离心, 并应用磁铁。将洗转换为新的管, 闪存冻结, 并存储在-80 和 #176; C.
注: 使用瓶盖锁, 以确保管不弹出开放, 而沸腾.
注意: 此时可以暂停协议, 并且可以将示例存储在-80 和 #176; C 数周. - 通过标准程序对马斯亮蓝染色、西方印迹或质谱法分析蛋白质样品 25 。代表性结果如 图 4 和 图 5 所示。 注: 为了确定蛋白质的产量是否足够的质谱, 7.5 和 #181; 每个样本的 l 用于分析马斯亮蓝染色和7.5 和 #181; l 为西方印迹的一个代表性的病毒基因组相关蛋白 (ICP4, ICP8, 或 UL42)。同一体积的裂解从步骤3.3.6。在控制输入蛋白质水平的同时运行。剩下的样品 (35 和 #181; L) 然后通过质谱法分析, 如前面所描述的 25 .
- DNA 隔离
- 将示例从步骤3.3.5 和3.5.4 中孵化. 在65和 #176; C 为 4-16 h. 从磁性珠子中取出样品, 如有必要.
- 用150和 #181 提取样品; L phenol:chloroform:isoamyl 酒精 (PCI), 并将水相转移到一个新的管.
- 用100和 #181 提取剩余的 PCI; 三 EDTA (TE), 并将水相添加到新的管中.
- 抽取200和 #181 的样品; L 氯仿: 异戊醇 (24:1).
- 根据制造商和 #39 的协议, 使用 PCR 纯化试剂盒净化水相.
注: 当添加到样品中时, 缓冲铅中的 pH 值会变紫。添加 10 & #181;L 3M NaOAc ph 值 5.0, 以降低样品的 ph 值. - 使用荧光确定 DNA 浓度.
注: 本协议通常产生 100-400 ng 珠绑定的 DNA。在1.3 步中未添加洗的负控制中, 不应检测到任何 DNA. - dna 可以储存在低 dna 结合管4或-20 和 #176; C, 可用于 real-time PCR 或高通量测序分析.
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Representative Results
使用单击化学从细胞纯化 DNA 首先是通过 iPOND 方法21完成的。iPOND 的目的是纯化细胞复制叉, 用于鉴定相关的蛋白质。我们已经适应了这一技术, 专门研究 vDNA 蛋白相互作用期间感染。使用 vDNA 标记病毒基因组的方法 (图 1) 和同步感染的操作, 允许选择性地隔离和调查不同的种群。HSV-1 DNA 被贴上 (图 1), 以促进荧光的共价附着, 以进行成像或生物素的纯化 (图 2)。病毒可在感染前 prelabeled, 用于分析与传入基因组相关的蛋白质 (图 1A), 或在 DNA 复制过程中标记, 用于分析与新合成的 vDNA (图 1B)25相关的蛋白质。此外, 脉冲追踪分析可用于研究与病毒复制叉 (图 1C)26相关的蛋白质的性质。dna 可以在细胞内可视化, 提供有关标记的 dna 的性质的空间信息, 并支持确定的 vDNA-蛋白质相互作用 (图 3)。综合起来, 这里所描述的协议允许对生产性感染的多个方面进行蛋白质组研究, 以提供对 HSV-1 染色体上发生的动态变化的洞察力。这些方法可以进一步调整, 以调查潜伏期和重新激活, 检查与病毒突变体相关的表型, 并研究其他 DNA 和 RNA 病毒。
这一蛋白纯化方法的各个方面都是由梁et al所改编的。22. 在这里一个主要的改进, 以净化的标记 DNA 是使用亲和 T1 珠, 而不是亲和涂层琼脂糖珠。为了优化 DNA 纯化, 在无氯亲和的情况下进行感染时进行了几种非特异性结合的检测, 并在存在的情况下进行最大的蛋白质恢复 (图 4A)。在这些实验中, 对 vDNA 结合蛋白 ICP4 进行了印迹。净化对亲和 T1 珠进行了最小的背景结合, 在缺乏的情况下和最大的蛋白质恢复在存在的。
与 vDNA 相关的蛋白质可以通过蛋白质组学方法识别, 包括印迹和质谱。西方印迹可以用来研究已知的相互作用的动力学和质谱可以作为一种无偏见的方法来识别新的 vDNA 相关蛋白。在图 4B中显示了一个以蛋白质收率为增加的功能的例子。涂片, 而不是一个明确的带状图案, 通常是通过马斯亮蓝染色观察。这可能是因为蛋白质样本中存在 DNA, 或者是因为有丰富的蛋白质。同样重要的是要注意, 在点击反应中使用的铜催化剂会导致蛋白质和核酸的部分降解28,29。由西方印迹, 类似水平的 ICP4 通常检测在溶 (步骤 3.5.5.) 后, vDNA 被标记为60分钟, 在相同数量的输入样品准备从核 lystates (步骤3.3.6。此信息可用作指南, 以确定恢复是否足以发送剩余样品进行质谱分析。
用串联质谱联用的纳米液相色谱 (LC-ms) 可以像以前描述的那样进行25来识别与纯化 vDNA 相关的蛋白质。通过对比实验样本与相应的无标记负控制之间的频谱计数 (SpC) 值, 对 LC-ms/毫秒数据进行了分析。根据以下标准, 在实验样品中, 蛋白质被认为是富集的: 1) 蛋白质在实验样品中至少有5光谱计数 (SpC), 2) 蛋白质在控制中没有被检测到或被丰富超过控制至少四倍基于除以 SpC 值和 3), 蛋白质在两个或多个生物复制的控制中被丰富。归一化谱丰度因子 (NSAF:) 可用于计算分子量 (兆瓦) 和总蛋白产量的差异. 
这个方程式决定了样本中单个蛋白质的相对丰度, 并允许对不同数量的 vDNA 纯化的两种不同实验条件进行直接比较 (例如, 比较输入的病毒基因组 (图 1A)复制的基因组 (图 1B))。
有多种方法来呈现蛋白质浓缩数据。一些例子包括饼图、维恩图和蛋白质相互作用网络。饼图可以用来说明已知的蛋白质在特定生物过程中所占的比例 (图 5A)。然而, 当一个蛋白质有一个以上的生物功能时, 就会出现问题, 这是常有的情况。在不同的饼图之间比较数据也很困难。维恩图有助于证明在不同实验条件下确定的蛋白质之间的关系, 但不提供有关所确定的蛋白质的任何功能信息 (图 5B)。蛋白质相互作用网络描绘了识别蛋白质之间潜在相互作用的直观例证, 并提供有关所涉及的生物过程类型的信息 (图 5C)。一些在线资源可用于映射预测的蛋白质-蛋白质相互作用, 包括字符串 (搜索工具, 用于检索相互作用的基因/蛋白质)30。在线工具通常可以处理来自不同物种的蛋白质组数据, 并提供有关病毒基因组力学中的宿主蛋白的宝贵信息。然而, 病毒蛋白一般不包括在数据库中, 这会使分析复杂化。因此, 在决定如何提供蛋白质组数据时, 重要的是要考虑一个主要的结论。
图 1:标记 HSV-1 DNA 的方法(A) 要分析传入病毒的状态, 在 G0中休眠的 MRC-5 细胞感染了 prelabeled HSV-1, 并且基因组在不到 4 hpi 的情况下检测复制病毒 DNA。(B) 要检测复制病毒的状态, MRC-5 细胞感染了未标记的 HSV-1, 并在病毒 DNA 复制 (4 hpi) 开始后, 在感染细胞的生长培养基中添加了 2-4 小时的橙星。(C) 要检测病毒复制叉, 感染的细胞被标记为5-20 分钟的脉冲. 复制叉可以用 deoxyC 来追赶。标记的 DNA 是橙色的。此图已从 Dembowski 和德鲁卡25中修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:本文中描述的过程用于分析标记的 DNA.(A) 对标记为 DNA 的成像方法的概述。标记的 DNA 以绿色表示。(B) vDNA 的纯化和下游分析方法概述。此图已从 Dembowski 和德鲁卡25中修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3:标记 DNA 的可视化.如图 1和 图 2所述, 单元格被感染、标记和成像。显示了标记的细胞和病毒 DNA 的代表性图像。细胞 DNA colocalizes 与赫斯特染色, vDNA 与 ICP4。比例栏: 5 µm. 此图是从 Dembowski 和德鲁卡25和 Dembowski et al.中修改的26.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 具有代表性的蛋白质纯化结果.(A) 通过使用几种不同类型的亲和包覆珠来进行纯化步骤的蛋白质产量比较。感染是在 (+) 存在的情况下进行比较蛋白质产量或在缺乏 (-) 比较背景结合。在图 1B中进行了感染和标记, 并按照图 2B中所述的步骤纯化了 DNA 蛋白复合物, 使用了可比较的不同类型的亲和包覆珠。顶部: 在亲和涂层琼脂糖珠或亲和 M-280 纯化后蛋白质收率的比较。底板: 亲和 M-270、M-280、亲和 C1 或亲和 T1 纯化后蛋白质收率的比较。用抗病毒蛋白 ICP4 的抗体进行了印迹。纯化 ICP4 显示在第一车道的比较。更长的暴露在底部板被要求观察相似的强度 ICP4 在车道 "280" 和在顶面小组。(B) 有代表性的蛋白质纯化结果作为一个时间的功能, 在标记的标签显示。在图 1B中进行了感染和标记, 并按照图 2B中概述的步骤使用亲和 T1 珠子纯化了 DNA 蛋白复合物。对0、20、40、60 min 和马斯亮蓝染色 (上) 和西印迹 (底) 的结果进行了标记。ICP4、UL42 或 GAPDH 特异抗体进行了印迹。洗样品取自步3.5.5。和从台阶3.3.6 的裂解液。箭头表示亲和, 而 L 表示蛋白质阶梯。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5:用于显示蛋白质组数据的不同方法的示例.(A) 饼图概述了由 6 hpi 纯化的与病毒基因组相关的蛋白质溶的质谱鉴定的蛋白质。值表示为每个功能类别确定的蛋白质数量。T 表示确定的蛋白质总数。颜色表示以下类别: 紫色 RNA 处理, 红色转录, 绿色染色质重构, 橙色脱氧核糖核酸复制, 黄色核运输, 蓝绿色细胞骨架, 深蓝色 HSV 结构蛋白质和灰色-其他/未知数。(B) 维恩图描述了在6、8或 12 hpi 中发现的与病毒基因组相关的蛋白质重叠。(C) 字符串映射描述了在5分钟脉冲后病毒复制叉上丰富的蛋白质。与未标记的阴性对照相比, 富含5倍的人类蛋白质在功能交互图中显示, 它是使用字符串30生成的, 数据设置仅显示高可信度交互。基因名称被用来映射相互作用。圆圈表示在同一生物过程中起作用的蛋白质。此图是从 Dembowski 和德鲁卡25和 Dembowski et al.中修改的26.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
该协议包括多个步骤, 如果不小心, 可能会导致蛋白质的产量和细胞 DNA 的污染显著降低。至关重要的是, 固定细胞用于所有的实验, 以确保细胞 DNA 没有标记和纯化。这可以证实, 由于缺乏细胞 dna 聚合在蛋白质样本, 因为 HSV-1 不利用细胞 dna 聚合酶的基因组合成。在标记和核收获步骤期间, 样品应错开, 以确保每一个处理平等。在纯化步骤中, 应注意不要过度移地操纵细胞核。这可能导致过早的原子核裂解, 以及由于黏附在吸管尖端的两侧而造成的样品损失。此外, 超声步骤应优化的个别 sonicators 和亲和涂层珠的数量, 用于生物素结合应滴定最佳的蛋白质产量。
可以对该协议进行若干修改, 包括使用不同的病毒或细胞类型, 或者添加一个步骤, 将蛋白质与 DNA 交联。在选择用于蛋白质组研究的细胞类型时, 检查该物种的蛋白质序列数据库的可用性是很重要的。蛋白质组学资源的缺乏将会极大地限制蛋白数据的下游分析。另一个限制是需要大量的细胞, 因此它可能很难准备足够的初级细胞, 如神经元, 为这个实验。只要病毒感染不依赖于细胞 dna 复制, 这种方法应该与其他 dna 或 RNA 病毒相容。此外, 研究在 HSV-1 突变体中发生的 DNA-蛋白质相互作用的变化是很有趣的。对该协议的另一个修改可能是在分离细胞核之前加入甲醛交联步骤, 这将使净化过程中的洗涤条件更严格21。在蛋白质洗脱过程中, 由于难以逆转通道, 甲醛的加入不会影响细胞核的收获能力, 但可能导致蛋白质产量降低。
该协议的结果代表了病毒 DNA 被检查的平均状态。因此, 很难区分复合物是在同一或单独的 DNA 分子。在这里描述的 vDNA 标记方法结合高分辨率成像可以用来验证蛋白质组数据, 并可能有助于区分不同群体的标记 DNA 在一个细胞。此外, 芯片序列可作为后续的方法, 以确定特定位置的蛋白质在病毒基因组。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢汉娜在准备这份手稿方面的帮助。这项工作得到了 NIH 补助金 R01AI030612 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
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