Summary
Le but du présent protocole est de marquer spécifiquement et sélectivement isoler l’ADN virale des cellules infectées pour la caractérisation des protéines de génome viral lié.
Abstract
Le but du présent protocole est d’isoler le virus de l’herpès simplex type 1 (HSV-1) ADN provenant de cellules infectées pour l’identification des associés virale et cellulaires protéines par spectrométrie de masse. Bien que les protéines qui interagissent avec les génomes viraux jouent un rôle important en déterminant les résultats de l’infection, une analyse complète des protéines de génome viral lié n’était pas précédemment possible. Nous démontrons une méthode qui permet la purification directe de HSV-1 génomes de cellules infectées. Réplication de l’ADN viral est sélectivement marquée avec des nucléotides modifiés contenant un groupe fonctionnel d’alcyne. DNA marqué est ensuite plus précisément et de manière irréversible tag via la fixation covalente d’azoture de biotine par l’intermédiaire de cuivre (I)-réaction de cycloaddition ou clic azoture-alcyne catalysée par. Biotine-tag ADN est purifiée sur perles streptavidine et protéines associées sont éluées et identifiés par spectrométrie de masse. Cette méthode permet le ciblage sélectif et l’isolement des fourches de réplication de HSV-1 ou des génomes entiers de milieux biologiques complexes. Par ailleurs, l’adaptation de cette approche permettra d’enquête sur les divers aspects de l’infection baculoviraux, ainsi que l’examen des génomes d’autres virus à ADN.
Introduction
Les virus ont une capacité limitée à remplir les fonctions essentielles et dépendent donc de facteurs de l’hôte pour faciliter les aspects critiques de l’infection, y compris le transport, la réplication, réparation, recombinaison et expression des gènes viraux. Les activités de ces facteurs de l’hôte sont souvent complétées par protéines virale. En outre, virus doivent éviter de détection et brouillage de la réponse cellulaire à l’infection virale. Par conséquent, interactions hôte virus dictent l’issue de l’infection. D’une importance primordiale est de comprendre comment les virus modifient l’environnement cellulaire afin d’adapter la machinerie cellulaire pour faciliter les processus viraux. Particulièrement intéressant est d’identifier quels facteurs et processus, agissent sur les génomes viraux durant tout le cycle infectieux.
Le virus de l’herpès simplex type 1 (HSV-1) est qu'un double stranded DNA virus qui infecte une proportion importante de la population humaine. Dans la première heure de l’infection, le génome viral pénètre dans le noyau, où une cascade ordonnée de l’expression des gènes viraux s’ensuit en coordination avec virale de réplication de l’ADN (vDNA)1. Dans le noyau, génomes sont soumis à régulation épigénétique, subir une réparation et recombinaison et sont emballés dans des capsides, telle que les virions de descendance premiers sont produites au sein de moins de six heures. L’évaluation complète des protéines de génome viral associé tout au long de l’évolution de l’infection jettera les bases pour étudier les détails moléculaires des processus qui agissent sur les génomes viraux et permettent de mieux comprendre quels facteurs viraux et cellulaires participent à divers stades de l’infection.
Les méthodes précédentes pour l’étude des facteurs impliqués dans l’infection virale de l’hôte incluent purification d’affinité des protéines virales pour l’analyse des protéines cellulaires associées2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. ces tests ont joué pour l’identification des facteurs cellulaires impliqués dans les réponses antivirales de l’hôte, mais aussi modification de la chromatine virale, l’expression des gènes, et réparation de l’ADN. Toutefois, il est difficile de vérifier si les interactions dépendent de la liaison avec vDNA, et protéomique seulement permettent de mieux comprendre les interactions qui se produisent en fonction d’un facteur viral spécifique. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) a été utilisée pour identifier où les protéines virus et cellulaires spécifiques se lient à des génomes viraux10,11,12,13,14 , 15 et hybridation in situ fluorescente (FISH) combinée à l’immunocytochimie a permis la visualisation des facteurs cellulaires qui sont colocalisées avec vDNA16,17,18, 19 , 20. ces tests permettent une analyse spatiale et temporelle. Cependant, les limitations incluent la nécessité d’anticorps hautement spécifiques, sensibilité limitée et la nécessité pour le précédent aperçu interactions hôte virus. Nous avons donc mis au point une méthode basée sur iPOND (isolement des protéines sur l’ADN naissante)21 et aniPOND (iPOND native accélérée)22 à étiqueter de manière sélective et purifier vDNA de cellules pour l’identification non biaisée du génome viral infectées protéines associées par spectrométrie de masse. iPOND a joué un rôle déterminant pour l’investigation de la fourche de réplication cellulaire dynamique.
Pour l’épuration sélective des génomes viraux provenant de cellules infectées, reproduisant vDNA est étiqueté avec éthynyl modifiée nucléosides, 5-éthynyl-2´-déoxyuridine (EdU) ou 5-éthynyl-2´-désoxycytidine (EdC) (Figure 1), suivie par liaisons covalentes conjugaison de l’azoture de biotine par clic chimie pour faciliter la purification de la seule étape de génomes viraux et des protéines associées sur streptavidine perles (Figure 2 b). Ce qui est important, les infections sont réalisées dans des cellules fixes qui ne sont pas engagés dans la réplication de l’ADN cellulaire pour permettre un étiquetage spécifique de vDNA. En outre, infection par HSV-1 provoque l’arrêt du cycle cellulaire et inhibe la cellular DNA réplication23,24. Virus peut être prémarquées avant l’infection pour l’analyse des protéines associées aux génomes viraux entrants (Figure 1 a) ou marqués au cours de la réplication de l’ADN pour l’analyse de protéines nouvellement synthétisée vDNA (Figure 1 b) 25. en outre, pulse chase analyse peut être utilisée pour étudier la nature des protéines associées à la réplication virale fourches (Figure 1)26. En outre, éthynyl-modified vDNA peut être conjugué de façon covalente à un fluorophore pour l’exploration spatiale de la dynamique des protéines (Figure 2 et Figure 3). L’imagerie permet la visualisation directe de vDNA et est une approche gratuite pour la validation des interactions protéine-vDNA peut être adapté pour assurer le suivi des génomes viraux tout au long de l’infection. Nous prévoyons que ces approches pourraient être modifiées ultérieurement pour étudier n’importe quel aspect d’infection baculoviraux, y compris le temps de latence et de réactivation et d’étudier d’autres virus à ADN. En outre, marquage avec l’uridine 5-éthynyle (UE) pourrait permettre pour l’analyse des génomes viraux RNA.
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Protocol
1. Culture cellulaire, Infection virale et EdC Labeling ( Figure 1)
le protocole suivant implique l’utilisation de virus. Veuillez vous référer à votre établissement ' protocoles de biosécurité s concernant la manipulation sécuritaire des virus et autres agents biologiques. Ce protocole a été approuvé par la Commission de révision institutionnelle de l’Université de Pittsburgh.
- Trypsinize une fiole de vitroplants confluentes 150 cm 2 de MRC-5 cellules et les cellules de transfert à une plaque de culture de tissu de 2 600 cm contenant 100 mL DMEM majoré de 10 % FBS. Incuber à 37 ° C en présence de 5 % de CO 2 pendant 3-4 jours atteindre la phase stationnaire et confluency. Un plat de 2 cm 600 confluentes contient environ 7 x 10 7 cellules. Préparer 1 assiette pour chaque condition et 1 assiette pour chaque contrôle négatif correspondant.
Remarque : Les cellules doivent parvenir à la phase stationnaire pour inhiber la réplication de l’ADN cellulaire pour s’assurer que seul vDNA est étiqueté et purifié dans les étapes suivantes.
Remarque : Chaque échantillon nécessite un gratuit non témoin négatif établi en utilisant les mêmes conditions d’infection et le point dans le temps sans l’ajout de l’ECD.
NOTE : A revus à la baisse la version de cette expérience devrait se faire en tandem pour tester pour l’étiquetage de l’ADN cellulaire par imagerie à l’aide de la croissance des cellules comparables, infection, EdC, des conditions d’étiquetage et de points de temps (voir étape 2). - Diluer 7 x 10 8 PFU HSV-1 à 7 mL froide Solution Saline (SCT). Retirez le milieu de croissance et à 37 ° C. Pour infecter, ajouter le virus dilué de 7 mL cellules MRC-5 et le rock pendant 1 h à température ambiante. Après adsorption, retirer inoculum, rincer avec la température de la pièce 50 mL du SCT et remplacer le milieu de croissance initiale. Incuber à 37 ° C en présence de 5 % de CO 2. Cette étape devrait être effectuée pour chaque condition expérimentale et un témoin négatif.
NOTE : Étiquetage d’EdC accrue peut être réalisé à l’aide de HSV-1 mutants déficients pour l’expression de la dUTPase virale (gène UL50) et/ou l’uracile glycosylase (gène AMT2). HSV-1 dUTPase a une spécificité de substrat faible et permet de réduire l’activation de plusieurs nucléosides analogues 25 , 27. - Des génomes viraux étiquette avec EdC. Suivre les indications pour étiqueter des génomes entrants (1.3.1.), reproduisant les génomes (1.3.2.), ou les fourches de réplication virale (1.3.3.).
NOTE : Seule étape 1.3.1 et 1.3.2 1.3.3 doit être effectué selon que les génomes entrants, génomes répliqués ou fourches de réplication sont à analyser dans les étapes suivantes, respectivement.
NOTE : EdU ou EdU f-ara peut être substitué pour EdC. La toxicité d’analogues nucléosidiques doit être surveillée et réduit au minimum.- Utilisation prémarquées des actions à mener à l’infection à l’étape 1.2 et passez à l’étape 2 ou 3 moins de 4 h après l’infection (hpi) pour enquêter sur les vDNA non répliquée ( Figure 1 a).
NOTE : Préparer des virus pré-étiquetée stocks en utilisant le protocole décrit précédemment 25. Les stocks de virus doivent être passés à travers une colonne G-25 pour enlever tout résidu EdC. - Label vDNA reproduisant en ajoutant 5 à 25 µM EdC au milieu de culture cellulaire des cellules infectées pendant 2-4 h ( Figure 1 b). Avant d’ajouter, diluer 1 mL de milieu de croissance EdC.
- D’étiqueter les fourches de réplication virale, après le début de la réplication de vDNA (≥ 4 hpi), étiquette impulsion reproduisant vDNA avec 5 à 25 µM EdC pour 5 à 20 min. Pour chasser, rincer 3 x milieu de chasse contenant 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC) et puis incuber en présence du milieu de la chasse pour une supplémentaire de 20 à 40 min ( Figure 1).
NOTE : Moyenne de pouls et chase doit être équilibré à 37 ° C et 5 % de CO 2 avant utilisation.
Remarque : Pour des expériences de pouls de chase, il est important de tenir compte de la quantité de temps qu’il faut pour les nucléosides entrer dans la cellule et être phosphorylé avant qu’ils peuvent être incorporés dans la réplication de l’ADN. Cela doit être déterminé empiriquement.
Remarque : Pour déterminer la résolution d’expériences de pulse chase, calculer le taux de réplication virale dans les conditions expérimentales utilisées. Ceci peut être déterminé par PCR quantitative des génomes viraux durant une seule étape croissance temps cours 26.
Remarque : Pour l’imagerie des génomes viraux passez à l’étape 2 et pour la purification des génomes viraux, passez à l’étape 3.
- Utilisation prémarquées des actions à mener à l’infection à l’étape 1.2 et passez à l’étape 2 ou 3 moins de 4 h après l’infection (hpi) pour enquêter sur les vDNA non répliquée ( Figure 1 a).
2. Imagerie de l’ECD étiquetée ADN ( Figure 2 a)
Remarque : il est utile d’effectuer l’imagerie en tandem avec la méthode de purification du génome viral pour vérifier que l’ADN cellulaire n’est pas étiquetée dans les expériences. L’imagerie permet également de visualiser la nature des vDNA marqué et valider les données de la protéomique. Exemples de patrons de coloration de l’ADN viraux et cellulaire sont indiquées à la Figure 3.
- Mener à des infections et EdC étiquetage comme indiqué à l’étape 1, sauf en utilisant revus à la baisse les conditions sur les lamelles dans un plat de culture de tissu de 12 puits contenant 1 mL de milieu de croissance. Paraformaldéhyde
- fix cellules avec 3,7 % de 1 mL dans du PBS 1 x pendant 15 min à température ambiante. Après fixation, rincer les cellules 2 x avec BSA 3 % 1 mL dans du PBS.
ATTENTION : Paraformaldéhyde peut causer des blessures graves ou permanentes. Suivez les consignes de sécurité.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici et lamelles peuvent être stockés à 4 ° C au cours du deuxième lavage jusqu'à 3 jours. - Permeabilize des cellules avec 1 mL de tampon de perméabilisation [Voir la Table des matières] pendant 20 min à température ambiante tout en berçant.
- Rincer avec 1 mL de 3 % de BSA, puis bloc avec BSA 3 % 1 mL dans du PBS pendant 30 min à température ambiante tout en berçant.
- Ajouter 1 mL de la réaction de clic cocktail [Voir la Table des matières] à lamelles de façon covalente conjugué Alexa Fluor 488 azoture d’EdC étiquetée ADN. Incuber à température ambiante pendant 30 min, tout bascule. Aspirer et rincer deux fois avec 1 mL de PBS.
- Tache ADN cellulaire avec 1 mL d’une dilution de 1:2,000 de Hoechst en PBS pendant 30 min à température ambiante tout en bascule. Aspirer et rincer deux fois avec 1 mL de PBS. Immunofluorescence indirecte
- tache avec des anticorps primaires et secondaires selon norme protocoles 25.
Remarque : VDNA étiqueté putative avec ICP8, ICP4 ou UL42 et étiqueté cellulaire ADN putative avec Hoechst tache. - Monter sur glissières lamelles couvre-objet et image des cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence.
Remarque : Diapositives peuvent être stockés à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
3. Purification des vDNA et des protéines associées aux
Remarque : plusieurs aspects de ce protocole ont été adaptées de Leung et al. 22
Remarque : tous les tampons et les réactifs doivent être réfrigérés sur la glace avant utilisation et toutes les mesures devraient être menées sur glace sauf indication contraire.
- Récolter noyaux.
NOTE : Avant l’isolement des noyaux, formaldéhyde peut servir aux protéines de réticulation à l’ADN. Des conditions plus strictes de lavage permet ensuite au cours de la purification de l’ADN sur des billes de streptavidine. Pour crconditions osslinking et lavage voir Sirbu et al. 21.- remplacer le milieu de culture avec 20 mL de tampon d’Extraction de noyaux (NEB) et incuber pendant 20 min à 4 ° C, avec parfois de la bascule. Noyaux deviendra visibles au microscope.
- Gratter des noyaux de la plaque à l’aide d’un grattoir de cellules et transvaser dans un tube conique de 50 mL. Centrifugation pendant 10 min à 2 500 g à 4 ° C à noyaux de granule, éliminer le surnageant.
NOTE : Trypan coloration bleue peut être utilisée pour vérifier l’isolement des noyaux des cellules. - Délicatement déloger le culot nucléaire dans 10 mL de PBS, transférez dans un tube conique de 15 mL et pellet par centrifugation pendant 10 min à 2 500 x g à 4 ° C. Completely remove PBS.
Remarque : Les noyaux peuvent être congelés et le protocole peut être suspendu à ce stade. Pour ce faire, doucement Resuspendre le culot nucléaire dans 500 µL de congélation mettre en mémoire tampon et incuber le tube dans un bain de glace d’éthanol/sec. Stocker des noyaux congelés à-80 ° C. Avant utilisation, décongeler à température ambiante, les noyaux, transférer rapidement vers la glace, ajouter 10 mL de PBS, roche doucement pour mélanger, pellet par centrifugation pendant 10 min à 2 500 g à 4 ° C et de supprimer complètement les PBS. Noyaux de congélation peut entraîner des rendements réduits.
- Par covalence conjugué Biotine-azide à EdC étiqueté vDNA.
- Remettre le culot nucléaire en réaction clic 10 mL mélanger [Voir la Table des matières] par pipetage doucement monter et descendre 5 fois avec une pipette de 10 mL.
Remarque : Il est important que les réactifs inclus dans le mélange réactionnel clic sont ajoutés dans l’ordre indiqué. - Tourner pendant 1h à 4 ° C. Pendant la rotation de préparer et refroidissez les tampons B1, B2 et B3 [Voir la Table des matières].
- Pellet noyaux par centrifugation pendant 10 min à 2 500 x g à 4 ° C. complètement supprimer cliquez sur mélange réactionnel et laver le culot par doucement resuspendant dans 10 mL de PBS et centrifugation pendant 10 min à 2 500 x g à 4 ° C.
- Resuspendre doucement le nucléaire culot dans 1 mL de PBS et le transfert d’un tube de microtubes de 1,5 mL à l’aide d’une pointe de pipette grosse perce. Noyaux de granule par centrifugation pendant 10 min à 2 500 x g à 4 ° C. Completely remove PBS et flash congélation dans l’azote liquide.
Remarque : Le protocole peut être suspendu à ce stade et noyaux congelés peuvent être conservés à-80 ° C. gel dégel contribue à la lyse ultérieure il est donc recommandé que les noyaux être flash gelés même quand procéder à l’étape 3.3 le même jour.
- Remettre le culot nucléaire en réaction clic 10 mL mélanger [Voir la Table des matières] par pipetage doucement monter et descendre 5 fois avec une pipette de 10 mL.
- Lyse des noyaux et de fragments d’ADN.
- Décongeler noyaux sur la glace et remettre en suspension dans 500 µL tampon B1 par pipetage de haut en bas. Incuber sur glace pour 45 min.
- Un échantillons 6 fois pendant 30 s chaque à amplitude de 40 % à l’aide d’une sonde de microtip 3 mm. Placer les échantillons sur la glace pendant 30 s entre les impulsions. Après la sonication, échantillons devraient être clair, pas nuageux.
NOTE : Conditions de Sonication doivent être optimisées pour chaque sonicateurs. Pour obtenir des instructions détaillées sur la façon d’optimiser les conditions de la sonication voir Leung et al. 22. - -pellet débris cellulaires par centrifugation à 14 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. La taille de granule devrait diminuer de manière importante. Filtrer le liquide surnageant à travers des tamis de cellule 100 µM et de conserver le débit par.
- Ajouter 500 µL tampon B2 pour le surnageant filtrée. 900 µL de cet exemple seront utilisés à l’étape 3.4.2.
- , Prélever une partie aliquote de chaque condition d’isolement d’ADN (50 µL ou volume 1/20ème) et ajouter 50 µL 2 x solution SDS-bicarb [Voir la Table des matières]. Procéder au protocole d’isolement de l’ADN (étape 3.6).
- Prélever une partie aliquote de chaque condition d’entrée protéine (50 µL ou volume 1/20ème) et ajouter 50 µL 2 x solution tampon de Laemmli, congélation dans l’azote liquide et stocker à -80 ° C. utiliser à l’étape 3.5.6.
- Billes recouvertes de bind biotinylé ADN de streptavidine.
- Préparer la Streptavidine T1 billes magnétiques en transférant 300 µL de lisier de perle à un tube de microtubes de 1,5 mL. Préparer un tube de perles par exemple. Perles de lavage 3 x avec 1 mL de tampon B2 par vortex pour remettre en suspension, en appliquant un aimant pour séparer les billes et aspirer le tampon de lavage.
NOTE : Optimisé liant le résultat de conditions en rendement maximisé et liaison fond minimal. Il a été déterminé expérimentalement que Streptavidin T1 billes magnétiques ont une capacité de liaison significativement plus élevée que d’agarose perles, mais aussi d’autres perles de streptavidine et moins de fond lie de streptavidine C1 perles ( Figure 4 a ). - Ajouter 900 µL de l’échantillon de l’étape 3.3.4. aux talons lavées et tourner la nuit à 4 ° C.
Remarque : Ne pas les perles de vortex, une fois que l’échantillon est ajouté à leur.
Remarque : Si des quantités importantes de l’ADN ou des protéines sont isolées dans le contrôle négatif sans étiquette, cette étape peut être réduite de nuit à 4 h afin de réduire la liaison fond.
- Préparer la Streptavidine T1 billes magnétiques en transférant 300 µL de lisier de perle à un tube de microtubes de 1,5 mL. Préparer un tube de perles par exemple. Perles de lavage 3 x avec 1 mL de tampon B2 par vortex pour remettre en suspension, en appliquant un aimant pour séparer les billes et aspirer le tampon de lavage.
- Laver les perles et éluer vDNA et des protéines associées.
Remarque : Il est recommandé d’utiliser des embouts de filtration pour les étapes restantes.- Échantillons de Place dans un portoir magnétique microtubes, enlever le surnageant, resuspendre doucement dans 1 mL de tampon B2, tournent à 4 ° C pendant 5 min.
- Répéter l’étape 3.5.1 triple.
- Placer les échantillons dans un portoir magnétique microtubes, éliminer le surnageant, resuspendre dans 1 mL de tampon B3, doucement et tourner à 4 ° C pendant 5 min.
- Transférer 100 µL de billes mélange (1/10 ème volume) dans un nouveau tube pour l’isolement d’ADN lié. Appliquer ce tube à l’aimant, éliminer le surnageant, remettre les billes en suspension dans 100 µL 1 x solution SDS-bicarb et procéder au protocole d’isolement de l’ADN (étape 3.6).
- Appliquer le tube contenant le reste du mélange 900 µL perle de l’étape 3.5.3. à l’aimant, éliminer le surnageant et remettre les billes en suspension dans 50 µL 2 x Laemmli solution tampon pour éluer les protéines et complexes ADN-protéine.
- Échantillons de bouillir à 95 ° C pendant 15 min, vortex, rapidement spin dans des microtubes et appliquer l’aimant. Transférer l’éluat dans un nouveau tube, congélation flash et conserver à -80 ° C.
Remarque : Serrures cap emploi pour s’assurer que les tubes ne pop pas ouvrir tout en ébullition.
Remarque : Le protocole peut être suspendu à ce stade et les échantillons peuvent être conservés à-80 ° C pendant plusieurs semaines. - Analyser des échantillons de protéine par le bleu de Coomassie coloration, éponger occidental ou spectrométrie de masse par des procédures standard 25. Résultats représentatifs sont présentés dans la Figure 4 et Figure 5.
Remarque : Pour déterminer si le rendement de protéine est suffisante pour la spectrométrie de masse, 7,5 µL de chaque échantillon est utilisé pour l’analyse par coloration au bleu de Coomassie et 7,5 µL pour éponger occidental d’un génome viral représentant associé la protéine (ICP4, ICP8 ou UL42). Le même volume de lysats de l’étape 3.3.6. sont exécutés aux côtés de contrôle des niveaux de protéine d’entrée. L’échantillon restant (35 µL) est ensuite analysée par mass spectrometry comme décrit plus haut 25.
- Isolement d’ADN
- Incuber les échantillons de mesures 3.3.5. et 3.5.4. à 65 ° C pendant 4 à 16 h. Retirer l’échantillon de billes magnétiques, si nécessaire.
- Extraire des échantillons avec alcool de phénol : chloroforme : isoamylique 150 µL (PCI) et transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube.
- Extraire le PCI restant avec 100µl Tris-EDTA (TE) et ajouter la phase aqueuse dans un nouveau tube.
- Extraire des échantillons avec alcool de chloroforme : isoamylique 200 µL (24:1).
- Purifier la phase aqueuse à l’aide de la PCR Purification Kit selon le fabricant ' protocole de s.
Remarque : L’indicateur de pH tampon PB devient pourpre lorsqu’ajoutés à l’échantillon. Ajouter 10 & #181 ; L 3M de NaOAc pH 5.0 pour diminuer le pH de l’échantillon. - Concentration d’ADN de déterminer à l’aide d’un fluorimètre.
Remarque : Ce protocole entraîne généralement de 100 à 400 ng perle lié aux DNA. Aucun ADN ne devrait être détecté dans l’éluat du contrôle négatif dans lequel EdC n'a pas été ajouté dans l’étape 1.3. - ADN peut être stocké dans une faible liaison ADN tube à 4 ou - 20 ° C et peut être utilisé pour la PCR en temps réel ou analyse de séquençage à haut débit.
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Representative Results
Tout d’abord, l’utilisation de la chimie de clic pour la purification de l’ADN des cellules a été réalisée par la méthode d’iPOND21. Le but d’iPOND est de purifier les fourches de réplication cellulaire pour l’identification des protéines associées. Nous avons adapté cette technique afin d’étudier spécifiquement les interactions de protéine de vDNA au cours de l’infection. Manipulation de l’approche d’étiqueter des génomes viraux avec EdC (Figure 1), combinées à des infections synchronisées, a permis l’isolement sélectif et l’investigation des populations distinctes de vDNA. ADN de HSV-1 est étiqueté avec EdC (Figure 1) pour faciliter la fixation covalente à un fluorophore pour l’imagerie ou biotine pour la purification (Figure 2). Virus peut être prémarquées avant l’infection pour l’analyse des protéines associées aux génomes entrants (Figure 1 a) ou marqués au cours de la réplication de l’ADN pour l’analyse de protéines nouvellement synthétisées vDNA (Figure 1 b)25. En outre, pulse chase analyse peut être utilisée pour étudier la nature des protéines associées à la réplication virale fourches (Figure 1)26. L’ADN peut être visualisée dans les cellules pour fournir des informations spatiales sur la nature de l’ADN et le soutien marqué des interactions de protéine-vDNA identifiés (Figure 3). Pris ensemble, les protocoles décrits ici permettent d’enquête sur les multiples facettes d’infection productive protéomiques à donner un aperçu des changements dynamiques qui se produisent sur les génomes de HSV-1. Ces approches pourraient être plus adaptés pour étudier la latence et la remise en service, d’examiner les phénotypes associés aux mutants viraux et d’étudier d’autres virus d’ADN et d’ARN.
Aspects de cette méthode de purification des protéines ont été adaptés de Leung et al. 22. ici une amélioration majeure pour la purification de l’ECD étiquetée ADN est l’utilisation de streptavidine T1 perles au lieu de streptavidine agarose perles. Pour optimiser la purification de l’ADN, plusieurs types de streptavidine perles ont été testés pour la liaison non spécifique lorsque l’infection a été réalisée en l’absence d’EdC ou pour la récupération maximale de protéines en présence d’EdC (Figure 4 a). Pour ces expériences, éponger occidental a été réalisée pour la protéine de liaison de le vDNA ICP4. Purifications effectuées sur Streptavidin T1 perles a abouti à la moindre quantité de liant de fond en l’absence d’EdC et la récupération maximale de protéines en présence d’EdC.
Protéines associées aux vDNA peuvent être identifiés par des méthodes protéomiques y compris western blot et spectrométrie de masse. Western blot peut être utilisé pour étudier la dynamique des interactions connues et spectrométrie de masse peut être utilisée comme une approche impartiale pour identifier les protéines vDNA de nouveaux associé. Un exemple de protéine donné comme une fonction de plus en plus l’étiquetage EdC est illustrée dans la Figure 4 b. Un frottis, plutôt qu’une tendance claire de baguage, est habituellement observée par coloration au bleu de Coomassie. C’est probablement parce qu’il y a l’ADN présent dans l’échantillon de protéines ou parce qu’il y a une abondance de protéine. Il est également important de noter que le catalyseur de cuivre utilisé dans la réaction de clic peut causer une dégradation partielle des protéines et des acides nucléiques28,29. Western blot, des niveaux similaires de ICP4 sont généralement détectés dans les éluats (étape 3.5.5.) après la purification de vDNA qui a été marquée pendant 60 min avec EdC comme celle présente dans la même quantité de l’échantillon d’entrée préparé à partir de lystates nucléaire (étape 3.3.6.). Cette information peut servir comme guide pour déterminer si la récupération est suffisante pour envoyer l’échantillon restant pour l’analyse par spectrométrie de masse.
Nano chromatographie en phase liquide avec la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) peut être effectué comme décrit plus haut25 pour identifier les protéines associées à vDNA purifiée. LC-MS/MS données sont analysées en comparant les valeurs spectrales comte (SpC) entre l’échantillon expérimental marqué EdC et le contrôle négatif sans étiquette correspondant. Les protéines sont censées être enrichie dans l’échantillon expérimental basé sur les critères suivants : 1) protéine a au moins 5 chefs d’accusation spectrales (CPS) de l’échantillon expérimental, protein 2) n’est pas détecté dans le contrôle ou est enrichi sur le contrôle au moins quatre fois basées sur la Division des valeurs de SpC et 3) la protéine est enrichie sur le contrôle dans deux ou plusieurs répétitions biologiques. Le facteur d’abondance spectrale normalisées (NSAF : 
) peut être utilisé pour tenir compte des différences dans le poids moléculaire (MW) et le rendement de protéine totale. Cette équation détermine l’abondance relative des protéines individuelles au sein d’un échantillon et permet une comparaison directe de deux différentes conditions expérimentales dans lesquelles différentes quantités de vDNA sont purifiées (par exemple, en comparant les génomes viraux d’entrée ( Figure 1 a) pour répliquer les génomes (Figure 1 b)).
Il y a plusieurs façons de présenter les données de l’enrichissement de protéine. Quelques exemples comprennent des graphiques, des diagrammes de Venn et réseaux d’interactions protéiques. Camemberts peut servir à illustrer la proportion des protéines identifiées qui sont connus pour fonctionner dans un processus biologique spécifique (Figure 5 a). Cependant, des problèmes peuvent survenir quand une protéine a plus d’une fonction biologique, qui est souvent le cas. Il est également difficile de comparer les données entre différents camemberts. Les diagrammes de Venn sont utiles pour démontrer les relations entre les protéines identifiées dans des conditions expérimentales différentes, mais ne fournissent pas d’informations fonctionnelles sur les protéines identifiées (Figure 5 b). Réseaux d’interactions protéiques dépeindre une illustration visuelle d’interactions entre les protéines identifiées et fournir des informations sur les types de processus biologiques qui sont en cause (Figure 5). Il existe plusieurs ressources en ligne pour la cartographie des interactions protéine-protéine dont30de la chaîne (outil de recherche pour les récupération de l’interaction gènes/protéines). Outils en ligne sont généralement équipés pour gérer la protéomique des données provenant de diverses espèces et fournir des informations précieuses sur l’hôte protéines impliquées dans la mécanique du génome viral. Cependant, protéines virales ne sont généralement pas inclus dans les bases de données, ce qui peuvent compliquer l’analyse. Par conséquent, il est important de tenir compte des conclusions essentielles on voudrait transmettre lorsqu’ils décident comment présenter les données de la protéomique.
Figure 1 :ONG > approches à étiquette ADN HSV-1. (A) pour analyser l’état du virus entrants, repos MRC-5 G0 , les cellules sont infectées par pré-étiquetée HSV-1 et génomes sont dosés à moins de 4 hpi pour étudier l’ADN viral non répliquée. (B) pour analyser l’état de réplication des virus, MRC-5 cellules sont infectées par HSV1 sans étiquette et EdC (étoiles orange) est ajouté au milieu de croissance des cellules infectées et incubé pendant 2-4 h après le début de la réplication de l’ADN viral (≥4 hpi). (C) pour doser les fourches de réplication virale, les cellules infectées sont des impulsions étiquetée avec EdC pour 5 à 20 min. fourches de réplication peuvent ensuite être chassés avec deoxyC. EdC étiquetée ADN est orange. Ce chiffre a été modifié par Dembowski et DeLuca25. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Procédures décrites dans cet article pour l’analyse de l’ECD étiquetée ADN. (A) un aperçu de la méthode d’imagerie EdC étiquetée d’ADN. Taggé ADN est représenté en vert. (B) un aperçu de la méthode pour la purification et l’analyse en aval de l’ECD étiquetés vDNA. Ce chiffre a été modifié par Dembowski et DeLuca25. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Visualisation d’EdC étiquetée ADN. Cellules ont été infectées, étiquetés et imagés comme décrit à la Figure 1 et Figure 2. Des images représentatives de l’ADN cellulaire et viral étiqueté sont indiqués. ADN cellulaire putative avec tache de Hoechst et vDNA avec ICP4. Barre d’échelle : 5 µm.This image a été modifiée de Dembowski et DeLuca25 et Dembowski et al. 26. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats de purification de protéine représentatif. (A) Comparaison du rendement des protéines lorsque les étapes de purification ont été réalisées à l’aide de différents types de perles de streptavidine enduite. L’infection a été réalisée en présence d’EdC (+) pour comparer le rendement de protéine ou en l’absence d’EdC (-) pour comparer la liaison de contexte. Infections et étiquetage d’EdC ont été réalisées comme décrit dans la Figure 1 b et complexes ADN-protéine ont été purifiées selon les étapes décrites dans la Figure 2 b en utilisant des quantités comparables de différents types de perles de streptavidine enduite. Panneau supérieur : comparaison du rendement de protéine après purification sur streptavidine enduit d’agarose perles ou streptavidine M-280. Panneau inférieur : comparaison du rendement de protéine après purification sur Streptavidin M-270, M-280, streptavidine C1 ou streptavidine T1. Western Blot a été réalisée avec un anticorps dirigé contre la protéine virale ICP4. ICP4 purifiée est montré dans la première voie de comparaison. Une exposition plus longue du panneau ventral était tenue de respecter une intensité similaire de ICP4 dans les couloirs « 280 » comme dans le panneau supérieur. (B) protéines représentant purification résultats en fonction du temps de l’étiquetage d’EdC sont indiqués. Infections et étiquetage d’EdC ont été réalisées comme décrit dans la Figure 1 b et complexes ADN-protéine ont été purifiées selon les étapes décrites dans la Figure 2 b à l’aide de perles de streptavidine T1. Étiquetage d’EdC a été réalisée pour 0, 20, 40, ou 60 min et bleu de Coomassie (en haut) et western blot (en bas) résultats s’affichent. Western Blot a été réalisée avec des anticorps spécifiques pour ICP4, UL42 ou GAPDH. L’exemple de l’éluat est extraite d’étape 3.5.5. et le lysat de l’étape 3.3.6. La flèche indique la Streptavidine, tandis que L indique l’échelle de la protéine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Exemples de différentes manières de présenter les données de protéomique. Les camemberts (A) résument les protéines qui ont été identifiés par spectrométrie de masse des éluats de protéines associées à des génomes viraux purifiés à 6 hpi. Les valeurs indiquent le nombre de protéines identifiées pour chaque catégorie fonctionnelle. T indique le nombre total des protéines identifiées. Couleurs indiquent les catégories suivantes : purple - traitement de RNA, rouge - transcription, verte - remodelage de la chromatine, l’orange - réplication de l’ADN, jaune - transport nucléaire, protéines structurales de la Sarcelle - cytosquelette, bleu foncé - HSV et gris - autre/inconnue. (B) les diagrammes de Venn dépeignent le chevauchement des protéines identifiées à associer à des génomes viraux à 6, 8 ou 12 hpi. (C), une chaîne carte montre protéines enrichies sur les fourches de réplication virale après une impulsion d’EdC de 5 min. Des protéines humaines, enrichies par un facteur 5 par rapport au témoin négatif non étiqueté sont indiquées sur la carte de l’interaction fonctionnelle, qui a été générée à l’aide de chaîne30 avec des paramètres de données pour afficher les interactions de confiance seulement élevée. Noms de gènes ont été utilisés pour cartographier les interactions. Cercles indiquent les protéines qui fonctionnent dans le même processus biologique. Ce chiffre a été modifié de Dembowski et DeLuca25 et Dembowski et al. 26. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole comprend plusieurs étapes qui, si ne pas suivi attentivement, peuvent entraîner en rendement de protéine significativement réduite ou une contamination par l’ADN cellulaire. Il est essentiel que cellules stationnaires sont utilisés pour toutes les expériences à faire en sorte que l’ADN cellulaire n'est pas étiqueté et purifié. Ceci peut être confirmé par l’absence de polymérases d’ADN cellulaires dans l’échantillon de protéines car HSV1 n’utilise pas l’ADN polymérase cellulaire pour la synthèse du génome. Pendant EdC étiquetage et étapes de la récolte des noyaux, des échantillons devraient être décalées pour s’assurer que chacun est traité également. Au cours des étapes de purification, il faut ne pas de manipuler les noyaux en pipettant également, trop de choses. Cela peut conduire à la lyse prématurée des noyaux, ainsi que la perte d’échantillon en raison de s’en tenir aux côtés des embouts. Par ailleurs, l’étape de sonication doit être optimisée pour les sonicateurs individuels et la quantité de streptavidine perles utilisées pour la liaison de biotine devrait être réglée pour un rendement optimal de protéines.
Plusieurs modifications peuvent être apportées à ce protocole et incluent l’utilisation de différents virus ou types de cellules ou l’ajout d’une étape à la protéine de liaison croisée à l’ADN. Lorsque vous choisissez un type de cellules à utiliser pour proteomic investigation, il est important de vérifier la disponibilité d’une base de données de séquences de protéines pour cette espèce. Un manque de ressources de protéomique limitera considérablement en aval analyse de données de protéine. Une autre limitation est la nécessité pour un grand nombre de cellules, il peut donc être difficile de préparer suffisamment de cellules primaires, comme les neurones, pour cette expérience. Cette méthode devrait être compatible avec d’autres virus d’ADN ou d’ARN, tant que l’infection virale ne dépend pas de réplication de l’ADN cellulaire. En outre, il serait intéressant d’explorer les changements dans les interactions ADN-protéines qui se produisent chez les mutants de HSV-1. Une autre modification au présent protocole pourrait être l’ajout d’une étape de réticulation de formaldéhyde avant l’isolement des noyaux, qui permettrait aux plus sévères par lavage au cours de la purification,21. L’ajout de formaldéhyde n’affectera pas la capacité de récolter des noyaux, mais peut-être survenir une diminution des protéines avec un rendement à cause de l’inversion difficilement crosslinks pendant l’élution de la protéine.
Les résultats de ce protocole représentent l’état moyen de l’ADN viral en cours d’examen. Par conséquent, il est difficile de distinguer si complexes sont ensemble sur les molécules d’ADN identiques ou séparés. vDNA marquage méthodes décrites ici en combinaison avec l’imagerie de haute résolution peut être utilisé pour vérifier les données de la protéomique et peut aider à distinguer entre des populations différentes d’ADN marqué dans une cellule. En outre, ChIP-seq pourrait être utilisé comme une méthode de suivi pour déterminer les emplacements précis des protéines sur le génome viral.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous reconnaissons Hannah Fox pour aider à la préparation de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIH grant R01AI030612.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
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