Summary
L'obiettivo del presente protocollo è specificamente tag e isolare selettivamente il DNA virale da cellule infettate per la caratterizzazione delle proteine del genoma virale associato.
Abstract
L'obiettivo del presente protocollo è per isolare il virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) DNA da cellule infettate per l'identificazione di associato virale e proteine cellulari di spettrometria di massa. Anche se le proteine che interagiscono con genomi virali svolgono un ruolo importante nel determinare l'esito dell'infezione, un'analisi completa delle proteine del genoma virale associato non era in precedenza fattibile. Qui dimostriamo un metodo che consente la purificazione diretta del genoma di HSV-1 da cellule infette. Replica del DNA virale in modo selettivo è etichettata con nucleotidi modificati che contengono un gruppo funzionale di alchini. Con etichetta DNA quindi è specificamente e irreversibilmente contrassegnato tramite il legame covalente di azide biotina tramite un rame (I)-catalizzato reazione di cicloaddizione o clic di azide-alchino. Biotina-etichetta DNA viene purificata su rivestite di streptavidina e proteine associate sono eluite e identificate mediante spettrometria di massa. Questo metodo consente il targeting selettivo e l'isolamento di HSV-1 replica forchette o interi genomi da ambienti biologici complessi. Inoltre, l'adattamento di questo approccio vi permetterà per l'indagine sui diversi aspetti della infezione herpesviral, nonché l'esame dei genomi di altri virus a DNA.
Introduction
I virus hanno una limitata capacità di svolgere le funzioni essenziali e pertanto dipendono da fattori dell'ospite per facilitare gli aspetti critici dell'infezione compreso trasporto, replica, riparazione, ricombinazione ed espressione genica virale. Le attività di questi fattori dell'ospite sono spesso aumentate di proteine codificate virally. Inoltre, virus deve evitare il rilevamento e interferenze di risposte cellulari all'infezione virale. Di conseguenza, interazioni ospite virus dettano l'esito dell'infezione. Di fondamentale importanza è capire come virus alterano l'ambiente cellulare per adattare il macchinario cellulare per facilitare processi virali. Di particolare interesse è identificare i fattori e i processi agiscono sui genomi virali durante tutto il ciclo infettivo.
Herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1) è che una doppia elica del DNA virus che infetta una parte sostanziale della popolazione umana. Entro la prima ora di infezione, il genoma virale entra nel nucleo, dove una cascata ordinata dell'espressione genica virale ensues in coordinamento con virale del DNA (vDNA) replica1. Nel nucleo, genomi sono soggetti a regolazione epigenetica, sottoposti a riparazione e ricombinazione e sono confezionati in capsidi, tale che i primi virioni di progenie sono prodotte in meno di sei ore. La valutazione completa delle proteine del genoma virale associato durante tutto il corso dell'infezione getterà le basi per indagare i dettagli molecolari dei processi che agiscono sui genomi virali e forniranno la comprensione di quali fattori virali e cellulari sono coinvolti nelle varie fasi dell'infezione.
Metodi precedenti per l'indagine sui fattori dell'ospite coinvolti nell'infezione virale includono purificazione di affinità delle proteine virali per l'analisi di proteine cellulari associati2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. questi saggi sono stati strumentali per l'identificazione di fattori cellulari coinvolti nella risposta antivirale ospite, così come modifica virale della cromatina, espressione genica, e riparazione del DNA. Tuttavia, è difficile da accertare se interazioni dipendono l'associazione con vDNA e proteomica solo consentono di comprendere le interazioni che si verificano in funzione di uno specifico fattore virale. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è stato utilizzato per identificare dove specifiche proteine virali e cellulari legano al genoma virali10,11,12,13,14 , 15 e ibridazione in situ fluorescente (FISH) combinato con immunocitochimica ha permesso la visualizzazione dei fattori cellulari che colocalize con vDNA16,17,18, 19 , 20. queste analisi consentono analisi spazio e temporale. Tuttavia, le limitazioni comprendono la necessità per gli anticorpi altamente specifici, sensibilità limitata e la necessità di approfondimenti precedenti interazioni ospite di virus. Abbiamo pertanto sviluppato un metodo basato su iPOND (isolamento delle proteine sul DNA nascente)21 e aniPOND (accelerata nativo iPOND)22 per selettivamente etichettare e purificare vDNA da infettato le cellule per l'imparziale identificazione del genoma virale proteine associate mediante spettrometria di massa. iPOND è stato determinante per l'indagine delle dinamiche di forcella di replicazione cellulare.
Per la purificazione selettiva di genomi virali da cellule infette, la replica di vDNA è etichettata con nucleosidi Etinil per volta, 5-Etinil-2-deoxyuridine (EdU) o 5-Etinil-2-deoxycytidine (EdC) (Figura 1), seguita da covalente Coniugazione di azoturo di biotina tramite clic su chimica per facilitare purificazione singolo passo del genoma virale e proteine associate su perline rivestite con streptavidina (Figura 2B). D'importanza, le infezioni avvengono nelle cellule fisse, che non sono impegnate nella replicazione del DNA cellulare per attivare specifici di etichettatura di vDNA. Inoltre, l'infezione HSV-1 provoca l'arresto del ciclo cellulare ed inibisce cellular DNA replica23,24. Virus può essere prelabeled prima dell'infezione per l'analisi di proteine associate con genomi virali in ingresso (Figura 1A) o con l'etichetta durante la replicazione del DNA per l'analisi di proteine associate con vDNA recentemente sintetizzato (Figura 1B) 25. Inoltre, analisi di inseguimento di impulso possono essere utilizzato per indagare la natura di proteine associate con replicazione virale forcelle (Figura 1)26. Inoltre, vDNA Etinil-modificato può essere coniugato covalentemente a un fluoroforo per indagine spaziale della dinamica della proteina (Figura 2A e Figura 3). Formazione immagine permette la visualizzazione diretta del vDNA è un approccio gratuito per la validazione delle interazioni della proteina-vDNA e può essere adattata per tenere traccia di genomi virali durante l'infezione. Ci aspettiamo che questi approcci potrebbero essere ulteriormente modificati per studiare qualsiasi aspetto dell'infezione herpesviral, compresa la latenza e riattivazione e di studiare altri virus a DNA. Inoltre, etichettatura con uridina 5-Etinil potrebbe consentire l'analisi di genomi virali RNA (UE).
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Protocol
1. colture cellulari, infezione virale e l'EdC etichettatura ( Figura 1)
il seguente protocollo coinvolge funzionare con virus. Fare riferimento al proprio Istituto ' protocolli di biosicurezza di s per quanto riguarda la manipolazione sicura di virus e altri agenti biologici. Questo protocollo è stato approvato da Institutional Review Board dell'Università di Pittsburgh.
- Tripsinizzano un pallone di coltura tissutale 2 cm 150 confluenti di cellule MRC-5 e trasferire le cellule ad una piastra di coltura del tessuto di 2 600 cm contenente 100 mL DMEM con 10% FBS. Incubare a 37 ° C in presenza di 5% CO 2 per 3-4 giorni per raggiungere la fase stazionaria ed confluenza. Un piatto di 2 cm 600 confluenti contiene ~ 7 x 10 7 cellule. Preparare 1 piastra per ogni condizione e 1 piatto per ogni controllo negativo corrispondente.
Nota: Le cellule devono raggiungere la fase stazionaria per inibire la replicazione del DNA cellulare per garantire che solo vDNA viene etichettato e purificata nei passaggi successivi.
Nota: Ogni campione richiede un accesso senza etichetta di controllo negativo, preparato con le stesse condizioni di infezione e il punto di tempo senza l'aggiunta di EdC.
Nota: Una versione ridimensionata di questo esperimento dovrebbe essere effettuata in tandem per testare per l'etichettatura del DNA cellulare da formazione immagine usando crescita cellulare paragonabile, infezione, EdC condizioni, di etichettatura e intervalli di tempo (vedi passo 2). - Diluire 7 x 10 8 PFU HSV-1 in 7 mL di freddo Buffered Saline (TBS). Rimuovere il mezzo di crescita e conservare a 37 ° C. Per infettare, aggiungere 7-mL diluito virus alle cellule MRC-5 e rock per 1 h a temperatura ambiente. A seguito di adsorbimento, rimuovere inoculo, sciacquare con temperatura ambiente 50 mL TBS e sostituire il mezzo di crescita originale. Incubare a 37 ° C in presenza di 5% CO 2. Questo passaggio deve essere effettuato per ogni condizione sperimentale ed il controllo negativo.
Nota: Maggiore EdC etichettatura possa essere acquisito utilizzando HSV-1 mutanti difettosi per l'espressione del dUTPase virale (gene UL50) e/o uracile glicosilasi (gene UL2). HSV-1 dUTPase ha specificità di substrato basso e può fare diminuire l'attivazione di alcuni inibitori nucleosidici analoghi 25 , 27. - Genomi virali di etichetta con EdC. Seguire le indicazioni per etichettare in arrivo genomi (1.3.1.), la replica di genomi (1.3.2.), o forche di replicazione virale (1.3.3.).
Nota: Solo un passo 1.3.1, 1.3.2 o 1.3.3 deve avvenire, a seconda se in arrivo genomi, genomi replicati o forcelle replica devono essere analizzati nei passaggi successivi, rispettivamente.
Nota: EdU o f-ara EdU può essere sostituito per EdC. La tossicità di analoghi nucleosidici deve essere monitorata e ridotto al minimo.- Uso prelabeled scorte per realizzare l'infezione nel punto 1.2 e procedere al passaggio 2 o 3 all'interno di 4 h post infezione (hpi) per studiare non replicata vDNA ( Figura 1A).
Nota: Preparare prelabeled virus scorte utilizzando il protocollo descritto in precedenza 25. Stock di virus deve essere passato attraverso una colonna di G-25 per rimuovere qualsiasi residuo EdC. - Etichetta replicante vDNA aggiungendo 5-25 µM EdC al terreno di coltura delle cellule delle cellule infettate per 2-4 h ( Figura 1B). Prima di aggiungere, diluire EdC in 1 mL di terreno di coltura.
- Per etichettare le forcelle di replicazione virale, dopo l'inizio della replica vDNA (≥ 4 hpi), etichetta di impulso replica vDNA con 5-25 µM EdC per 5-20 min. Per inseguire, sciacquare 3 x con mezzo di chase contenente 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC) e poi incubare in presenza di medium di chase per altri 20-40 min ( Figura 1).
Nota: Pulse e chase medio dovrebbe essere equilibrato al 37 ° C e 5% CO 2 prima dell'uso.
Nota: Per esperimenti di pulse chase, è importante considerare la quantità di tempo che necessaria per nucleosidi entrare nella cellula ed essere fosforilato prima che queste possano essere incorporate nella replica del DNA. Questo deve essere determinato empiricamente.
Nota: Per determinare la risoluzione di esperimenti di pulse chase, calcolare il tasso di replicazione virale nelle circostanze sperimentali utilizzati. Questo può essere determinato mediante PCR quantitativa di genomi virali durante un singolo passaggio crescita tempo corso 26.
Nota: Per l'imaging di genomi virali procedere al passaggio 2 e per la purificazione di genomi virali, procedere al passaggio 3.
- Uso prelabeled scorte per realizzare l'infezione nel punto 1.2 e procedere al passaggio 2 o 3 all'interno di 4 h post infezione (hpi) per studiare non replicata vDNA ( Figura 1A).
2. Formazione immagine di EdC DNA ( Figura 2A) contrassegnato
Nota: è utile effettuare imaging in tandem con il metodo di purificazione del genoma virale per verificare che il DNA cellulare non è etichettato in esperimenti. La formazione immagine può essere utilizzata anche per visualizzare la natura di vDNA con etichetta e per convalidare i dati di proteomica. Esempi di DNA virale e cellulare modelli di macchiatura sono mostrati nella Figura 3.
- Svolgere infezioni ed EdC etichettatura come indicato nel passaggio 1, ad eccezione di utilizzando ridimensionato condizioni sulle lamelle in un piatto di coltura del tessuto 12-pozzetti contenente 1 mL di terreno di coltura.
- Fix cellule con 1 mL 3,7% paraformaldeide in PBS 1X per 15 minuti a TA. Dopo la fissazione, risciacquo celle 2 volte con 1 mL 3% BSA in PBS.
Attenzione: Paraformaldeide può causare lesioni gravi o permanenti. Attenersi alle precauzioni di sicurezza.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e le lamelle possono essere memorizzate a 4 ° C nel secondo lavaggio per fino a 3 giorni. - Permeabilize le cellule con 1 mL di tampone di permeabilizzazione [vedi Tabella materiali] per 20 min a temperatura ambiente mentre dondolo.
- Lavare con 1 mL di 3% BSA e quindi blocco con 1 mL 3% BSA in PBS per 30 min a temperatura ambiente mentre dondolo.
- Aggiungere 1 mL della reazione clicca cocktail [vedi Tabella materiali] alle lamelle di coniugare covalentemente Alexa Fluor 488 azoturo di EdC DNA contrassegnato. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti mentre a dondolo. Aspirare e lavare due volte con 1 mL di PBS.
- Macchia DNA cellulare con 1 mL di una diluizione di 1:2,000 di Hoechst in PBS per 30 min a temperatura ambiente mentre a dondolo. Aspirare e lavare due volte con 1 mL di PBS. Immunofluorescenza indiretta
- macchia con gli anticorpi primari e secondari secondo standard di protocolli 25.
Nota: VDNA con etichetta colocalizza con ICP8, ICP4 o UL42 ed etichettati cellular DNA colocalizza con macchia di Hoechst. - Montare vetrini coprioggetti sui vetrini e immagine celle utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Nota: I vetrini possono essere conservati a 4 ° C per diverse settimane.
3. Purificazione di vDNA e proteine associate
Nota: diversi aspetti del presente protocollo sono stati adattati da Leung et al. 22
Nota: tutti i buffer e i reagenti devono essere refrigerati il ghiaccio prima dell'uso e tutti i passaggi devono essere effettuati sul ghiaccio se non diversamente indicato.
- Raccogliere nuclei.
Nota: Prima di isolamento dei nuclei, formaldeide può essere utilizzato per crosslink proteine a DNA. Condizioni più rigorose di lavare quindi possono essere utilizzate durante la purificazione del DNA su perline rivestite con streptavidina. Per crcondizioni di osslinking e lavaggio vedere Sirbu et al. 21.- sostituire crescita medio con 20 mL di tampone di estrazione di Nuclei (NEB) e incubare per 20 min a 4 ° C con occasionali a dondolo. I nuclei diventano visibili al microscopio.
- Raschiare i nuclei dalla piastra con un raschietto in cella e trasferire in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare per 10 min 2.500 x g a 4 ° C per a pellet di nuclei, scartare il surnatante.
Nota: Trypan blu colorazione può essere utilizzato per verificare l'isolamento dei nuclei da cellule. - Delicatamente sloggiare la pallina nucleare in 10 mL di PBS, trasferirlo in una provetta conica 15 mL e pellet mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente rimuovere PBS.
Nota: I Nuclei possono essere congelati e il protocollo può essere sospesa a questo punto. A tale scopo, Risospendere delicatamente la pallina nucleare in 500 µ l di congelamento nel buffer e incubare la provetta in un bagno di ghiaccio di etanolo/a secco. Memorizzare i nuclei congelati a-80 ° C. Prima dell'uso, scongelare i nuclei a temperatura ambiente, trasferire rapidamente di ghiaccio, aggiungere 10 mL di PBS, roccia delicatamente per mescolare, pellet mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C e rimuovere completamente PBS. I nuclei di congelamento può provocare ridotta resa.
- Covalentemente coniugato biotina-azoturo di EdC etichettato vDNA.
- Risospendere il pellet nucleare in reazione clicca 10ml mescolare [vedi Tabella materiali] pipettando delicatamente su e giù 5 volte con una pipetta da 10 mL.
Nota: È importante che i reagenti inclusi nella combinazione di reazione di clic vengono aggiunti nell'ordine indicato. - Ruotare per 1h a 4 ° C. Durante la rotazione preparare e chill buffer B1, B2 e B3 [vedi Tabella materiali].
- Pellet nuclei mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente rimuovere fare clic su mix di reazione e lavare la pallina delicatamente risospendere in 10 mL di PBS e centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C.
- Risospendere delicatamente la pallina nucleare in 1 mL di PBS e trasferirlo in una provetta di microfuge 1,5 mL utilizzando un puntale di grande diametro. Pellet di nuclei mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente rimuovere PBS e freeze flash in azoto liquido.
Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto e nuclei congelati possono essere conservati a-80 ° C. gelo disgelo aiuta con conseguente lisi quindi è consigliabile che i nuclei essere flash congelati anche quando si procede a passo 3.3 nello stesso giorno.
- Risospendere il pellet nucleare in reazione clicca 10ml mescolare [vedi Tabella materiali] pipettando delicatamente su e giù 5 volte con una pipetta da 10 mL.
- Lyse nuclei e il frammento di DNA.
- Scongelare i nuclei su ghiaccio e risospendere in 500 µ l di Buffer B1 pipettando su e giù. Incubare in ghiaccio per 45 min.
- Sonicate campioni 6 volte per 30 s ogni ampiezza 40% usando una sonda del microtip di 3 mm. Posizionare il campione sul ghiaccio per 30 s tra gli impulsi. Dopo sonicazione, campioni dovrebbero apparire chiaro, non nuvoloso.
Nota: Condizioni di sonicazione devono essere ottimizzate per sonicatori individuali. Per istruzioni dettagliate su come ottimizzare le condizioni di sonicazione riferirsi a Leung et al. 22. - pellet detriti cellulari mediante centrifugazione a 14.000 x g per 10 min a 4 ° C. Il formato della pallina dovrebbe diminuire sostanzialmente. Filtrare il surnatante con colino di cella 100 µM e mantenere il flusso attraverso.
- Aggiungere 500 µ l tampone B2 per il surnatante filtrato. 900 µ l di questo esempio verrà utilizzato nel passaggio 3.4.2.
- Prendere una parte aliquota di ciascuna condizione per isolamento del DNA (50 µ l o 1/20th volume) e aggiungere 50 µ l 2 x soluzione SDS-bicarbonato [vedi Tabella materiali]. Procedere con il protocollo di isolamento del DNA (punto 3.6).
- Prendere una parte aliquota di ciascuna condizione per ingresso proteina (50 µ l o 1/20th volume) e aggiungere 50 µ l 2 x tampone di Laemmli, congelato in azoto liquido e conservare a -80 ° C. uso nel passaggio 3.5.6.
- Bind biotinylated del DNA di streptavidina rivestito perline.
- Preparare Streptavidin T1 biglie magnetiche trasferendo 300 µ l di liquami tallone ad un tubo di microfuge 1,5 mL. Preparare una provetta di perline per campione. Lavare 3 volte con 1 mL di Buffer B2 su vortex per risospendere, applicando un magnete per separare le perline, e aspirando il tampone di lavaggio delle perle.
Nota: Ottimizzato vincolante il risultato di condizioni nel fondo minimo legame e resa ingrandita. È stato determinato sperimentalmente che biglie magnetiche Streptavidin T1 hanno una capacità di associazione significativamente maggiore rispetto dell'agarosi branelli, come pure altri branelli di streptavidina e meno sfondo vincolante di perle di streptavidina C1 ( Figura 4A ). - Aggiungere 900 µ l di campione dal punto 3.3.4. ai branelli lavati e ruotare durante la notte a 4 ° C.
Nota: Non non perle di vortice, una volta che il campione viene aggiunto a loro.
Nota: Se gli importi significativi di DNA o proteine sono isolati nel controllo negativo senza etichetta, questo passaggio può essere ridotto da pernottamento a 4 h per ridurre rilegatura.
- Preparare Streptavidin T1 biglie magnetiche trasferendo 300 µ l di liquami tallone ad un tubo di microfuge 1,5 mL. Preparare una provetta di perline per campione. Lavare 3 volte con 1 mL di Buffer B2 su vortex per risospendere, applicando un magnete per separare le perline, e aspirando il tampone di lavaggio delle perle.
- Lavare perline ed eluire vDNA e proteine associate.
Nota: Si consiglia di utilizzare puntali con filtro per i passaggi rimanenti.- Campioni di posto in una cremagliera del tubo magnetico microfuge, Rimuovi sovranatante, Risospendere delicatamente in 1 mL di Buffer B2, ruotare a 4 ° C per 5 min
- Ripetere tre volte il punto 3.5.1.
- Posizionare i campioni in una cremagliera del tubo magnetico microfuge, rimuovere il surnatante, risospendere in 1 mL di Buffer B3, delicatamente e ruotare a 4 ° C per 5 min.
- Miscela di microsfere di trasferire 100 µ l (volume di th 1/10) ad un nuovo tubo per isolamento del DNA associato. Applicare questo tubo al magnete, rimuovere il surnatante, risospendere perline in 100 µ l 1 x soluzione SDS-bicarbonato e procedere con il protocollo di isolamento del DNA (punto 3.6).
- Applicare il tubo contenente la miscela di microsfere di 900 µ l restante dal punto 3.5.3. al magnete, rimuovere il surnatante e risospendere perline in 50 µ l 2 x Laemmli buffer del campione per eluire complessi della DNA-proteina e proteina.
- Campioni di ebollizione a 95 ° C per 15 min, vortice, rapidamente nel microfuge e applicare il magnete. Trasferire l'eluato a un nuovo tubo, congelamento flash e conservare a -80 ° C.
Nota: Uso cap blocchi per garantire che i tubi non pop aprire durante la cottura.
Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto e campioni possono essere conservati a-80 ° C per diverse settimane. - Analizza campioni di proteine di Blue di Coomassie macchiatura, macchiarsi occidentale o spettrometria di massa di procedure standard 25. Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 4 e Figura 5.
Nota: Per determinare se il rendimento di proteina è sufficiente per la spettrometria di massa, 7,5 µ l di ogni campione viene utilizzato per l'analisi di macchiatura blu di Coomassie e 7,5 µ l per macchiarsi occidentale di un genoma virale rappresentanza associato la proteina (ICP4, ICP8 o UL42). Lo stesso volume di lisati dal passaggio 3.3.6. vengono eseguiti a fianco al controllo per i livelli della proteina di input. Il campione rimanente (35 µ l) viene poi analizzato dalla massa spettrometria come descritto in precedenza 25.
- Isolamento del DNA
- Incubare i campioni da passaggi 3.3.5. e 3.5.4. a 65 ° C per 4-16 h. Rimuovi il campione dai branelli magnetici, se necessario.
- Estrarre campioni con 150 µ l fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (PCI) e trasferire la fase acquosa ad un nuovo tubo.
- Estrarre la rimanente PCI con 100 µ l Tris-EDTA (TE) e aggiungere la fase acquosa ad un nuovo tubo.
- Estrarre campioni con 200 µ l cloroformio: alcool isoamilico (24:1).
- Purificare la fase acquosa utilizzando il Kit di purificazione di PCR secondo il produttore ' protocollo s.
Nota: L'indicatore di pH nel Buffer PB diventerà viola quando aggiunto al campione. Aggiungere 10 & n.181; PH di L 3m NaOAc 5.0 per diminuire il pH del campione. - Concentrazione di DNA determinare utilizzando un fluorometro.
Nota: Questo protocollo produce in genere 100-400 ng associato a perlina del DNA. Nessun DNA dovrebbe essere rilevato nell'eluito del controllo negativo in cui EdC non è stato aggiunto al passaggio 1.3. - DNA può essere conservato in un grippaggio del DNA basso tubo a 4 o - 20 ° C e può essere utilizzato per PCR in tempo reale o analisi di sequenziamento di throughput elevato.
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Representative Results
L'uso della chimica clicca per la purificazione di DNA dalle cellule è stata compiuta in primo luogo il metodo di iPOND21. Lo scopo di iPOND è quello di purificare le forcelle di replicazione cellulare per l'identificazione di proteine associate. Abbiamo adattato questa tecnica per studiare specificatamente interazioni proteina vDNA durante l'infezione. Manipolazione dell'approccio di etichettare genomi virali con EdC (Figura 1), combinati con le infezioni sincronizzate, ha permesso per l'isolamento selettivo e l'indagine di popolazioni separate di vDNA. DNA di HSV-1 è etichettata con EdC (Figura 1) per facilitare il collegamento covalente di un fluoroforo per l'imaging o biotina per purificazione (Figura 2). Virus può essere prelabeled prima dell'infezione per l'analisi di proteine associate con genomi in ingresso (Figura 1A) o con l'etichetta durante la replicazione del DNA per l'analisi di proteine associate con vDNA recentemente sintetizzato (Figura 1B)25. Inoltre, analisi di inseguimento di impulso possono essere utilizzato per indagare la natura di proteine associate con replicazione virale forcelle (Figura 1)26. DNA può essere visualizzato all'interno delle cellule per fornire informazioni spaziali sulla natura del DNA con etichetta e supporto per le interazioni identificate vDNA-proteina (Figura 3). Presi insieme, i protocolli descritti qui consentono l'indagine proteomica su molteplici aspetti della infezione produttiva per fornire una conoscenza dinamica dei cambiamenti che si verificano sui genomi di HSV-1. Questi approcci potrebbero essere ulteriormente adattati per studiare la latenza e riattivazione, per esaminare i fenotipi associati con mutanti virali e per studiare altri virus a DNA e RNA.
Gli aspetti di questo metodo di purificazione della proteina sono stati adattati da Leung et al. 22. qui un miglioramento importante per la purificazione di EdC DNA contrassegnato è l'uso delle perle di streptavidina T1 invece di perline rivestite con streptavidina agarosio. Per ottimizzare la purificazione del DNA, diversi tipi di perline rivestite con streptavidina sono stati testati per legame non specifico quando l'infezione è stato effettuato in assenza di EdC e per il recupero massimo della proteina in presenza di EdC (Figura 4A). Per questi esperimenti, macchiare occidentale è stato effettuato per la proteina vDNA ICP4. Purificazioni effettuate su streptavidina T1 perline ha provocati la quantità minima di rilegatura in assenza di EdC e il recupero di massimo proteine in presenza di EdC.
Proteine associate con vDNA possono essere identificati da metodi di proteomica compreso western blotting e spettrometria di massa. Macchiarsi occidentale può essere utilizzato per studiare la dinamica delle interazioni e spettrometria di massa può essere utilizzata come un approccio imparziale per identificare proteine romanzo vDNA associato. Un esempio di proteina resa come una funzione di crescente EdC etichettatura è mostrata in Figura 4B. Una sbavatura, piuttosto che un disegno a strisce chiara, è osservata solitamente di macchiatura blu di Coomassie. Questo è probabilmente perché c'è il DNA presente nel campione della proteina o perché c'è un'abbondanza di proteine. È anche importante notare che il rame catalizzatore usato nella reazione clic può causare parziale degradazione di proteine e acidi nucleici28,29. Mediante western blotting, i livelli simili di ICP4 vengono in genere rilevati in eluati (passaggio 3.5.5). dopo la purificazione di vDNA che è stata etichettata per 60 min con EdC come quella presente nella stessa quantità di input campione preparato da nucleare lystates (passo 3.3.6.). Questa informazione utilizzabile come guida per determinare se il recupero è sufficiente inviare il campione rimanente per l'analisi di spettrometria di massa.
Nano cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) può essere effettuata come descritto in precedenza25 per identificare proteine associate vDNA purificata. LC-MS/MS dati sono analizzati confrontando i valori spettrali totali (SpC) tra il campione sperimentale EdC-con l'etichetta e il controllo negativo senza etichetta corrispondente. Proteine sono considerate essere arricchita nel campione sperimentale basato sui seguenti criteri: 1) proteina ha almeno 5 conteggi spettrali (SpC) nel campione sperimentale, 2) proteina non viene rilevata nel controllo o è arricchita nel corso del controllo di almeno quattro volte Basato su dividendo i valori SpC e 3) la proteina è arricchita nel corso del controllo in due o più repliche biologiche. Il fattore di abbondanza spettrale normalizzata (NSAF: 
) può essere utilizzato per tenere conto delle differenze di peso molecolare (MW) e la proteina totale resa. Questa equazione determina l'abbondanza relativa delle singole proteine all'interno di un campione e consente il confronto diretto di due differenti condizioni sperimentali in cui gli importi differenti di vDNA sono purificati (ad esempio, confrontando (ingresso genomi virali Figura 1A) per replicare genomi (Figura 1B)).
Ci sono diversi modi per presentare i dati di arricchimento di proteine. Alcuni esempi includono i grafici a torta, diagrammi di Venn e reti di interazione della proteina. Grafici a torta possono essere utilizzati per illustrare la proporzione di proteine identificate che sono noti per funzionare in un determinato processo biologico (Figura 5A). Tuttavia, possono verificarsi problemi quando una proteina ha più di una funzione biologica, che è spesso il caso. Inoltre è difficile confrontare i dati tra diversi grafici a torta. Diagrammi di Venn sono utili per illustrare le relazioni tra proteine identificate sotto diverse condizioni sperimentali, ma non forniscono tutte le informazioni funzionali sulle proteine identificate (figura 5B). Reti di interazione della proteina ritrarre un'illustrazione visiva di potenziali interazioni tra proteine identificate e fornire informazioni sui tipi di processi biologici che sono coinvolti (Figura 5). Diverse risorse online sono disponibili per il mapping di interazioni proteina-proteina preveduta cui STRING (strumento di ricerca per il recupero di interazione geni/proteine)30. Strumenti online generalmente sono attrezzati per gestire i dati di proteomica di una varietà di specie e fornire preziose informazioni host proteine coinvolte nella meccanica del genoma virale. Tuttavia, proteine virali non sono generalmente inclusi nei database, che possono complicare l'analisi. Pertanto, è importante considerare le conclusioni principali uno vorrebbe trasmettere al momento di decidere come presentare dati di proteomica.
Figura 1:ONG > approcci all'etichetta DNA HSV-1. (A) analizzare lo stato del virus in ingresso, che riposa MRC-5 celle in G0 sono infettate con HSV-1 prelabeled e genomi sono dosati a meno di 4 hpi per studiare il DNA virale non replicato. (B) analizzare lo stato di replicate virus, cellule MRC-5 sono infettate con HSV-1 senza etichetta ed EdC (stelle arancioni) è aggiunto al medium della crescita delle cellule infettate e incubate per 2-4 h dopo l'inizio della replicazione del DNA virale (≥ 4 hpi). (C) test forcelle di replicazione virale, cellule infette sono etichettato con EdC per forcelle replica 5-20 min possono poi essere inseguite con deoxyC di impulso. EdC DNA contrassegnato è arancione. Questa figura è stata modificata da Dembowski e DeLuca25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Le procedure descritte in questo documento per analisi di EdC DNA contrassegnato. (A) una descrizione del metodo per l'imaging dell'EdC DNA contrassegnato. Tagged DNA è rappresentato in verde. (B) un contorno del metodo per la purificazione e l'analisi a valle di EdC etichettato vDNA. Questa figura è stata modificata da Dembowski e DeLuca25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Visualizzazione di EdC DNA contrassegnato. Le cellule erano infetti, etichettate e imaged come descritto nella Figura 1 e Figura 2. Immagini rappresentative di DNA virale e cellulare con etichettato vengono visualizzati. DNA cellulare colocalizza con macchia di Hoechst e vDNA con ICP4. Barra della scala: 5 µm.This figura è stata modificata da Dembowski e DeLuca25 and Dembowski et al. 26. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Risultati di purificazione della proteina rappresentante. (A) confronto del rendimento di proteina quando punti di purificazione sono stati effettuati utilizzando diversi tipi di perline di streptavidina. L'infezione è stato effettuato in presenza di EdC (+) per confrontare il rendimento di proteina o in assenza di EdC (-) per confrontare la rilegatura. Le infezioni e l'etichettatura di EdC sono stati effettuati come descritto in Figura 1B e complessi della DNA-proteina sono stati purificati seguendo i passaggi descritti in Figura 2B utilizzando importi paragonabili di diversi tipi di perline di streptavidina. Pannello superiore: confronto del rendimento della proteina dopo purificazione su streptavidina rivestito dell'agarosi branelli o streptavidina M-280. Pannello inferiore: confronto del rendimento di proteina dopo purificazione su streptavidina M-270, M-280, streptavidina C1 o streptavidina T1. Macchiarsi occidentale è stato effettuato con un anticorpo contro la proteina virale ICP4. ICP4 purificata è mostrato nella prima corsia per il confronto. Esposizione più lunga del pannello inferiore è stato richiesto di osservare una simile intensità di ICP4 nelle corsie "280" come nel pannello superiore. (B) rappresentante della proteina purificazione risultati in funzione del tempo di EdC etichettatura sono mostrati. Le infezioni e l'etichettatura di EdC sono stati effettuati come descritto in Figura 1B e complessi della DNA-proteina sono stati purificati seguendo i passaggi descritti in Figura 2B usando le perle di streptavidina T1. Etichettatura di EdC è stato effettuato per 0, 20, 40, o 60 min e Blue di Coomassie colorazione (in alto) e risultati (in basso) macchiantesi occidentali sono mostrati. Macchiarsi occidentale è stato effettuato con gli anticorpi specifici per ICP4, UL42 o GAPDH. Dal passaggio 3.5.5 è stato prelevato il campione di eluato. e lisato dal passaggio 3.3.6. La freccia indica la streptavidina, mentre L indica la scaletta della proteina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Esempi dei diversi modi di presentare dati proteomica. Grafici a torta (A) sintetizzare proteine che sono state identificate mediante spettrometria di massa di eluati di proteina associata con genomi virali purificati alle 6 hpi. I valori indicano il numero di proteine identificate per ogni categoria funzionale. T indica il numero totale di proteine identificate. Colori indicano le seguenti categorie: viola - elaborazione del RNA, rosso - trascrizione, verde - rimodellamento della cromatina, arancio - replicazione del DNA, giallo - nucleare trasporto, proteine strutturali di teal - citoscheletro, blu scuro - HSV e grigio - altri/unknown. (B) diagrammi di Venn raffigurano la sovrapposizione delle proteine identificate per essere associato con genomi virali a 6, 8 o 12 hpi. (C) A stringa mappa raffigura proteine arricchiti sulle forcelle di replicazione virale dopo un 5 min impulso di EdC. Proteine umane arricchite da 5 volte rispetto al controllo negativo senza etichetta vengono visualizzati nella mappa interazione funzionale, che è stata generata utilizzando STRING30 con le impostazioni dei dati per visualizzare le interazioni solo alta fiducia. Nomi di gene sono stati usati per mappare le interazioni. Cerchi indicano proteine che funzionano nello stesso processo biologico. Questa figura è stata modificata da Dembowski e DeLuca25 and Dembowski et al. 26. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo include più passaggi che, se non seguite con attenzione, possono provocare rese significativamente riduttrice della proteina o contaminazione con DNA cellulare. È fondamentale che cellule stazionarie sono utilizzate per tutti gli esperimenti per garantire che DNA cellulare non è etichettato e purificato. Questo può essere confermato dall'assenza di polimerasi del DNA cellulare del campione di proteine perché HSV-1 non utilizzare il cellulare DNA polimerasi per la sintesi di genoma. Durante EdC etichettatura e nuclei passaggi di raccolta, campioni dovrebbero essere sfalsati per garantire che ciascuno è trattato ugualmente. Durante fasi di purificazione, si dovrebbe prestare attenzione non per manipolare i nuclei pipettando troppo. Questo può portare a lisi prematura dei nuclei, nonché campione perdita dovuto attaccare ai lati delle punte di pipetta. Inoltre, il passo di sonicazione deve essere ottimizzato per sonicatori individuali e la quantità di perline rivestite con streptavidina utilizzata per l'associazione di biotina dovrebbe essere titolata per una resa ottimale della proteina.
Parecchie modifiche possono essere fatta al presente protocollo e includono l'uso di diversi virus o tipi cellulari o l'aggiunta di un passaggio alla reticolazione proteina al DNA. Quando si sceglie un tipo di cella da utilizzare per analisi proteomica, è importante verificare la disponibilità di un database di sequenze di proteine per quella specie. Mancanza di risorse di proteomica limiterà in maniera significativa a valle analisi di dati della proteina. Un'altra limitazione è la necessità di un numero elevato di celle, quindi può essere difficile da preparare abbastanza cellule primarie, quali neuroni, per questo esperimento. Questo metodo dovrebbe essere compatibile con altri virus del DNA o RNA, purché l'infezione virale non dipende dalla replicazione del DNA cellulare. Inoltre, sarebbe interessante esplorare i cambiamenti nelle interazioni della DNA-proteina che si verificano nei mutanti di HSV-1. Un'altra modifica al presente protocollo potrebbe essere l'aggiunta di un passaggio di reticolazione di formaldeide prima isolamento dei nuclei, che consentirebbe di condizioni più rigorose di lavaggio durante la purificazione21. L'aggiunta di formaldeide non influenzerà la capacità di raccogliere i nuclei ma può provocare in diminuzione della proteina resa a causa difficilmente invertendo le reticolazioni durante l'eluizione di proteina.
Risultati da questo protocollo rappresentano lo stato medio del DNA virale in esame. Di conseguenza, è difficile distinguere se complessi sono insieme sulle molecole del DNA stesse o separate. vDNA etichettatura metodi descritti qui in combinazione con formazione immagine ad alta risoluzione può essere utilizzato per verificare i dati di proteomica e può aiutare a distinguere tra diverse popolazioni del DNA con etichettato all'interno di una cella. Inoltre, ChIP-seq potrebbe essere usato come un follow-up metodo per identificare le posizioni specifiche delle proteine sul genoma virale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo Hannah Fox per aiuto nella preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal NIH concedere R01AI030612.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
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