Summary
このプロトコルの目標は、具体的にはタグし、関連付けられているウイルスのゲノムのタンパク質のキャラクタリゼーションのため感染細胞からウイルス DNA を選択的に分離することです。
Abstract
このプロトコルの目標は感染した細胞の同定 (HSV-1) DNA 関連ウイルス単純ヘルペス ウイルス 1 型を分離する、細胞タンパク質質量分析法。ウイルスのゲノムと相互作用するタンパク質を担う感染症の結果を決定する上で主要な役割が、関連付けられているウイルスのゲノムのタンパク質の網羅的解析は以前は不可能だった。ここで我々 は、感染細胞からの HSV-1 ゲノムの直接浄化を可能にするメソッドを示します。ウイルス DNA を複製する選択的にアルキン官能を含む修正されたヌクレオチドにラベル付けされています。標識 DNA、特に不可逆的なタグ、ビオチン アジ化銅 (I) 経由での共有添付ファイルを介して-アジ化物アルキンの環化付加反応やクリックの反応を触媒。ストレプトアビジン コーティング ビーズにビオチン標識 DNA が浄化され、関連付けられているタンパク質の溶出し質量分析によって識別されます。このメソッドには、選択的ターゲティングと HSV 1 複製フォークまたは複雑な生物的環境から全体のゲノムの分離ができます。さらに、このアプローチの適応は他の DNA ウイルスのゲノムの検査と同様に、ウイルス感染症の様々 な側面の調査のためになります。
Introduction
ウイルスは、重要な機能を遂行し、したがって感染症ウイルス遺伝子発現、レプリケーション、修理、再結合、輸送などの重要な側面を促進する宿主因子に依存する限られた能力を持っています。これらの宿主因子の活動がエンコードされたウイルス蛋白質によって補強されること。さらに、ウイルスはウイルス感染に対する細胞応答の検出と干渉を避ける必要があります。したがって、ウイルス ホスト相互作用は、感染症の結果を左右します。最も重要のウイルスがウイルスのプロセスを容易にする細胞の機械に合わせて携帯電話の環境を変更する方法を理解されています。特別な関心の感染サイクルを通してウイルスのゲノムに関する法律のどの要因とプロセスで識別します。
単純ヘルペス ウイルス タイプ 1 (HSV-1) は、二本鎖 DNA ウイルスは人間の人口のかなりの割合が感染します。感染の最初の 1 時間内でウイルスのゲノムはウイルスの遺伝子発現の順序付けされたカスケードがウイルス DNA (vDNA) レプリケーション1との連携ですさまじい核を入力します。核のゲノムはエピジェネティック制御は予告、修復と組換えを受けるし、6 時間未満内最初の子孫ウイルス粒子を生産するように、カプシドに包まれます。感染症のコース全体を通じて関連付けられているウイルスのゲノム蛋白質の包括的な評価、ウイルス ゲノムに関する法律、どのウイルスおよび細胞の要因を理解するためのプロセスの分子の詳細を調べるに土台を築く感染症のさまざまな段階に関与しています。
ウイルス感染に関与する宿主因子の調査のための以前の方法は、関連する細胞蛋白質2,3,4、5の分析のためのウイルス蛋白質の親和性の浄化,6,7,8,9. これらの試金は抗ウイルスのホストの応答としてウイルス性クロマチンの修飾、遺伝子発現に関与する細胞因子の同定のため尽力されているし、DNA 修復します。ただし、vDNA との関連付けに依存する相互作用プロテオミクスのみ特定ウイルス因子の関数として発生する相互作用への洞察力を提供するかどうかを確認することは困難です。クロマチン免疫沈降 (チップ) は、特定のウイルスおよび細胞の蛋白質がウイルスのゲノム10、11,12,13,14にバインドを識別するために使用されています,15と蛍光そのままの交配 (魚) 併用免疫細胞化学は vDNA16,17,18,と colocalize の細胞の要因の可視化が有効になっています。19,20します。 これらの試時空間解析を可能にします。ただし、制限は、特異性の高い抗体、限られた感度とウイルスの宿主に以前の洞察力のための必要性の必要性を含めます。そこで iPOND (初期の DNA に蛋白質の分離)21に基づく方法と感染ウイルスのゲノムの公平な識別のため細胞の選択的にラベルを付けから vDNA を浄化する aniPOND (加速ネイティブ iPOND)22質量分析法によるタンパク質関連。iPOND は、細胞複製フォーク力学の調査のために尽力されています。
感染細胞からのウイルスのゲノムの選択的浄化、5-エチニル-2´-デオキシウリジン (EdU) または 5-エチニル-2´-デオキシシチジン (EdC) (図 1)、共有結合に続いて変更エチニル ヌクレオシドとラベルは vDNA を複製します。経由でビオチン アジ化する共役は、ウイルス ゲノムおよびストレプトアビジン コーティング ビーズ (図 2 b) に関連付けられているタンパク質の 1 つのステップ精製を容易にするために化学をクリックします。重要なは、感染症は、vDNA の特殊にラベリングを有効にする細胞の DNA 複製に従事しない定置型電池で実行されます。さらに、HSV-1 感染により、細胞周期の停止と細胞の DNA 複製23,24を抑制します。ウイルスを受信ウイルス ゲノム (図 1 a) に関連付けられている蛋白質の分析のための感染前に prelabeled または新たに合成された vDNA (図 1 b) に関連付けられている蛋白質の分析のための DNA 複製時にラベルすることができます。25します。 さらに、パルス チェイス分析はウイルス複製フォーク (図 1)26に関連付けられているタンパク質の性質を調査する使用できます。また、エチニル変更 vDNA は、空間におけるタンパク質ダイナミクス (図 2 aおよび図 3) の蛍光体にした共役系します。イメージングは、vDNA の直接可視化は、vDNA 蛋白質の相互作用を検証するための無料のアプローチで、感染でウイルスのゲノムをトラックに適応することができます。ヤマメ感染、遅延、再活性化などのあらゆる側面を研究し、他の DNA ウイルスを研究、これらのアプローチがさらに変更することができると期待しています。また、5 エチニル ウリジンとラベリング (EU) により、RNA のウイルスのゲノムの分析のため。
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Protocol
1。 細胞培養、ウイルス感染および EdC ラベリング ( 図 1)
次のプロトコル ウイルスの作業が含まれます。あなたの機関を参照してください ' ウイルスやその他の生物学的製剤の安全な取り扱いに関する s バイオ安全プロトコル。このプロトコルは、ピッツバーグ大学の制度上の審査委員会によって承認されました
。- Trypsinize MRC 5 セルの合流 150 cm 2 培養フラスコ、100 mL DMEM プラス 10% を含む 600 cm 2 組織培養プレートにセルを転送 FBS。合流と静止した段階に到達する 3-4 日間 5% CO 2 の存在下で 37 ° C で孵化させなさい。合流 600 cm 2 皿には、7 ~ 10 の 7 セル x が含まれています。条件ごとに 1 プレートと各対応する否定的な制御のための 1 のプレートを準備します
。 注: 電池がその唯一の vDNA ラベル付けされて後続のステップで精製できるように細胞の DNA 複製を阻害する静止した段階に達する必要があります
。 注: 各サンプルが必要です無料同じ感染条件と EdC 添加せず時間ポイントを使用したネガティブ コントロールをラベルします
。 注: スケール ダウン バージョンのこの実験は行われるべきに匹敵する増殖、感染症の分類の条件、EdC を用いたイメージングによる細胞 DNA の分類のためのテスト時間ポイント (手順 2 を参照). - 希釈 7 × 10 8 7 mL PFU HSV 1 冷 Tris-Buffered 生理食塩水 (TBS)。成長培地を取り除き、37 ° C で保存感染 MRC 5 セルに 7 mL 希釈ウイルスを追加し、室温で 1 時間ロックします。吸着、次接種を取り外し、50 mL 室温 TBS、すすぎおよび元の成長培地を交換します。5% CO 2 の存在下で 37 ° C で孵化させなさい。この手順を各実験条件と負のコントロールの実施必要があります
。 注: 増加 EdC のラベリングを実現できますウイルス dUTPase (UL50 遺伝子) および/またはウラシル グリコシラーゼ (UL2 遺伝子) 発現の HSV-1 欠損変異株を用いたします。HSV-1 dUTPase、低い基質特異性がありいくつかヌクレオシド類似体 25 , 27 の活性化を減らすことができます 。
EdC と - ラベルのウイルスのゲノム。着信ゲノム (1.3.1) ゲノム (1.3.2)、またはウイルスの複製フォーク (1.3.3) 複製のラベルに指示に従ってください
。 注: 唯一のステップ 1.3.1、1.3.2、または 1.3.3 実施されなければならない受信ゲノム、レプリケートされたゲノムまたは複製フォークがそれぞれ以降の手順で分析するかどうかに応じてします
。 注: エドゥや f ara エドゥは、EdC の代わりできます。ヌクレオシド類縁体の毒性を監視され、最小化する必要があります。- 使用 prelabeled ステップ 1.2 で感染を行い、ステップ 2 に進んでくださいする株式または 4 h 以内 3 投稿レプリケートされていない vDNA ( 図 1 a) を調査する感染 (hpi).
注: は、prelabeled ウイルス 25 上記プロトコルを使用して株式を準備します。ウイルス株は、任意の残留 EdC を削除する G-25 列を介して渡す必要があります 。
- ラベル 5 〜 25 μ M を追加しての複製 vDNA 2 4 時間 ( 図 1 b) 感染細胞の細胞培養液に EdC。追加すると、前に成長培地 1 mL で EdC を希薄化します 。 VDNA レプリケーションの発症後ウイルスの複製フォークのラベルに
- (≥ 4 hpi)、パルス ラベル 5-25 μ m vDNA を複製する EdC 5 ~ 20 分。追いかける、追いかける培 25 100 μ M 2´deoxycytidine で 3 x をすすいでください (deoxyC)、さらに 20-40 分 ( 図 1) チェイス媒体の存在下でインキュベーションしてと。
。 注: パルスとチェイスの媒体は使用前に CO 2 を 37 ° C、5% に平衡する必要があります
。 注: パルス追跡する実験、それはセルを入力し、彼らは複製 DNA に組み込まれることができる前にリン酸化されるヌクレオシドにかかる時間の量を考慮することが重要。これは経験的に定められる必要があります
。 注: パルス追跡する実験の解像度を調べるには、使用される実験条件下でウイルスの複製率を計算します。これは一歩成長時間コース 26 中にウイルスのゲノムの量的な PCR によって決定できる
。 注: ウイルスのゲノムのイメージングのためステップ 2 に進み、ウイルス ゲノムの浄化のためには、ステップ 3 に進みます 。
- 使用 prelabeled ステップ 1.2 で感染を行い、ステップ 2 に進んでくださいする株式または 4 h 以内 3 投稿レプリケートされていない vDNA ( 図 1 a) を調査する感染 (hpi).
2。EdC のイメージング標識 DNA ( 図 2 a)
注: 細胞 DNA が実験でラベルはありませんを確認するウイルスのゲノムの精製法とタンデムでイメージングを実行すると便利です。画像は、ラベル付き vDNA の性質を視覚化し、プロテオミクス データを検証にも使えます。細胞やウイルスの DNA が染色パターンの例として、 図 3 に示す.
- 感染を行い成長培地 1 mL を含む 12 ウェル培養皿に coverslips に条件 EdC ラベル以外を使用して手順 1 で示されているように縮小します 。 室温 15 分 1 × PBS の
- 修正セル 1 mL 3.7% パラホルムアルデヒド固定後、リンス細胞 2 倍の PBS で 1 mL 3 %bsa で
。 注意: パラホルムアルデヒドは深刻なまたは永続的な損傷を引き起こすことができます。安全上の注意に従ってください
。 注: プロトコルをここで一時停止できるし、coverslips 第 2 洗浄の 4 ° C で保存できる 3 日間 。
- 1 mL 透過バッファーとセルを permeabilize [材料表 を見る] ロッキングしながら室温で 20 分間です 。
- 揺動中 3 %bsa をし、室温で 30 分間 PBS で 1 mL 3 %bsa を用いたブロック 1 mL でリンスします 。
- クリック反応カクテルの 1 つの mL を追加 [材料表 を見る] 共有 Alexa Fluor 488 を共役に coverslips に edc のアジ化が分類される DNA。揺動中 30 分間室温でインキュベートします。吸引、1 mL の PBS で 2 回すすいでください 。
- 1 ml の揺動中室温で 30 分間 PBS のヘキストの 1:2,000 の希釈の細胞 DNA を染色します。吸引、1 mL の PBS で 2 回すすいでください 。
- 染色標準に従って第一次および二次抗体と間接蛍光抗体法 25 のプロトコルします
。 注: ラベル付き vDNA colocalizes ICP8、ICP4、または UL42 と細胞標識 DNA colocalizes ヘキスト染色 。
- スライド coverslips をマウントし、イメージの蛍光顕微鏡を用いた細胞
。 注: スライド格納できる 4 ° C で数週間 。
3。VDNA と関連タンパク質の精製
注: このプロトコルのいくつかの側面は、レオン ら から適応されています。 22
注: すべてのバッファーおよび試薬を使用する前に氷の上冷蔵する必要があり、すべてのステップべきである氷の上特に明記しない限り
- 核を収穫します
。 注: 前の核の隔離、に、ホルムアルデヒドは DNA に架橋蛋白質に使用できます。厳しい洗浄条件は、ストレプトアビジンをコートしたビーズで DNA 精製時に使用できます。Crosslinking、洗浄条件を参照してください Sirbu et al. 21.- 20 ml の核抽出バッファー (NEB) 成長培地を交換し、時折ロッキング 4 ° C で 20 分間インキュベートします。核が顕微鏡で見えるようになります 。
- 細胞スクレーパーを使用してプレートから核をこすりし、50 mL の円錐管に転送します。核をペレット、上澄みを廃棄に 4 ° C で 2,500 x g で 10 分間遠心します
。 注: トリパン ブルー染色は細胞から核の分離を確認する使用できます 。
- そっと 10 mL の PBS、15 mL の円錐管に転送に核ペレットを取り除くし、4 ° c. 完全に削除 PBS で 2,500 x g で 10 分間遠心分離によってペレットします
。 注: 核を凍結することができます、プロトコルをこの時点で一時停止することができます。これを行うには、穏やかで再懸濁します核ペレット 500 μ L 凍結バッファーし、エタノール/ドライ氷浴でチューブを孵化させなさい。-80 ° C で凍結核を格納します。使用前に室温で核を解凍、氷、10 mL の PBS、ミックス、4 ° C で 2,500 x g で 10 分間の遠心分離でペレットに優しくロックを追加にすばやく転送、PBS を完全に削除します。低収量があります核凍結します 。
- EdC に共役したビオチン アジ ラベル vDNA。
- 10 mL クリック反応における核ペレット ミックス [材料表 を見る] 上下に軽くピペッティングして 5 回 10 mL のピペットを使い、再懸濁します
。 注: クリック反応混合物に含まれる試薬が指定された順序で追加されていることが重要です 。
4 ° C で 1 時間の - を回転させる回転しながら準備し、バッファーの B1、B2、および B3 [材料表 を見る] を寒さ 。
- ペレット 4 ° c. 完全に削除で 2,500 x g で 10 分間遠心分離核反作用の組合せをクリックし、優しく 4 で 2,500 x g で 10 分間遠心分離 10 mL の PBS に再してペレットを洗浄 ° C
- には、1 mL の PBS に核ペレットと大口径のピペット チップを使用して 1.5 mL および microfuge の管への転送軽く再懸濁します。2,500 x 4 ° c. 完全に削除 PBS で g と液体窒素で凍結で 10 分間遠心分離によって核をペレットします
。 注:、プロトコルがこの時点で一時停止にできる、核は、同じ日にステップ 3.3 に赴く際にも冷凍フラッシュする勧めしますので、後続の換散を-80 ° C 凍結融解で凍結核を格納できます 。
- 10 mL クリック反応における核ペレット ミックス [材料表 を見る] 上下に軽くピペッティングして 5 回 10 mL のピペットを使い、再懸濁します
- 核を溶解し、DNA のフラグメントします。
- は、氷の上の核を解凍し、500 μ L ではバッファー B1 上下ピペッティングによって再懸濁します。45 分の氷の上を孵化
- Sonicate サンプル 6 回の 30 s 各 3 mm マイクロ探針プローブを用いた 40% 振幅で。30 の氷のサンプルを場所パルス間 s。明確な曇りない超音波処理、サンプルが表示されます
。 注: 超音波照射条件は、個々 の sonicators を最適化する必要があります。超音波照射条件を最適化する方法の詳細についてレオン ら を参照してください。 22. - 4 ° C で 10 分間 14,000 × g で遠心分離によって細胞の残骸をペレットペレットのサイズが大幅に減少します。100 μ M の細胞のストレーナーで上清をフィルターし、流れを保持します 。
- 追加 500 μ L 3.4.2 の手順でこのサンプルのフィルター処理された上澄み 900 μ l にバッファー B2 を使用されます。 。
- DNA の隔離 (50 μ L または 1/20 ボリューム) の各条件の因数を取るし、x SDS 重曹液 50 μ l 添加 2 [材料の表 を参照してください]。DNA の隔離のプロトコル (手順 3.6) に進みます 。
- 入力蛋白質 (50 μ L または 1/20 ボリューム) の各条件の因数を取ると 50 μ L 2 x 塩化物イオン サンプルバッファーを追加、液体窒素で凍結、-80 デパート ° C. 3.5.6 の手順で使用します 。
- バインド ビオチン化 DNA にストレプトアビジン コーティング ビーズ。
- ビーズ スラリーの 300 μ L を 1.5 mL および microfuge の管に転送することによって磁気ビーズをストレプトアビジン T1 の準備します。サンプルあたりのビーズの 1 つの管を準備します。洗うビーズ 1 ml バッファー B2 に再懸濁しますボルテックス、ビーズを分離する磁石を適用し、吸引洗浄バッファーで 3 x.
注: は、最大収量と最小限の背景結合条件結果のバインドを最適化されています。ストレプトアビジン T1 磁気ビーズが大きく結合能と他のストレプトアビジン ビーズと同様、アガロース ビーズより背景結合ストレプトアビジン C1 ビーズよりも小さいであることが決定された実験的 ( 図 4 a). - ステップ 3.3.4 からサンプルの追加 900 μ L. ビーズを洗浄し、回転の 4 泊 ° C
注: それらに追加するサンプルにない渦ビーズをしないでください
。 注: 大量の DNA やタンパク質を分離するラベルのない否定的な制御で、このステップ減らすことができます一晩から背景の結合を減らすために 4 h にします 。
- ビーズ スラリーの 300 μ L を 1.5 mL および microfuge の管に転送することによって磁気ビーズをストレプトアビジン T1 の準備します。サンプルあたりのビーズの 1 つの管を準備します。洗うビーズ 1 ml バッファー B2 に再懸濁しますボルテックス、ビーズを分離する磁石を適用し、吸引洗浄バッファーで 3 x.
- ビーズを洗浄し、vDNA と関連するタンパク質を溶出します
。 注: 残りの手順にフィルターのヒントを使用することをお勧めします。- 磁気および microfuge の管ラック、削除上清に場所サンプルは優しく 1 mL バッファー B2、4 ° C で回転 5 分で再懸濁します
- 手順を繰り返します 3.5.1 3 回 。
- 磁気および microfuge の管ラックにサンプルを置き、上清を除去、優しく 1 mL バッファー B3 で再懸濁します、4 ° C、5 分で回転
- 転送 100 μ L ビーズ混合 (1/10 th 容積) バインドされた DNA の隔離のための新しい管へ。マグネットにこのチューブを適用、上清を除去、100 μ L 1 x SDS 重曹液でビーズを再懸濁します、DNA の隔離のプロトコル (手順 3.6) に進みます 。
- ステップ 3.5.3 から残り 900 μ L ビーズの混合物を含んでいる管を適用、磁石に培養上清を削除し、50 μ l 2 x 蛋白質および DNA 蛋白質の複合体を溶出する塩化物イオン サンプル バッファーでビーズを再懸濁します。 。
- 15 95 ° C で沸騰サンプル分、渦、すぐに、および microfuge のスピンし、磁石を適用します。溶出液を新しいチューブ、フラッシュ凍結し-80 で店に転送 ° C
注意: 沸騰中オープンされているチューブがポップしないように使用キャップ ロックします
。 注: プロトコルをこの時点で一時停止できるし、サンプルは数週間-80 ° C で保存できます 。
- ブルー染色、西部のしみが付くこと、または標準的な手順 25 質量分析による蛋白質のサンプルを分析します。代表的な結果を 図 4 および 図 5 に示します
。 注意: 蛋白質収量が質量分析法のために十分であるかどうか、各サンプルの 7.5 μ L が使用する分析用ブルー染色および代表的なウイルスのゲノムのウェスタンブロッティング用 7.5 μ L 関連蛋白質 (ICP4、ICP8、または UL42)。3.3.6 のステップからの lysates の同じボリューム。入力蛋白質のレベルのコントロールと一緒にを実行されます。質量 (35 μ L) の残りのサンプルが分析され、 25 を前述のように分析します 。
- DNA の隔離
- 3.3.5 の手順からサンプルをインキュベートしますと 3.5.4。 必要に応じて磁気ビーズからサンプル 4-16 h. 削除 65 ° C で。 。
- 150 μ L フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (PCI) のサンプルを抽出し、新しい管に水相を転送します 。
- 100 μ L で残りの PCI を抽出トリス EDTA (TE) し、新しい管に水相を追加 。
- 200 μ L クロロホルム: イソアミル アルコール (24:1) とサンプルを抽出します 。
- 浄化水性相は、メーカーによると PCR 精製キットを使用して ' s プロトコル
。 注: バッファー PB で pH 指示薬はサンプルに追加されたときに紫色になります。10 ・ # を追加します。181;L 3 M NaOAc pH 5.0 のサンプルの pH が低下する 。
- を決定する DNA 濃度を蛍光光度計を使用しています
。 注: このプロトコルは通常、100-400 ng ビード区切 DNA を生みます。手順 1.3 EdC の追加がされませんでしたネガティブ コントロールの溶出 DNA は検出されませんする必要があります 。
- 低 DNA 結合に DNA を格納できる 4 または - 20 ° C のチューブし、リアルタイム PCR または高スループット シーケンス解析に使用できます 。
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Representative Results
クリックケミストリーのセルからの DNA の精製用は iPOND 法21によって初めて達成されました。IPOND の目的は、関連付けられているタンパク質の同定のため細胞複製フォークを浄化することです。我々 は、特に感染時 vDNA 蛋白質の相互作用の研究にこの手法を適応しています。選択分離そして vDNA の個別集団の調査のため同期感染症と組み合わせる EdC (図 1) とウイルスのゲノムのラベルへのアプローチの操作ができました。HSV 1 DNA にはイメージング用蛍光やビオチン (図 2) の浄化のために共有添付ファイルを容易にする EdC (図 1) が付いています。ウイルスを受信ゲノム (図 1 a) に関連付けられている蛋白質の分析のための感染症の前に prelabeled または新たに合成された vDNA (図 1 b)25に関連付けられている蛋白質の分析のための DNA の複製中にラベル付けできます。さらに、パルス追跡解析は、ウイルスの複製フォーク (図 1)26に関連付けられているタンパク質の性質を調査する使用できます。識別された vDNA タンパク質間相互作用 (図 3) のラベル付きの DNA とサポートの性質に関する空間情報を提供するために細胞内で DNA を視覚化できます。一緒に取られて、ここで説明したプロトコルは HSV 1 ゲノム上に発生する動的な変更への洞察力を提供するために生産性の高い感染症の複数の側面のプロテオーム研究の許可します。これらのアプローチは、遅延や再活性化、ウイルスの変異に関連付けられている表現型を調べると他の DNA と RNA のウイルスを研究する調査にさらに適応できます。
この蛋白質の浄化方法の側面は Leung et alから合わせられました。22。 ここで主要な改善 EdC の精製分類される DNA はストレプトアビジン コーティング アガロース ビーズではなく T1 ストレプトアビジン ビーズを使用。DNA の浄化を最適化するには、ストレプトアビジンをコートしたビーズのいくつかの種類を調べた非特異的結合感染は EdC (図 4 a) の存在下で最大タンパク質の回収、EdC の不在で行われたとき。これらの実験のため西部にしみが付くことを行った vDNA 結合蛋白質 ICP4 の。精製ビーズ EdC と EdC の存在下で最大タンパク質の回収の不在で背景結合の量が少なくなったストレプトアビジン T1 で実施します。
VDNA に関連付けられているタンパク質は、プロテオームなど西部にしみが付くことおよび質量分析によって識別できます。知られている相互作用の動力学を調査するため使用することができます西部にしみが付くことおよび質量分析法は、関連付けられている新規の vDNA 蛋白質を識別する公平なアプローチとして使用できます。タンパク質の例は、増加 EdC ラベリング関数を図 4 bに示すように得られます。明確な帯状の模様ではなく、スミアは通常ブルー染色で観察されます。蛋白質のサンプルで現在の DNA があるので、または蛋白質の多量があるので可能性が高いです。また、クリック反応に用いられる銅の触媒がタンパク質と核酸の28,29の部分的な分解を原因、注意することが重要です。ウェスタンブロット法で波 (ステップ 3.5.5。) で同じ量核 lystates (ステップ 3.3.6。) から調製した入力サンプルの提示することとして EdC と 60 分のために標識された vDNA の精製後 ICP4 の同じようなレベルを検出する通常されます。この情報は、回復が質量分析計の残りのサンプルを送信するのに十分であるかどうかを決定するためのガイドとして使用できます。
ナノ液体クロマト グラフ/タンデム質量分析法 (MS/LCMS) は、精製された vDNA に関連付けられている蛋白質を識別する25を前述のよう実施することができます。LC ・ MS/MS データは、EdC ラベル実験サンプルと対応するラベルのない否定的なコントロールの値のスペクトル カウント (SpC) を比較することによって分析されます。タンパク質は次の基準に基づいて実験サンプルの豊かさと見なされます: 1) 蛋白質は、実験試料の少なくとも 5 スペクトル数 (SpC)、2) タンパク質がコントロールで認識されないまたは統制によって少なくとも 4 倍濃縮されてSpC 値と 3 分割に基づく) 2 つ以上の生物学的複製の制御をタンパク質を濃縮します。正規化されたスペクトルの豊富な因子 (NSAF: 
) 分子量 (MW) と総蛋白収量の違いを考慮して使用することができます。この方程式サンプル内での個々 のタンパク質の相対量を決定し、vDNA の量が異なるが (の例では、(入力のウイルスのゲノムを比較すると精製が 2 つの異なる実験条件の直接の比較では、図 1 a)レプリケートするゲノム (図 1 b))。
タンパク質濃縮データを表示する複数の方法があります。いくつかの例は、円グラフ、ベン図、タンパク質相互作用ネットワークをなど。円グラフは、特定の生物学的プロセス (図 5 a) で機能する知られている特定の蛋白質の割合を説明するために使用できます。ただし、1 つのタンパク質には多くの場合 1 つ以上の生物学的機能がある場合、問題が生じる可能性があります。また、別の円グラフでデータを比較することは困難です。ベン図は異なる実験条件下で識別される蛋白質の間の関係を示すに役立ちますが、蛋白質の識別 (図 5 b) についての機能の情報を提供しません。タンパク質相互作用ネットワーク識別された蛋白質の潜在的な相互作用の視覚的な図を描くし、生物学的プロセスの種類についての情報を提供する (図 5) を関与しています。文字列 (検索の相互作用の遺伝子/蛋白質の検索ツール)30を含む予測タンパク質間相互作用のマッピングには、いくつかのオンライン リソースがあります。オンライン ツール一般的に様々 な種からのプロテオミクス データ処理ウイルスゲノム力学に関係するホスト タンパク質に関する貴重な情報を提供しおります。ただし、ウイルス蛋白質は一般的に分析を複雑にすることができますデータベースに含まれません。したがって、1 つはプロテオミクス データを表示する方法を決定するときに伝えたい主要な結論を考慮する重要です。
図 1:オング >ラベル HSV 1 DNA へのアプローチです。(A) 受信ウイルス、MRC 5 を安静時の状態を試金する G0のセルは、prelabeled の HSV-1 に感染しているし、ゲノム研究レプリケートされていないウイルス DNA より小さい 4 hpi で試金されます。(B) の状態を試金する複製ウイルス、MRC 5 セルはラベルの HSV-1 に感染している、EdC (オレンジ色の星) は感染細胞の成長媒体に追加され、ウイルス DNA の複製 (≥4 hpi) 発症後 2-4 時間インキュベートします。(C) ウイルスの複製フォークを試金するため感染細胞の 5-20 分複製フォークすることができます deoxyC に追われる、EdC の付いたパルスは。分類される DNA EdC は、オレンジです。この図は、Dembowski、デルーカの25から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:EdC の分析分類される DNA のため本稿で説明している手順です。イメージング法の概要 (A) EdC が分類される DNA。付けられた DNA は、緑色で表されます。(B) 浄化法の概要と EdC のストリーム分析 vDNA というラベルの付いた。この図は、Dembowski、デルーカの25から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:EdC の可視化が分類される DNA 。細胞感染、ラベル、図 1に示すようにイメージと図 2。ラベル付きの細胞およびウイルス DNA の代表的な画像が表示されます。細胞の DNA は、ヘキスト染色および ICP4 と vDNA colocalizes します。スケール バー: Dembowski し25と Dembowskiらから 5 µm.This の図が変更されました。26.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表蛋白質精製結果。(A) 蛋白質収量精製工程はストレプトアビジン コーティング ビーズのいくつかの種類を使用して行ったときの比較。感染症は、または背景バインディングを比較する EdC (-) の不在でタンパク質の収量を比較する EdC (+) 存在下で実施されました。感染症や EdC ラベリングを実施した前述の図1 b とストレプトアビジン コーティング ビーズの種類の同等額を用いて図 2 bに記載されている手順に従って DNA-タンパク質複合体を精製しました。上部パネル: 蛋白質収量アガロース ビーズやストレプトアビジン M-280 ストレプトアビジンの浄化がコーティングされた後の比較。底板: ストレプトアビジン M-270 浄化後蛋白質収量の比較 M-280 ストレプトアビジン C1 やストレプトアビジン T1。ICP4 のウイルスの蛋白質に対する抗体を用いたウエスタンブロットを行った。精製 ICP4 は比較のため第 1 レーンに表示されます。下のパネルの長い露光時間は、上部のパネルのようにレーン「280」ICP4 のような強度を観察する必要でした。EdC のラベリングの時間の関数として (B) 代表的なタンパク質精製結果が表示されます。感染症や EdC ラベリングを実施した前述の図1 b と T1 ストレプトアビジン ビーズを使用して図 2 bに記載されている手順に従って DNA-タンパク質複合体を精製しました。0、20、40、60 分やブルー染色 (top) の行った EdC ラベリングおよび西部のしみが付く (下) 結果が表示されます。西部にしみが付くことを行った特異抗体を ICP4、UL42、または GAPDH の。溶出液のサンプルは、ステップ 3.5.5 から取られました。ライセート 3.3.6 のステップから。矢印は、ストレプトアビジンを示し、L 蛋白質の梯子を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:プロテオミクス データを表示するさまざまな方法の例です。(A) パイ グラフ要約 6 hpi で精製ウイルスのゲノムに関連付けられている蛋白質波の質量分析によって識別された蛋白質。値は、タンパク質機能カテゴリごとに特定の数を示します。T は、特定のタンパク質の合計数を示します。次のカテゴリが指定した色: 紫色 - RNA プロセシング、赤 - 緑 - 転写のクロマチン、- DNA の複製、黄色 - オレンジ色の核内輸送、ティール - 細胞骨格、濃い青 - HSV の構造蛋白質と灰色 - その他/不明。(B) ベン図は 6、8、または 12 hpi でウイルスのゲノムに関連する特定の蛋白質の重なりを描きます。(C) A 文字列マップ 5 分 EdC パルス後ウイルスの複製フォークの濃縮タンパク質を示しています。5 倍濃縮ヒトタンパク質に比べて機能的相互作用マップでは、唯一の高信頼の相互作用を表示するデータの設定と文字列30を使用して生成されたラベルのない否定的なコントロールが表示されます。遺伝子名は、相互作用をマップする使用されました。円は、同じ生物学的プロセスで機能する蛋白質を示します。Dembowski し25と Dembowskiらからこの図が変更されました。26.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルには、慎重に、従わない場合に大幅に削減蛋白質収量または細胞の DNA の混入を引き起こすことがある複数の手順が含まれています。定置型電池を使用すべての実験細胞の DNA はないラベル、精製したことを確認することが重要です。これは、HSV-1 はゲノム合成細胞の DNA ポリメラーゼを利用しないので蛋白質のサンプルの細胞の DNA ポリメラーゼの不在によって確認できます。EdC のラベリングと核収穫の手順は、サンプルを交互それぞれが均等に処理されるようにします。精製工程中に核をあまりピペッティング操作に注意をすべき。これはピペット先端の両側に付着のためのサンプルの損失と同様、核の早期溶解する可能性があります。さらに、超音波処理の手順は、個々 の sonicators の最適化必要があり、ストレプトアビジン コートしたビーズとビオチン バインディングに使用量は、最適な蛋白質収量の滴定する必要があります。
いくつかの変更はこのプロトコルにして異なるウイルスや細胞の種類の使用や DNA に架橋タンパク質へのステップの追加と。プロテオーム研究に使用するセルの種類を選択すると、その種のタンパク質配列のデータベースの可用性を確認することが重要です。プロテオミクス資源の不足は大幅にタンパク質データのストリーム分析を制限します。別の制限は、多数のセルの必要性、そのためこの実験のため十分な初代培養細胞、神経細胞などを準備することは困難があります。このメソッドは、ウイルス感染が細胞の DNA 複製に依存しない限り、他の DNA または RNA ウイルスと互換性があります。さらに、HSV-1 突然変異で発生する DNA 蛋白質の相互作用の変化を探るは興味深いででしょう。このプロトコルへの別の変更は、浄化の21時より厳しい洗浄条件可能になる核の分離前にホルムアルデヒド架橋ステップの追加可能性があります。ホルムアルデヒド添加核を収穫する機能は影響しませんが減らされた蛋白質収量タンパク質の溶出時に架橋を難しく反転のため可能性があります。
このプロトコルからの結果は、検討されているウイルスの DNA の平均状態を表します。したがって、錯体が同じまたは別の DNA 分子上に共存する場合を区別することは困難です。vDNA 高分解能イメージングとの組み合わせでここで説明する方法をラベリング プロテオミクス データを確認するためし、セル内で分類された DNA の異なった人口間で区別を助けることがあります。さらに、ウイルスのゲノムのタンパク質の特定の場所を識別するためにフォロー アップの方法としてチップ seq を使用可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は、この原稿の準備で助けをハンナ フォックスを認めます。この作品は、NIH によって支えられた R01AI030612 を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
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