Summary
El objetivo de este protocolo es específicamente la etiqueta y aislar selectivamente la DNA viral de células infectadas para la caracterización de proteínas del genoma viral asociado.
Abstract
El objetivo de este protocolo es para aislar el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) DNA de las células infectadas para la identificación de asociado viral y celulares proteínas por espectrometría de masas. Aunque proteínas que interaccionan con genomas virales desempeñan un papel importante en determinar el resultado de la infección, un análisis exhaustivo de las proteínas del genoma viral asociado no era previamente posible. Aquí nos muestran un método que permite la purificación directa de los genomas de HSV-1 de las células infectadas. Replicación de ADN viral selectivamente se etiqueta con nucleótidos modificados que contienen un grupo funcional de alquino. Etiquetado ADN es entonces irreversible y específicamente etiquetada vía el accesorio covalente de la azida de biotina través de cobre (I)-catalizado reacción de cicloadición o clic de azida-alquino. DNA etiquetados biotina es purificado en bolas recubiertas de estreptavidina y las proteínas asociadas son eluidas identificadas por espectrometría de masas. Este método permite la focalización selectiva y el aislamiento de las horquillas de replicación de HSV-1 o genomas enteros de entornos biológicos complejos. Además, la adaptación de este enfoque permitirá la investigación de diversos aspectos de la infección herpética, así como el examen de los genomas de otros virus ADN.
Introduction
Virus tienen una capacidad limitada para realizar las funciones esenciales y por lo tanto depende de factores del anfitrión para facilitar los aspectos más importantes de infección que incluye transporte, replicación, reparación, recombinación y expresión génica viral. Las actividades de estos factores de host están a menudo aumentadas por proteínas virally codificadas. Además, el virus deben evitar detección e interferencia por respuestas celulares a la infección viral. Por lo tanto, las interacciones host de virus determinan el resultado de la infección. De primordial importancia es entender cómo virus alteran el ambiente celular para adaptar la maquinaria celular para facilitar procesos virales. De particular interés es identificar qué factores y procesos que actúan sobre genomas virales durante todo el ciclo infeccioso.
Herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1) es que un doble trenzado DNA virus que infecta una parte sustancial de la población humana. En la primera hora de la infección, el genoma viral entra en el núcleo, donde una cascada de pedidos de la expresión génica viral sobreviene en coordinación con el viral de replicación de ADN (vDNA)1. En el núcleo, genomas están sujetas a regulación epigenética, se someten a reparación y recombinación y se empaquetan en la cápsida, que los primeros viriones de progenie se producen en menos de seis horas. La evaluación integral de las proteínas del genoma viral asociado a través del curso de la infección será sentar las bases para investigar los detalles moleculares de los procesos que actúan en genomas virales y se proporcionan la penetración en qué factores virales y celulares participan en distintas etapas de la infección.
Los métodos anteriores para la investigación de factores de huésped implicados en la infección viral incluyen la purificación de la afinidad de las proteínas virales para el análisis de las proteínas celulares asociadas2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. estos ensayos han sido instrumentales para la identificación de los factores celulares implicados en las respuestas antivirales host, así como modificación de la cromatina viral, la expresión génica, y reparación del ADN. Sin embargo, es difícil determinar si las interacciones dependen de la asociación con vDNA y proteómica sólo proporciona la penetración en las interacciones que se producen en función de un factor viral específico. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se ha utilizado para identificar donde se unen las proteínas virales y celulares específicas a genomas virales10,11,12,13,14 , 15 y la hibridación in situ fluorescente (FISH) combinado con inmunocitoquímica ha permitido la visualización de los factores celulares que colocalize con vDNA16,17,18, 19 , 20. estos ensayos permiten análisis espacial y temporal. Sin embargo, limitaciones incluyen la necesidad de anticuerpos altamente específicos, sensibilidad limitada y la necesidad de la visión anterior de las interacciones host de virus. Por lo tanto hemos desarrollado un método basado en iPOND (aislamiento de proteínas de ADN naciente)21 y aniPOND (acelerada nativa iPOND)22 selectivamente etiqueta y purificar vDNA de infectado las células para la identificación objetiva de genoma viral proteínas asociadas por espectrometría de masas. iPOND ha sido fundamental para la investigación de la dinámica de la bifurcación de replicación celular.
Para la purificación selectiva de los genomas virales de las células infectadas, replicar vDNA está etiquetado con nucleósidos ethynyl modificado, 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) o 5-ethynyl-2´-desoxicitidina (EdC) (figura 1), seguido de covalente verbal a azida de biotina a través, haga clic en química para facilitar la purificación del solo paso de genomas virales y las proteínas asociadas en bolas recubiertas de estreptavidina (figura 2B). Lo importante, las infecciones se llevan a cabo en las células fijas, que no participan en la replicación del ADN celular para permitir el etiquetado específico de vDNA. Además, la infección HSV-1 causa la detención del ciclo celular e inhibe celular ADN replicación23,24. Virus puede ser prelabeled antes de la infección para el análisis de proteínas relacionadas con genomas virales entrantes (figura 1A) o marcado durante la replicación del ADN para el análisis de proteínas relacionadas con vDNA recién sintetizada (figura 1B) 25. Además, los análisis de chase de pulso pueden utilizarse para investigar la naturaleza de las proteínas asociadas con la replicación viral las horquillas (figura 1)26. Además, vDNA ethynyl-modificado puede ser covalentemente conjugado con un fluoróforo de investigación espacial de la dinámica de la proteína (figura 2A y figura 3). La proyección de imagen permite la visualización directa de vDNA es un método gratuito para la validación de las interacciones vDNA-proteína y puede ser adaptada para rastrear genomas virales a lo largo de la infección. Esperamos que estos enfoques podrían modificarse aún más para el estudio de cualquier aspecto de la infección herpética, incluyendo latencia y reactivación y para el estudio de otros virus ADN. Por otra parte, etiquetado con uridina 5-ethynyl (UE) podría permitir el análisis de genomas virales de RNA.
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Protocol
1. cultivo celular, infección Viral y etiquetado de EdC ( figura 1)
el siguiente protocolo implica trabajar con virus. Por favor, consulte a su institución ' protocolos de bio-seguridad de s sobre manejo seguro de virus y otros agentes biológicos. Este protocolo fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Pittsburgh.
- Trypsinize un frasco de cultivo de tejidos 2 150 cm confluentes de células MRC-5 y las células se transfieren a una placa de cultivo de tejidos de 600 cm 2 que contiene 100 mL DMEM y 10% FBS. Incubar a 37 ° C en presencia de 5% CO 2 para 3-4 días llegar a la fase estacionaria y confluency. Un plato de 2 cm 600 confluente contiene ~ 7 x 10 7 células. Preparar 1 para cada condición y 1 placa para cada control negativo correspondiente.
Nota: Las células deben llegar a la fase estacionaria para inhibir la replicación del ADN celular para asegurar que sólo vDNA es etiquetado y purificado en los pasos posteriores.
Nota: Cada muestra requiere una conexión sin etiqueta de control negativo preparado con las mismas condiciones de infección y momento sin la adición de EdC.
Nota: A escala versión de este experimento debe llevarse a paralelamente a la prueba para el etiquetado de la DNA celular por proyección de imagen usando el crecimiento de la célula comparable, infección, EdC etiquetado condiciones y puntos de tiempo (ver paso 2). - Diluir 7 x 10 8 PFU HSV-1 en 7 mL frío Tris-Buffered salino (TBS). Retire el medio de crecimiento y mantenga a 37 ° C. Para infectar, añadir 7 mL diluido virus células MRC-5 y por 1 h a temperatura ambiente. Después de adsorción, retirar el inóculo, lave con 50 mL temperatura TBS y reemplazar el original medio de crecimiento. Incubar a 37 ° C en presencia de 5% CO 2. Este paso debe realizarse para cada condición experimental y el control negativo.
Nota: EdC mayor etiquetado puede lograrse utilizando a HSV-1 mutantes defectuosos para la expresión del dUTPase viral (gen UL50) o uracil glicosilasa (UL2 gene). HSV-1 dUTPase tiene especificidad de substrato baja y pueden disminuir la activación de varios análogos de los nucleósidos análogos 25 , 27.
Genomas virales de la etiqueta de - con EdC. Siga las instrucciones de etiqueta entrantes genomas (1.3.1.), replicación de genomas (1.3.2.), u horquillas de replicación viral (1.3.3)..
Nota: Único paso 1.3.1, 1.3.2 y 1.3.3 debe realizarse según genomas entrantes, genomas duplicados o las horquillas de replicación que se analizará en los pasos posteriores, respectivamente.
Nota: Puede sustituirse por EdC EdU o f ara EdU. La toxicidad de los análogos de nucleósidos debe supervisar y minimiza.- Uso prelabeled las acciones a llevar a cabo la infección en el paso 1.2 y proceda al paso 2 o 3 a 4 horas post infección (hpi) para investigar sin replicar vDNA ( figura 1A).
Nota: Preparar virus prelabeled las existencias utilizando el protocolo descrito previamente 25. Las poblaciones de virus deben pasarse a través de una columna G-25 para quitar cualquier EdC residual. - Etiqueta vDNA replicación mediante la adición de 5-25 μm EdC al medio de cultivo celular de las células infectadas para 2-4 h ( figura 1B). Antes de agregar, diluir EdC en 1 mL de medio de cultivo.
- Para etiquetar las horquillas de replicación viral, después del inicio de la replicación vDNA (≥ 4 hpi), etiqueta de pulso replicar vDNA con 5-25 μm EdC durante 5-20 min. A perseguir, lavar 3 x con medio de chase que contiene 25-100 μm 2´deoxycytidine (deoxyC) y luego se incuban en presencia de medio de chase para un adicional 20-40 min ( figura 1).
Nota: Medio pulso y chase debe equilibrarse a 37 ° C y 5% de CO 2 antes de su uso.
Nota: Para los experimentos de la persecución del pulso, es importante considerar la cantidad de tiempo que toma para que nucleósidos entrar en la célula y ser phosphorylated antes que pueden ser incorporados en la replicación de ADN. Esto debe determinarse empíricamente.
Nota: Para determinar la resolución de los experimentos de pulso chase, calcular la tasa de replicación viral bajo las condiciones experimentales utilizados. Esto puede ser determinado por PCR cuantitativa de genomas virales durante un solo paso crecimiento tiempo curso 26.
Nota: Para imágenes genomas virales proceda al paso 2 y para la purificación de los genomas virales, vaya al paso 3.
- Uso prelabeled las acciones a llevar a cabo la infección en el paso 1.2 y proceda al paso 2 o 3 a 4 horas post infección (hpi) para investigar sin replicar vDNA ( figura 1A).
2. Proyección de imagen de EdC etiquetado ADN ( figura 2A)
Nota: es útil para llevar a cabo la proyección de imagen junto con el método de purificación del genoma viral para verificar que el ADN celular no está etiquetado en experimentos. La proyección de imagen también puede utilizarse para visualizar la naturaleza del etiquetado vDNA y validar datos de proteómica. Ejemplos de ADN viral y celular, patrones de tinción se muestran en la figura 3.
- Realizar infecciones y EdC etiquetado como se indica en el paso 1 excepto usando escala las condiciones sobre cubreobjetos en un plato de cultivo de tejidos de 12 pozos que contienen 1 mL de medio de cultivo.
- Fijar las células con 1 mL 3.7% paraformaldehido en PBS 1 x durante 15 min a TA. Después de la fijación, enjuague las células 2 x con 1 mL 3% BSA en PBS.
PRECAUCIÓN: Paraformaldehido puede causar lesiones graves o permanentes. Precauciones de seguridad.
Nota: El protocolo se puede detener aquí y cubreobjetos pueden conservarse a 4 ° C en el segundo lavado hasta 3 días. - Permeabilizar las células con 1 mL de tampón de permeabilización [véase Tabla de materiales] por 20 min a temperatura ambiente mientras balanceo.
- Enjuague con 1 mL de 3% de BSA y luego cuadra con 1 mL 3% BSA en PBS durante 30 min a temperatura ambiente mientras balanceo.
- Agregar 1 mL de la reacción de clic cóctel [véase Tabla de materiales] a cubreobjetos Conjugación covalente Alexa Fluor 488 azida a EdC etiquetado ADN. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras la mecedora. Aspirar y lavar dos veces con 1 mL de PBS.
- Tinción de ADN celular con 1 mL de la dilución de 1:2,000 de Hoechst en PBS durante 30 min a temperatura ambiente mientras balanceo. Aspirar y lavar dos veces con 1 mL de PBS. Protocolos de inmunofluorescencia indirecta de
- tinción con los anticuerpos primarios y secundarios según el estándar 25.
Nota: Etiqueta vDNA colocalizes con ICP8, ICP4 o UL42 y etiquetada celulares ADN colocalizes con tinción de Hoechst. - Montaje de cubreobjetos en portaobjetos y las células mediante un microscopio de fluorescencia de imagen.
Nota: Diapositivas pueden almacenarse a 4 ° C durante varias semanas.
3. Purificación de proteínas asociadas y vDNA
Nota: varios aspectos de este protocolo han sido adaptados de la Leung et al. 22
Nota: todos los buffers y reactivos deben ser enfriados en hielo antes de su uso y todas las medidas deben realizarse en hielo a menos que se indique lo contrario.
- Núcleos de cosecha.
Nota: Antes de aislamiento de los núcleos, formaldehído puede utilizarse para la reticulación proteínas al ADN. Condiciones más estrictas de lavado pueden utilizarse durante la purificación de ADN en bolas recubiertas de estreptavidina. Para crcondiciones de osslinking y lavado ver Sirbu et al. 21.- reemplazar el medio de cultivo con 20 mL de tampón de extracción de núcleos (NEB) e incubar por 20 min a 4 ° C con oscilación ocasional. Los núcleos serán visibles en el microscopio.
- Raspar el núcleo de la placa usando un raspador celular y transferir a un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar durante 10 min a 2.500 x g a 4 ° C a núcleos de la pelotilla, descartar el sobrenadante.
Nota: Trypan coloración azul se puede utilizar para verificar el aislamiento de los núcleos de las células. - Suavemente desalojar el pellet nuclear en 10 mL de PBS, transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL y de pellets por centrifugación durante 10 minutos a 2.500 x g a 4 ° C. completamente quitar PBS.
Nota: Los núcleos pueden ser congelados y el protocolo se puede detener en este punto. Para ello, con cuidado Resuspender el precipitado nuclear en 500 μl de congelación de búfer e incubar el tubo en un baño de hielo seco/etanol. Almacenar los núcleos congelados a-80 ° C. Antes de usar, descongelar núcleos a temperatura ambiente, transferir rápidamente al hielo, añadir 10 mL de PBS, roca suavemente a la mezcla, de pellets por centrifugación durante 10 minutos a 2.500 x g a 4 ° C y eliminar completamente PBS. Núcleos de congelación puede resultar en rendimiento reducido.
- Covalentemente conjugada biotina-azida a EdC etiquetado vDNA.
- Resuspender el pellet nuclear en reacción de click 10 mL de la mezcla [véase Tabla de materiales] transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces con una pipeta de 10 mL.
Nota: Es importante que los reactivos incluidos en la mezcla de reacción de clic se agregan en el orden indicado. - Gire durante 1h a 4 ° C. Mientras gira preparar y enfriar búferes de B1, B2 y B3 [véase Tabla de materiales].
- Núcleos de sedimento por centrifugación durante 10 minutos a 2.500 x g a 4 ° C. completamente eliminar haga clic en la opción de mezcla de reacción y lavar el precipitado resuspender en 10 mL de PBS suavemente y centrifugar 10 min a 2.500 x g a 4 ° C.
- Suavemente Resuspender el pellet nuclear en 1 mL de PBS y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con una pipeta de gran diámetro. Núcleos de pellets por centrifugación 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente quitar PBS y flash congelación en nitrógeno líquido.
Nota: El protocolo puede ser una pausa en este punto y núcleos congelados pueden almacenarse a-80 ° C. congelación deshielo ayuda con posterior lisis, lo que se recomienda que los núcleos sean flash congelado incluso cuando procediendo a paso 3.3 en el mismo día.
- Resuspender el pellet nuclear en reacción de click 10 mL de la mezcla [véase Tabla de materiales] transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces con una pipeta de 10 mL.
- Lyse núcleos y fragmento de la DNA.
- Descongelar los núcleos de hielo y resuspender en 500 μl tampón B1 mediante pipeteo arriba y abajo. Incubar en hielo durante 45 minutos
- Muestras de someter a ultrasonido 6 veces para 30 s cada en amplitud 40% utilizando una sonda de microtip de 3 mm. Coloque las muestras en hielo por 30 s entre pulsos. Después de la sonicación, muestras deben aparecer clara, turbia no.
Nota: Condiciones de sonicación deben optimizarse para cada sonicators. Para obtener instrucciones detalladas sobre cómo optimizar las condiciones de la sonicación se refieren a Leung et al. 22. - de la pelotilla de restos celulares por centrifugación a 14.000 x g por 10 min a 4 ° C. El tamaño de la pelotilla debe disminuir sustancialmente. Filtrar el sobrenadante a través de filtro de la célula de 100 μm y mantener el flujo a través de.
- Añadir 500 μl tampón B2 para el sobrenadante filtrado. 900 μl de esta muestra se utilizará en paso 3.4.2.
- Tomar una alícuota de cada condición para aislamiento de DNA (volumen de 1/20 o 50 μL) y añadir 50 μl de 2 x solución SDS-bicarb [véase Tabla de materiales]. Continúe con el protocolo de aislamiento de ADN (paso 3.6).
- Tomar una alícuota de cada condición de entrada proteína (volumen de 1/20 o 50 μL) y añadir 50 μl de 2 x Tampón Laemmli, congelar en nitrógeno líquido y guardar a -80 ° C. uso de paso 3.5.6.
- Enlace biotinilado ADN a estreptavidina cubierto cuentas.
- T1 de estreptavidina preparar granos magnéticos al transferir 300 μL de la mezcla de grano a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Preparar un tubo de granos por muestra. Perlas de lavado 3 veces con 1 mL de tampón B2 Vortex para suspender de nuevo, aplicando un imán para separar los granos, y aspirando el tampón de lavado.
Nota: Optimizado vinculante el resultado de las condiciones en producción maximizada y Unión de fondo mínimo. Se determinó experimentalmente que granos magnéticos Streptavidin T1 tienen una capacidad significativamente mayor de perlas de agarosa, así como otros granos de estreptavidina y menos fondo obligatorio de Streptavidin C1 granos ( Figura 4A ). - Agregar 900 μl de la muestra del paso 3.3.4. los granos lavados y girar durante la noche a 4 ° C.
Nota: No no granos de vortex, una vez que la muestra se agrega a ellos.
Nota: Si cantidades significativas de ADN o de proteína están aisladas en el control negativo sin etiqueta, este paso se puede reducir de la noche a la mañana a 4 h para reducir el atascamiento de fondo.
- T1 de estreptavidina preparar granos magnéticos al transferir 300 μL de la mezcla de grano a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Preparar un tubo de granos por muestra. Perlas de lavado 3 veces con 1 mL de tampón B2 Vortex para suspender de nuevo, aplicando un imán para separar los granos, y aspirando el tampón de lavado.
- Lavar granos y eluir proteínas asociadas y vDNA.
Nota: Se recomienda usar puntas de filtro para los pasos restantes.- Muestras de lugar en un bastidor de tubo de microcentrífuga magnético, eliminar sobrenadante, resuspender suavemente en 1 mL de tampón B2, gira a 4 ° C por 5 min
- Tres veces Repita el paso 3.5.1.
- Coloque las muestras en un bastidor de tubo de microcentrífuga magnético, eliminar el sobrenadante, resuspender en 1 mL de tampón B3 y mueva levemente a 4 ° C por 5 min
- Transferir 100 μl del grano mezcla (volumen del th del 1/10) a un nuevo tubo para aislamiento de DNA dependiente. Este tubo se aplica al imán, eliminar sobrenadante, resuspender granos en 100 μL 1 x solución de SDS bicarb y continúe con el protocolo de aislamiento de ADN (paso 3.6).
- Aplicar el tubo que contiene la mezcla restante del grano de 900 μl de paso 3.5.3. al imán, eliminar el sobrenadante y resuspender granos en 50 μl de 2 x Laemmli sample buffer eluir proteínas y complejos ADN-proteína.
- Hervir las muestras a 95 ° C por 15 min, vortex, rápidamente gira en la microcentrífuga y aplicar el imán. Transferencia de eluato a un nuevo tubo flash congelar y conservar a -80 ° C.
Nota: Abren cerraduras de casquillo de uso para asegurar que los tubos no haga al hervir.
Nota: El protocolo se puede detener en este punto y las muestras pueden almacenarse a-80 ° C durante varias semanas. - Analizar las muestras de proteína por tinción de Coomassie Blue, western blot o espectrometría de masas por procedimientos estándar 25. Resultados representativos se muestran en la figura 4 y figura 5.
Nota: Para determinar si el rendimiento de proteína es suficiente para espectrometría de masas, 7.5 μl de cada muestra se utiliza para el análisis por azul de Coomassie tinción y 7.5 μL para borrar occidental de un genoma viral representante asociado proteína (ICP4, ICP8 o UL42). El mismo volumen de lisados de paso 3.3.6. se ejecutan junto al control de niveles de entrada de la proteína. Luego se analiza la muestra restante (35 μL) por masa espectrometría como se describió anteriormente 25.
- De ADN
- incubar las muestras de pasos 3.3.5. y 3.5.4. a 65 ° C para 4-16 h. Quite de la muestra de granos magnéticos, si es necesario.
- Extraer muestras con alcohol de fenol: cloroformo: isoamílico de 150 μL (PCI) y transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.
- La restante PCI con 100 μl del extracto Tris-EDTA (TE) y añadir la fase acuosa a un tubo nuevo.
- Extraer muestras con alcohol de cloroformo: isoamílico de 200 μl (24:1).
- Purificar la fase acuosa utilizando la PCR Purification Kit según el fabricante ' Protocolo s.
Nota: El indicador de pH en PB de búfer se volverá púrpura cuando se añade a la muestra. Añadir 10 & #181; L 3M de NaOAc pH 5.0 para disminuir el pH de la muestra. - Concentración de ADN determinar usando un fluorómetro.
Nota: Este protocolo da típicamente 100-400 ng ADN de límite de grano. Ninguna DNA debe ser detectada en el efluente del control negativo en el que EdC no fue agregada en el paso 1.3. - ADN puede almacenarse en un enlace de ADN bajo tubo a 4 ó - 20 ° C y puede ser utilizado para PCR en tiempo real o el análisis de secuenciación de alto rendimiento.
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Representative Results
El uso de la química del tecleo para la purificación de la DNA de las células primero fue logrado por el método de iPOND21. El propósito de iPOND es purificar las horquillas de replicación celular para la identificación de las proteínas asociadas. Hemos adaptado esta técnica para estudiar específicamente las interacciones proteína vDNA durante la infección. Manipulación del acercamiento a la etiqueta de genomas virales con EdC (figura 1), combinados con infecciones sincronizadas, ha permitido la investigación de poblaciones separadas de vDNA y aislamiento selectivo. ADN del HSV-1 se etiqueta con EdC (figura 1) para facilitar el accesorio covalente a un fluoróforo para la proyección de imagen o biotina para la purificación (figura 2). Virus puede prelabeled antes de la infección para el análisis de proteínas relacionadas con genomas entrantes (figura 1A) o marcado durante la replicación del ADN para el análisis de proteínas relacionadas con vDNA recién sintetizada (figura 1B)25. Además, los análisis de chase de pulso pueden utilizarse para investigar la naturaleza de las proteínas asociadas con la replicación viral las horquillas (figura 1)26. ADN puede visualizarse dentro de las células para proveer información espacial sobre la naturaleza del ADN etiquetado y el apoyo de las interacciones identificadas vDNA-proteína (figura 3). Tomados en conjunto, los protocolos aquí descritos permiten la investigación proteómica de múltiples aspectos de la infección productiva para proporcionar la penetración en los cambios dinámicos que ocurren en genomas de HSV-1. Estos enfoques podrían adaptarse más para investigar la latencia y reactivación, para examinar los fenotipos asociados a mutantes virales y para el estudio de otros virus ADN y ARN.
Aspectos de este método de purificación de proteína fueron adaptados de Leung et al. 22. aquí una mejora importante para la purificación de EdC etiquetado ADN es el uso de granos de Streptavidin T1 en lugar de perlas de agarosa recubiertas de estreptavidina. Para optimizar la purificación de DNA, varios tipos de bolas recubiertas de estreptavidina fueron probados para el atascamiento no específico cuando la infección se llevó a cabo en ausencia de EdC y para la recuperación máxima de la proteína en presencia de EdC (Figura 4A). Para estos experimentos, se llevó a cabo western blot para la proteína vDNA ICP4. Purificaciones de Streptavidin T1 cuentas dio lugar a la menor cantidad de enlace de fondo en la ausencia de EdC y la recuperación de proteína máximo en presencia de EdC.
Proteínas relacionadas con vDNA pueden identificarse por métodos proteómicos incluyendo borrar occidental y espectrometría de masas. Western Blot se puede utilizar para investigar la dinámica de las interacciones conocidas y espectrometría de masas puede utilizarse como un enfoque imparcial para identificar proteínas vDNA nuevos asociado. Un ejemplo de proteína rendimiento como una función de creciente EdC etiquetado se muestra en la Figura 4B. Un borrón de transferencia, en lugar de un patrón de bandas claro, generalmente se observa por el azul de Coomassie de tinción. Esto es probable porque hay ADN presente en la muestra de proteína o porque hay una abundancia de la proteína. También es importante tener en cuenta que el catalizador de cobre utilizado en la reacción de clic puede causar degradación parcial de proteínas y ácidos nucleicos28,29. Por western blot, niveles similares de ICP4 se detectan normalmente en eluidos (paso 3.5.5.) después de la purificación de vDNA que fue etiquetado de 60 minutos con la EdC como la presente en la misma cantidad de muestra de entrada de lystates nuclear (paso 3.3.6.). Esta información puede utilizarse como una guía para determinar si la recuperación es suficiente enviar la muestra restante para el análisis de espectrometría de masa.
La cromatografía de líquidos de nano con espectrometría total en tándem (LC-MS/MS) puede realizarse como se describe anteriormente25 para identificar proteínas relacionadas con vDNA purificada. LC-MS/MS datos se analizan comparando valores de cuenta espectral (SpC) entre la muestra experimental marcado con EdC y el correspondiente control negativo sin etiqueta. Las proteínas se consideran para ser enriquecido en la muestra experimental basada en los siguientes criterios: 1) proteína tiene al menos 5 cuentas espectrales (SpC) en la muestra experimental, 2) proteína no se detecta en el control o se enriquece por el control de al menos cuatro veces basado en dividir los valores de SpC y 3) la proteína es enriquecida por el control en dos o más muestras biológicas. El factor de abundancia espectral normalizada (NSAF: 
) puede utilizarse para tener en cuenta las diferencias de peso molecular (MW) y producción de proteína total. Esta ecuación determina la abundancia relativa de proteínas individuales dentro de una muestra y permite la comparación directa de dos diferentes condiciones experimentales en las que diferentes cantidades de vDNA son purificadas (por ejemplo, comparar genomas virales entrada ( Figura 1A) replican genomas (figura 1B)).
Hay varias formas para presentar datos de enriquecimiento de proteína. Algunos ejemplos incluyen gráficos, diagramas de Venn y redes de interacción de proteínas. Gráficos puede utilizarse para ilustrar la proporción de proteínas identificados que se sabe que funcionan en un proceso biológico específico (figura 5A). Sin embargo, pueden surgir problemas cuando una proteína tiene más de un función biológica, que es a menudo el caso. También es difícil comparar los datos a través de diferentes gráficos. Diagramas de Venn son útiles para demostrar las relaciones entre proteínas identificadas bajo diferentes condiciones experimentales, pero no proporcionan información funcional de las proteínas identificadas (figura 5B). Redes de interacción de proteínas retratar una ilustración visual de las interacciones potenciales entre las proteínas identificadas y proporcionan información sobre los tipos de procesos biológicos que están involucrados (figura 5). Varios recursos en línea están disponibles para el mapeo de las interacciones de la proteína-proteína prevista incluyendo cadena (herramienta de búsqueda para las recuperación de la interacción Genes/proteínas)30. Herramientas en línea están equipadas para manejar datos de Proteómica de una variedad de especies y proporcionar valiosa información acerca de host las proteínas implicadas en la mecánica del genoma viral. Sin embargo, las proteínas virales generalmente no figuran en las bases de datos, que pueden complicar el análisis. Por lo tanto, es importante considerar las conclusiones principales uno quisiera transmitir al momento de decidir cómo presentar datos de proteómica.
Figura 1:ONG > enfoques etiqueta DNA HSV-1. (A) analizar el estado de virus entrantes, descansando MRC-5 células en G0 están infectadas con HSV-1 prelabeled y genomas son analizados en menos de 4 hpi para el estudio de DNA viral sin replicar. (B) analizar el estado de replican virus, células MRC-5 se infectan con HSV-1 sin etiqueta y EdC (estrellas naranja) se añade al medio de crecimiento de las células infectadas y se incuba durante 2-4 h después del inicio de la replicación del DNA viral (≥4 hpi). (C) analizar las horquillas de replicación de los virus, infectan las células son pulso marcado con EdC para las horquillas de replicación de 5-20 min luego pueden ser perseguidas con deoxyC. Etiquetado ADN EdC es de color naranja. Esta figura ha sido modificada desde Dembowski y DeLuca25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los procedimientos descritos en este documento para análisis de EdC etiquetado ADN. (A) un esquema del método de proyección de imagen de EdC etiquetado ADN. Etiquetado ADN está representado en verde. (B) un esquema del método para la purificación y posterior análisis de EdC etiquetado vDNA. Esta figura ha sido modificada desde Dembowski y DeLuca25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Visualización de EdC etiquetado ADN. Las células fueron infectadas, etiquetadas y reflejadas como se describe en la figura 1 y figura 2. Se muestran imágenes representativas de etiquetado ADN viral y celular. ADN celular colocalizes con tinción de Hoechst y vDNA con ICP4. Barra de escala: 5 µm.This figura se modificó de Dembowski y DeLuca25 y Dembowski et al. 26. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Resultados de purificación de proteína representante. (A) comparación de rendimiento de proteína cuando pasos de purificación se llevaron a cabo utilizando diferentes tipos de granos de streptavidin recubierto. La infección se llevó a cabo en presencia de EdC (+) para comparar el rendimiento de proteína o en la ausencia de EdC (-) para comparar la Unión de fondo. Infecciones y etiquetado EdC se llevaron a cabo como se describe en la figura 1B y complejos ADN-proteína se purificaron según los pasos descritos en la figura 2B usando cantidades comparables de diferentes tipos de granos de streptavidin recubierto. Panel superior: comparación de rendimiento de proteína después de purificación de streptavidin recubierto perlas de agarosa o estreptavidina M-280. Panel inferior: comparación de rendimiento de proteína después de la purificación de estreptavidina M-270, M-280, estreptavidina C1 o Streptavidin T1. Western Blot se realiza con un anticuerpo contra la proteína viral ICP4. En el primer carril para la comparación se muestra purificada ICP4. Una exposición más larga del panel inferior estaba obligada a observar una intensidad similar de ICP4 en carriles "280" como en el panel superior. (B) representante proteína purificación resultados en función del tiempo de EdC etiquetado aparecen. Infecciones y etiquetado EdC se llevaron a cabo como se describe en la figura 1B y complejos ADN-proteína se purificaron según los pasos descritos en la figura 2B usando granos de Streptavidin T1. Etiquetado EdC se llevó a cabo de 0, 20, 40, o 60 min y azul de Coomassie tinción (arriba) y western blot (abajo) resultados aparecen. Western Blot se llevó a cabo con anticuerpos específicos para ICP4, UL42 o GAPDH. La muestra de efluente fue tomada de paso 3.5.5. y lisado de paso 3.3.6. La flecha indica la estreptavidina, mientras que L indica escala de proteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplos de diferentes formas para presentar datos de proteómica. Gráficos (A) sintetizar proteínas que fueron identificadas por espectrometría de masas de los eluatos de la proteína asociada a genomas virales purificadas a las 6 hpi. Los valores indican el número de proteínas identificadas para cada categoría funcional. T indica el número total de proteínas identificadas. Los colores indican las siguientes categorías: púrpura transcripción - procesamiento de RNA, rojo - verde - remodelación de cromatina transporte nuclear naranja - replicación del ADN, amarillo -, las proteínas estructurales de teal - citoesqueleto, azul oscuro - HSV y gris - otros/desconocido. (B) diagramas de Venn representan la superposición de proteínas identificadas para ser asociado de genomas virales en 6, 8 o 12 hpi. (C) A cadena mapa muestra proteínas enriquecidas en las horquillas de replicación viral después de un pulso de EdC de 5 minutos. Proteínas humanas enriquecidas por 5 veces en comparación con el control negativo se muestran en el mapa funcional de la interacción, que se generó con cadena30 configuración de datos para mostrar las interacciones de confianza sólo a la altura. Se utilizaron nombres de gene para mapear las interacciones. Los círculos indican las proteínas que funcionan en el mismo proceso biológico. Fue modificado este dato de Dembowski y DeLuca25 y Dembowski et al. 26. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo incluye varios pasos que, si no siguen cuidadosamente, pueden resultar en rendimiento de proteína redujo significativamente o contaminación con el ADN celular. Es esencial que las células fijas se utilizan para todos los experimentos para asegurar que el ADN celular no es etiquetado y purificada. Esto puede confirmarse por la ausencia de polimerasas de la DNA celulares en la muestra de proteína debido a HSV-1 no utilizar celular polimerasa de la DNA para la síntesis del genoma. EdC etiquetado y núcleos recolección de medidas, muestras deben alternarse para que cada uno se procesa igual. Durante los pasos de purificación, debe tener cuidado no manipular núcleos mediante pipeteo demasiado. Esto puede conducir a la lisis de núcleos, así como pérdida de muestra debido a que se pegue a los lados de puntas de pipeta. Además, el paso de sonicación debe optimizarse para sonicators individuales y la cantidad de perlas recubiertas de estreptavidina, utilizado para el atascamiento de la biotina debe titularse para producción de proteína óptima.
Varias modificaciones pueden hacerse en el presente Protocolo e incluyen el uso de virus diferentes o tipos de la célula o la adición de un paso a la reticulación de proteínas a ADN. Al elegir un tipo de células para investigación proteómica, es importante comprobar la disponibilidad de una base de datos de secuencia de la proteína para esa especie. La falta de recursos de proteómica limitará considerablemente posterior análisis de datos de la proteína. Otra limitación es la necesidad de un gran número de células, por lo tanto puede ser difícil de preparar suficiente células primarias, como las neuronas, para este experimento. Este método debe ser compatible con otros virus DNA o RNA como la infección viral no depende de la replicación del ADN celular. Además, sería interesante explorar cambios en las interacciones DNA-proteína que se producen en mutantes de HSV-1. Otra modificación de este protocolo podría ser la adición de un paso de la reticulación de formaldehído antes de aislamiento de núcleos, que permitan condiciones más estrictas de lavado durante la purificación21. La adición de formaldehído no afectará la capacidad de los núcleos de la cosecha, pero puede resultar en la producción disminuida de la proteína debido a la dificultad de inversión vínculos cruzados durante la elución de la proteína.
Los resultados de este protocolo representan el estado promedio de ADN viral siendo examinada. Por lo tanto, es difícil distinguir si los complejos están juntos en el mismo o separadas las moléculas de ADN. vDNA etiquetado métodos descritos aquí en combinación con la proyección de imagen de alta resolución puede utilizarse para verificar los datos de proteómica y puede ayudar a distinguir entre las diferentes poblaciones de ADN marcado dentro de una célula. Además, ChIP-seq podría utilizarse como un método de seguimiento para identificar las ubicaciones específicas de las proteínas en el genoma viral.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos Hannah Fox para ayuda en la preparación de este manuscrito. Este trabajo fue financiado por los NIH grant R01AI030612.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | Stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| Freezing buffer | Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| Cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | Prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | Prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| Mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
References
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