Summary
نماذج الثقافة بلير الحالية لا تسمح للدراسات الفنية في المختبر التي تحاكي في فيفو ميكرونفيرونمينتس. استخدام البولي إثيلين غليكول وأسلوب قولبة أكسيد الزنك، يصف هذا البروتوكول وضع الغشاء المحاكاة البيولوجية سامسونج مع تصلب الانضباطي، المسامية، وتكوين البيوكيميائية الذي يحاكي عن كثب في فيفو مصفوفات خارج الخلية.
Abstract
الغشاء هو عنصر حاسم من بليرس الخلوية التي يمكن أن تختلف في صلابة وتكوينها، والهندسة المعمارية والمساميه. الدراسات في المختبر غشائي طلائي بليرس تقليديا يعتمد على نماذج الدعم نفاذية تمكين الثقافة بلير، ولكن يدعم نفاذية محدودة في قدرتها على إجراء نسخ متماثل تنوع البشرية الطابق السفلي الأغشية. على النقيض من ذلك، نماذج المائية التي تتطلب تجميع المواد الكيميائية العالية الانضباطي والسماح لإدخال تعديلات على صلابة المواد وتكوين البيوكيميائية عن طريق إدماج الببتيدات المحاكاة البيولوجية أو البروتينات. ومع ذلك، محدودة نماذج المائية التقليدية في وظيفة لأنهم يفتقرون إلى المسام خلية خلية الاتصالات والوظيفية في المختبر دراسات الهجرة. بالإضافة إلى ذلك، نظراً لسمك الهلاميات المائية التقليدية، تم إدماج المسام التي تمتد على كامل سمك الهلاميات المائية الصعبة. في الدراسة الحالية، ونحن نستخدم الهلاميات المائية poly-(ethylene-glycol) (الربط) وأسلوب قولبة رواية أكسيد الزنك لمعالجة أوجه القصور السابقة من الهلاميات المائية المحاكاة البيولوجية. كنتيجة لذلك، فإننا نقدم المائية سامسونج، مثل الغشاء تسمح ثقافة بيلاييرس الخلوية المتلاقية على سقالة لتخصيص مع أبنية المسام متغير والخواص الميكانيكية والتركيب البيوكيميائية.
Introduction
مصفوفات خارج الخلية (ECM) يشكلون السقالات البروتين التي دعم مرفق خلية وتكون بمثابة حواجز بين أنواع الخلايا متميزة وعنصرا أساسيا في مجمع الأنسجة والأعضاء. على النقيض من النسيج الضام الخلالي، الغشاء الطابق السفلي (بي أم) هو نوع متخصصة لإدارة المحتوى في المؤسسة التي تعمل كحاجز لتقسيم المقصورات الأنسجة عن بعضها البعض. خدمات إدارة المباني سميكة حوالي 100 ميكرون، وذلك السماح للاتصالات المباشرة وغير المباشرة بين الخلايا على جانبي. اثنين من الأمثلة الشائعة من خدمات إدارة المباني هي الأوعية الدموية خدمات إدارة المباني، وجدت في الجدار ميكروفاسكولار بين بيريسيتيس وخلايا بطانية، وخدمات إدارة المباني في مجرى الهواء التي توجد بين الخلايا الظهارية وبطانية. خدمات إدارة المباني تخدم دوراً هاما في تنظيم وظيفة الخلية، مثل الخلية القطبية، والهجرة، وفي الصحة والمرض. 1 تكوين وصلابة، والهندسة المعمارية، والمساميه لخدمات إدارة المباني تختلف نظم الجهاز لتسهيل الوظائف الفسيولوجية متميزة. على سبيل المثال، المسام BM حاسمة للحفاظ على الاتصالات خلية خلية، نشر جزيء القابلة للذوبان، والهجرة من الخلايا المناعية أثناء التهاب أو بكتيريا أثناء الإصابة. في الخطوط الجوية، تمتد المسام سمك BM، كامل مع أقطار تتراوح بين 0.75 إلى 3.86 ميكرومتر.2
وتكفل طبيعة رقيقة بي أم أنه على الرغم من أن أنواع الخلايا جسديا مفصولة عن بعضها البعض، هو الحفاظ على الاتصالات بين الخلايا عن طريق وساطة paracrine والاتصال مما يشير إلى. وهكذا، اعتمدت الباحثين لدراسة الأمراض البشرية في المختبر، على إدراج دعم نفاذية المسامية للثقافة بليرس الخلوية. 3 هذه النماذج كانت ذات أهمية حاسمة لفهم الاتصالات الخلوية التي تلعب دوراً في الصحة والمرض. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 إدراج دعم نفاذية تلبية المتطلبات الأساسية لفهم كيف يشير إلى خلية خلية ينظم العمليات الفسيولوجية، مثل تجنيد الكريات البيض وتسلل البكتيرية؛ بيد إدراج قيود كبيرة وتفشل لتقليد دعم بيرميابل BM. بشرية عدم إدراج ألواح كل الميكانيكية والكيميائية الحيوية، وبنية مسامية التبسيط لا تقليد هيكل ليفي أن يخلق المسام غير النظامية النموذجية لخدمات إدارة المباني. ولذلك، هناك حاجة متزايدة لنظم الانضباطي الذي يمكن إعادة إنشاء خصائص BM الأصلية التي تؤثر على العمليات الخلوية.
هي ركائز أساس البوليمر مرشحا مثاليا لتطوير خدمات إدارة المباني لدراسة بليرس الخلوية في إطار أوثق يحاكي البيئة في فيفو المحاكاة البيولوجية. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 البوليمرات ميكانيكيا الانضباطي ويمكن تعديلها كيميائيا لدمج المحاكاة البيولوجية ببتيد شظايا. 11 , 12 , 13 بيوينيرت بوليمر البولي إيثيلين جلايكول (شماعة) يمكن استخدامها لتشييد المباني المحاكاة البيولوجية، ومؤخرا عمل مفصلة توليف شماعة حمض ارجينين-جليكاين-الأسبارتيك (إدارات) الهلام ميكانيكيا الانضباطي مع شبكات المسامية التي تدعم نمو الخلايا وانزيمية الخلية الملتهبة. 14 على الرغم من نشر القائمة على شماعة ركائز قدم نموذج إدارة المحتوى في المؤسسة البشرية أكثر واقعية مما يدعم نفاذية، العديد من هذه النماذج سميكة جداً، مع عمق ميكرومتر تقريبا 775 يحد من القدرة على خلق الثقافات bilayer مع خلية خلية جهات الاتصال. 14
نقدم هنا، على بروتوكول لإنشاء شماعة المستندة إلى البوليمر BM تقليد أن يتغلب على العديد من أوجه قصور التكنولوجيات الثقافة bilayer الخلية الحالية. لقد قمنا بتطوير أسلوب قولبة أكسيد الزنك، وهي مادة تستخدم على نطاق واسع لتصنيع الإنتاج ميكروكريستالاين، ودمج البوليمر أثناء التوليف وكروسلينكينج، الذي يتم إزالته في وقت لاحق وانتقائية من بوليمر الأكبر الناجمة عن ذلك. هذه العملية بإنشاء شبكة مسامية عشوائي، محاكاة شبكة المسام متعرجة والمترابطة للبشرية خدمات إدارة المباني. علاوة على ذلك، يمكن تغيير التسلل عن طريق تغيير حجم وشكل من ميكروكريستالس أكسيد الزنك عن طريق تعديل stoichiometry رد فعل أثناء إنتاج الإبرة. هذه التقنية المتقدمة هنا يخلق المائية سامسونج الذي يحاكي سمك BM. البشرية "أخيرا"، الميكانيكا، والتسلل، ويمكن بسهولة تغيير تكوين هذه الثوابت مثل BM البيوكيميائية لتوليد المكروية الأكثر مشابهة لتلك المشاهدة في فيفو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يرجى قراءة ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) لجميع المواد السابقة لاستخدام واستخدام احتياطات السلامة في جميع الأوقات.
1-تجميع الإبر أكسيد الزنك
- تحضير 250 مل من الزنك (لا3) 0.04 متر2* 6 ح2س الحل عن طريق إضافة 2.9749 غرام نترات الزنك إلى 250 مل الماء.
- إعداد 150 مل من هيدروكسيد الصوديوم م 1 بإضافة 6 جم من هيدروكسيد الصوديوم إلى 150 مل الماء.
- قم بإعداد حمام زيت المعدني على لوح ساخن مع محرض، وتغرق قارورة 500 مل قاع جولة في حمام الزيت في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 250 مل من الزنك (لا3)2* 6 ح2س إلى قارورة وتبدأ إثارة رد فعل.
- إضافة 150 مل حل هيدروكسيد الصوديوم (ترسبات بيضاء شكل بإيجاز وثم تختفي كما تواصل الحلين مزيج). إثارة ح 2 كشف.
- الحرارة في قارورة إلى 55-60 درجة مئوية ويستمر التحريك ح 24.
- إيقاف الحرارة ويسمح الحل لتبرد بدرجة حرارة الغرفة بينما التحريك.
- تصفية الحل على قمع [بشنر] مع حجم مسام ميكرومتر 11 والسماح لتجف بين عشية وضحاها، وكشفت. عندما لم يعد ورقة تصفية الرطب من الحل سكب ومسحوق أبيض شكلت عبر الثقوب القمع، هي تماما المجففة الجسيمات.
- جمع الإبر أكسيد الزنك، والتحضير للمسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) لتأكيد مورفولوجية الشبيهة بالإبر. بإيجاز، تحميل الشريط الكربون على كعب روتين دبوس وتستخدم ملعقة معدنية لتشويه الإبر أكسيد الزنك على الشريط الكربون. تفل معطف مع ايريديوم 8 مم في كثافة 22.4 غرام/سم3 ، والحصول على الصور في 10 كيلوفولت.
2-إضافة طبقة الزنك الذبيحة على شرائح المجهر ل HCl الناجمين عن الإفراج عن شماعة
- تحضير حل خلات الزنك بتذويب 1.756 ز خلات الزنك في 200 مل ميثانول.
- تنظيف مجهر عادي شرائح "3 × 1 بوصة مع الإيثانول 70% ومسح المتاح. تسمح للهواء الجاف لمدة 10 دقائق.
- ضع كوب 150 ملم طبق بيتري على صفيحة ساخنة وتسخَّن إلى 150-160 درجة مئوية.
- استخدام بيبيت زجاج مع لمبة بيبيت، عقد الشرائح الزجاجية مع الشرائح ملاقط ومعطف بتطبيق 5 قطرات خلات الزنك، تشكيل طبقة رقيقة موزعة على الشريحة. تسمح حل الزائدة بالتنقيط مرة أخرى في حل الأسهم.
- ضع الشريحة في طبق بيتري ساخنة مسبقاً (150-160 درجة مئوية) مع الجانب المغلفة خلات الزنك مواجهة. إجازة في وميكروريف لمدة 15 دقيقة.
- إزالة الشريحة مع ملاقط والسماح لها لتبرد بدرجة حرارة الغرفة. سوف تظهر الشريحة لتكون مغلفة بالشرائط البيضاء.
- قم بإزالة أي الزنك الزائدة المتبقية على الشرائح باستخدام مسح المتاح لإزالة الشرائط البيضاء بارزة. ينبغي أن يكون السطح موحدة.
- كشف الضوء على الشرائح استعدادا للأشعة فوق البنفسجية في غطاء السلامة الأحيائية ح 1 على الأقل لضمان العقم.
تنبيه: الأشعة فوق البنفسجية الضارة على العينين وتعرض الجلد. تجنب التعرض المباشر للجلد أو العينين وإيقاف إمدادات الطاقة الكهربائية عندما لا تستخدم.
3-إعداد عوازل السيليكون
- ورقة قطع سيليكون في المربعات أقل من 1 "س 1" (عوازل يجب أن تكون قادرة على احتوائه في طبق 6-جيدا).
- لكمه ثقوب 8-12 ملم في وسط المربعات لكمه خزعة.
- عوازل السيليكون اﻷوتوكﻻف لمدة 20 دقيقة في 121.0 درجة مئوية و 1.12 كغ/سم.
4-إعداد الحل شماعة و "ربط توليف هلام"
ملاحظة: الروغان البلمرة شماعة يتم على نطاق واسع استكشاف والمفصلة سابقا لدينا مختبر وغيرها. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17
- الجمع بين إدارات الخلية الببتيد لاصقة مع أكريلويل-شماعة--دائرة الصحة الوطنية في بيكربونات الصوديوم 50 مم (pH 8.5) بنسبة 1:1 مولى لتمكين الروغان المحطة أمين من الببتيد مع مجموعة أكريلاتي، ردود فعل بيوكيميائية التي كانت سابقا وتتميز تؤتي أكبر من كفاءة 85%. 17
- تحضير صور-البادئ بمخالطة 2، 2-ديميثوكسي-2-فينيلاسيتوفينوني 1-الفينيل-2-بولي بتركيز 300 ملغ/مل.
- في فصل أنابيب 1.5 مل، تزن ما يلي: 20 ملغ من أكسيد الزنك الإبر و 12.5 مغ دا شماعة 2.5 ملغ من إدارات الوتد.
- تعليق 20 ملغ إبر أكسيد الزنك في 270 ميليلتر من محلول FBS/برنامج تلفزيوني 10%؛ دوامة لخلط (حوالي 15 ثانية).
- بإيجاز (< 1 s) تدور الحل في أجهزة الطرد مركزي benchtop مصغرة جلب أي المجاميع أكسيد الزنك لقاعدة للأنبوب.
- جمع 250 ميليلتر من الجزء العلوي من حل أكسيد الزنك، لضمان أن تظل المجاميع في الجزء السفلي من الأنبوب. الجمع بين دا شماعة وإدارات شماعة لإنشاء حل الوتد مع حوالي 2.5 مم إدارات. دوامة لخلط (حوالي 15 ثانية).
- إضافة 2 ميليلتر بولي أسيتوفينوني/n-الفينيل صور-البادئ ودوامه بإيجاز المزيج (حوالي 5 s).
- إضافة 20 ميليلتر من الحل البوليمر على طول وسط الشرائح أكسيد الزنك المغلفة.
- انخفاض ببطء شريحة ثانية في الأعلى، مع أكسيد الزنك طلاء الوجه لأسفل (يجب أن يكون الحل الربط بين طبقتين أكسيد الزنك المغلفة). في محاولة لمنع تشكيل أي فقاعات الهواء. نقل الشرائح أفقياً على طول المحور الرئيسي للسماح لأي فقاعات للهروب ونشر الحل على طبقة رقيقة. وتغطي معظم الشريحة مع الحل البوليمر. إنشاء تراكم طفيف مع الشريحة الأعلى لضمان أنه يمكن سحب الشرائح عن بعضها البعض في خطوات لاحقة.
- التشعب الشرائح تحت مصباح نانومتر الأشعة فوق البنفسجية 365 (حوالي 10 ميغاواط/سم2) لمدة 15 دقيقة.
5-الإفراج عن شماعة الهلام من الشرائح الزجاجية
- تطبيق الضغط على الشريحة الذي يخيم وسحب شريحتين أربا بوتيرة بطيئة في أمر تجنب تكسير الشرائح يدوياً. تسمح المواد الهلامية تجف لمدة 5 دقائق على الأقل، أو بين ليلة وضحاها.
- ضع الشريحة في كوب معقم 25 مم طبق بيتري وتصب برفق حل HCl 1 م على الشريحة، باستخدام ما يكفي فقط لتغطية الشريحة (حوالي 10-20 مل). روك بلطف طبق بيتري؛ ينبغي أن تبدأ الجل لرفع إيقاف الشريحة HCl يذوب بطلاء الزنك الذبيحة والإبر. وبمجرد الهلام خالية من الشريحة، صب HCl مرة أخرى في حل الأسهم.
- شطف الجل بصب حوالي 25 مل من س 1 برنامج تلفزيوني بلطف إلى طبق بتري حتى مغمورة بالشريحة وجل.
6. بذر خلية بيلاييرس
- إعداد خلايا A549 للبذر. باختصار، شطف قارورة2 75 سم مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1 x، أضف 3 مل من 0.25% يدتا التربسين واسمحوا الجلوس لمدة 2-3 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- ميكانيكيا تحرض قارورة واخماد رد فعل مع "تعديل النسر المتوسطة" 3 مل دولبيكو مع 10% الجنين البقري 1% ومصل البنسلين-ستربتوميسين، وجمع في قارورة مخروطية الشكل 15 مل. شطف مع مل 4 إضافية "تعديل النسور" إكمال دولبيكو، وجمع في نفس مخروطية الشكل. تدور الخلايا في 475 x ز لمدة 6 دقائق.
- بينما هي الغزل الخلايا إلى الأسفل، إضافة قطره صغيرة من "تعديل النسر المتوسطة" كامل دولبيكو لكل بئر من لوحة 6-جيدا. استخدام الملقط لنقل عوازل السيليكون مع المواد الهلامية في لوحة 6-بئر جديدة، مثل أن الجل هو يستريح على قطره من وسائل الإعلام. الآن أن المواد الهلامية تنتشر في طبقة رقيقة، تحقق للتأكد من أن توجد لا ثقوب كبيرة مرئية بالعين. ينبغي أن يتم هذا قبل مباشرة خلية البذر لتجنب التجفيف وتكسير من المواد الهلامية.
- ريسوسبيند الخلايا في "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو مع 10% الجنين البقري 1% ومصل البنسلين-ستربتوميسين بتركيز 6 × 105 خلايا/مل. إضافة قطره تعليق خلية الحكمة إلى مركز الهلام، في محاولة للحفاظ على غضروف في المنطقة لكمات خارجاً من غشاء السيليكون. السماح للخلايا الانضمام ح 4.
- بعد ح 4، إضافة 0.5 مل من "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو كاملة إلى البئر واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية للسماح للانضمام الكامل.
- في اليوم التالي، إعداد هوفيكس لبذر الخلية.
- شطف قارورة2 75 سم مع 5 مل من 1 X PBS، أضف 3 مل من 0.25% يدتا التربسين واسمحوا الجلوس لمدة 2-3 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- ميكانيكيا تحرض قارورة واخماد رد فعل مع 3 مل M199 وسائل الإعلام مع 20% مصل بقرى الجنين، 1% البنسلين-ستربتوميسين، وتكملة النمو 1%، وجمع إلى 15 مل مخروطية.
- شطف مع 4 مل M199 كاملة وسائط الإعلام، وجمع في نفس مخروطية الشكل. تدور الخلايا في 475 x ز لمدة 6 دقائق.
- بينما هي الغزل الخلايا إلى الأسفل، إضافة قطره صغيرة من المتوسطة كاملة 199 لكل بئر في صفيحة 6-بئر جديدة. مكان عازل سيليكون جديدة في البئر مع قطره من وسائل الإعلام في مركز السيليكون.
- استخدام الملقط، بعناية الوجه عازل سيليكون دعم هلام الوتد مع خلايا A549 على المعزل في لوحة 6-بئر جديدة.
- ريسوسبيند هوفيكس بتركيز 6 × 105 خلايا/مل وإضافة تعليق الخلية إلى وسط انخفاض جل انقلبت الحكمة، في محاولة للحفاظ على غضروف في هلام داخل المنطقة لكمات خارجاً من غشاء السيليكون. السماح للخلايا الانضمام ح 2.
- بعد ح 2، بلطف إضافة 2 مل M199 وسائط كاملة لكل بئر.
7-الفلورة
- بعناية قم بإزالة الوسائط من الهلام مع ماصة يدوي وإضافة ما يقرب من 500 ميليلتر من 4% بارافورمالدهيد (PFA) إلى مركز جل حيث يتم المصنف الخلايا. السماح للجلوس لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: منهاج عمل بيجين مادة كيميائية سامة؛ ارتداء حماية وضمان التعامل مع القيام في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء. - بعناية إزالة منهاج عمل بيجين، وإضافة ما يقرب من 500 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 2% في برنامج تلفزيوني لكل جيل. واسمحوا الجلوس ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- بعناية إزالة جيش صرب البوسنة. إعداد الأجسام المضادة الأساسي في إضعاف 1: 100 في جيش صرب البوسنة 2% في برنامج تلفزيوني، وإضافة 500 ميليلتر لكل جيل. واسمحوا الجلوس ح 1 في درجة حرارة الغرفة. شطف بلطف مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x.
- كرر نفس العملية مع الأجسام المضادة الثانوية. استخدام التالية الأضداد: 1) المضادة الإنسان CD144 16B1 استنساخ (VE-كادهيرين)؛ 2) المضادة الإنسان CD324 (E-كادهيرين) استنساخ 6714؛ 3) المضادة الإنسان CD31 استنساخ (بيكم-1) C-20؛ 4) مكافحة-A549؛ 5) المضادة الماوس فيتك؛ 6) المضادة الماعز 647 فلور أليكسا. أن تصور واكتين، إضافة 500 ميليلتر من فالويدين (10 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني) لمدة 20 دقيقة.
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية أو فالويدين بعناية وإضافة 500 ميليلتر من DAPI (0.1 ميكروغرام/مل) عن 20 دقيقة بعناية إزالة الحل DAPI ولطف إضافة 1.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لكل بئر حيث تكون المواد الهلامية في التعليق.
- استخدام العوازل ملاقط وسيليكون، نقل جل واحد على شريحة زجاجية. تنفيذ هذا الإجراء لكل جل فورا قبل التصوير، واستبدال المواد الهلامية في حل برنامج تلفزيوني بعد التصوير.
- وبدلاً من ذلك، جبل الجل باستخدام وسيلة متزايدة DAPI. ختم العينات مع طلاء الأظافر جيدا، والحصول على الصور من خلال يومين لمنع تجفيف وتكسير جل. الرجوع إلى الجدول 1 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وشكلت إدارات شماعة الهلاميات المائية ساندويتشينج الحل البوليمر بين طبقتين الذبيحة أكسيد الزنك وإنشاء قوالب المسام مع الإبر أكسيد الزنك. ثم تم إزالة مكونات الذبيحة أكسيد الزنك مع حمض الهيدروكلوريك، وتوليد الهلاميات المائية شماعة سامسونج مع المسام المستمر (الشكل 1). وأكد المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) مورفولوجية الإبر أكسيد الزنك، وتم تحديد متوسط الطول والعرض لتكون 3.92 ميكرومتر ± 0.089 و 0.43 ± 0.02 ميكرومتر، على التوالي (الشكل 2أ-2). وبعد إزالة الإبر أكسيد الزنك، المسام المائية كانت تصور بوزارة شؤون المرأة وتتميز (الشكل 2ج-2E). وكان المسام متوسط الكثافة الهلاميات المائية 176,863 ± 49,532 المسام. وزارة شؤون المرأة واستخدمت أيضا لتصور وحساب كثافة المسام إدراج دعم نفاذية البولي المسام ميكرومتر 3 القياسية، وكثافة المسام ووجد أن تكون أقل بكثير، مع حوالي 2.51 المسام ± 0.05 كل مربع مم (الشكل 2د، الجدول 2). قطر المسام متوسط في أكسيد الزنك templated المائية شماعة 0.19 ± 0.01 ميكرون، وهو أصغر بكثير من المسام ميكرومتر ± 0.21 3.47 لاحظ في إدراج دعم نفاذية (الشكل 2ه، الجدول 2). تم استخدام التصوير المقطعي التماسك الضوئية للحصول على كلتا الصورتين 2 و 3 الأبعاد وتحديد سمك الهلاميات المائية العائمة في برنامج تلفزيوني 1 x (الشكل 3أ-3). وكان جل متوسط السمك 18.89 ± 3.47 ميكرومتر (الجدول 2). ميكانيكا جل قيمت أيضا بقياس معامل مطاطا كما تم وصفه سابقا، وتبين المعامل للشباب متوسط 96.78 ± 23.92 كيلوباسكال (الجدول 2). 14
مجهر الفلورة يوضح أن غشائي الخلايا والخلايا الظهارية الحفاظ على هوياتها المظهرية بعد يجري مثقف في سامسونج شماعة-إدارات الهلاميات المائية. خلايا بطانية الإبقاء على التعبير عن خلايا بيكام-1، والظهارية الملون إيجابيا مع جسم A549 المضادة (الشكل 4أ-4). كما يحتفظ كل أنواع الخلايا القدرة على تشكيل تقاطعات ضيق. خلايا بطانية وأعرب VE-كادهيرين في تقاطعات خلية خلية والخلايا الظهارية أعرب ه-كادهيرين (الشكل 4ج-4 د). الهلاميات المائية إدارات شماعة أيضا دعم بيلاييرس الخلوية، والسماح لجهات الاتصال خلية للنموذج ضمن هياكل يسهل اختراقها، كما يتبين من التصوير إيممونوفلوريسسينت من فالويدين الملون عينات (الشكل 4ﻫ).
الشكل 1 . نظرة عامة على التخطيطي المائية إعداد البروتوكول. A) التوليف وجمع الإبر أكسيد الزنك. ب) إعداد الشرائح الزجاجية؛ إنشاء طبقة أكسيد الزنك الذبيحة. ج) التحضير والتعقيم لعوازل السيليكون. د) "التحضير لربط" الحل بالإبر أكسيد الزنك. ه) "بلمرة لربط" الهلام بين الشرائح الزجاجية أكسيد الزنك المغلفة. تمثل خطوط بيضاء الذبيحة أكسيد الزنك الإبر ومواد الطلاء. و) HCl شطف لإزالة الإبر والإفراج عن جل من الشرائح. تمثل الخطوط الداكنة المسام التي تم إنشاؤها بواسطة الإبر أكسيد الزنك المذاب. ز) نقل المواد الهلامية وعوازل السيليكون إلى الطبق 6-جيدا للتحضير لبذر الخلية. ح) البذر الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . توصيف إبرة الزنك والمائية المسامية. A) الصورة SEM الإبر الزنك (مقياس بار 5 ميكرومتر). ب) الطول والعرض للزنك الإبر. وتمثل النقاط القياسات للابر الفردية؛ تمثل الخطوط يعني والخطأ القياسي. ج) SEM صورة المائية المسامية (مقياس بار 2 ميكرون). د) المسام الكثافة و ه) المسام متوسط القطر ليدعم نفاذية البولي والهلاميات المائية الوتد. تمثل أشرطة يعني والخطأ القياسي. ف < 0.0001 عن طريق اختبار T. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . سمك المائية. يوضح "التصوير المقطعي التماسك الضوئية" A) 3-الأبعاد و ب) صور ثنائية الأبعاد من الهلاميات المائية العائمة في برنامج تلفزيوني. تمثل الأسهم سطح السائل، وتمثل العلامة النجمية المائية. شريط الحجم هو 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . دعم الهلاميات المائية أحادي الطبقة والثقافة بلير- كلا غشائي الخلايا والخلايا الظهارية قادرون على تشكيل مونولاييرس المتلاقية على شماعة الهلاميات المائية، كما تجلى في تلطيخ الفلورسنت ل أ) CD31 (CD31 الأحمر والأزرق DAPI) و ب) A549 (A549 الأحمر، DAPI الأزرق)، على التوالي. وأظهرت تشكيل تقاطعات كادهيرين سليمة ل ج) خلايا بطانية (VE كادهيرين الخضراء، DAPI الأزرق) و د) الخلايا الظهارية (E كادهيرين أخضر، أزرق DAPI) (مقياس أشرطة 100 ميكرون). ه) وأظهرت مثالين بليرس الخلوية تلطيخ (فالويدين الأحمر والأزرق DAPI) فالويدين (مقياس أشرطة 10 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المشكلة | الحل المحتمل |
| وقد الجل ثقوب كبيرة. | تأكد من أن الإبر الزنك بما فيه الكفاية انقسموا قبل استخدامها. |
الجدول 1. اقترح حلولاً لمشاكل استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
| هيدروجيل | ترانسويل | المصفوفة خارج الخلية | |
| كثافة المسام (المسام/مم2) | 1.77 x ± 4.9 × 105 104 | 2.51 ± 0.05 | 8.50 × 102 إلى 7.0 x 104 2,14 |
| المسام القطر (ميكرومتر) | 0.19 ± 0.01 | 3.47 ± 0.21 | 0.47 إلى 3.86 2,14 |
| سمك (ميكرومتر) | 18.89 ± 3.47 | 10 | 0.05 إلى 0.10 17 |
| معامل التحويل (الكوري) للشباب 5 | 96.78 ± 23.92 | > 1000 | 3.5 14 |
الجدول 2. مقارنة الخصائص المائية لإدراج دعم نفاذية القياسية والمصفوفة خارج الخلية (تمثل القيم يعني ± الخطأ القياسي)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول بالتفصيل هنا أتاح لنا أن خلق المائية شماعة الانضباطي لتكون بمثابة سقالة المحاكاة البيولوجية BM. على وجه التحديد، متفاوتة الأوزان الجزيئية شماعة، استراتيجيات الاقتران الببتيد، وهياكل ميكروكريستالاين أكسيد الزنك أو تركيزات، معامل المرونة، الخصائص الكيميائية الحيوية، وبنية مسامية من الهلاميات المائية يمكن تعديلها، على التوالي. سقالة شماعة سامسونج يتميز بكثافة أعلى في مسام وقطرها مسام أصغر mimetic المزيد من الميزات الموجودة في الأغشية الطابق السفلي في فيفو مقارنة بنموذج دعم نفاذية قياسية (الجدول 2). علاوة على ذلك، من خلال هذه الطريقة حققنا بنية سامسونج مع سمك متوسط أقل من 20 ميكرومتر. في حين حققت بالفعل نماذج دعم نفاذية البولي طبقة سامسونج لمجرد 10 ميكرومتر، على حد علمنا، هذا هو أول نظام التعويم الحر والانضباطي المائية لتحقيق هذا السمك. وأخيراً، قد الهلاميات المائية شماعة معامل حوالي 100 كيلو باسكال، وهي أوامر من حجم أقل شديدة مما يدعم نفاذية التقليدية، وزراعة الأنسجة من البلاستيك، والزجاج، والتي جميع بواقي مطاطا في نطاق برنامج العمل العالمي، وهي لذلك أكثر مرونة قابلة للمقارنة إلى الانخفاض (< 10 كيلو باسكال) معامل مرونة في فيفو خارج الخلية مصفوفة (الجدول 2).
تحقيق معامل مرونة منخفضة كان واحداً من الأهداف الرئيسية للعمل الذي عرضه هنا، وهو واحد من الحد بالاستخدام البولي التقليدية نماذج الدعم نفاذية. فمن المعروف جيدا أن صلابة الركيزة يمكن أن تملي سلوك الخلية، وقد أظهرت الأعمال أن تصلب الركيزة يمكن أن توجه مصير الخلوية للتفريق بين الخلايا. 12 ركائز قاسية أيضا شائعة تستخدم لتقليد الدول المرض، بما في ذلك أنسجة تليفية أو الأورام السرطانية، وبالتالي لا دقة الممثل للأنسجة السليمة. 18 , 19 , 20 , 21 من أجل دراسة هادئة تعمل الخلوي ووظائفه، من المهم استخدام ركائز التي تحاكي معامل مرونة ذات الصلة في فيفو. واحدة من المزايا الرئيسية لهذا النظام هو القدرة على لحن ميكانيكا الجل، الذي يمكن تحقيقه باستخدام الوتد مع الأوزان الجزيئية مختلفة. كما العديد من الأمراض المرتبطة بتشديد إدارة المحتوى في المؤسسة، أن هذا النظام يوفر منصة المحاكاة البيولوجية لدراسة آثار صحية مقابل BM المريضة في وظيفة الخلية. يمكن أيضا أن يتحقق مزيد من تعديل هذا النظام بتغيير الجزء الببتيد المدرجة لالتصاق الخلايا. لأغراض هذه الدراسة، استخدمت إدارات سبب التعبير في كل مكان في العديد من البروتينات BM وقدرته لتيسير مرفق خلية الراسخ. بالإضافة إلى إدارات، يمكن أيضا إدراج الشظايا laminin لتعزيز التفاعلات laminin الظهارية التي توجه الاستقطاب خلية قمي القاعدية. 1 مثلما هو تغيير صلابة BM في المرض، يتم تشكيلها تكوين غشاء الطابق السفلي في الحالات المرضية. استخدام السلائف شماعة--دائرة الصحة الوطنية أمين المتفاعلة، من الممكن متزاوجة مجموعة متنوعة من الببتيدات والبروتينات لقاعدة البوليمر الوتد. 11 , 14 , 15 وهذا مفيد خاصة للتحقيق في آثار الاشتباك إنتغرين لمستقبلات إنتغرين مختلفة. على سبيل المثال، تسلسل إدارات التي يتم التعبير عنها في فيبرونيكتين والكولاجين يشرك إينتيجرينس متعددة، ولكن خصوصية عالية إنتغرين αvβ3. لتقليد الركازة غنية فيبرونيكتين على وجه التحديد، يمكن إدراج تسلسل حمض-فالين (LDV) الأسبارتيك leucine للمشاركة α4β1، أو تقليد غشاء كولاجينوس، حمض الأسبارتيك-جليكاين-جلتاميت حمض-ألانين (دجيا) يمكن أن تضاف إلى إشراك إنتغرين Α2Β1. 8
بيلاييرس بطانية الظهارية هي مجرد مثال واحد من بيلايير الخلوية التي يمكن أن تنشأ فيما يتعلق بالنموذج المعروض هنا. وتشمل بليرس الأخرى التي توجد بطبيعة الحال في فيفو، مفصولة بواسطة BM رقيقة أو إدارة المحتوى في المؤسسة، فقط بطانية بيريسيتي والعضلات الملساء غشائي خلية بليرس. وهكذا، طلبات الحصول على هذه الطريقة واسعة وتمتد من الطب الرئوي لبيولوجيا الأوعية الدموية. علاوة على ذلك، وبسبب المسامية فريدة من نوعها لهذه الهلاميات المائية، أنها توفر القدرة على إجراء الدراسات الفنية أن النماذج المائية السابقة لم تكن قادرة على تقديم الدعم. من خلال دمج المسام إلى نظامنا المائية سامسونج، أنشأنا بديل المحاكاة البيولوجية معززة لنماذج الدعم يسهل اختراقها، تمكين التحقيق البكتيرية التسلل وشائع عبر الرئة الظهارية غشائي الحاجز في السل. 3 , 6 , 14 , 22 وعلى نحو مماثل، التهجير أو إنزيمية الخلايا التحريضية عبر الثقافات الخلية الأوعية الدموية يمكن أن يحقق بقياس معدل التقاط خلية على سطح الخلية فونكتيوناليزيد إدارات لاصقة من الجل، كما تبين سابقا. 16 وهذا ميزة واضحة عبر الطرق المائية على أساس السابقة التي حققت شروط ثقافة المشارك عن طريق التغليف. تسمح هذه النظم بمقربة وخلية خلية الاتصال بين نوعين من الخلايا وقد نجحت لقياس وظائف مثل الأوعية وفاسكولوجينيسيس، ولكن تفتقر إلى إمكانية الوصول التي توفرها نظم ثنائية الأبعاد، التي توفر كثير أبسط منهاج قياس تسرب أو تسلل أو الهجرة النشطة عبر حاجز خلوية شارك مثقف. 17
وهكذا، الأسلوب أداءهم هنا يوفر منبرا لمجموعة متنوعة من الدراسات عبر حقول متعددة، ويوفر نقطة انطلاق نحو توليد البيانات ذات الصلة أكثر من الدراسات في المختبر زيادة فهم الأمراض في فيفو والآليات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب يود أن يشكر البروفسور بول فإن شرابه والأستاذ كيندوم أوسوجي للأحاديث المدروسة والخبرة علوم المواد. تم توفير التمويل لهذا العمل بالجائزة مبادرة جديدة Dubinsky والمعاهد الوطنية للصحة نيبيب BRPR01 EB16629-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
- Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
- Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
- Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
- Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
- Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
- Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
- West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
- Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
- DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
- Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
- Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
- Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
- Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
- Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
- Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).
