Summary
Текущие модели культуре бислой не позволяют для функциональных в vitro исследования, которые имитируют в vivo микросреды. С помощью полиэтиленгликоля и метод шаблонов оксид цинка, этот протокол описывает развитие ультратонких biomimetic базальной мембраны с перестраиваемой жесткость, пористость и биохимический состав, который тесно имитирует в естественных условиях внеклеточные матрицы.
Abstract
Базальной мембраны является критически важным компонентом клеточной бислоев, которые могут меняться в жесткости, композиция, архитектуры и пористость. В vitro исследования эндотелия эпителиальных бислоев традиционно полагались на проницаемых поддержка моделей, которые позволили культуре бислой, но проницаемых поддерживает ограничены в их способности копировать разнообразия человеческого подвале мембран. В противоположность этому гидрогеля модели, требующие химического синтеза высоко настраиваемый и позволяют изменения жесткости материала и биохимический состав через включение biomimetic пептидов и белков. Однако традиционных гидрогелевых модели ограничены в функциональности, потому что им не хватает поры для ячеек контактов и функциональных в vitro исследования миграции. Кроме того из-за толщины традиционных гидрогели, включение поры, которые охватывают всю толщину гидрогели был сложным. В настоящем исследовании мы используем poly-(ethylene-glycol) (PEG) гидрогелей и метод шаблонов Роман окись цинка для устранения предыдущих недостатков biomimetic гидрогелей. В результате мы представляем ультратонких, базальной мембраны, как гидрогель, который позволяет культуры вырожденная сотовой бислоев на настраиваемый леску с переменной поры архитектуры, механические свойства и биохимический состав.
Introduction
Внеклеточные матрицы (ECM) составляют леса белка, которые крепления клеток и служить в качестве барьеров между типами отдельных клеток и являются важным компонентом комплекса тканей и органов. В отличие от интерстициальных соединительной ткани базальной мембраны (БМ) — это специализированный тип ECM, который действует как барьер для разделения отсеков ткани друг от друга. СЭЗ толщиной примерно 100 мкм и поэтому позволяют прямые и косвенные связи между ячейками с обеих сторон. Двумя распространенными примерами СЭЗ являются сосудистые СЭЗ, нашли в микрососудистой стене между pericytes и эндотелиальных клеток и сократимость БМС, которые находятся между эндотелия и эпителиальных клеток. СЭЗ играют важную роль в регулировании функции клеток, клеток полярности и миграции, в здоровье и болезни. 1 состав, жесткость, архитектуры и пористость СЭЗ варьируется систем органов для содействия различных физиологических функций. К примеру BM поры имеют решающее значение для поддержания связи ячеек, растворимых молекул диффузии и для миграции иммунных клеток воспаления или бактерий во время инфекции. В дыхательных путях поры охватывают полную толщину BM, диаметром от 0,75 до 3,86 мкм2
Тонкий характер BM гарантирует, что, хотя типы клеток физически отделены друг от друга, межклеточные связи через опосредованной паракринными и контакт сигнализации сохраняется. Таким образом для изучения болезней человека в пробирке, исследователи полагались на пористых проницаемых Поддержка вставки бислоев клеточной культуры. 3 эти модели были критически важное значение для понимания сотовой связи, который играет определенную роль в здоровье и болезни. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 проницаемых Поддержка вставки удовлетворить основные требования для понимания, как ячеек сигнализации регулирует физиологические процессы, такие как набора лейкоцитов и бактериальных проникновения; Однако, вставки имеют значительные ограничения и не имитировать человека BM. Permeable Поддержка вставки не хватает как механических, так и биохимических перестройки, и упрощенным пористая структура не имитировать волокнистая структура, которая создает нерегулярных поры Типичные СЭЗ. Таким образом существует растущая потребность перестраиваемый систем, которые можно воссоздать родной BM свойств, которые влияют клеточных процессов.
На основе полимерной подложки являются идеальными кандидатами для развития biomimetic СЭЗ для изучения клеточных бислоев в контексте, который более тесно имитирует в естественных условиях окружающей среды. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 полимеры механически перестраиваемый и может быть химически изменена для включения biomimetic терпеноидные фрагменты. 11 , 12 , 13 биоинертный полимер полиэтиленгликоля (PEG) может использоваться для создания биомиметических СЭЗ, и недавняя работа подробный синтез механически перестраиваемый PEG аргинин глицин аспарагиновой кислоты (РГД) гели с пористой сетями, которые поддерживают рост клеток и хемотаксис воспалительных клеток. 14 Хотя опубликованные на базе PEG субстратов предусмотрено более реалистичной модели человека ECM чем проницаемых поддерживает, многие из этих моделей являются чрезвычайно толстый, с глубиной приблизительно 775 мкм, что ограничивает возможность создания бислой культур с ячеек Контакты. 14
Здесь мы представляем собой протокол для создания BM имитировать PEG на полимерной основе, которая преодолевает многие из ограничений текущей ячейки бислой культуры технологий. Мы разработали метод шаблонов, который включает в себя оксид цинка, широко используемым материалом для производства микрокристаллической продукции, в полимерной во время синтеза и сшивки, которая впоследствии и выборочно удалить из результате массовых полимер. Этот процесс создает случайный пористых сеть, подражая извилистый и взаимосвязанных поры сети человека СЭЗ. Кроме того пористость может быть изменено путем изменения размера и формы окись цинка микрокристаллов через изменение реакции стехиометрии во время производства иглы. Методика, разработанная здесь создает ультратонких гидрогеля, который имитирует толщина человеческого BM. Наконец, механики, пористость и биохимический состав этих конструкций BM-как легко может быть изменен для создания микроокружения, наиболее Аналогично, видели в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Пожалуйста, прочитайте безопасности продукта (MSDS) всех материалов предварительного использовать и использовать меры предосторожности на всех раз.
1. синтез оксид цинка иглы
- Подготовка 250 мл 0,04 М Zn (№3)2* 6 H2O решения, добавив 2.9749 g Нитрат цинка в 250 мл воды.
- Подготовка 150 мл 1 M NaOH, добавив 6 г NaOH до 150 мл воды.
- Установить ванну минерального масла на горячей плите с мешалкой и погружаться флакон 500 мл круглым дном в масляной ванне при комнатной температуре.
- Добавить 250 мл Zn (№3)2* 6 H2O в колбу и начать помешивая реакции.
- Добавьте 150 мл раствора NaOH (Белый преципитат форме кратко и затем исчезнуть как два решения по-прежнему смешать). Перемешайте 2 h обнаружили.
- Тепла колбу до 55-60 ° C и продолжать перемешивание за 24 ч.
- Выключите огонь и дайте решение остыть до комнатной температуры во время перемешивания.
- Фильтр решения на воронке Бюхнера с порами размером 11 мкм и дайте высохнуть на ночь, открытые. Когда фильтр бумага больше не мокрой от разлитых решения и белый порошок сформировала над отверстиями воронка, частицы полностью высох.
- Собирать ZnO иглы и подготовиться к растровая электронная микроскопия (SEM) для подтверждения морфология иглы. Кратко монтировать ленту углерода на PIN-код заглушки и использовать металлический шпатель для мазка ZnO иглы на ленту углерода. Распыления пальто с 8 мм Иридиум на плотности 22,4 г/см3 и получить изображения на 10 кв.
2. Добавление жертвенных цинкового слоя на скольжениях микроскопа для HCl индуцированной релиз PEG
- Подготовьте раствор ацетата цинка растворяют 1.756 g ацетат цинка в 200 мл метанола.
- Очистить 3 "x 1" обычный Микроскоп слайды с 70% этанола и одноразовые протирают. Дайте высохнуть на воздухе на 10 мин.
- Место 150-мм стекла Петри на горячей пластине и подогрейте до 150-160 ° C.
- С помощью пипетки стеклянные с лампой пипетки, удерживайте стекла слайды с помощью пинцета и пальто горками, применяя 5 капель ацетат цинка, образуя тонкий слой рассеяны на слайде. Разрешить избыточного решения капать обратно в раствор.
- Поместите слайд в разогретую чашку Петри (150-160 ° C) с покрытием ацетат цинка, стороной вверх. Оставьте на конфорку на 15 мин.
- Удалить слайд с помощью пинцета и дайте ему остыть до комнатной температуры. Слайд появится быть покрыты с белыми прожилками.
- Удалите избыток цинка, что оставшиеся на слайдах с помощью одноразовых очистки для удаления известные белые полосы. Поверхности должны быть одинаковыми.
- Разоблачить подготовленные слайды для УФ света в капюшоне биобезопасности для по крайней мере 1 час для обеспечения стерильности.
Предупреждение: УФ свет вреден для глаз и воздействию кожи. Избегайте прямого воздействия на глаз или кожи и отключение электроснабжения, когда не используется.
3. Подготовка силиконовых изоляторов
- Вырезать силиконовый лист на площади менее 1 "х 1" (изоляторы должны уметь вписываются в 6-ну блюдо).
- Пробейте отверстия 8-12 мм в центре квадратов с пуншем биопсии.
- Автоклав силиконовые изоляторы для 20 мин 121,0 ° C и 1,12 кг/см.
4. Подготовка PEG решение и PEG гель синтез
Примечание: Функционализации полимеризации PEG были широко изучены и подробный ранее в нашей лаборатории и другие. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17
- Совместить клей пептид РСЗ клеток с acryloyl-PEG-NHS в бикарбонат натрия 50 мм (рН 8,5) в соотношении 1:1 молярная для включения функционализация Амин конечной пептид с акрилат остаток, биохимическая реакция, которая была ранее характеризуется приносить более чем 85% эффективности. 17
- Подготовьте фото инициатора, смешивая 2,2-диметокси-2-phenylacetophenone с 1-Винил-2-пирролидона в концентрации 300 мг/мл.
- В отдельных 1.5 мл пробирок, весят следующее: 20 мг ZnO игл, 12,5 мг PEG-да и 2,5 мг PEG-РГД.
- Приостановить 20 мг ZnO иглы в 270 мкл раствора FBS/PBS 10%; вихревой смешивать (примерно 15 s).
- Кратко (< 1 s) спина решение в центрифугу мини Настольная принести любой ZnO агрегатов на базе трубки.
- Соберите 250 мкл от верхней части ZnO решения, чтобы обеспечить агрегатов в нижней части трубки. Сочетании с ПЭГ-да и ПЭГ-РГД для создания решения КОЛЫШЕК с приблизительно 2,5 мм РГД. Вихревой смешивать (примерно 15 s).
- 2 мкл пирролидона ацетофенон/n Винил фото инициатор и вихревой кратко, чтобы смешивать (примерно 5 s).
- 20 мкл раствора полимера вдоль центра ZnO покрытием слайды.
- Медленно опускайте второй слайд на вершине, с ZnO покрытие лицом вниз (PEG решение должно быть между двумя слоями ZnO покрытием). Попробуйте во избежание любых воздушных пузырьков. Перемещение слайдов боково вдоль главной оси, чтобы разрешить любые пузыри бежать и распространить решение тонким слоем. Обложка часть слайда с раствор полимера. Создайте небольшой навес с верхней слайд, чтобы обеспечить, что слайды можно растаскивают в последующих шагах.
- Crosslink слайды под 365 Нм УФ лампа (около 10 МВт/см2) за 15 мин.
5. выпуск PEG Гели от стекла слайды
- Приложите давление к свисая слайд и вручную вытащить два слайда, помимо медленными темпами в порядке избежать растрескивания слайды. Разрешить гели сухой для по крайней мере 5 минут, или на ночь.
- Слайд в стерильные 25 мм стекла Петри и осторожно налить раствор HCl 1 M на слайд, используя только достаточно, чтобы покрыть слайд (около 10-20 мл). Осторожно покачайте Петри; геля должны начать снять слайд как HCl растворяет жертвенных цинковое покрытие и иглы. После того, как гель свободен от слайда, наливайте HCl обратно в раствор.
- Промойте гель, нежно поливая примерно 25 мл ПБС в Петри блюдо пока погруженной слайд и гель.
6. Заполнение ячейки бислоев
- Подготовка клетки A549 для заполнения. Вкратце, промойте 75 см2 флакон с 5 мл ПБС, добавить 3 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и пусть сидят в течение 2-3 минут при 37 ° C.
- Механически агитировать колбу, утолить реакции с 3 мл Дульбекко изменение средних орла с 10% плода bovine сыворотки и 1% пенициллин стрептомицина и собирать в коническую колбу 15-мл. Промыть еще 4 мл полной Дульбекко изменение орел СМИ и собирать в тот же конической. Вращайте клетки на 475 x g за 6 мин.
- В то время как клетки спиннинг вниз, добавьте небольшое падение полной Дульбекко изменение Eagle среды каждой скважины 6-ну плиты. Используйте пинцет для передачи силиконовых изоляторов с Гели в пластину новый 6-хорошо, таким образом, что гель покоится на падение средств массовой информации. Теперь, что гели распространяются в тонкий слой, убедитесь, что есть нет больших отверстий видимым для глаз. Это должно быть сделано сразу до клеток посева во избежание высыхания и растрескивания гели.
- Ресуспензируйте клетки в Дульбекко изменение средних орла с 10% плода говядину сыворотки и 1% пенициллин стрептомицина в концентрации 6 x 105 кл/мл. Добавление ячейки подвеска падение мудрым в центр геля, пытаясь сохранить мениска в районе кулаками, силиконовые мембраны. Позволяют клеткам следовать за 4 ч.
- После 4 ч добавить 0,5 мл Дульбекко изменение Eagle полной среды в колодец и инкубировать на ночь при 37 ° C для полной адгезии.
- Следующий день, подготовьте HUVECs для заполнения ячейки.
- Промойте 75 см2 флакон с 5 мл ПБС, добавить 3 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и пусть сидят в течение 2-3 минут при 37 ° C.
- Механически агитировать колбу, утолить реакции с 3 мл M199 СМИ с плода бычьим сывороточным 20%, 1% пенициллин стрептомицином и дополнение 1% роста и собирать в 15 мл конические.
- Промойте с 4 мл M199 полный СМИ и собирать в тот же конической. Вращайте клетки на 475 x g за 6 мин.
- В то время как клетки спиннинг вниз, добавьте небольшое падение полного среднего 199 каждой скважины в новом 6-ну пластине. Место новые силиконовые изолятор в колодец с каплей СМИ в центре силикона.
- С помощью пинцета, тщательно флип изолятор силикона, поддерживая PEG гель с A549 клеток на изолятор в новом 6-ну пластины.
- Ресуспензируйте HUVECs в концентрации 6 x 105 клеток/мл и добавьте суспензию клеток в центре перелистывание гель падение мудрый, пытаясь сохранить мениска на геле в пределах области кулаками, силиконовые мембраны. Позволяют клеткам присоединиться 2 h.
- После 2 ч осторожно добавьте 2 мл M199 полный СМИ для каждой скважины.
7. иммунофлуоресценции
- Тщательно удалить СМИ из гелей с ручной дозатор и добавить примерно 500 мкл параформальдегида 4% (PFA) к центру гель где посеяны клетки. Пусть сидят в течение 30 мин при комнатной температуре.
Предупреждение: PFA является токсичных химических веществ; Защита от износа и убедитесь, что обработка осуществляется в биологической безопасности кабинета. - Тщательно удалите ППД и добавить примерно 500 мкл 2% BSA в PBS в каждой гель. Пусть сидят в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Осторожно удалите BSA. Подготовка первичного антитела в разведении 1: 100 в 2% BSA в PBS и 500 мкл каждого геля. Пусть сидят в течение 1 ч при комнатной температуре. Осторожно промыть 500 мкл ПБС.
- Повторите тот же процесс с вторичные антитела. Используйте следующий антитела: 1) против человека CD144 (VE-Кадгерины) клон 16В1; 2) против человека CD324 (E-Кадгерины) клон 6714; 3) антинародным CD31 (PECAM-1) клон C-20; 4) анти A549; 5) анти мышь FITC; 6) анти коза Alexa Fluor 647. Чтобы визуализировать F-актина, добавить 500 мкл Фаллоидин (10 мкг/мл в PBS) за 20 мин.
- Тщательно удалить вторичные антитела или Фаллоидин и 500 мкл DAPI (0,1 мкг/мл) на 20 мин тщательно удалить DAPI решения и аккуратно добавить 1,5 мл 1 x PBS для каждой скважины, так что гели находятся во взвешенном состоянии.
- С помощью пинцета и силиконовых изоляторов, передачи одной гель на стеклянное скольжение. Сделайте это для каждого гель непосредственно перед изображений и заменить гели в PBS раствор после съемки.
- Кроме того смонтируйте гели, с помощью средства монтажа DAPI. Печать также образцы с лаком, получение изображений в течение 2 дней для предотвращения высыхания и растрескивания геля. Для устранения неполадок обратитесь к таблице 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ПЭГ-РГД гидрогели были сформированы сэндвич раствор полимера между двумя слоями жертвенных оксид цинка и создание шаблонов поры оксида цинка иглами. Жертвенный оксид цинка компоненты затем были удалены с соляной кислотой, генерации ультратонких гидрогели КОЛЫШЕК с непрерывной поры (рис. 1). Морфология оксид цинка иглы был подтвержден растровая электронная микроскопия (SEM), и средняя длина и ширина были полны решимости быть 3.92 ± 0,089 мкм и 0,43 ± 0,02 мкм, соответственно (Рисунок 2A - 2B). После удаления окиси цинка иглы гидрогеля поры были визуализированное SEM и характеризуется (рис. 2C - 2E). Средняя поры плотность для гидрогели был 176,863 ± 49,532 поры. SEM также используется для визуализации и рассчитать плотность поры стандартный 3 мкм поры поликарбоната проницаемых Поддержка вставки, и поры плотность оказалась значительно ниже, с приблизительно 2.51 ± 0,05 поры на квадратный мм (рис. 2D, Таблица 2). Средняя поры диаметром в оксид цинка шаблонного PEG гидрогеля был 0.19 ± 0,01 мкм и был значительно меньше, чем 3.47 ± 0,21 мкм поры наблюдаются в проницаемых поддержки вставка (Рисунок 2E, Таблица 2). Оптическая когерентная томография был использован для приобрести оба 2 - и 3-мерных изображений и определения толщины гидрогели, плавающие в однократном ПБС (рис. 3A - 3B). Средняя гель толщина был 18.89 ± 3.47 мкм (Таблица 2). Гель механики были также оценены путем измерения упругости как описано ранее, и было установлено, что средняя Юнга 96.78 ± 23.92 кПа (Таблица 2). 14
Иммунофлуоресценции демонстрирует, что эндотелиальные клетки и клетки эпителия поддерживать их фенотипические тождества после культивированный на ультратонких PEG-РГД гидрогели. Эндотелиальные клетки поддерживали выражения PECAM-1 и эпителиальных клеток, положительно окрашивали антитела анти A549 (рис. 4A - 4B). Обоих типов клеток также сохранить способность образовывать плотные соединения. Эндотелиальные клетки выражена VE-Кадгерины развязках ячеек, а эпителиальные клетки о E-Кадгерины (рис. 4C - 4 D). Гидрогели PEG-РГД также поддерживают сотовой бислоев и позволяют для ячеек контактов в форму внутри пористой структуры, что подтверждается immunofluorescent изображений Фаллоидин витражи образцы (Рисунок 4E).
Рисунок 1 . Схематический обзор гидрогеля подготовки протокола. A) синтез и сбор ZnO иглы. B) подготовка стеклянных скольжениях; Создание жертвенного слоя ЗНО. C) подготовка и стерилизации силиконовых изоляторов. D) подготовка PEG решение с ZnO иглы. E) полимеризации PEG гели между ZnO покрытием стеклянных скольжениях. Белые линии представляют собой жертвенных ZnO иглы и покрытий. F) HCl полоскания для снятия иглы и освобождения геля из слайдов. Темные линии представляют собой поры, созданные растворенного ZnO иглы. G) передачи гели и силиконовых изоляторов 6-ну блюдо готовить для заполнения ячейки. H) заполнения ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Характеристика иглой цинка и пористость гидрогеля. A) SEM образ цинка иглы (шкалы 5 мкм). B) длины и ширины цинка иглы. Точки представляют измерения для индивидуальных игл; линии представляют собой среднее и стандартная ошибка. C) SEM изображение пористых гидрогеля (шкалы 2 мкм). D) поры плотности и E) средней поры диаметр для проницаемых поддерживает поликарбоната и гидрогели КОЛЫШЕК. Столбики показывают среднее и стандартная ошибка. p < 0.0001 через T-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Гидрогель толщина. Оптическая когерентная томография демонстрирует A) 3-мерной и B) 2-мерных изображений гидрогелей, плавающие в PBS. Стрелки обозначают поверхности жидкости, звездочка представляет гидрогеля. Шкалы бар-100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Поддержка гидрогели монослоя и культуре бислой. Оба эндотелиальные клетки и клетки эпителия способны сформировать вырожденная монослои на PEG гидрогели, как продемонстрировано флуоресцентные пятная для A) CD31 (CD31 красный, синий DAPI) и B) A549 (A549 красный, синий DAPI), соответственно. Для формирования узлов нетронутыми Кадгерины демонстрируются C) эндотелиальных клеток (VE Кадгерины зеленый, синий DAPI) и D) эпителиальных клеток (E Кадгерины зеленый, синий DAPI) (шкала баров 100 мкм). E) два примера сотовой бислоев свидетельствует Фаллоидин окрашивание (Фаллоидин красный, синий DAPI) (шкала баров 10 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Проблема | Возможное решение |
| Гели имеют большие отверстия. | Убедитесь, что цинк иглы достаточно разобран перед их использованием. |
Таблица 1. Предлагаемые решения для устранения неполадок.
| Гидрогель | Transwell | Внеклеточная матрица | |
| Поры плотность (поры/мм2) | 1.77 x 105 ± 4.9 x 104 | 2.51 ± 0,05 | 8,50 х 102 -7.0 x 104 2,14 |
| Диаметр пор (мкм) | 0.19 ± 0,01 | 3.47 ± 0,21 | 0,47 до 3,86 2,14 |
| Толщина (мкм) | 18.89 ± 3.47 | 10 | 0,05-0,10 17 |
| Юнга модуль (кПа) 5 | 96.78 ± 23,92 | > 1000 | 3.5 14 |
В таблице 2. Сравнение свойств Гидрогель для вставки поддержка стандарта проницаемых и внеклеточного матрикса (значения представляют собой среднее ± Стандартная ошибка)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, подробно здесь позволило нам создать перестраиваемый PEG Гидрогель в качестве лески biomimetic BM. В частности, различной молекулярной массой PEG, пептид спряжение стратегии и оксид цинка микрокристаллическая структур или концентрации, упругости, биохимическими свойствами и пористой структуры гидрогелей могут быть изменены, соответственно. Ультратонких PEG леска имеет более высокую плотность поры и меньшего диаметра поры, что является более подражательный функций в в естественных условиях подвале мембраны по сравнению с Стандартный проницаемых поддержки модели (Таблица 2). Кроме того с помощью этого метода мы достигли ультратонкой структуры средняя толщина менее 20 мкм. В то время как модели проницаемых поддержки поликарбоната уже достигли слой ультратонких всего 10 мкм, насколько нам известно, это первая система свободного плавания и перестраиваемые Гидрогель для достижения этого толщина. И наконец гидрогели PEG имеют упругости приблизительно 100 кПа, который является порядков менее жесткими, чем традиционные проницаемых поддерживает, Культура ткани пластика и стекла, которые все имеют упругих модулей в диапазоне ГПД и поэтому являются более сопоставимы с низкой (< 10 кПа) упругости в vivo внеклеточного матрикса (Таблица 2).
Достижения низкой упругости является одной из основных целей работы, представленные здесь и является одним из ограничений на использование традиционных поликарбоната проницаемых поддержки модели. Хорошо известно, что жесткость субстрата может диктовать поведение клеток, и работа показала, что жесткость субстрата может направлять сотовой судьба дифференциации клеток. 12 жесткой субстратов также часто используются для имитации болезни государства, включая фиброзных тканей или раковой опухоли и поэтому не являются точно представитель здоровых тканей. 18 , 19 , 20 , 21 для изучения функций и покоя клеточном фенотипу, важно использовать субстраты, которые имитируют упругости, что отношение в естественных условиях. Одним из главных преимуществ этой системы является возможность настройки механики гель, который может быть достигнуто с помощью КОЛЫШЕК с различных молекулярных масс. Как многие заболевания, связанные с ECM жесткости, эта система обеспечивает biomimetic платформу для изучения воздействия здоровых по сравнению с больными БМ на функции клеток. Дальнейшие модификации этой системы можно также добиться путем изменения Пептидный фрагмент включены для клеточной адгезии. Для целей настоящего исследования РГД был использован из-за его повсеместно выражение многих BM белки и ее способности для облегчения фирмы клеток вложений. В дополнение к РСЗ Ламинин фрагменты могут быть также включены для содействия Ламинин эпителиальные взаимодействия, которые руководство верхушечно базальной клетки поляризации. 1 как BM жесткость изменяется в болезни, состав базальной мембраны перестроенный в патологических условиях. С помощью Амин реактивной PEG-NHS прекурсоров, возможна конъюгат различных пептидов и белков на базу полимер PEG. 11 , 14 , 15 это особенно выгодно для расследования последствий Интегрин участия для различных Интегрин рецепторов. Например последовательность РСЗ, которая выражается в коллагена и фибронектина участвует несколько интегринов, но имеет высокую специфичность для Интегрин αvβ3. Конкретно имитировать фибронектин богатые субстрата, лейцин аспарагиновой кислоты валина (АМГ) последовательности могут быть включены заниматься α4β1, или имитировать коллагеновых мембраны, аспарагиновой кислоты глицин глутаминовая кислота аланина (DGEA) могут быть добавлены к заниматься Интегрин Α2Β1. 8
Эндотелия эпителиальных бислоев являются лишь одним из примеров сотовой бислой, которые могут быть созданы с моделью, представленные здесь. Другие бислоев, которые естественно существует в естественных условиях, разделенных лишь тонкий BM или ECM, включают эндотелиальной перицит и бислоев клеток эндотелия гладких мышц. Таким образом приложения для данного метода являются широкими и выражаем от легочной медицины сосудистая биология. Кроме того из-за уникального пористость этих гидрогели, они предлагают возможность проведения функциональных исследований, которые предыдущих моделей гидрогеля не смогли поддержать. Включив поры в нашей системе ультратонких гидрогеля, мы создали расширение biomimetic замена для проницаемых поддержки моделей, позволяя расследования бактериальных инфильтрации, обычным явлением по легочной эпителия эндотелиальный барьер в туберкулеза. 3 , 6 , 14 , 22 аналогично, переселения или хемотаксис воспалительных клеток через сосудистые клеточных культур могут расследоваться путем измерения скорости захвата клеток на поверхности клей функционализированных клеток РГД геля, как было показано ранее. 16 это неоспоримое преимущество перед предыдущих гидрогеля на основе методов, которые добились условий совместного культуры через инкапсуляции. Такие системы позволяют для географической близости и ячеек контакт между двумя типами клеток и были успешными для измерения функции, такие как ангиогенез и vasculogenesis, но не хватает доступности, предоставляемые двухмерных систем, которые обеспечивают гораздо проще платформа для измерения утечки, проникновения или активной миграции через совместно культивируемых сотовой барьер. 17
Таким образом метод продемонстрировали здесь предлагает платформу для широкого спектра исследований по нескольким полям и предоставляет ступенькой к генерации более релевантные данные в vitro исследований для более глубокого понимания в vivo патологий и механизмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить профессор Пол ван кисточкой и профессор Чинедум Osuji за их продуманные диалоги и материаловедения опыт. Финансирование для этой работы было предоставлено Дубинский новая инициатива премии и национальных институтов здравоохранения NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
- Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
- Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
- Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
- Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
- Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
- Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
- West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
- Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
- DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
- Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
- Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
- Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
- Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
- Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
- Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).
