Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kültür Ultrathin Porated elastik Hydrogels bir Biomimetic membran için çift olarak hücre

Published: December 26, 2017 doi: 10.3791/56384
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Engineering, Yale University

Summary

Geçerli bilayer kültür modelleri içinde vivo microenvironments taklit fonksiyonel vitro çalışmalar için izin vermez. Polietilen glikol ve çinko oksit şablon oluşturma yöntemi kullanarak, bu iletişim kuralını geliştirme, bir ultrathin biomimetic membran tunable sertlik, porozite ve yakından vivo içinde taklit eden biyokimyasal kompozisyonu ile açıklanır hücre dışı matrisler.

Abstract

Membran sertlik, kompozisyon, Mimarlık ve porozite değişebilir hücresel bilayers önemli bir bileşenidir. Epitel endotel bilayers in vitro çalışmalar geleneksel bilayer kültür etkinleştirmek geçirgen destek modellerde yararlanmıştır ancak geçirgen destekler yeteneklerini insan Bodrum membranlar çeşitliliği çoğaltmak için sınırlı. Buna ek olarak, kimyasal sentez gerektiren hidrojel modelleri son derece ayarlanabilir ve malzeme sertlik ve biyokimyasal bileşimi biomimetic peptidler veya proteinler birleşme yoluyla değişiklikler için izin. Ancak, onlar gözenekleri hücre-hücre rehber ve fonksiyonel vitro geçiş çalışmaları için eksikliği nedeniyle geleneksel hidrojel modelleri işlevleri sınırlıdır. Buna ek olarak, geleneksel hydrogels kalınlığı nedeniyle, hydrogels tüm kalınlığı span gözenekleri birleşme zor olmuştur. Bu da çalışmanın, biz poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels ve roman çinko oksit şablon oluşturma yöntemi biomimetic hydrogels önceki eksikliklerini gidermek için kullanın. Sonuç olarak, biz Konfluent hücresel bilayers kültür değişken gözenek mimarileri, mekanik özellikleri ve biyokimyasal kompozisyonu ile özelleştirilebilir bir iskele izin verir bir ultrathin, membran benzeri hidrojel mevcut.

Introduction

Hücre dışı matrisler (ECM) hücre ek destek ve farklı hücre tipleri arasındaki engelleri olarak hizmet ve karmaşık doku ve organların bir unsuru olan protein iskele kadar olun. İnterstisyel bağ dokusu aksine, membran (BM) doku bölmeleri birbirinden ayırmak için bir bariyer görevi görür ECM, özel bir türüdür. BMs yaklaşık 100 µm kalın ve bu nedenle iki tarafında hücreler arasında doğrudan ve dolaylı iletişim için izin. İki ortak BMs vasküler BMs, mikrovasküler duvar perisitlerden ve endotel hücreleri arasında bulunan ve endotel ve epitel hücreleri arasında bulunan hava yolu BMs örnekleridir. BMs kullanımında önemli bir rol hücre işlevi, hücre polarite ve göç gibi düzenleyen, sağlık ve hastalık. 1 kompozisyon, sertlik, Mimarlık ve BMs porozite farklı fizyolojik fonksiyonları kolaylaştırmak için organ sistemleri arasında değişir. Örneğin, BM gözenekleri bağışıklık hücreleri enfeksiyon sırasında geçiş sırasında iltihap veya bakteri ve hücre-hücre iletişim, çözünür molekül difüzyon, bakımı için önemlidir. Havayolları, gözenekleri BM, tam kalınlığı 0,75 3,86 µm.2 ' ye kadar çeşitli çaplarda span

BM ince doğası ne kadar hücre tipleri fiziksel olarak birbirinden ayrılır, parakrin ve iletişim aracılı sinyalleşme ile hücreler arası iletişim korunur sağlar. Böylece, insan hastalık in vitro çalışma araştırmacılar kültür hücresel bilayers gözenekli geçirgen destek ekler üzerinde yararlanmıştır. 3 bu modellerin sağlık ve hastalık bir rol oynar hücresel iletişim anlamak için kritik olmuştur. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 geçirgen destek ekler nasıl hücre-hücre sinyallemesi lökosit işe alım ve bakteriyel infiltrasyon gibi fizyolojik süreçleri düzenleyen anlamak için temel gereksinimlerini karşılamak; Ancak ekler önemli kısıtlamalar sahip ve insan BM. Permeable destek taklit etmek başarısız ekler eksikliği mekanik ve biyokimyasal ayar ve basit gözenekli yapısı düzensiz gözenekler oluşturur lifli yapısı taklit değil BMs tipik. Bu nedenle, hücresel etkileyen yerel BM özellikler yeniden oluşturabilirsiniz tunable sistemler için büyüyen bir ihtiyaç vardır.

Polimer esaslı yüzeylerde biomimetic daha yakından in vivo ortamda taklit eden bir bağlamda hücresel bilayers çalışmaya BMs gelişimi için ideal adaylardır. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polimerler mekanik olarak ayarlanabilir ve kimyasal olarak biomimetic peptid parçaları. dahil etmek için değiştirilebilir 11 , 12 , 13 bioinert polimer polietilen glikol (PEG) biomimetic BMs oluşturmak için kullanılabilir ve son çalışma mekanik olarak ayarlanabilir PEG arginin-glisin-aspartik asit (RGD) jeller hücre büyümesini desteklemek gözenekli ağları ile sentezi ayrıntılı ve inflamatuar hücre kemotaksis. 14 PEG tabanlı yayınlandı, ancak bir insan ECM daha gerçekçi bir model daha geçirgen destekler yüzeylerde sağlanan, bu modellerin çoğu son derece kalın, hücre-hücre ile bilayer kültürler oluşturma yeteneği sınırlar kabaca 775 µm derinliğe kişiler. 14

Burada, bu çok geçerli hücre bilayer kültür teknolojileri sınırlamalar üstesinden gelir bir PEG polimer esaslı BM taklit oluşturulması için bir iletişim kuralı mevcut. Polimer sentezi ve sonradan ortaya çıkan ve seçmeli olarak kaldırılır crosslinking sırasında içine çinko oksit, Mikrokristalin üretim, üretim için yaygın olarak kullanılan bir malzeme içerir bir şablon oluşturma yöntem geliştirdik elde edilen toplu polimer. Bu işlemi insan BMs dolambaçlı ve birbirine bağlı gözenek ağının taklit rasgele gözenekli bir ağ oluşturur. Ayrıca, gözeneklilik boyutunu ve şeklini çinko oksit microcrystals tepki stoichiometry değişikliği sırasında iğne üretim yolu ile değiştirerek değiştirilebilir. Burada geliştirilen teknik insan BM. son olarak, mekanik, gözeneklilik kalınlığı taklit eden bir ultrathin hidrojel oluşturur ve bu BM benzeri yapıları biyokimyasal bileşimi çoğu bir microenvironment oluşturmak için kolayca değiştirilebilir Bu görüldü vivo içindebenzer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Lütfen okuyun önceki tüm malzemelerin malzeme güvenlik veri sayfası (MSDS) ve tüm güvenlik önlemleri kullanır için kez.

1. çinko oksit iğneler sentezi

  1. 0,04 M Zn (NO3)2250 mL hazırlamak * 6 H2O çözüm 2.9749 g çinko nitrat 250 mL su ekleyerek.
  2. 1 M NaOH 150 mL 150 mL su için 6 g NaOH ekleyerek hazırlayın.
  3. Mineral yağ banyo karıştırıcı ile sıcak tabakta ayarlayın ve bir 500 mL yuvarlak alt şişesi yağ banyolu oda sıcaklığında içine daldırın.
  4. Zn (NO3)2250 mL ekleyin * 6 H2O balonun için ve reaksiyon karıştırmaya başlar.
  5. 150 mL (beyaz çökelti kısaca formu ve iki çözüm karıştırmaya devam ederken kaybolduğunu) NaOH çözüm ekleyin. Heyecan için 2 h ortaya çıkardı.
  6. Şişeye 55-60 ° c ısı ve 24 saat için karıştırmaya devam.
  7. Isı kapatın ve çözüm için oda sıcaklığında karıştırma sırasında soğutmak izin verin.
  8. Çözüm Büchner huni ile 11 µm gözenek boyutu üzerinde filtre uygulamak ve kurumaya izin gecede, ortaya. Filtre kağıdı artık döktü çözümden ıslak ve beyaz bir toz huni delikleri üzerinden kurdu zaman parçacıkları tamamen kurutulur.
  9. ZnO iğneler toplamak ve elektron mikroskobu (SEM) taramak için iğne benzeri Morfoloji onaylamak için hazır olun. Kısaca, karbon teyp üzerine bir PIN saplama takma ve karbon teyp üzerine ZnO iğneler smear için metal bir spatula kullanın. 8 mm iridyum 22,4 g/cm3 yoğunluğu, paltoyla şaplatın ve 10, görüntüleri elde kV.

2. kurban çinko kaplama HCl için mikroskop slaytlarda ilavesi PEG sürümü indüklenen

  1. Çinko asetat çözüm 1.756 g çinko asetat 200 ml metanol çözülerek hazırlayın.
  2. Temiz 3 "x 1" düz mikroskop % 70 etanol ve tek kullanımlık mendil ile slaytlar. Hava için 10 dakikadır kuru sağlar.
  3. 150 mm cam Petri kabına sıcak bir tabak üzerine yerleştirin ve 150-160 ° c Onceden
  4. Bir cam damlalıklı damlalıklı ampul ile kullanarak, cam slaytlar cımbız ve ceket slaytlar ile çinko asetat, slayt üzerinde dağınık ince bir tabaka oluşturan 5 damla uygulayarak tutun. Hisse senedi çözüm damla aşırı çözüm izin verin.
  5. Önceden ısıtılmış Petri kabına (150-160 ° C) slayt çinko kaplı asetat yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Pinar 15 dakika bırakın.
  6. Cımbız ile slayt kaldırmak ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Slayt beyaz çizgiler ile kaplı olması görünür.
  7. Önde gelen beyaz çizgileri kaldırmak için tek kullanımlık mendil kullanarak slaytlarda kalan herhangi bir fazla çinko kaldırın. Yüzeyi düzgün olmalıdır.
  8. Açığa hazır slaytlar için UV ışık Biyogüvenlik başlıklı kısırlık emin olmak en az 1 h için.
    Dikkat: UV ışık gözlere zararlı ve cildin maruz. Gözleri ya da deri doğrudan maruz önlemek ve elektrik kaynağını değil kullanırken açın.

3. silikon izolatörler hazırlanması

  1. Kesme silikon sayfasına kareler daha az 1 "x 1" (izolatörler bir 6-şey tabak içinde sığacak şekilde mümkün olmalıdır).
  2. Bir biyopsi yumruk ile 8-12 mm delikler karelerin ortasına.
  3. Otoklav silikon izolatörler için 20 dk 121.0 ° C ve 1.12 kg/cm.

4. PEG çözüm ve PEG jel sentez hazırlanması

Not: Functionalization ve PEG polimerizasyon edilmiş kapsamlı araştırdı ve daha önce bizim laboratuvar ve diğerleri tarafından ayrıntılı. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17

  1. Acryloyl-PEG-NHS içinde 50 mM sodyum bikarbonat (pH 8,5) functionalization peptid akrilat yan, daha önce yapılmış bir biyokimyasal reaksiyon ile Amin terminus, etkinleştirmek için 1:1 molar oranında RGD hücre yapışkanlı peptid birleştirin % 85 verimliliği büyük verim ile karakterizedir. 17
  2. Fotoğraf-başlatıcı ile 1-vinil-2-pirolidon 300 mg/mL bir konsantrasyon, 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone karıştırarak hazırlayın.
  3. In ayrı 1,5 mL tüpler, aşağıdaki dışarı tartmak: ZnO iğne 20 mg, PEG-DA 12.5 mg ve PEG-RGD 2.5 mg.
  4. ZnO iğne 20 mg % 10 FBS/PBS çözüm 270 µL içinde askıya alma; girdap karışımı (yaklaşık 15 s).
  5. Kısaca (< 1 s) herhangi bir içeriği ZnO toplamları tüp üsse getirmek için benchtop mini santrifüj çözümde spin.
  6. 250 µL toplamları tüp alt kısmında kalmasını sağlamak için ZnO çözüm tepesinden topluyoruz. PEG-DA ve PEG-RGD ile yaklaşık 2.5 mM RGD PEG çözüm oluşturmak için birleştirmek. Girdap karışımı (yaklaşık 15 s).
  7. Acetophenone/n-vinil pirolidon fotoğraf-başlatıcı ve kısa bir süre karıştırmak için girdap 2 µL ekleyin (yaklaşık 5 s).
  8. Polimer çözüm merkezi kaplı ZnO slaytların boyunca 20 µL ekleyin.
  9. Yavaşça indirin ZnO kaplama yüz ile üst ikinci bir slayt aşağı (PEG çözüm iki kaplı ZnO katmanlar arasında olmalı). Herhangi bir hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek deneyin. Slaytlar Yanal Eksen Binbaşı herhangi bir kabarcıklar kaçmak için ve ince bir tabaka çözümü yaymak için izin vermek için hareket. Polimer çözüm içeren slaydı çoğunluğu kapsayacak. Slaytları sonraki adımda ayrı çekilebilir emin olmak için en iyi slayt ile hafif bir çıkıntı oluşturmak.
  10. Crosslink slaytları 15dk için 365 nm UV lamba (yaklaşık 10 mW/cm2) altında.

5. serbest bırakmak-in PEG cam slaytlardan jelleri

  1. Taşkın slayt ve el ile iki slayt ayrı sırayla yavaş bir hızda slaytları çatlama önlemek çekme basınç uygulayın. En az 5 min için kuru, veya bir gece jeller izin.
  2. Slayt bir steril 25 mm cam Petri kabına yerleştirin ve nazikçe bir slayda, yeterince sadece slayt (yaklaşık 10-20 mL) kullanacak 1 M HCl solüsyonu dökün. Yavaşça Petri kabına rock; jel kurban çinko kaplama ve iğneler HCl çözülür gibi slaytın dışına Asansör başlamalıdır. Jel slayttan özgür olduğunda, HCl geri stok solüsyonu dökün.
  3. Jel slayt ve jel batık kadar yavaşça yaklaşık 25 mL 1 x PBS Petri kabına dökerek durulayın.
Dikkatle PBS bir atık konteyner içine dökün.
  • Yavaşça jel çözüm içinde yüzen kadar yaklaşık 25 mL 1 x PBS Petri kabına dökün.
  • Cımbız kullanarak, dikkatle altında jel silikon izolatör slayt ve jel üstüne kaldırın.
  • İzolatör ve jel steril 1 x PBS ile dolu bir 6-iyi çanak içine aktarın.
  • Tüm jelleri slaytlardan kaldırıldı ve PBS içinde iliklerine kadar bu işlemi yineleyin. UV ışık kısırlık emin olmak en az 1 h için Biyogüvenlik Hood için hazırlanan jeller kullanır.

    • 6. tohum hücre Bilayers

    1. A549 hücreleri tohum için hazırlayın. Kısaca, bir 75 cm2 şişesi 5 mL 1 x PBS ile durulayın, 3 mL % 0.25 ekleyin tripsin-EDTA ve 37 ° C'de 2-3 dakika için oturup izin
      1. Mekanik şişeye kışkırtmak, 3 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta % 10 fetal sığır serum ve % 1 penisilin-streptomisin ile ile reaksiyonu gidermek ve bir 15 mL konik şişesi toplamak. Tam Dulbecco'nın modifiye kartal medya bir ek 4 mL ile durulayın ve aynı konik toplamak. 475 x g 6 dk için hücreleri spin.
    2. Hücreleri aşağı dönen iken, bir 6-şey plaka her şey için tam Dulbecco'nın modifiye kartal orta küçük bir damla ekleyin. Öyle ki jel medya teslimi dinleniyor silikon izolatörler jelleri ile yeni 6-şey plaka aktarmak için cımbız kullanın. Jelleri ince bir tabaka yayılır sonra büyük yeşil göze görünür olduğundan emin olmak için denetleyin. Bu hemen hücre kurutma ve jelleri çatlama önlemek için tohum önce yapılmalıdır.
    3. Dulbecco'nın modifiye kartal orta % 10 fetal sığır serum ve % 1 penisilin-streptomisin, 6 x 105 hücre/mL bir konsantrasyon ile hücrelerde resuspend. Bilge jel silikon membran dışarı delikli alanında bir Menisküs korumak çalışıyorum, ortasına hücre süspansiyon damla ekleyin. Hücreler için 4 h bağlı kalmak izin verir.
    4. 4 h sonra Dulbecco'nın modifiye kartal tam orta 0.5 mL kuyuya ekleyin ve gecede 37 ° C'de tam yapışma için izin vermek için kuluçkaya.
    5. Ertesi gün, HUVECs hücre tohum için hazır olun.
      1. 75 cm2 şişesi 5 mL 1 X PBS ile durulayın, 3 mL % 0.25 ekleyin tripsin-EDTA ve 37 ° C'de 2-3 dakika için oturup izin
      2. Mekanik şişeye kışkırtmak, 3 mL % 20 fetal sığır serum, % 1 penisilin-streptomisin ve % 1 büyüme ek M199 medya ile reaksiyonu gidermek ve bir 15-mL konik toplamak.
      3. M199 komple medya 4 mL ile durulayın ve aynı konik toplamak. 475 x g 6 dk için hücreleri spin.
    6. Hücreleri aşağı dönüyor olsa da, her şey yeni bir 6-şey plaka tam orta 199 küçük bir damla ekleyin. Yeni bir silikon izolatör medya merkezi silikon damla ile iyi bir yer.
    7. Cımbız kullanarak, dikkatle PEG jel izolatör üzerine A549 hücrelerle yeni 6-şey plaka destekleyen silikon izolatör çevir.
    8. 6 x 105 hücre/mL konsantrasyonu HUVECs resuspend ve hücre süspansiyon çevrilen jel damla bilge, jel silikon membran dışarı delikli alanı içinde bir Menisküs korumak çalışan Merkezi ekler. Hücreler için 2 saat bağlı kalmak izin verir.
    9. 2 h sonra yavaşça her şey için 2 mL M199 tam medya ekleyin.

    7. ayirt

    1. Dikkatle jelleri manuel bir pipet ile medya kaldırmak ve nerede hücreleri seribaşı merkezine jel yaklaşık 500 µL % 4 paraformaldehyde (PFA) ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika oturup bekleyin.
      Dikkat: PFA toksik bir kimyasaldır; koruma giymek ve işleme biyolojik Emanet dolabı yapılır olun.
    2. Dikkatle PFA kaldırın ve yaklaşık 500 µL % 2 BSA PBS içinde her jel için ekleyin. Oda sıcaklığında 1 h için oturup bekleyin.
    3. BSA dikkatli bir şekilde çıkarın. 1: %100 2 BSA PBS içinde içinde bir seyreltme, birincil antikorlar hazırlamak ve 500 µL her jel için ekleyin. Oda sıcaklığında 1 h için oturup bekleyin. Yavaşça 1 x PBS 500 µL ile yıkayın.
      1. İkincil antikorlar ile aynı işlemi tekrarlayın. Kullanın antikorlar: 1) Anti-insan CD144 (VE-Cadherin) klon 16B1; 2) Anti-insan CD324 (E-Cadherin) klon 6714; 3) Anti-insan CD31 (PECAM-1) klon C-20; 4) anti-A549; 5) Anti-fare FITC; 6) Anti-keçi Alexa Fluor 647. F-aktin görselleştirmek için Phalloidin 500 µL ekleyin (10 µg/mL PBS) 20 dk için.
    4. Dikkatle ikincil antikorlar veya phalloidin kaldırın ve DAPI 500 µL ekleyin (0.1 µg/mL) için 20 dk. dikkatle DAPI çözüm kaldırın ve böylece jelleri süspansiyon yavaşça 1,5 mL 1 x PBS her şey için ekleyin.
      1. Cımbız ve silikon izolatörler kullanarak, bir jel bir cam slayt için transfer. Her jel hemen önce görüntüleme için bunu uygulayın ve jelleri PBS çözüm içine görüntüleme sonra değiştirin.
      2. Alternatif olarak, DAPI montaj orta kullanarak jelleri bağlayın. Tırnak cilası örnekleriyle de mühür, kurutma ve jöleyi çatlama önlemek için 2 gün içinde görüntüler elde etmek. Sorun giderme için tablo 1'e bakın.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    PEG-RGD hydrogels polimer çözüm iki kurban çinko oksit tabakalar arasında sandviç ve çinko oksit iğnelerle gözenek şablonları oluşturma tarafından kuruldu. Kurban çinko oksit bileşenleri sonra ultrathin PEG hydrogels sürekli gözenekli (şekil 1) üreten hidroklorik asitle çıkarıldı. Çinko oksit iğneler morfolojisi elektron mikroskobu (SEM) tarama tarafından doğrulandı ve ortalama uzunluğu ve genişliği 3,92 ± 0.089 µm ve 0.43 ± 0,02 µm, sırasıyla olduğu tespit (Resim 2A - 2B). Çinko oksit iğneler kaldırılması, ardından hidrojel gözenekleri SEM tarafından görüntülenir ve (Şekil 2C - 2E) ile karakterizedir. Hydrogels için ortalama gözenek yoğunluğu 176,863 ± 49,532 gözenekleri yapıldı. SEM de görselleştirmek ve bir standart 3 µm gözenek polikarbonat geçirgen destek eklemek gözenek yoğunluğunu hesaplamak için kullanılan ve gözenek yoğunluğu önemli ölçüde daha düşük, yaklaşık 2,51 ± 0,05 gözenekli kare mm (Şekil 2D, başı bulundu Tablo 2). PEG hidrojel 0,19 ± 0,01 µm ve geçirgen destek Ekle (Şekil 2E, Tablo 2) gözlenen 3,47 ± 0.21 µm gözenekleri daha önemli ölçüde daha küçük oldu çinko oksit şablonu esas alan ortalama gözenek çapı. Optik Koherens tomografi her iki 2 ve 3 boyutlu görüntüleri ve hydrogels 1 x PBS (şekil 3A - 3B) yüzen kalınlığı belirlemek için kullanılmıştır. Ortalama jel kalınlığı 18.89 ± 3.47 µm (Tablo 2) yapıldı. Jel mekaniği de daha önce açıklandığı gibi elastik modül ölçerek değerlendirildi ve ortalama Young katsayısı 96.78 ± 23.92 kPa (Tablo 2) bulundu. 14

    Ayirt mikroskobu endotel hücreleri ve epitel hücreleri fenotipik kimliklerini ultrathin PEG-RGD hydrogels kültürlü sonra korumak gösterir. Endotel hücreleri ifade olumlu bir anti-A549 antikor (şekil 4A - 4B) ile lekeli PECAM-1 ve epitel hücrelerinin yapılmaktadır. Her iki hücre tipleri de sıkı kavşaklar oluşturmak için yetenek yapılmaktadır. Endotel hücreleri hücre-hücre kavşaklar VE-cadherin ifade ve epitel hücreleri E-cadherin (şekil 4C - 4 D) dile getirdi. PEG-RGD hydrogels da hücresel bilayers destek ve hücre-hücre kişiler olarak gösterdiği yanında örnekleri (şekil 4E) lekeli phalloidin immünfloresan düşsel gözenekli yapıları içinde forma için izin.

    Figure 1
    Resim 1 . Hidrojel hazırlık Protokolü şematik bakış. A) sentezi ve ZnO iğneler toplanması. B) cam slaytlar; hazırlanması bir kurban ZnO katman oluşturma. C) hazırlanması ve silikon izolatörler sterilizasyon. D) ZnO iğneler ile çözüm hazırlık, PEG. E) , polimerizasyon PEG jelleri ZnO kaplı cam slaytlar arasında. Beyaz çizgiler kurban ZnO iğneler ve kaplamalar temsil eder. F) HCl durulama iğneler kaldırılması ve jel sürümünden slaytlar için. Karanlık çizgiler gözenekleri çözünmüş ZnO iğneler tarafından oluşturulan gösterir. G) hücre tohum için hazırlamak için jeller ve silikon izolatörler için Transfer 6-iyi yemek. H) hücre tohum. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 2
    Resim 2 . Çinko iğne karakterizasyonu ve hidrojel gözeneklilik. A) SEM görüntü çinko iğne (5 mikron bar ölçek). B) uzunluğu ve genişliği çinko iğneler. Nokta bireysel iğneler için ölçümleri temsil; satırları temsil eden ortalama ve standart hata. C) SEM görüntü gözenekli hidrojel (ölçek 2 mikron bar). D) gözenek yoğunluk ve E) ortalama gözenek çapı polikarbonat geçirgen destekler ve PEG hydrogels için. Çubuklar ortalama ve standart hata gösterir. p < 0,0001 T-testi ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 3
    Şekil 3 . Hidrojel kalınlığı. Optik Koherens tomografi gösterir A) 3 boyutlu ve B) PBS içinde yüzen hydrogels 2 boyutlu görüntüleri. Oklar sıvı yüzey gösterir, yıldız işareti hidrojel temsil eder. Ölçek çubuğu var. 100 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 4
    Şekil 4 . Hydrogels destek Monolayer ve Bilayer kültür. Her ikisi de endotel hücreleri ve epitel hücreleri Konfluent monolayers PEG hydrogels üzerinde oluşturabilir floresan için boyama tarafından gösterildiği gibi A) CD31 (CD31 kırmızı, DAPI mavi) ve B) A549 (A549 kırmızı, DAPI mavi), anılan sıraya göre. Sağlam cadherin kavşak oluşumu gösterdiği için C) endotel hücreleri (VE cadherin yeşil, DAPI mavi) ve D) epitel hücreleri (E cadherin yeşil, DAPI mavi) (100 mikron çubuklar ölçek). E) hücresel bilayers iki örnek (phalloidin kırmızı, DAPI mavi) Boyama phalloidin (ölçek çubukları 10 µm) tarafından gösterdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Sorun Olası çözüm
    Jelleri büyük delikler vardır. Çinko iğneler yeterince kullanmadan önce bölünmüfltü ki emin olun.
    Onları ayırmak için bir harç ve havaneli kullanmak yardımcı olabilir. Büyük toplamları seyreltik FBS süspansiyon takip hızlı bir spin ile kaldırılır emin olun. Jel hücre tohum sonra 6-şey plaka altına sıkıştı. Medya jel altında bir damla tohum için 6-şey plaka içine aktarmadan önce ekleyin. Jel silikon izolatör alt ve üst koruyor. Uzun tırnaklar için jeller, herhangi bir fazla jel silikon izolatör hücreleri seribaşı nerede merkezinde sadece tek bir katmanda olduğundan emin olmak için etrafında sarın. Hücre katmanı jel kapalı patlıyor. Hücreleri aşırı birleşmesi olabilir. Düşük yoğunluk, tohum. Var olmak çok dikkatli tüm durulama adımları ile. Ayrıca hücre adezyon geliştirmek için peptid konsantrasyon artırabilir. Hücreler çok hızlı bir şekilde Proliferasyona değil ve izdiham erişemeyecektir. Böylece bunlar tohum sırasında izdiham olur yüksek yoğunluklu hücreleri tohum. Jel sertlik beklenenden daha yüksek. Jel HCl tutulur süreyi azaltın. Jel kalınlığı beklenenden daha yüksek olduğunu. Herhangi bir içeriği ZnO toplamları PEG jel slaytlar düzgün olmasını sağlamak için döküm önce cam slayt kapalı silinir emin olun. Slaytlar PEG çözüm daha fazla yayılmaya Binbaşı ekseni boyunca hareket.

    Tablo 1. Sorunlarını gidermek için önerilen çözümler.

    Hidrojel Transwell Hücre dışı matriks
    Gözenek yoğunluğu (gözenekleri/mm2) 1.77 x 105 ± 4,9 x 104 2.51 ± 0,05 8.50 x 102 7.0 x 104 2,14
    Gözenek çapı (µm) 0,19 ± 0,01 3,47 ± 0.21 0,47 3.86 2,14
    Kalınlık (µm) 18.89 ± 3.47 10 0.05-0.10 17
    Young'ın modülü (kPa) 5 96.78 ± 23.92 > 1000 3.5 14

    Tablo 2. Karşılaştırma, standart geçirgen desteği Ekle ve hücre dışı matriks hidrojel özelliklerinin (değerleri temsil eden ortalama ± Standart hata)

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Burada ayrıntılı iletişim kuralı bir biomimetic BM iskele hizmet etmek için ayarlanabilir bir PEG hidrojel oluşturmak için bize izin verdi. Özellikle, değişen PEG moleküler ağırlıkları, peptid konjugasyon stratejileri ve çinko oksit Mikrokristalin yapıları veya konsantrasyonları, elastik modülü tarafından biyokimyasal özellikleri ve gözenekli yapısı hydrogels, anılan sıraya göre değiştirilebilir. Ultrathin PEG iskele yüksek gözenek yoğunluklu ve in vivo içinde Bodrum standart geçirgen destek modeli (Tablo 2) karşılaştırıldığında membranlarda bulundu şekil daha mimetic daha küçük gözenek çapı sahiptir. Ayrıca, bu yöntemle bir ultrathin yapısı daha az 20 µm bir ortalama kalınlık ile başardık. Polikarbonat geçirgen destek modelleri zaten bizim bilgi için sadece 10 µm ultrathin bir tabakanın elde ise bu kalınlık elde etmek için ilk serbest yüzer ve akort hidrojel sistem olmasıdır. Son olarak, PEG hydrogels büyüklük geleneksel geçirgen destekler, doku kültürü plastik ve cam, tüm GPa aralığı içinde elastik dönmeler var ve bu nedenle daha az sert olan yaklaşık 100 kPa, elastik bir modül var En düşük karşılaştırılabilir (< 10 kPa) elastik modülü içinde vivo hücre dışı Matriks (Tablo 2).

    Düşük elastik modül elde burada sunulan iş birincil amaçlarından biri de ve geleneksel polikarbonat kullanmak için bir sınırlama geçirgen destek modelleri. İyi yüzey sertliği hücre davranış dikte edebilirsiniz ve iş yüzey sertliği hücreleri ayırt hücresel kader rehberlik eder göstermiştir olduğu bilinmektedir. 12 sert yüzeylerde de genellikle hastalık durumlarında fibrotik doku veya kanserli tümörleri, dahil, taklit etmek için kullanılır ve bu nedenle doğru bir şekilde sağlıklı dokuların temsilcisi değildir. 18 , 19 , 20 , 21 çalışma deneniyor hücresel fenotipleri ve işlevleri için ilgili vivo içindeolduğunu bir elastik modül taklit yüzeylerde kullanmak için çok önemlidir. Bu sistemin en büyük avantajlarından biri farklı molekül ağırlıkları ile PEG kullanarak elde edilebilir jel mekaniği ayarlamak için yeteneğidir. Birçok hastalığın ECM sertleşme ile ilişkili olduğu için bu sistemi etkilerini karşı hastalıklı BM sağlıklı hücre işlevi eğitim için biomimetic platformu sağlar. Bu sistemin daha fazla değişiklik Ayrıca hücre adezyon için dahil peptid parçası değiştirerek elde edilebilir. Bu çalışmanın amacı gereği, RGD birçok BM protein ve onun yetenek her yerde onun ifade nedeniyle sağlam hücre eki kolaylaştırmak için kullanıldı. RGD yanı sıra, laminin parçaları da apikal Bazal Hücre polarizasyon rehberlik laminin epitel etkileşimleri tanıtmak için dahil edilebilir. 1 sadece BM sertliği hastalığında değişmiş gibi membran bileşimi patolojik koşullarda remodeled. Amin-reaktif PEG-NHS habercisi kullanarak, peptidler ve proteinler PEG polimer tabanına çeşitli çekimlerine mümkündür. 11 , 14 , 15 bu özellikle integrin nişan için farklı integrin reseptörleri etkilerini araştıran için avantajlıdır. Örneğin, fibronektin ve kollajen ifade RGD sıra birden fazla integrinler yürütmektedir ancak integrin αvβ3 için yüksek bir özgüllüğü vardır. Özellikle fibronektin zengin substrat taklit etmek için lösin-aspartik asit-Valin (LDV) sıra dahil α4β1 meşgul veya kolajen bir membran taklit etmek için aspartik asit-glisin-glutamik asit-alanin (DGEA) integrin girişme eklenebilir α2β1. 8

    Epitel endotel bilayers burada sunulan modeli ile oluşturulan bir hücresel bilayer sadece bir örnektir. Sadece bir ince BM veya ECM, ayrılmış doğal olarak vivo içindemevcut diğer bilayers pericyte endotel ve endotel düz kas hücre bilayers içerir. Böylece, bu yöntem için uygulamalar geniş ve pulmoner tıp vasküler Biyoloji için genişletmek. Ayrıca, bu hydrogels benzersiz porozite nedeniyle, önceki hidrojel modelleri destek edemedik fonksiyonel çalışmalar yapmak için yetenek sundukları. Gözenekleri ultrathin hidrojel sistemimiz birleşmeyle, biz geçirgen destek modeller için bir gelişmiş biomimetic yedek bakteriyel infiltrasyon, pulmoner arasında ortak bir olay soruşturma etkinleştirme oluşturduk Tüberküloz endotel epitel bariyer. 3 , 6 , 14 , 22 benzer şekilde, hicret veya vasküler hücre kültürleri arasında inflamatuar hücrelerin kemotaksis RGD functionalized hücre yapışkan yüzeyi daha önce gösterildiği gibi jel hücre yakalama oranı ölçerek araştırılması. 16 bu ortak kültür koşulları kapsülleme yoluyla elde ettik önceki hidrojel dayalı yöntemler üzerinde ayrı bir avantajdır. Bu tür sistemleri yakın için izin verir ve hücre-hücre iki hücre tipleri arasında iletişim ve anjiogenezi ve vasculogenesis gibi ölçmek için başarılı olmuştur, ama bir çok sağlamak iki boyutlu sistemleri tarafından sunulan erişilebilirlik eksikliği sızıntı, infiltrasyon veya etkin geçiş arasında ortak kültürlü bir hücresel bariyer ölçmek için daha basit bir platform. 17

    Böylece, aşağıda gösterildiği yöntem birden çok alan arasında çok çeşitli çalışmalar için bir platform sunuyor ve daha alakalı verileri içinde vitro çalışmalar daha vivo içinde patolojiler anlamak için oluşturan doğru bir basamak sağlar ve mekanizmaları.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Acknowledgments

    Yazarlar Prof. Paul Van Tassel ve Prof. Chinedum Osuji onların düşünceli konuşmaları ve malzeme bilimi uzmanlık için teşekkür etmek istiyorum. Bu iş için fon Dubinsky yeni girişimi Ödülü ve ulusal kurumları sağlık NIBIB BRPR01 EB16629-01A1 tarafından sağlandı.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1M Hydrogel Chloride (HCl) EMD HX0603-75 2.5L Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.
    1X PBS Gibco 14040-133 500 mL None
    Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) Sigma-Aldrich 228737-500g Use with eye protection and gloves.
    Sodium Hydroxide (NaOH) Macron Chemicals 278408-500g Use with eye protection and gloves.
    Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) Fisher Scientific AC45180010 1 kg Use with eye protection and gloves.
    Methanol (CH3OH) J.T. Baker 9070-05 4L Use in fume hood with eye protection and gloves.
    VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS VWR 97068-085 Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS
    Mineral oil CVS  PLD-B280B None
    Round bottom flask ChemGlass N/A
    Thermometer N/A
    Stir bar N/A
    Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick Thermo Scientific 420-004T Spray with ethanol and let dry prior to use.
    Glass pasteur pipets N/A
    1 mL rubber bulbs N/A
    Plastic 100 mm petri dishes N/A
    Sterile forceps N/A
    Silicone isolators 0.8 mm thick
    Polydimethylsiloxane (PDMS) punches N/A
    Glass bottles N/A
    6 well plates Cellstar 657 160 N/A
    Filter Paper Whatman 8519 N/A
    Stirrer-hot plate VWR Dya-Dual 12620-970 Use with eye protection and gloves.
    2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 Sigma-Aldrich 24650-42-8 Use with eye protection and gloves.
    1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) Aldrich Use with eye protection and gloves.
    Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) Fluka 81280-1kg Use with eye protection and gloves.
    RGDS Life Tein 180190 Use with eye protection and gloves.
    Blak-Ray long wave UV lamp UVP Model B 100AP N/A
    Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 N/A

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
    2. Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
    3. Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
    4. Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
    5. Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
    6. Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
    7. Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
    8. Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
    9. Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
    10. West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
    11. DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
    12. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
    13. Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
    14. Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
    15. DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
    16. Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
    17. Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
    18. Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
    19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
    20. Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
    21. Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
    22. Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).

    Tags

    Biyomühendislik sayı: 130 biyomalzemeler membran polietilen glikol mikro-gözenek Bilayer elastik Hydrogels
    Kültür Ultrathin Porated elastik Hydrogels bir Biomimetic membran için çift olarak hücre
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Pellowe, A. S., Lauridsen, H. M.,… More

    Pellowe, A. S., Lauridsen, H. M., Matta, R., Gonzalez, A. L. Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture. J. Vis. Exp. (130), e56384, doi:10.3791/56384 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter