Summary
该协议描述了使用第二次谐波生成成像和差示扫描量热法评估兔巩膜化学交联的技术。
Abstract
方法加强组织通过引入化学键 (酶交联) 到结构蛋白 (纤维胶原) 的治疗包括光化学交联和组织交联 (txl-) 方法。在角膜变薄 (机械减弱) 性疾病中, 如圆锥的角膜, 以及渐进性近视的巩膜, 在后部巩膜发生, 可能有助于轴向伸长。这种组织增强的主要靶蛋白是纤维胶原, 它构成了角膜和巩膜中绝大部分的干重蛋白。偶然、纤维胶原蛋白是组织细胞外空间第二次谐波生成信号的主要来源。因此, 通过使用第二次谐波生成显微镜 (SHGM), 对胶原蛋白 (如通过交联疗法诱导的蛋白质) 的修饰可能会被发现并定量。通过使用激光扫描显微镜系统和红外激发光源来监测 SHGM 信号是一种令人兴奋的现代成像方法, 在生物医学科学中得到广泛的应用。因此, 本研究是为了评价使用 SHGM 显微镜作为一种手段, 以测量诱导交联效果的前体内兔巩膜, 继注射了化学交联剂到分榫的空间 (sT),注射法是眼科临床过程中引起眼部麻醉的标准做法。化学交联剂, hydroxymethylglycinate 钠 (SMG), 是从一类的化妆品防腐剂称为甲醛释放剂 ()。与 SMG 反应后的巩膜改变导致倍信号增加, 并与热变性温度的变化相关, 这是评价诱导组织交联效应的标准方法。
Introduction
渐进性近视是假设通过酶巩膜交联 (光化学和/或化学) 可以治疗, 这是有道理的, 因为阻断胶原酶交联可以增加实验形式剥夺 (FD) 诱导近视1。Elsheikh 和菲利普斯2最近讨论了使用标准紫外线-A 辐照 (UVA)-核黄素介导的光化学交联 (也称为德累斯顿协议) 的可行性和潜力, 这里缩写为 (核黄素第一百四十)后巩膜稳定, 以制止近视的轴向伸长。这种光化学方法已成功地用于治疗圆锥和后 LASIK keratectasia 的前地球仪表面的失稳 (即, 膨隆的角膜)。然而, 这一第一百四十协议的应用受阻的问题与困难的后巩膜与紫外线 (UV) 光源, 以及需要修改一个更大的组织表面积。尽管如此, 第一百四十的方法已被用来制止视觉形式的剥夺兔的轴向伸长 (通过 tarsorrhaphy), 虽然后巩膜的多个区域需要多个单独的照射区在该研究3。相比之下, 通过 sT 空间注入化学稳定剂 (即, 交联剂) 可以更简单地改变后巩膜, 避免了引入紫外线光源的需要。这种注射技术是众所周知的一种有用的方法, 诱导眼麻醉期间眼科手术, 如白内障外科4,5,6。Wollensak7描述了先前使用的甘油 (一种化学交联剂, 在概念上类似于本研究中描述的甲醛释放剂 (法)) 来硬化兔巩膜和京尼平有已显示在 FD 豚鼠中限制轴向长度8,9。这些研究人员已经证明了在光化学第一百四十技术上使用可溶性化剂的明显优势。因此, 巩膜交联使用某种类型的注射化学剂, 包括法 (即, txl-)10, 可以提供一种可行的治疗方法, 以阻止近视伸长的进展。
在这里提出的协议, 我们使用化学交联溶液的钠 hydroxymethylglycinate (SMG), 通过 sT 注射到兔尸体的眼睛巩膜。我们已经实施了类似的协议之前的局部化学交联在角膜。特别是在先前报告的研究中 , 可利用 SMG 获得浓度依赖联效应 , 其作用范围可达到与光化学第一百四十一样的程度 , 由热变性分析确定为11.
在这里, 我们描述的协议, 以评估通过 sT 注射的 SMG 传递到巩膜组织, 热变性使用差示扫描量热法 (DSC) 和第二次谐波生成显微镜 (SHGM) 的交联效应。
使用差示扫描量热法 (DSC), 也称为热量分析, 测量热变性转变, 这对于巩膜组织主要是由纤维胶原的性质, 因为它们构成了大多数的蛋白质。该方法评价胶原分子结构的稳定性和稳定胶原纤维的交联键, 即主要的第三系蛋白质结构。在 DSC 加热过程中, 实现了一个关键的转变温度, 导致胶原分子的变性, 导致三重螺旋的开卷, 这一过程形成了通常所说的明胶。这种热变性扰乱了胶原分子的氢键, 通过诱导交联方法12,13可以转移到更高的温度。这种方法已经使用了几十年, 特别是在生物材料行业和工艺, 包括皮革制造。然而, 这种方法需要提取的巩膜组织, 因此只能作为一个ex 体内技术。
二次谐波生成显微镜 (SHGM) 是基于中心分子环境的特殊材料的非线性光学特性。在这种材料中, 强光, 例如激光产生的光, 产生倍信号, 其中入射光的频率加倍。已知产生倍信号的生物材料是胶原蛋白、微管和肌球蛋白。例如, 以 860 nm 波长的红外光激发的胶原蛋白将在可见光范围内发射一个倍信号, 其波长为 430 nm。二次谐波 (倍) 信号成像是评价治疗性胶原交联的一种很有前途的方法。已知30年多来, 组织中的胶原纤维发出倍信号14。但是, 只有最近才能在各种组织中获得高分辨率图像15 , 包括肌腱16、皮肤、软骨17、血管18和胶原凝胶19。
基于这一知识, 本研究通过 SMG 化学诱导的胶原交联来评价巩膜倍信号的变化。结果表明, 对巩膜的 SMG 修饰增加了组织胶原纤维束产生的倍信号 (由胶原蛋白组成的高阶第四纪结构), 同时也产生了胶原蛋白的结构形态变化。光纤网络, 反映在纤维束 "矫直" 中。
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Protocol
所有的程序都是使用尸体兔眼在完整的 outbred 兔头。遵循了关于实验室动物的护理和使用的所有机构和国家准则。
1. 解决方案的编写
- txl-的 SMG 准备:
- 1毫升的0.2 米碳酸氢钠溶液 (NaHCO3) 溶液, 使用0.0165g 的 NaHCO3 粉末溶解在蒸馏水的1毫升。
- 将0.1016 毫克的粉状钠 hydroxymethylglycinate (smg) 溶解在1毫升的蒸馏水中, 最终得到 800 mM 的浓度。调整碳酸氢钠溶液的最终浓度为0.1 米 NaHCO3和 400 mM SMG。根据所需的交联效果的 SMG 的浓度。在这里描述的协议中, 我们使用了40、100和 400 mM 的 SMG。
2. SubTenon txl-使用 SMG 的注射
- 分别用400µL 控制和 SMG 溶液填充两个1毫升的胰岛素注射器 (25G 针)。
- 在一个垫子的帮助下, 把兔子的头放在剖面平面上。聚苯乙烯泡沫塑料或纸栈可以用来修复头部在一个最佳位置。
- 用儿童眼窥镜收回眼睑。
- 使用平眼压装置测量初始眼压 (眼压)。
- 在角膜缘的上半部分用组织标记标记拟注入的部位。
- 用结膜钳 (或任何带有锯齿状圆尖的钳子) 在注射部位周围收回结膜, 并将针头插入结膜, 进入榫的蒴果稍超出标记的角膜缘部位 (即, 2-3从角膜缘的毫米)。一个小切口在结膜也可以用虹膜剪刀, 以方便通过针通过榫的胶囊。
- 一旦在榫的胶囊, 确保针是自由移动, 通过移动它的侧边。在这段时间里, 地球不应该移动。这证实了适当的位置, 针以上的巩膜在小榫的 (sT) 空间。
- 从注射器中注入溶液并丢弃针头。紧接着注射, 液体将积累在 sT 空间创造一个前凸出看到通过结膜 (即, 水肿)。
- 重复的眼压测量, 以确认它没有改变, 由于一个疏忽穿孔的全球。
- 取下盖子窥镜, 并通过闭合的眼睑进行数字按摩约2-3 分钟。
- 在移动到下一步骤之前, 将头部保持在3.5 小时 (室温 = 18 ° c) 的潜伏期。
3. 组织制备
- 使用眼睑窥镜收回眼睑, 以优化对全球的访问。根据眼睛的大小选择最佳尺寸的窥镜。
- 将结膜周围的角膜缘分开。如果它已经被切割附近的注射点, 圆周扩大边界, 所以它将包含一个接种大小约1x1 厘米。
- 切割 extra-ocular 的肌肉在他们的位置巩膜插入。
- 用钳子把眼球抬高, 从后侧推。这提供了进入后地球, 并有助于切割视神经的眼动脉和静脉位于地球后极附近。
- 切出的巩膜复合体, 外边界包括标记的注射地点。该污渍仍应在巩膜的剩余部分可见。
- 通过使用组织钳牵引, 将语料库 vitreus和所有层连接到巩膜内侧。
注意: 进一步的步骤取决于正在执行的以下过程: 4.-DSC 分析, 5.-倍显微镜。
4. 区域 DSC 分析
-
治疗眼睛:用剪刀从剩余的巩膜杯中切出四个巩膜扇区, 使注射部位位于上部区域, 并集中排列。将其余的3扇区从侧边 (即、鼻和颞部) 和底部剪切。
注意: 在图 1A中演示了进一步划分为正方形 (1-16) 的扇区 (1-4) 的编号。 - 将巩膜扇区 (1-4) 切割成较小的正方形 (1-16), 每块大约 4 x 4 毫米。区段1应该被划分成9正方形 (使射入的确切的站点一个单独正方形 [正方形 2])。划分区段2和3成2正方形每个 (正方形10-11 和 12-13) 和区段4成3正方形 (正方形 14-16)。
- 为每个正方形分配一个数字, 如图 1A所示, 以便将分析的组织的距离定位到注入区域的位置。
- 控制眼睛:将组织分成四个巩膜扇区 (类似于处理过的组织) 后, 从以下位置切割出正方形的组织: 3 平方从顶部扇区 (扇区 1), 1 从每边 (扇区2和 3), 1 从底部区段 (区段 4)。
- 将剩余的视网膜和脉络膜层刮掉, 每次用新鲜的 PBS 冲洗两次, 将这些碎片浸入溶液中一次大约十年代。
5. 倍成像
- 使用剪刀切开巩膜的上部, 以创建一个 1 x 1 厘米的区域, 并将注射部位居中对齐。
- 刮掉剩余的视网膜和脉络膜层, 每次用新鲜的 PBS 洗两次, 然后在大约十年代的时候把这些碎片留在溶液中。
- 将组织放置在1毫升的管子中, 用 PBS 溶液填充, 以输送到成像设备。所有的程序, 在孵化时间之后, 从眼球解剖开始, 应在一小时内完成。
6. 显微镜协议
注意: 本协议为激光扫描显微镜量身定做了从巩膜组织胶原蛋白成像后散射的倍信号。
-
显微镜设置
- 在执行倍显微镜时最大化信号和分辨率使用物镜优化传输红外光和高数值孔径 (NA)。我们的目标是尼康钻 25 x/NA1.1 水浸泡。
- 调整镜头的校正衣领, 以配合样品的深度, 在这种情况下, 是厚度的片, 0.17 毫米。
- 安装25x 物镜, 并添加大量的润滑水性凝胶, 以覆盖成像表面前安装样品。水基凝胶不会在实验过程中蒸发, 因此会保持图像质量。
- 将巩膜组织从1毫升管与 PBS 不干燥之间的两个25毫米圆形片 (巩膜侧向下) 提供最大的接触之间的烧灼和片表面。
注: 组织也可放置在片上。大量的 PBS 应保持组织水合过程中的成像。在这种情况下, 添加组织片和 PBS 后组装的 cellchamber。 - 通过放置一个25毫米圆形片, 单或在夹层技术, 组装的细胞室, 在底部的部分和螺钉的顶部部分下来, 以创建一个密封的圆形室。当使用顶部片时, 不要拧紧, 以免人为地使组织扁平和损坏。
- 在显微镜台上用组织标本装入细胞室。
- 用透射光将显微镜设置为眼观。
- 定位舞台和调整目标的高度, 使样品的下表面处于焦点, 由明亮的现场检查通过眼睛片断确定。
- 关闭所有的灯, 除了电脑显示器和阻挡尽可能多的光从显示器上, 铝箔板披在显微镜阶段。最小化任何到达探测器的杂散光将确保低噪音的获取, 因为 GaAsP NDD 探测器具有高灵敏度。
- 在软件的 Ti Pad 面板中, 检查镜头定义是否正确。
- 在 A1 紧凑的 GUI 面板, 选择红外激光成像, 选择 NDD 探测器, 并选择 DAPI 通道, 配备了 400-450 nm 带通滤波器。
- 在 A1 MP GUI 面板中, 将红外激光器的波长设置为 860 nm, 并打开快门。
- 在 A1 紧凑的 GUI 面板中设置激光扫描条件, 如下所示。选择: (a) 电扫描仪, (b) 单向扫描, (c) 像素驻留时间6.2 µs, (d) 帧大小 1024 x 1024 像素, (e) 线平均2x
注: 电扫描仪和单向扫描确保精确点对齐。整个视场的大小为 1024 x 1024, 转换为0.5 微米/像素的像素大小。线平均将减少图像中的拍摄噪声。 - 通过调整激光功率和探测器增益来设置 A1 紧凑型 GUI 面板中的成像条件。打开 "查找表格" 面板 (尿路), 在当前图像中显示像素亮度值的直方图。打开 "查找" 模式中的实时图像, 通过调整激光功率和探测器增益来最大化检测到的像素值范围。避免饱和。典型值是2.5% 激光功率, 从 2.35 W 在 860 nm, 和100高压 (探测器增益)。
- 注: 对于此设置, 用内部功率计测量的激光功率为5.2 兆瓦。每次进行实验时, 重新调整激光百分比, 使内部功率测量在5.2 兆瓦的成像会话之间恒定。设置激光电源时应注意。变色龙 II 激光器是一个 3 W 激光器在 800 nm 和10% 或更高的功率可能导致组织损伤。
-
图像采集
- 在预览模式下, 使用 XYZ 概述工具扫描组织区域。
- 将图像设置为较低的分辨率 (256 x 256 像素, 无线平均), 以加快此模式下的映像的获取速度。
- 捕捉 5 x 5, 3 x 3, 或单一的视野, 以覆盖整个表面的组织。在每个位置, 在概要捕获之前, 打开现场 "扫描" 模式, 并使组织成为焦点。注意, 不同区域的组织将有轻微不同的位置在轴向方向。
- 找到一个平坦的区域, 其中胶原纤维在整个视图字段中可见, 并在 "概览" 工具中双击该位置以将舞台移动到该特定位置。
- 打开实时 "扫描" 模式, 调整目标的 z 位置, 使底部平面处于焦点, 在 Ti Pad 中, 使用 z 驱动器将光学平面10-15 μ m 移到此底部层之上。
- 使用 "捕获" 按钮, 获取高分辨率的图像, 具有 1024 x 1024 像素和2x 线平均。
- 使用 "+" 按钮保存 XYZ 概述中的位置。这样可以确保不重新捕获同一区域的组织。
- 为每块组织捕捉10图像的不重叠的视野。
7. DSC 协议
注意: 当组织准备完成时, 进行区域 DSC 分析, 或在 SHGM 进行组织成像后立即进行此步骤。
- 准备好 DSC, 称量和标注。
注意: 此步骤应在组织剥离前进行, 以减少组织的脱水。 - 用吸水组织干燥每个巩膜正方形, 并用齿钳将其平放在 DSC 盘的底部。
- 称锅内有组织, 盖子卷曲, 覆盖以获得组织湿重 (样品质量应在5至11毫克范围内)。
注: 在进行下一个组织样本之前, 使用机密封每个平底锅。锅是密封的, 防止任何水分损失之前, 热分析。 - 一旦样品卷曲, 将其放置在其指定的位置上的 DSC 托盘。应该有6样本的控制和16的治疗眼睛。
- 使用仪器管理软件创建方法, 指定组织的重量, 并使用以下参数运行热分析: 温度范围40至80° c, 加热速率: 1 ° c/分钟, 热流: 17.37 兆瓦, 气体 (N2) 流量: 19.8 毫升/分钟,气压: 2.2 巴。
- 完成后, 通过使用仪器管理软件来提取热变性发生的过渡温度峰值来分析每个样品的数据。
8. 图像分析
-
倍信号
- 选择至少5-10 个最具代表性的图像从每个治疗和它的控制, 这样, 图像的面积是由大多数胶原纤维占据。
- 在 ImageJ 软件中上传每个图像, 并通过选择活动图像的分析 > 测量来测量平均像素强度。
- 提取的值被报告为平均像素强度, 也可以通过从菜单 "分析 > 直方图" 中选择绘制亮度直方图来显示。
- 使用 Excel 工作表, 创建一个表, 以相应地将所有测量的数据记录到示例 ID。
- 计算每个处理和控制条件下像素强度的平均值和标准偏差。
- 使用学生的 t 检验, 比较所有对浓度的两两比较的差异 (即, 40 mm smg vs. 0 和 400 mm, 0)。[P≤0.05]。
-
波纹
- 选择显示胶原纤维的图像。每个样品至少有10图像应该分析 (包括每个浓度的控制样品-至少 40)。
- 打开ImageJ > 插件 > NeuronJ。NeuronJ需要预先安装。
- 将所有 imagesby 拖放到打开的NeuronJ窗口中。
- 沿纤维创建跟踪线, 跟随纤维与鼠标的轮廓 (可以使用钢笔绘图片), 单击 M 以测量总光纤长度的距离。
- 选择 "选项" 以绘制切线直线, 并连接先前绘制的纤维轮廓的开始和结束。现在, 单击 M 以测量端对长度。
- 对每个图像至少10纤维重复相同的过程。
- 收集这两个测量从每10纤维, 并输入数据到一个 excel 电子表格, 表示总纤维长度 (轮廓) 和端面长度 (直线连接线) 长度 [曲线] 和长度 [线性], 分别。
- 使用公式计算波纹度指数 (w): w = 长度 [曲线]/长度 [线性]。
- 使用该公式计算来自处理样品 (smg) 图像的波纹度与对照样品的图像的百分比: (w [smg]-1)/(w [控制]-1)
- 对波纹度指数 (W) 进行配对 t 检验, 以确定不同处理条件和对照的胶原纤维形态的统计差异 (p 值)。
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Representative Results
热变性温度 (Tm) 作为一种测定 txl-交联效应的方法:在这些实验中, 共使用了16对兔眼的 txl-程序。作为本研究的第一部分, 对单次注射 SMG 交联剂在兔尸体头上的 sT 间隙诱导交联效应的定位进行了评价。这种类型的实验与患者的临床治疗相关, 因为在一个以上的位置注射可能是稳定一个理想的巩膜区域是必要的。
根据基本扩散系数的预测, 该效应在注射部位的影响最大, 在相邻区域也有影响, 这取决于溶液的浓度。图 1A代表了巩膜扇区的示意图位置 (1-4 在红色空心数字字体) (进一步划分为正方形 (1-16 在黑色薄数字字体)), 经过单独的热变性分析后, 单一 sT 注射液颜色映射索引。表 1显示了每个编号扇区的 Tm 值的变化, 与相应的控件相比。价值包括 40 mm 和 400 mm 注射, 包括标准误差的平均值计算至少三独立的决定。
图 1B-c表示使用两种不同浓度的 SMG, 40 mm (图 1B) 和 400 mm (图 1C) 的结果。在图 1B中, 较低浓度的 40 mM 样本显示了 Tm 中的轻微移位, 在方形 2 (注射点) 中被注意到。相似的变动在毗邻正方形1和3被看见了 (浅蓝色)。在正方形4到6和7到9之间, 没有统计学意义的差异。在较低的正方形14到16处没有发现 Tm 移位, 这代表了远离注射场的最远的区段。
如图 1C所示, 较高浓度 (400 mM) 具有统计高度显著的交联效应 (表示为橙色的深浅)。在 Tm 的大位移与相关的小标准偏差和 p < 0.05 被观察了, 反射一个大区别在400毫米的作用比较低40毫米集中。最引人注目的影响是在1区的上层世界。至于其余的部门, 在正方形10和 14 (可能是由于对交联流体向后的一些跟踪) 观察到较小的影响, 在平方11、12、13、15和16中没有观察到效果。总的来说, 在区段2和3的交联作用是边际的, 在区段 4 (即, 最遥远的位置从射入站点) 没有观察到, 类似于40毫米样品。这些结果表明, 有一个 "效应区", 这种类型的模式可以预期后, 一个 sT 注射交联剂。这可能表明需要在几个地点注射, 以诱导对广泛的组织区域的影响。
本文还对两种浓度的 txl-在完整眼中的交联效应进行了研究。对经巩膜交联的组织进行热变性分析。交叉连接时间是 3.5 h 为 txl-使用三不同的浓度, 40 (tm = 1.11 +/-1.2), 100 (tm = 5.12 +/-2.9), 和 400 (tm = 14.34 +/-1.1) mM SMG。结果表明, 在 SMG 的交联组织中存在着浓度依赖性效应。
第二次谐波产生 (倍) 成像作为一种评价 txl-交联效应的方法:
对倍信号和光纤束波纹度的像素强度进行了倍显微图像分析。广泛的交联浓度 (从40到400毫米) 被用来探索倍信号的变化, 可能发生在广泛的交联效应。使用包括在斐济图像处理程序20中的直方图分析功能, 可以通过 sT 注射液对巩膜组织中产生的倍信号进行定量, 比较 40 mm 对使用 400 mm 的效果。平均像素 intesities 在40毫米的平均值差是66.3 ±27.7 相比, 361.4 ±28.3 为 400 mM 样本, 一个几乎6倍的增加。这对应与增加组织交联, 因为相应地增加在 Tm 在这些情况下也被注意了。图 2显示了从控件 (图 2A)、40 mm (图 2B) 和 400 mm (图 2C) 中取出的具有代表性的倍图像。同时还显示了相应的直方图分析, 包括平均亮度 (或像素强度)。所分析的图像总数为: 120 为 40 mM, 98 为其控制;121为400毫米和94为它自己的控制。组织成像的深度从巩膜表面的10到15µm。直方图分析的结果, 涉及许多图像场的平均值, 表明了较高的交联效应浓度(图 3)产生了更大的像素强度。
如图 4所示, 使用 ImageJ 插件 "神经元 J"21, 还用心血管血管文献中采用的方法进行图像分析。我们估计的波纹系数 W = 长度 [曲线]/长度 [线性] 和我们观察到, 交联导致纤维束矫直, 表明在40毫米和400毫米交叉巩膜与未经处理的控制巩膜 (W% = (WSMG)-1)/(W [控制]-1),表 2)。40和 400 mM SMG 处理的样品在波纹度上的差异没有统计学意义。
图 1: 使用40和 400 mM SMG 通过 sT 注入 txl-效果的定位。
(A) 4 巩膜扇区 (数字1-4 在大红色空心字体) 的示意图表示法, 用巩膜分成正方形 [数字1-16 在更小的黑色稀薄的字体] (不被画到比例) 接受热分析。注射地点对应于1区的中心位置正方形 (正方形 2)。txl - 的热变联效果与( 1B ) 40 mM smg 和( 1C ) 400mM smg 。(D) (B)和(C)的颜色编码的温度刻度图例。此图已从具有权限22的 Zyablitskaya et al.中进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 有代表性的图像浓度依赖性增加倍信号亮度水平产生以下 txl-使用 SMG 通过 sT 注射巩膜ex 活体.SMG 的浓度显示为(B) 40mM 和(C) 400mM。每个图像包含50µm 缩放栏 (右下角) 和平均像素强度值 (右上角)-绝对值。此图已从具有权限22的 Zyablitskaya et al.中进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 倍信号像素强度的变化 (Δ) 的条形图 (与同一个兔子头部的配对控制相比), 通过 sT 注入 (txl-) 与40和 400 mM 的 SMG 解决方案交联的巩膜完好无损的地球仪.平均值与标准错误平均值是:66 ±27.7 为40毫米和361±28.3 为400毫米。此图已从具有权限22的 Zyablitskaya et al.中进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 光纤波纹度分析示例 (由线性表示).控制样品的图像 40 mM 的 SMG 浓度与50µm 规模酒吧 (右下角)。此图已从 Zyablitskaya et al中进行了修改。具有权限22。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: sT 注入的示意图表示形式.编号为1-3 的区域对应于图 1A中表示的区域。请单击此处查看此图的较大版本.
| ±Δ Tm | ||
| 地区 | 40mM | 400mM |
| 1 | 3.4 ±2。8 | 20.5 ±0。6 |
| 2 | 3.4 ±0.53 | 19.58 ±1。5 |
| 3 | 2.5 ±2.47 | 17.99 ±3.06 |
| 4 | 0.72 ±0。9 | 20.36 ±0.19 |
| 5 | 0.85 ±0.55 | 19.11 ±1.33 |
| 6 | 0.52 ±1.35 | 18.66 ±4。1 |
| 7 | 0.78 ±1。6 | 18.44 ±2。8 |
| 8 | 0.56 ±0。9 | 17.77 ±2.69 |
| 9 | 0.22 ±0。6 | 18.92 ±2。6 |
| 10 | 0.46 0 | 8.75 ±10.56 |
| 11 | 0.47 ±0.18 | 0.63 ±1.84 |
| 12 | 0.11 ±0.08 | 0.66 ±1.52 |
| 13 | 0.08 ±0.05 | 0.71 ±2.17 |
| 14 | 0.22 ±0。7 | 5.71 ±0.29 |
| 15 | 0.32 0。2 | 0.29 ±0。7 |
| 16 | 0.24 ±0.73 | 0.26 ±0.79 |
表 1:DSC 结果为 txl-作用研究的地方化。如图 1A所示, 每个取样扇区的热熔化温度 (ΔTm) 的变化与标准误差相同。每个值都表示为 Tm ascompared 对它的配对控制的差异, 是平均至少3独立的决定。
| SMG, mM | 波纹 | 波纹度-% | t 检验 vs [0 mM SMG] |
| 0 | 1.106 ±0.044 | 100 | |
| 40 | 1.067 ±0.017 | 63 | 宝洁 < 0.02 |
| 400 | 1.059 ±0.009 | 55 | 宝洁 < 0.003 |
| 线性纤维 | 1.000 | 0 | |
| 理论) |
表 2.纤维波纹度分析结果。利用神经元 J 软件对 txl-注射区的倍图像进行了纤维波纹度的分析。十纤维从每个图象被选择了, 并且一共大约100纤维被分析了为波纹度的程度。平均值与标准误差均包括在内。
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Discussion
进行的实验表明, 证据支持使用倍信号显微镜作为一种方法评价胶原交联效果的巩膜, 提高未来的可能性, 使用该技术作为一种监测工具的交联治疗靶向胶原蛋白。值得注意的是, 一个仪器已经在临床上使用, 它可能会捕获这个倍信号。虽然该仪器主要是为成像皮肤人的真皮设计的, 它已成功地用于图像角膜和巩膜23。
在比较控制和处理样品时, 必须保持相同的扫描和成像条件。第二次谐波生成显微镜的胶原在巩膜组织要求荧光显微镜兼容光子成像, 脉冲红外激光可调在 800-900 nm 波长范围, 和高度敏感的探测器, 如 GaAsPnon-descanned (NDD) 探测器。本手稿中描述的指南是一个出发点。这些条件应专门为新的实验或不同的系统确定。
角膜和巩膜也已在研究中同时评估使用此技术24,25,26,27。知道倍信号在向前和向后方向传播, 几项研究在它的本机状态独立地审查了角膜组织28,29,30,31, 32,33,34和圆锥35,36以及以下第一百四十 (如下所述)。这些研究结果表明, 角膜信号在前向散射方向上是优化的, 这对角膜的透明性和光通过组织来打击前向散射系统中的监测的事实是有意义的。通常, 倍信号是在蓝色的可见范围, 并会大大减少, 当通过一个高度散射组织, 如眼睛巩膜。因此, 检测前向散射倍将需要薄的组织50微米或更少的厚度, 以及一个特殊的光学设置。相反, 背散射信号可以通过荧光显微镜的常规光路捕捉, 不需要组织切片, 因此这种模式是首选, 当成像胶原在完整的巩膜组织到深度30-40 μ m。在这项研究中, 我们注意到浓度依赖于信号密度的增加。然而, 这是很有可能的, txl-可能有额外的和类似的影响, 在更深层的巩膜, 而且效果可能更明显, 并延伸到更深的层, 特别是随着较高的浓度。然而, 由于有限的倍信号穿透在巩膜和为了这一初步研究的目的, 我们选择了最好的质量图像, 这是从最肤浅的巩膜 (15 µm 深度) 获得的工作。在未来的研究中, 我们将考虑 txl-方法后的深度依赖性效应, 因为这可能提供额外的重要信息, 为什么在40和400毫米处理的样品之间没有观察到更大的差异。
此外, 关于使用倍评价核黄素第一百四十诱导的组织交联, 倍显微镜成像后的核黄素第一百四十的角膜已经报告了几个组37,38,39,40,41. 在由史蒂文et al.进行的一项研究中37, 使用第一百四十技术的角膜稳定导致了 "均匀化" 的信号和组织 "褶皱" 或 "起伏" 在非链样本中看到的损失。然而, 这些类型的变化, 也被指出在一项研究评估的影响, 眼压变化的角膜倍信号, 提高可能性的技术文物。从组织的纤维以及高阶纤维束/层状结构的角度来看, 巩膜和角膜有很大的不同, 从电子显微镜的研究中也了解到这些差异。这两个组织不同的纤维包装, 其中包括纤维直径分布 (小均匀的纤维为角膜和可变直径的纤维为巩膜) 和 inter-fibril 间距 (统一的角膜和可变的巩膜)。同样, 高阶组织成片状 (角膜) 与纤维束 (巩膜) 是完全不同的。这种结构差异反映在这两个组织产生的倍信号中。因此, 交联引起的变化可能改变倍信号的不同, 但平行的方式。换言之, 在本研究中观察到的巩膜纤维的 "矫直", 以及文献中所报道的角膜信号的 "均匀化", 都是胶原交联修饰的结果。因此, 角膜中的 "均匀化" 效应在某种程度上类似于在这里报道的巩膜的 "矫直" 效应。
根据目前的研究结果, txl-产生的这种矫直效应的机制尚不清楚。一种可能的可能是, 组织在某种程度上是 "固定" 在机械 "负载" 的位置。这将支持产生 "纤维和纤维稳定" 的概念。由于眼压在 sT 段注射之前和之后被监测并且保持稳定, 眼压的变化可能没有导致这种作用。总的来说, 这些观察的重要性尚不清楚, 需要进一步研究。值得注意的是, 单独的成像技术, 如布里渊显微镜42, 这已被证明是提供定量的措施, 交联 (由剪切模量确定) 后第一百四十光化学可能是有用的确认的结果与倍这项研究的影像学。然而, 应该指出, 它的使用与高度散射组织, 如巩膜43, 需要技术修改, 并没有得到验证的交叉巩膜组织。
激光偏振和倍显微镜是一个重要的问题。激光是线性极化和定向垂直于倍信号传播的方向和在某一角度在 xy 平面到每一个胶原纤维。因此, xy 平面中与偏振激光光束完全垂直的纤维会产生比其他角度更高的倍信号, 包括那些与入射光平行的光纤 (即, z 平面), 这将产生最低的倍信号 (由于破坏性干扰)。在巩膜组织方面, 胶原纤维是以不同角度在微观水平, 虽然首选的解剖纤维的方向是已知存在的基于地球的位置。因此, 由于所产生的倍信号会因每种纤维的 xy 平面角而异, 因此, 如果所有的胶原纤维都完全一致 (如肌腱, 例如)。因此, 在本研究中, 由于样品被成像的性质, 极化的方向不是有意确定的, 而是在整个研究中保持一致。此外, 我们注意到从相同的巩膜区域获得治疗和控制球的组织, 尽量减少样品间纤维取向的差异。最后, 我们分析了超过100图像每个样本, 以获得强度值。这种广泛的评估应该对任何可能已注册的异常倍信号进行规范化。有人说, 有可能由于我们在交联样品中观察到的 "纤维矫直" (如上所述), 更大比例的 "在焦平面" 纤维可能有助于增加倍信号以及增加倍信号从更大的 xy 平面对准。这两种可能性都是诱导交联效应的表现。
一个区域分析的交联变化 (由 Tm) 诱导的 sT 注射的 SMG 进行。如预期的, 交联效应的水平集中在注射的区域。少量或没有交联作用在区域直接地被注意了在 (最远) 从射入, 一致与什么是已知的关于作用的本地化在 sT 射入以后显示由超声本地化44, 45和计算机断层扫描46。
最后, 关于交联治疗和近视, 胶原交联角膜是发现广泛使用的治疗角膜不稳定, 包括圆锥, 后 LASIK keratectasias, 透明边缘变性 (PMD), 并作为一个辅助到屈光手术程序47。通过交联治疗角膜疾病的成功, 导致了在眼球后部, 特别是巩膜, 用于限制高度近视的轴向伸长的治疗方法的探索2, 这一概念可追溯到治疗交联概念的非常早期的阶段48,49。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢 Tongalp Tezel, MD, 咨询有关 sT 注射液;特里萨 Swayne, 博士, 咨询有关倍显微镜;来自哥伦比亚大学医学中心欧文研究所的设计和生物统计学资源和生物核心设施。
在部分支持的研究, 以防止失明和国家卫生研究院赠款 NCRR UL1RR024156, 内 P30 EY019007, P30 CA013696, 和内 R01EY020495 (DCP)。哥伦比亚大学拥有相关知识产权: 美国颁发的专利号: 8466203 和 no: 9125856。国际专利待定: PCT/US2015/020276。
图像收集的共焦和专业显微镜共享资源的赫伯特欧文综合癌症中心在哥伦比亚大学, 支持的 NIH 赠款 #P30 CA013696 (国家癌症研究所)。共焦显微镜是购买与 NIH 赠款 #S10 RR025686。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V | EMD Millipore, Massachusetts, USA | Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1 | |
| Sodium hydroxymethylglycinate | Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA | Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2 | |
| Injection needle with luer-lock syringe | BD Eclipse, NJ, USA | Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1 | |
| Rabbit head | La Granja poultry | Outbred | Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2 |
| Tono-pen | Reichter Technologies Depew, NY | IOP measurements - protocol step 2.4 | |
| DSC 6000 Autosampler | Perkin-Elmer Waltham, MA, USA | Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4 | |
| Pyris software | Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA | Ver 11.0 | protocol step 7.5 |
| CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1. | |
| GenTeal | Alcon, Fort Worth, TX | B000URVDQ8 | Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1 |
| Chameleon Vision II | Coherent, Santa Clara,CA, USA | Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11 | |
| AttoFluor cell chamber | Thermo Fisher Scientific Inc | A7816 | Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3 |
| 25-mm round coverslips, #1.5 | Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA | GG-25-1.5 | protocol step 8.1.3 |
| Eclipse Ti-E | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | protocol step 8.1.4. | |
| Non-descanned (NDD) GaAsP detector | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7 | |
| A1R-MP laser scanning system | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8 | |
| NIS Elements software | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Ver 4.3 | refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9 |
| Fiji/ImageJ | National Institute of Health | protocol step 9.1.2 | |
| NeuronJ | Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands | https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | Ver 14 | protocol step 9.2.8 |
References
- McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
- Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Ophthalmic Physiol Opt. 33 (3), 385-389 (2013).
- Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
- Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon's administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90 (6), 787-793 (2003).
- Guise, P. Sub-Tenon's anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
- Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon's capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196 (1), 103-108 (2013).
- Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27 (3), 353-356 (2008).
- Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91 (4), e253-e257 (2013).
- Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89 (2015).
- Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1274-1282 (2015).
- Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35 (4), 550-556 (2016).
- da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. , (2017).
- Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42 (4), 528-533 (2017).
- Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94 (1986).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215 (6), 682-691 (2009).
- Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10 (83), 20121004 (2013).
- Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (1), 21-29 (2017).
- Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14 (6), 064040 (2009).
- Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13 (15), 5791-5797 (2005).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1216-1224 (2006).
- Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Jr Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34 (24), 3779-3781 (2009).
- Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32 (11), 1784-1791 (2006).
- Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2459-2465 (2010).
- Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 8818-8827 (2011).
- Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 911-915 (2011).
- Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (4), 2476-2481 (2014).
- Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5622-5629 (2015).
- Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
- Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8377-8385 (2014).
- Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (3), 1087-1094 (2007).
- Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36 (12), 2150-2159 (2010).
- Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (8), 5325-5331 (2011).
- McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33 (2), 125-130 (2014).
- Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3584-3592 (2015).
- Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4231-4238 (2011).
- Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
- Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24 (19), 22232-22238 (2016).
- Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon's cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17 (9), 1003-1007 (2003).
- Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon's, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25 (1), 56-59 (1999).
- Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17 (4), Fi72-Fi74 (1998).
- Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking--a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (2), 78-93 (2013).
- Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30 (3), 689-695 (2004).
- Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87 (3), 279-285 (2008).
