Summary
Det här protokollet beskriver tekniker för utvärdering av kemiska cross-linking av kanin sklera använder andra harmoniska generation bildhantering och differential scanning calorimetry.
Abstract
Metoder för att stärka vävnaden genom att införa kemiska bindningar (icke-enzymatiska cross-linking) strukturella proteiner (fibrillar kollagen) för terapi inkluderar fotokemiska cross-linking och vävnad cross-linking (TXL) metoder. Sådana metoder för att inducera mekaniska vävnad egenskapsändringar är att vara anställd på hornhinnan i korneal förtunning (mekaniskt försvagat) störningar såsom keratokonus samt sklera i progressiv närsynthet, där gallring och försvagningen av bakre sklera uppstår och sannolikt bidrar till axiell töjning. De primära målproteiner för sådan vävnad förstärkning är fibrillar kollagen som utgör den stora majoriteten av torr vikt proteiner i hornhinnan och sklera. Slump, är fibrillar kollagen den huvudsakliga källan av andra harmoniska generation signaler i den vävnad extracellulära. Därför kunde potentiellt ändringar av kollagen proteiner, såsom de inducerade genom cross-linking terapier, upptäckas och quantitated med hjälp av andra harmoniska generation mikroskopi (SHGM). Övervakning SHGM signaler med hjälp av en laser scanning mikroskopi system tillsammans med en infraröd magnetisering ljus källa är en spännande modern bildgivande metod som njuter av utbredd användning inom biomedicinsk vetenskap. Således föreliggande studie genomfördes för att utvärdera användningen av SHGM mikroskopi som ett sätt att mäta inducerade tvärbindande effekter i ex vivo kanin sklera, efter en injektion av en kemikalie bryggbindningen agent i den sub-Tenons rymden (sT), en injektion tillvägagångssätt det är standardförfarande för att orsaka okulära anestesi under oftalmologiska kliniska rutiner. Den kemiska bryggbindningen agent, är natrium n (SMG), en klass av kosmetiska konserveringsmedel känd som formaldehyd släppa agenter (FARs). Skleral förändringar efter reaktion med SMG resulterade i ökningar SHG signaler och korrelerade med förändringar i termisk denaturering temperatur, en standardmetod för att utvärdera inducerad vävnad cross-linking effekter.
Introduction
Progressiv närsynthet är postulerade för att vara behandlingsbar genom icke-enzymatisk skleral cross-linking (fotokemiska eller kemisk), vilket är logiskt med tanke på att blockera kollagen enzymatisk cross-linking kan öka experimentell form deprivation (FD)-inducerad myopi1. ElSheikh och Phillips2 nyligen diskuterade möjligheterna och potentialen för att använda standard-ultraviolett-A bestrålning (UVA)-riboflavin medierad fotokemiska cross-linking (även känd som Dresden protokollet), förkortat här som (riboflavin CXL) för bakre skleral stabilisering att stoppa axiell töjning i myopi. Fotokemisk metoden har med framgång använts för behandling av destabilisering av den främre globe ytan (dvs, svällande hornhinnan) sett i keratokonus och post-LASIK keratectasia. Dock hindras tillämpningen av denna CXL protokoll för sklera av problem relaterade till svårigheter att få tillgång till bakre sklera med en ultraviolett (UV) ljuskälla, liksom behovet av att ändra en mycket större vävnad yta. Som sagt, metoden CXL har använts för att stoppa axiell töjning i visuellt form berövas kaniner (av tarsorrhaphy), även om flera regioner på bakre sklera krävs flera separata bestrålning zoner i denna studie3. Injektion av en kemisk stabiliserande agent (dvs, bryggbindningen agent) via sT utrymmet kan däremot utgöra ett enklare sätt att ändra bakre sklera, undvika behovet av att införa en UV-ljuskälla. Denna injektionsteknik är känd som ett användbart sätt att inducera okulär anestesi under oftalmologiska förfaranden såsom katarakt kirurgi4,5,6. Wollensak7 har beskrivit tidigare användning av sT injektion använder glyceraldehyd (en kemisk bryggbindningen agent liknande koncept till formaldehyd släppa agenter (FARs) beskrivs i denna studie) stelna den kanin sklera och genipin har visat att begränsa axiell längd i FD marsvin8,9. Dessa utredare har visat en klar fördel med att använda en löslig kemisk agent över den fotokemiska CXL-tekniken. Således, skleral cross-linking använder en injicerbara kemisk agent av någon typ, inklusive FARs (dvsTXL)10, skulle kunna bli en genomförbar metod att stoppa utvecklingen av skleral töjning sett i myopi.
I de protokoll som presenteras här, använder vi en kemisk tvärbindande lösning av natrium n (SMG), levereras via sT injektion till sklera av avlidna kanin ögon. Vi har implementerat liknande protokoll tidigare för aktuella kemiska cross-linking i hornhinnan. Särskilt i de tidigare rapporterade studierna, kunde koncentrationsberoende cross-linking effekter erhållas med SMG, med en effekt spänner över som kan uppnås med fotokemiska CXL som bestäms av termiska denaturering analys11 .
Här beskriver vi protokoll för att bedöma den korslänkande effekten av SMG levereras via sT injektioner skleral vävnad, termisk denaturering med Differential Scanning Calorimetry (DSC) och andra harmoniska Generation mikroskopi (SHGM).
Med hjälp av differential scanning calorimetry (DSC), även känd som termisk analys, mäts en termisk denaturering övergång, som för skleral vävnad är huvudsakligen styrs av egenskaperna för de fibrillar kollagen, eftersom de utgör bulk majoriteten av protein. Denna metoden utvärderar stabiliteten i kollagen molekylstruktur och tvärbunden obligationer som stabilisera de kollagen fibrillerna, den huvudsakliga tertiära proteinstrukturen. Under värme i DSC uppnås en kritisk övergång temperatur som resulterar i denaturering av kollagenmolekylen, vilket resulterar i uncoiling av den Trippel helix, en process som bildar vad är allmänt känd som gelatin. Denna termiska denaturering stör Väteförbindelser längs kollagenmolekylen och kan skiftas till högre temperaturer genom inducerad tvärbindande metoder12,13. Denna metod har använts för många årtionden, särskilt inom biomaterial och processer som innehåller läder-making. Men denna metod kräver utvinning av sklera vävnad och kan därför bara vara användbar som ett ex vivo -teknik.
Andra-harmoniska generation mikroskopi (SHGM) bygger på de icke-linjära optiska egenskaperna av visst material, med icke-centrosymmetric molekylära miljöer. I sådant material, intensivt ljus, till exempel ljus produceras av lasrar, genererar SHG signaler, där det infallande ljuset fördubblas i frekvens. Biologiska material som är kända för att skapa SHG signaler är kollagen, mikrotubuli och muskel myosin. Till exempel avger kollagen glada med ett infrarött ljus av 860 nm våglängd en SHG signal i det synliga området med 430 nm våglängd. Andra harmoniska generation (SHG) signal bildbehandling är en lovande metod för att utvärdera terapeutiska collagen cross-linking. Det har varit känt i mer än 30 år att kollagen fibriller i vävnader avger SHG signaler14. Dock kunde endast nyligen högupplösta bilder fås15 i en mängd olika vävnader, inklusive senan16, hud, brosk17, blodkärl18, och i kollagen geler19.
Baserat på denna kunskap, utvärderar denna studie de SHG signalförändringar inducerade i sklera genom SMG kemiskt inducerad cross-linking av kollagen. Resultaten indikerar att SMG modifiering av sklera ökar de SHG signaler som produceras från vävnad kollagen fiberpackar (högre ordning Kvartära strukturen består av kollagen fibriller) och producerar även en morphologic strukturomvandling i kollagen fibernät, återspeglas i fiber bundle ”uträtning”.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden utfördes med avlidna kanin ögon inom intakt utkonkurrerat dö ut kanin huvuden. Alla institutionella och nationella riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur följdes.
1. beredning av lösningar
- SMG förberedelse för TXL:
- Laga 1 mL 0,2 M koncentrationen av natriumbikarbonat lösning (NaHCO3) lösning med 0.0165 g NaHCO3 pulver löses i 1 mL destillerat vatten.
- Lös 0.1016 mg pulveriserad natrium n (SMG) i 1 mL destillerat vatten till få en slutlig koncentration på 800 mM SMG. Justera natriumbikarbonatlösning till en slutlig koncentration av 0,1 M NaHCO3 och 400 mM SMG. Koncentrationer av SMG beroende på korslänkande effekt önskas. I protokollet beskrivs här använde vi 40, 100 och 400 mM SMG.
2. Subtenons injektion för TXL använder SMG
- Fyll två sprutor med 1 mL insulin (25G injektionsnålar) med 400 µL kontroll och SMG lösning, respektive.
- Placera kaninens huvud i en profil planet med hjälp av en kudde. Frigolit eller en pappersbunten kan användas för att fixa huvudet i en optimal position.
- Dra tillbaka ögonlocken med en pediatrisk ögat spekulum.
- Mäta det inledande intraokulära trycket (IOP) med en applanation tonometri enhet.
- Markera avsedda injektionsstället på den övre mellersta delen av limbus med en vävnad markör.
- Återkalla bindhinnan kring injektionsstället med en konjunktival tången (eller någon pincett med sågtandade rund spets) och stick in nålen genom bindhinnan, in Tenons kapsel strax utanför markerade limbala platsen (dvs2-3 mm från limbus). Ett litet snitt i bindhinnan kan också göras med iris sax för att underlätta passagen av nålen genom Tenons kapsel.
- En gång inom Tenons kapsel, se till att nålen är fritt mobil genom att flytta den sida till sida. Under denna tid bör i världen inte flytta. Detta bekräftar korrekt placering av nålen över sklera i den sub-Tenon's (sT) utrymme.
- Injicera lösningen från sprutan och Kassera injektionsnålen. Omedelbart efter injektion, kommer vätskan ansamlas i sT utrymmet skapar en främre utbuktning sett genom bindhinnan (dvs, kemos).
- Upprepa den IOP-mätningen för att bekräfta att det inte förändrades på grund av en oavsiktlig perforation av världen.
- Ta bort de locket spekulum och utföra digital massage genom de slutna ögonlock i ca 2-3 min.
- Lämna huvudet för en inkubationstid på 3,5 h (rumstemperatur = 18 ° C), innan de flyttar till nästa steg.
3. vävnad förberedelse
- Dra tillbaka ögonlocken med hjälp av spekulum för att optimera tillgång till Globen. Välj den optimalt storlek spekulum beroende på storleken på ögat.
- Separata bindhinnan kring limbus. Om det har redan varit anskäras nära injektionsstället, maskrad expandera gränserna så det skulle innehålla en inokulum storlek på ca 1 x 1 cm.
- Skär extra okulär musklerna på deras webbplatser skleral isättning.
- Höja ögongloben med pincett, pressar det från bakre sida. Detta ger tillgång till bakre Globen och underlättar kapning av synnerven med oftalmologiska artär och ven belägna nära den bakre stolpen av världen.
- Klipp ut corneoscleral komplex, med yttre gränsen även markerade injektionsstället. Fläcken ska fortfarande vara synliga på den återstående delen av sklera.
- Ta bort de corpus vitreus och alla lager kopplade till insidan av sklera genom att tillämpa dragkraft med vävnad pincett.
Obs: Ytterligare steg beror på följande procedurer utförs: 4. - DSC analys, 5. - SHG mikroskopi.
4. för Regional DSC analys
-
För det behandlade ögat: klipp ut fyra skleral sektorer från återstående skleral cup med saxen så att platsen för injektionen ligger i den övre sektorn och justerad centralt. Skär de återstående 3 sektorerna från både laterala sidorna (dvs, nasal och temporal) och botten.
Obs: numreringen av de sektorer (1-4) som är ytterligare indelade i rutor (1-16) demonstreras i figur 1A. - Skär de skleral sektorerna (1-4) i mindre fyrkanter (1-16) cirka 4 x 4 mm varje. Sector 1 bör delas in i 9 rutor (göra exakta platsen för injektionen en enskilda torget [2]). Dela sektorer 2 och 3 i 2 rutor varje (torg 10-11 och 12-13) och sektor 4 i 3 fyrkanter (torg 14-16).
- Tilldela ett nummer till varje ruta, som visas i figur 1A, för att lokalisera distansera av de analyserade vävnaden från placeringen av det injicerade området.
- För kontroll ögat: efter att dela upp vävnaden i fyra skleral sektorer (liknar den behandlade vävnaden) skär ut fyrkantiga bitar av vävnad från följande platser: 3 rutor från den övre sektorn (sektor 1), 1 från varje sida (sektorer 2 och 3) och 1 från den botten sektor (4).
- Skrapa bort de återstående retinal och koroidal skikten och tvätta två gånger med färska PBS varje gång, lämnar bitar nedsänkt i lösningen för cirka 10 s i taget.
5. för SHG Imaging
- Skär den övre delen av sklera med sax för att skapa ett 1 x 1 cm område med injektionsstället justerad centralt.
- Skrapa bort de återstående näthinnan och åderhinnan lagrarna och tvätta två gånger med färska PBS varje gång lämnar bitarna i lösning för ca 10 s.
- Placera vävnaden i 1 mL rör fyllda med PBS lösning för transport till anläggningen imaging. Alla förfaranden, efter inkubationstiden och börjar med dissektion av ögongloben bör utföras inom en timme.
6. mikroskopi protokoll
Obs: Detta protokoll för imaging bakåtspritt SHG signal från kollagen av sklera vävnad är skräddarsydd för laser skanning Mikroskop.
-
Mikroskopi ställa in
- För att maximera Optimera signalen och upplösning när utför SHG mikroskopi använda ett objektiv för att överföra IR ljus och med en hög numeriska bländaröppningen (NA). Målsättningen är Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 vatten nedsänkning.
- Justera korrigering kragen av linsen för att matcha djupet av provet, i detta fall som är tjockleken på täckglaset, 0.17 millimeter.
- Montera det 25 x objektivet och lägga till en generös mängd smörjolja vattenbaserad gel för att täcka imaging ytan före montering av provet. Den vattenbaserade gel avdunstar inte under experimentet och därmed kommer att bibehålla bildkvaliteten.
- Placera den skleral vävnaden från en 1 mL tub med PBS utan torkning mellan två 25 mm runda coverslips (episklerala sida ner) som ger maximal kontakt mellan episclera och täckglas ytan.
Obs: Vävnaden kan också placeras avtäckt på täckglaset. En bra mängd PBS bör hålla vävnaden hydrerad under imaging. I detta fall, lägga till vävnad lappa och PBS efter montering av cellchamber. - Montera cell kammaren genom att placera ett 25 mm runda täckglas, enskilt eller i en sandwich-teknik, på nedre delen av kammaren och skruva fast den övre delen ner för att skapa en sluten rund kammare. Skruva inte ner tätt när ett topp täckglas används, för att undvika artificiellt plattas och skada vävnaden.
- Montera cell kammaren med vävnadsprov på Mikroskop scenen.
- Ställa in mikroskopet för öga vyn med genomlysning på.
- Placera på scenen och justera höjden på målet så att det lägre ytbehandlar av provet är i fokus, som bestäms av ljusa fältbesiktning genom ögat bit.
- Stänga av alla lampor utom datorskärmen och blockera lika mycket ljus från bildskärmen som möjligt med aluminiumfolie ark draperad på Mikroskop scenen. Minimera eventuella ströljus når detektorerna säkerställer låg ljudnivå förvärv, som GaAsP NDD detektorerna har hög känslighet.
- I panelen Ti Pad av programvaran, kontrollera att linsen definitionen är korrekt.
- I panelen A1 Compact GUI välja IR laser för avbildning, Välj NDD detektorerna och välja DAPI kanal som är utrustad med en 400-450 nm bandpassfilter.
- A1 MP GUI på panelen ange infraröd laser våglängd till 860 nm och öppna slutaren.
- Ställ in laserscanning villkor i panelen A1 Compact GUI enligt följande. Välj: a Galvano scanner b enkelriktade skanning, (c) Pixel dwell time 6.2 µs, (d) RAM storlek 1 024 x 1 024 pixlar, e Line genomsnitt 2 x
Obs: Galvano skanner och enkelriktad skanning garanterar exakt punkt för punkt anpassning. En storlek på 1 024 x 1 024 för hela synfältet översätter till en pixelstorlek på 0,5 μm /pixel. Linje i genomsnitt kommer att minska det sköt bruset i bilden. - Ställ in imaging villkoren i A1 Compact GUI panel genom att justera laser power och detektor vinst. Öppna panelen leta upp tabellen (LUTs) som visar ett histogram över intensitet pixelvärdena i den aktuella bilden. Slå på levande imaging i ”hitta”-läge och maximera den upptäckta utbud av pixelvärdena genom att justera laser power och detektor vinst. Undvika mättnad. Typiska värden är 2,5% lasereffekt, från totalt 2,35 W på 860 nm och 100 HV (detektor vinst).
- Obs: För denna installation, laser kraften mäts med en inre wattmetern är 5.2 mW. Varje gång ett experiment utförs, och justera procentandelen laser så att den interna effektmätningen är konstant på 5.2 mW mellan imaging sessioner. Var försiktig när du ställer in lasereffekt. Chameleon II lasern är en 3 W laser 800 nm och en 10% eller högre makt kunde potentiellt orsaka vävnadsskada.
-
Bild förvärv
- Skanna området vävnad med verktyget XYZ översikt i granskningsläge.
- Ange avbildning till lägre upplösning (256 x 256 pixlar och ingen linje i genomsnitt) för att påskynda förvärvet av bilder i det här läget.
- Fånga 5 x 5, 3 x 3 eller enda synfält att täcka hela ytan av vävnaden. På varje plats, innan den Översikt fångst, aktivera live ”skanningsläge” och föra vävnaden i fokus. Observera att olika regioner i vävnaden kommer att ha lite olika positioner i axiell riktning.
- Hitta en plan yta där kollagenfibrer ses i hela synfältet och dubbelklicka på den positionen i verktyget översikt att flytta scenen till just den platsen.
- Slå på live ”Scan”-läge, justera Z position av målet så att det nedersta planet är i fokus och, i den Ti Pad, använda Z disken för att flytta optiska planet 10-15 μm ovanför denna bottenlagret.
- Förvärva en bild med hög upplösning med 1 024 x 1 024 pixlar och 2 x line genomsnitt, med hjälp av ”Capture”-knappen.
- Spara platsen i översikten XYZ med knappen ”+”. Detta garanterar att samma område av vävnad inte återerövras.
- För varje bit vävnad ta 10 bilder av icke-överlappande synfält.
7. DSC protokoll
Obs: Gå vidare till detta steg så snart vävnad förberedelse är klar, för regional DSC analys eller efter vävnad imaging när SHGM utförs.
- Förbereda DSC kastruller, vägde och märkt.
Obs: Detta steg bör göras innan vävnad dissektion för att minimera vävnad uttorkning. - Torka varje skleral kvadrat med en absorberande vävnad och lägga den platt på botten av en DSC kastrull med tandad tång.
- Väga pannan med vävnad inne och locket veckad och täckt att erhålla vävnad våt vikt (massa prover bör vara i intervallet 5 till 11 mg).
Obs: Försegla varje panorera med crimper innan du fortsätter till nästa vävnad provet. Kastruller är hermetiskt tillslutna, hindrar vattenförlust före termisk analys. - När provet är veckad, placera den på dess bestämda plats i DSC-facket. Det bör finnas 6 prover för kontroll och 16 för det behandlade ögat.
- Skapa en metod som använder instrumentet hantera programvara, ange vikten av vävnaden och kör den termisk analys med följande parametrar: temperatur mellan 40 till 80 ° C, värme hastighet: 1 ° C/min, värma flöde: 17,37 mW, gasflöde (N2): 19,8 mL/min, Gas trycket: 2,2 bar.
- En gång fullständig, analysera data för varje prov genom att extrahera övergången temperatur toppen vid som termisk denaturering uppstår med hjälp av instrumentet hantering av programvara.
8. bildanalys
-
SHG Signal
- Markera minst 5-10 av de mest representativa bilderna från varje behandling och dess kontroll, så att området i bilden är ockuperat av mestadels kollagenfibrer.
- Ladda upp varje bild i ImageJ programvara och mäta genomsnittlig pixel intensiteten genom att välja Analyze > åtgärd för den aktiva bilden.
- De värden som extraheras redovisas som medelvärde pixel intensiteten och kan också visas genom att rita histogram av stödnivåer genom att välja från menyn Analyze > Histogram.
- Med hjälp av ett Excel-blad, skapa en tabell för att dokumentera alla mätdata med detta till prov-ID.
- Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för pixel intensitet för varje behandling och kontroll villkor.
- Med student's t-test, jämföra skillnader för alla parvisa jämförelser av koncentrationer (dvs.40 mM SMG vs 0 och 400 mM SMG jämfört med 0). [P≤0.05].
-
Vågighet
- Välj en bild som visar kollagenfibrer. Minst 10 bilder per prov bör analyseras (inklusive ett kontrollprov för varje koncentration - minst 40 totalt).
- Öppna ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ kräver föregående installation.
- Ladda upp alla imagesby att dra in en öppnade NeuronJ fönstret.
- Skapa spårning linjer längs fibrerna, efter konturen av fibrill med musen (penna ritning tabletter kan användas), klicka på M för att mäta avståndet mellan totala fiberlängd.
- Välj ”alternativ” för att rita en tangentiell rak linje och ansluta början och slutet av tidigare dragna fibern konturen. Klicka nu på M för att mäta längden end-to-end.
- Upprepa samma procedur på minst 10 fibriller per bild.
- Samla de två mätningarna från varje 10 fibriller och mata in data i ett excel-kalkylblad, uttrycker totala fiberlängd (kontur) och end-to-end längd (direkt anslutande linje) som längd [kurva] och längd [linjär], respektive.
- Beräkna vågighet index (W) med följande formel: W = längd [kurva] / längd [linjär].
- Beräkna % av vågighet jämföra data från bilderna av behandlade samples(SMG) med bilder från kontrollprover med hjälp av formeln: (W [SMG] - 1) / (W [kontroll] - 1)
- Utför en parvisa t-test för vågighet index (W) för att fastställa statistiska skillnader (p-värden) av kollagen fiber morfologi mellan olika behandling och kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Termiska denaturering temperatur (Tm) som en analys metod att utvärdera TXL cross-linking effekt: Sammanlagt 16 par kanin ögon användes i dessa experiment för TXL förfarandet. Som en första del av denna studie utvärderades localizationen av korslänkande effekt induceras av en enda injektion av SMG bryggbindningen agent via sT utrymme i avlidna kanin huvudet. Denna typ av experiment har relevans för klinisk behandling av patienter, eftersom injektioner i mer än en plats kan vara nödvändigt att stabilisera ett önskat område av sklera.
Som skulle förutsägas utifrån grundläggande diffusivitet principer, var effekten störst på injektionsstället med effekter induceras i angränsande regioner samt, beroende på koncentrationen av lösningarna. Figur 1A representerar Schematisk platsen för skleral sektorer (1-4 i röda ihåliga sidnumreringens typsnitt) (indelad i rutor (1-16 i svart tunn sidnumreringens typsnitt)) som genomgick separat termisk denaturering analys efter en enda sT injektion med kartläggning färgindex. Tabell 1 visar förändringen i Tm värden för varje numrerade sektorn jämfört med dess motsvarande kontroll. Värden ingår för både 40 mM och 400 mM injektioner och inkluderar standardavvikelsen för medelvärdet beräknas för minst tre oberoende bestämningar.
Siffror 1B-C representerar resultaten med två olika koncentrationer av SMG, 40 mM (figur 1B) och 400 mM (figur 1 c). I figur 1B, lägre koncentration 40 mM provet visade en mild shift Tm som noterades i torget 2 (injektionsstället). Liknande förändringar sågs i intilliggande rutor 1 och 3 (ljusare blå). Marginella förändringar ses i torg 4 till 6 och 7 till 9 utan statistiskt signifikanta skillnader från torget injicerade. Ingen Tm Skift sågs i den nedersta rutorna 14 till 16, som föreställde den mest avlägsna sektorn från injektionsstället.
Som visas i figur 1 c, hade den högsta koncentrationen (400 mM) en statistiskt betydande korslänkande effekt (anges som nyanser av orange). En stor förändring i Tm med tillhörande liten standardavvikelse och p < 0,05 observerades, vilket återspeglar en stor skillnad i effekten av 400 mM jämfört med lägre 40 mM koncentration. De mest dramatiska effekterna noterades i sektor 1 i den övre världen. När det gäller de återstående sektorerna, en mindre effekt observerades i rutorna 10 och 14 (vilket kan ha berott på vissa spårning av bryggbindningen vätska posteriort) och ingen effekt observerades i torg 11, 12, 13, 15 och 16. Övergripande, tvärbindande effekterna var marginella sektorer 2 och 3 med ingen effekten som observerats i sektorn 4 (dvs., de mest avlägsna läge från injektionsstället), liknar 40 mM provet. Dessa resultat visade att det fanns en '' zon effekt '' och att denna typ av mönster kan förväntas efter en sT injektion av bryggbindningen agent. Detta kan tyda på behovet av injektion på flera platser för att inducera effekter över ett brett område av vävnad.
Studie av bryggbindningen effekterna induceras i intakta ögon utvärdera TXL med två koncentrationer av SMG utfördes också. Termiska denaturering analysen av vävnad som genomgick sådana skleral cross-linking utfördes. Cross-linking tid var 3,5 h för TXL använder tre olika koncentrationer, 40 (Tm = 1,11 +/-1,2), 100 (Tm = 5.12 + /-2,9), och 400 (Tm = 14,34 +/-1,1) mM SMG. Resultaten visade att det finns en koncentration beroende effekt sågs hos SMG tvärbunden vävnad.
Andra harmoniska generation (SHG) imaging som en metod för att utvärdera TXL cross-linking effekt:
SHG mikroskopi bilderna var analyseras både för pixel intensiteten av den SHG signal och fiber bunt vågighet. En bred spännvidd av cross-linking koncentrationer (från 40 till 400 mM) användes för att utforska de förändringar av SHG-signal som kan uppstå över ett brett spektrum av cross-linking effekter. Använder funktionen histogram analys ingår i Fiji bildbehandling program20, var det möjligt att kvantifiera SHG signalen produceras i skleral vävnad av sT injektion, jämföra effekterna på 40 mM de använder 400 mM. Den genomsnittliga skillnaden i genomsnittlig pixel intesities på 40 mM var 66,3 ± 27,7 jämfört 361,4 ± 28,3 för 400 mM prover, en ökning med nästan 6-fold. Detta motsvarar en ökning av vävnad bryggbindningen, eftersom motsvarande ökningar av Tm också noterades under dessa förhållanden. Figur 2 visar representativa SHG bilder av sklera tas från kontroll (figur 2A), 40 mM (figur 2B) och 400 mM (figur 2 c). Den medföljande histogram analys, inklusive genomsnittliga ljusstyrka (eller pixel intensitet) visas också. Det totala antalet bilder analyseras var: 120 för 40 mM och 98 för dess kontroll; 121 för 400 mM och 94 för sin egen kontroll. Djup vävnad imaging var 10-15 µm från episklerala ytan. Resultaten av de analyser som histogram, som innebar att de i genomsnitt av talrika bildfält, indikerade att högre koncentrationer av cross-linking effekt (figur 3) producerade större pixel stödnivåer.
I figur 4visas utfördes också en bildanalys med metoder från den kardiovaskulära blodkärl litteraturen, med hjälp av ImageJ plugin ''Neuron J''21. Vi uppskattade Vågighetsfaktor W = längd [kurva] / längd [linjär] och vi observerade att cross-linking resulterade i uträtning av fiberpackar som indikeras av en minskad vågighet % i 40 mM och 400 mM tvärbunden sklera jämfört med obehandlad kontroll sklera (W % = (W [ SMG]-1)/(W[Control]-1), tabell 2). Skillnaden i vågighet mellan 40 och 400 mM SMG behandlade prover var inte statistiskt signifikant.
Figur 1 : Lokalisering av TXL effekt via sT injektion med 40 och 400 mM SMG.
(A) Schematisk framställning av 4 skleral sektorer (nummer 1-4 i stora röda ihåliga teckensnitt), med sklera uppdelad i fyrkanter [nummer 1-16 i mindre svart tunn teckensnitt] (inte dras till skala) som genomgick termisk analys. Injektionsstället motsvarade det centralt belägna torget (2) i sektor 1. Den termiska denaturering cross-linking effekten av TXL med (1B) 40 mM SMG och 1 C 400 mM SMG. (D) färgkodade temperatur skalförklaringar för (B) och (C). Denna siffra har ändrats från Zyablitskaya et al. med tillstånd22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa bilder av koncentration beroende ökar i SHG signal ljusstyrkenivåer som produceras efter TXL med SMG via sT injektion av sklera ex vivo . Koncentrationer av SMG visas som (B) 40 mM och (C) 400 mM. Varje bild innehåller en 50 µm skala bar (nedre högra hörnet) och genomsnittlig pixel intensitetsvärdet (övre högra hörnet) - absoluta värden. Denna siffra har ändrats från Zyablitskaya et al. med tillstånd22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Stapeldiagram i förändring (Δ) av SHG pixel signalintensitet (jämfört med en parkopplad kontroll från samma kanin huvudet) i skleral intakt jordglober tvärbunden via sT injektion (TXL) med SMG lösningar i 40 och 400 mM. Genomsnittliga värden med standardavvikelsen för medelvärdet var: 66 ± 27,7 för 40 mM och 361 ± 28,3 400 mm. Denna siffra har ändrats från Zyablitskaya et al. med tillstånd22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Exempel på fiber vågighet analys (som uttrycks av linjäritet). Bild av kontrollprov för 40 mM SMG koncentration med en 50 µm skala bar (nedre högra hörnet). Denna siffra har ändrats från Zyablitskaya et al. med tillåtelse22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Schematisk framställning av sT injektion. Områden som numrerade 1-3 motsvarar områden representerade i figur 1A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| ±Δ Tm | ||
| område | 40mM | 400mM |
| 1 | 3.4 ±2.8 | 20.5 ±0.6 |
| 2 | 3.4 ±0.53 | 19.58 ±1, 5 |
| 3 | 2,5 ±2.47 | 17.99 ±3.06 |
| 4 | 0.72 ±0.9 | 20.36 ±0.19 |
| 5 | 0,85 ±0.55 | 19.11 ±1.33 |
| 6 | 0,52 ±1.35 | 18.66 ±4.1 |
| 7 | 0,78 ±1.6 | 18.44 ±2.8 |
| 8 | 0.56 ±0.9 | 17.77 ±2.69 |
| 9 | 0,22 ±0.6 | 18.92 ±2.6 |
| 10 | 0,46 ±0 | 8,75 ±10.56 |
| 11 | 0.47 ±0.18 | 0,63 ±1.84 |
| 12 | 0.11 ±0.08 | 0.66 ±1.52 |
| 13 | 0.08 ±0, 05 | 0,71 ±2.17 |
| 14 | 0,22 ±0.7 | 5,71 ±0.29 |
| 15 | 0.32 ±0.2 | 0.29 ±0.7 |
| 16 | 0,24 ±0.73 | 0,26 ±0.79 |
Tabell 1: DSC resultat för lokalisering av TXL effekt studie. Förändring av termiska smälttemperaturer (ΔTm) med standardfel för varje samplade sektor är som avbildas i figur 1A. Varje värde uttrycks som skillnaden i Tm ascompared till sin parkopplade kontroll och är ett genomsnitt av minst 3 oberoende bestämningar.
| SMG, mM | Vågighet | Vågighet-% | t-test vs. [0 mM SMG] |
| 0 | 1.106 ± 0,044 | 100 | |
| 40 | 1.067 ± 0,017 | 63 | p < 0,02 |
| 400 | 1.059 ± 0,009 | 55 | p < 0,003 |
| Linjär fibrer | 1.000 | 0 | |
| (Teoretiskt) |
Tabell 2. Resultaten av fiber vågighet analys. SHG bilder från området av TXL injektion analyserades för graden av fiber vågighet med Neuron J programvara. Tio fibrer valdes från varje bild och totalt cirka 100 fibrer analyserades för graden av vågighet. Genomsnittliga värden med standardavvikelsen för medelvärdet ingår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genomförda experiment har visat bevis som stöder användningen av SHG signal mikroskopi som en metod för utvärdering av kollagen tvärbindning effekter i sklera, höja den framtida möjligheten att använda denna teknik som övervakningsinstrument för cross-linking behandlingar som rikta kollagen proteiner. Notera är ett instrument redan i klinisk användning som potentiellt kan fånga denna SHG-signal. Även detta instrument var främst avsedd för imaging huden mänskliga dermis, har det använts framgångsrikt till bild hornhinnan och sklera23.
Det är nödvändigt att upprätthålla identiska scanning och imaging villkoren när man jämför kontroll och behandlade prover. Harmonisk understödjautvecklingen mikroskopi av kollagen i sklera vävnad kräver fluorescens Mikroskop kompatibel med flera photon imaging, en pulsad infraröd laser avstämbara i intervallet 800-900 nm våglängd och en högkänslig detektor som GaAsP icke-descanned (NDD) detektorer. Riktlinjerna som beskrivs i detta manuskript är en utgångspunkt. Villkoren bör fastställas särskilt för nya experiment eller för de olika systemen.
Hornhinnan och sklera har också utvärderats samtidigt i studier med hjälp av denna teknik24,25,26,27. Att veta att SHG signalen propagerar i både framåt och bakåt, har flera studier undersökt Hornvävnad självständigt i sina infödda statligt28,29,30,31, 32,33,34 och i keratokonus35,36 samt efter CXL (som diskuteras nedan). Resultaten av dessa studier tyder på att hornhinnans signalen är optimerad i spridda riktning framåt, vilket är logiskt med tanke på hornhinnans öppenhet och det faktum att ljuset passerar genom vävnaden att slå en monitor i framåt spridda system. Normalt SHG signalen är i det blå synliga området och kommer att sänkas kraftigt när de passerar genom en mycket scattering vävnad som ögats sklera. Som ett resultat, skulle identifiering av framåt spridda SHG kräva en tunna avsnitt av vävnaden i 50 μm eller mindre i tjocklek, samt en speciell optisk set-up. Däremot bakåtspritt signalen kan fångas genom regelbundna ljusstrålen av fluorescens Mikroskop utan vävnad snittning och därför detta läge är att föredra när imaging kollagen i intakt sklera vävnad till ett djup av 30-40 μm. I denna studie noterade vi en koncentration beroende ökning i signal densitet. Det är dock ganska möjligt, att TXL kan ha haft ytterligare och liknande effekter på djupare lager av sklera, och att effekten kan vara mer uttalad och utvidga till djupare hudlagren bestämt med den högsta koncentrationen. Dock på grund av den begränsade SHG signal penetrationen i sklera och vid tillämpningen av denna inledande studie valde vi att arbeta med bästa kvalitetsbilder, som erhölls från mest ytliga sklera (15 µm djup). I framtida studier, kommer vi att överväga djup beroende effekter efter TXL metoder eftersom detta kan ge ytterligare viktig information om varför ens större skillnader var inte observerats mellan 40 och 400 mM behandlade prover.
Vidare angående användning av SHG för utvärdering av riboflavin CXL inducerad vävnad cross-linking, SHG mikroskopi imaging följande riboflavin CXL av hornhinnan har rapporterats av flera grupper37,38,39 , 40 , 41. i en studie av Steven o.a. 37, korneal stabilisering med hjälp av CXL teknik resulterade i en '' homogenisering '' av signal- och förlust av vävnad '' veck '' eller '' vågor '' sett i icke-kors-länkade prover. Dessa typer av förändringar, men noterades också i en studie som utvärderade effekterna av förändringar i IOP på hornhinnan SHG signaler, öka möjligheten av tekniska artefakter. Organisatoriskt från fibrill samt högre ordning fiber bunt/lamellär organisation synvinkel, de sklera och hornhinnan är helt annorlunda och mycket är känt om sådana skillnader från elektronmikroskopi studier. De två vävnaderna skiljer sig när det gäller fibrill packning, vilket inkluderar fibrill diameter distribution (små enhetliga fibriller för de hornhinnan och variabel diameter fibrillerna för sklera) och mellan fibrill avstånd (uniform för hornhinnan och variabel för sklera). Samt, är högre ordning organisationen in i lamellär ark (hornhinnan) kontra fiberpackar (sklera) helt annorlunda. Sådana strukturella skillnader avspeglas i de SHG signaler som produceras av dessa två vävnader. Således kan förändringar som kan framkallas av cross-linking förändra SHG signalen på olika men parallell sätt. Med andra ord, var den '' uträtning '' fibrer i sklera observerades i denna studie och '' homogenisering '' av signal i hornhinnan rapporteras i litteraturen, både resultatet av kollagen tvärbindning modifiering. Således kan '' homogenisering '' effekten i hornhinnan på något sätt vara analogt med '' uträtning '' effekten av sklera som har rapporterats här.
De mekanismer som denna rakpermanent effekt som produceras av TXL är oklara baserat på den aktuella studien. En möjlighet skulle vara att vävnaden var på något sätt '' fast '' i en mekaniskt '' laddad '' position. Detta skulle stöd för uppfattningen att inducerad '' fibrill och fiber stabilisering '' hade inträffat. Förändringar i intraokulärt tryck sannolikt bidrog inte till denna effekt eftersom IOP var övervakas före och efter sT injektionen och förblev stabil. Övergripande, betydelsen av dessa observationer är oklara och fortsatta studier kommer att behövas. Notera, separat imaging tekniker såsom Brillouin mikroskopi42, som har visat sig ge kvantitativa mått av cross-linking (som bestäms av skjuvning modulus) följa CXL fotokemi kan vara användbar för att bekräfta resultaten med SHG Imaging i denna studie. Det bör dock noteras att dess användning med mycket spridning vävnader såsom sklera43, kräver tekniska ändringar och inte har validerats med tvärbunden skleral vävnad.
Laser polarisering och SHG mikroskopi är en viktig fråga. Laserljuset är linjärt polariserad och orienterade vinkelrätt mot riktningen av SHG signalen förökning och vissa vinkel i xy-planet till varje kollagen fiber. Således, fibrer i xy-planet som är väl anpassade och exakt vinkelrätt mot polariserade laserljuset kommer att producera en högre SHG signal än de i andra vinklar, inklusive de parallellt infallande ljuset (dvsz-planet), som kommer att producera den lägsta SHG signal (på grund av destruktiv interferens). Med avseende på sklera vävnad utifrån kollagen fibrer är orienterade i olika vinklar på mikroskopisk nivå, även om rekommenderad anatomiska fiber riktlinjer är kända världen läge. Således då SHG signalen produceras varierar beroende på xy-planet vinkeln på varje fiber, övergripande signalen kommer att vara mindre än det som skulle produceras om alla kollagenfibrer var exakt i linje med samma vinkel (i en vävnad såsom en sena till exempel). Således i denna studie på grund av provet som avbildas, riktning mot polarisering bestämdes inte avsiktligt men hölls konsekvent genom hela studien. Dessutom tog vi hand för att få vävnader från behandlade och kontroll glober från identiska skleral regioner, minimera eventuella skillnader i fiber orientering mellan prover. Slutligen, analyserade vi över 100 bilder per prov för att erhålla intensitetsvärden. Denna omfattande utvärdering bör ha normaliserade några avvikande SHG-signaler som kan ha varit registrerat. Som sagt, är det möjligt att till följd av den ”fiber uträtning” som vi observerat i tvärbunden proverna (beskrivs ovan), en större andel av ”i fokalplanet” fibrer kunde ha bidragit till ökningen av SHG signal samt ökad SHG signaler från större xy-planet justering. Båda dessa möjligheter skulle vara manifestationer av inducerad tvärbindande effekter.
En regional analys av cross-linking förändringar (av Tm) induceras av en sT injektion av SMG utfördes. Som förväntat, var nivån av cross-linking effekt koncentrerat till området av injektionen. Liten eller ingen korslänkande effekt noterades i regionen mittemot (längst bort) från injektionen, överensstämmer med vad som är känt om lokalisering av effekt efter sT injektion som visas genom ultraljud lokalisering44, 45 och beräknade datortomografi46.
Slutligen, angående tvärbindande terapi och närsynthet, collagen cross-linking av hornhinnan är att hitta utbredd användning i behandling av hornhinnans destabilisering inklusive keratokonus, post LASIK keratectasias, pellucid marginella degeneration (PMD), och som en adjungerad till refraktiva kirurgiska ingrepp47. Framgång för att behandla hornhinnan sjukdom med cross-linking har lett till utforskningen av denna behandlingsform på baksidan av ögat och, i synnerhet, sklera, för att begränsa axiell töjning i hög myopi2, ett koncept som går tillbaka till den allra tidigaste stadier av de terapeutiska tvärbindande koncept48,49.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Tongalp Tezel, MD, för samråd avseende sT injektion; Theresa Swayne, PhD, för samråd avseende SHG mikroskopi; och Jimmy Duong från Design och biostatistik resurs och biostatistisk core facility för Irving Institute på Columbia University Medical Center.
Stöds delvis av forskning för att förhindra blindhet och av nationella institut för hälsa bidrag NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 och NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University äger relaterade immateriella: U.S. utfärdade patent nr: 8,466,203 och inga: 9,125,856. Internationella patentsökt: PCT/US2015/020276.
Bilder samlades i Confocal och specialiserade mikroskopi delad resurs för Herbert Irving omfattande Cancer Center vid Columbia University, stöds av NIH bevilja #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Mikroskopet confocal köptes med NIH bevilja #S10 RR025686.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V | EMD Millipore, Massachusetts, USA | Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1 | |
| Sodium hydroxymethylglycinate | Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA | Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2 | |
| Injection needle with luer-lock syringe | BD Eclipse, NJ, USA | Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1 | |
| Rabbit head | La Granja poultry | Outbred | Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2 |
| Tono-pen | Reichter Technologies Depew, NY | IOP measurements - protocol step 2.4 | |
| DSC 6000 Autosampler | Perkin-Elmer Waltham, MA, USA | Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4 | |
| Pyris software | Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA | Ver 11.0 | protocol step 7.5 |
| CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1. | |
| GenTeal | Alcon, Fort Worth, TX | B000URVDQ8 | Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1 |
| Chameleon Vision II | Coherent, Santa Clara,CA, USA | Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11 | |
| AttoFluor cell chamber | Thermo Fisher Scientific Inc | A7816 | Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3 |
| 25-mm round coverslips, #1.5 | Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA | GG-25-1.5 | protocol step 8.1.3 |
| Eclipse Ti-E | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | protocol step 8.1.4. | |
| Non-descanned (NDD) GaAsP detector | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7 | |
| A1R-MP laser scanning system | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8 | |
| NIS Elements software | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Ver 4.3 | refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9 |
| Fiji/ImageJ | National Institute of Health | protocol step 9.1.2 | |
| NeuronJ | Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands | https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | Ver 14 | protocol step 9.2.8 |
References
- McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
- Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Ophthalmic Physiol Opt. 33 (3), 385-389 (2013).
- Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
- Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon's administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90 (6), 787-793 (2003).
- Guise, P. Sub-Tenon's anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
- Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon's capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196 (1), 103-108 (2013).
- Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27 (3), 353-356 (2008).
- Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91 (4), e253-e257 (2013).
- Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89 (2015).
- Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1274-1282 (2015).
- Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35 (4), 550-556 (2016).
- da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. , (2017).
- Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42 (4), 528-533 (2017).
- Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94 (1986).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215 (6), 682-691 (2009).
- Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10 (83), 20121004 (2013).
- Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (1), 21-29 (2017).
- Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14 (6), 064040 (2009).
- Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13 (15), 5791-5797 (2005).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1216-1224 (2006).
- Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Jr Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34 (24), 3779-3781 (2009).
- Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32 (11), 1784-1791 (2006).
- Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2459-2465 (2010).
- Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 8818-8827 (2011).
- Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 911-915 (2011).
- Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (4), 2476-2481 (2014).
- Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5622-5629 (2015).
- Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
- Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8377-8385 (2014).
- Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (3), 1087-1094 (2007).
- Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36 (12), 2150-2159 (2010).
- Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (8), 5325-5331 (2011).
- McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33 (2), 125-130 (2014).
- Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3584-3592 (2015).
- Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4231-4238 (2011).
- Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
- Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24 (19), 22232-22238 (2016).
- Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon's cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17 (9), 1003-1007 (2003).
- Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon's, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25 (1), 56-59 (1999).
- Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17 (4), Fi72-Fi74 (1998).
- Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking--a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (2), 78-93 (2013).
- Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30 (3), 689-695 (2004).
- Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87 (3), 279-285 (2008).
