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दूसरे चिकित्सीय ऊतक के मूल्यांकन के लिए एक उपकरण के रूप में खरगोश श्वेतपटल में दूसरी सुरीले पीढ़ी संकेतों को पार से जोड़ने (TXL) निकट दृष्टि के लिए

Published: January 6, 2018 doi: 10.3791/56385
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Ophthalmology, Columbia University College of Physicians and Surgeons, 2Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource, Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University

Summary

इस प्रोटोकॉल रासायनिक पार के मूल्यांकन के लिए तकनीक का वर्णन खरगोश श्वेतपटल के दूसरे सुरीले पीढ़ी इमेजिंग और अंतर स्कैनिंग calorimetryका उपयोग कर जोड़ने ।

Abstract

तरीके रासायनिक बांड शुरू करने से ऊतक को मजबूत बनाने के लिए (गैर एंजाइमी पार से जोड़ने) संरचनात्मक प्रोटीन में (fibrillar कोलेजन) चिकित्सा के लिए photochemical पार जोड़ने और ऊतक पार से जोड़ने (TXL) तरीके शामिल हैं. यांत्रिक ऊतक संपत्ति परिवर्तन उत्प्रेरण के लिए इस तरह के तरीके corneal thinning में कॉर्निया के लिए नियोजित किया जा रहा है (यांत्रिक रूप से कमजोर) विकारों जैसे keratoconus के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रगतिशील निकट दृष्टि में श्वेतपटल, जहां thinning और पीछे के कमजोर श्वेतपटल होती है और संभावना के सलए बढ़ाव का योगदान होता है । इस तरह के ऊतकों को मजबूत बनाने के लिए प्राथमिक लक्ष्य प्रोटीन fibrillar कोलेजन जो कॉर्निया और श्वेतपटल में शुष्क वजन प्रोटीन के महान बहुमत का गठन कर रहे हैं । अनायास, fibrillar कोलेजन ऊतक extracellular अंतरिक्ष में दूसरी सुरीले पीढ़ी के संकेत का मुख्य स्रोत हैं । इसलिए, ऐसे पार के माध्यम से प्रेरित उन के रूप में कोलेजन प्रोटीन के संशोधन, चिकित्सा को जोड़ने, संभवतः पता लगाया जा सकता है और दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी माइक्रोस्कोपी (SHGM) के उपयोग के माध्यम से quantitated. एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी एक अवरक्त उत्तेजना प्रकाश स्रोत के साथ युग्मित प्रणाली के उपयोग के माध्यम से SHGM संकेतों की निगरानी एक रोमांचक आधुनिक इमेजिंग तरीका है कि जैव चिकित्सा विज्ञान में व्यापक उपयोग का आनंद ले रहा है । इस प्रकार, वर्तमान अध्ययन के लिए एक साधन के रूप में SHGM माइक्रोस्कोपी के उपयोग का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता था के रूप में प्रेरित पार-प्रभाव को मापने के लिए पूर्व vivo खरगोश श्वेतपटल में, एक इंजेक्शन के बाद एक रासायनिक पार जोड़ने एजेंट उप में-Tenon के अंतरिक्ष (sT), एक इंजेक्शन दृष्टिकोण है कि आंखों नैदानिक प्रक्रियाओं के दौरान नेत्र संज्ञाहरण के कारण के लिए मानक अभ्यास है । रासायनिक पार से जोड़ने एजेंट, सोडियम hydroxymethylglycinate (47), कॉस्मेटिक विरक्षकों formaldehyde रिहा एजेंटों (फारों) के रूप में जाना जाता है के एक वर्ग से है । Scleral परिवर्तन के साथ की प्रतिक्रिया के बाद 47 स्वसहायता समूहों के संकेतों में वृद्धि हुई है और थर्मल विकार तापमान, प्रेरित ऊतक पार से जोड़ने के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक मानक विधि में बदलाव के साथ संबद्ध ।

Introduction

प्रगतिशील अदूरदर्शिता गैर के माध्यम से इलाज किया जा माने है एंजाइमी scleral पार से जोड़ने (photochemical और/या रासायनिक), जो कि अवरुद्ध कोलेजन एंजाइमी पार जोड़ने प्रयोगात्मक फार्म वंचित (एफडी)-प्रेरित बढ़ा सकते है समझ में आता है अदूरदर्शिता1. Elsheikh और फिलिप्स2 हाल ही में व्यवहार्यता और मानक पराबैंगनी का उपयोग करने की क्षमता पर चर्चा की-एक विकिरण (UVA)-riboflavin photochemical पार-जोड़ने मध्यस्थता (भी ड्रेसडेन प्रोटोकॉल के रूप में जाना), यहां संक्षिप्त के रूप में (riboflavin CXL) पीछे scleral स्थिरीकरण के लिए निकट दृष्टि में अक्षीय बढ़ाव को रोकने के लिए । इस photochemical विधि सफलतापूर्वक पूर्वकाल ग्लोब सतह (यानी, उभार कॉर्निया) के स्थिरीकरण के इलाज के लिए इस्तेमाल किया गया है keratoconus और बाद में देखा LASIK keratectasia । हालांकि, श्वेतपटल के लिए इस CXL प्रोटोकॉल के आवेदन एक पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश स्रोत के साथ पीछे श्वेतपटल तक पहुंचने में कठिनाइयों से संबंधित मुद्दों से रुकावट है, साथ ही साथ एक बहुत अधिक ऊतक सतह क्षेत्र को संशोधित करने की जरूरत है । यह कहा जा रहा है, CXL दृष्टिकोण नेत्रहीन फार्म से वंचित खरगोशों में अक्षीय बढ़ाव को रोकने के लिए इस्तेमाल किया गया है (tarsorrhaphy द्वारा), हालांकि पीछे श्वेतपटल के कई क्षेत्रों में है कि अध्ययन में कई अलग विकिरण क्षेत्रों की आवश्यकता3। इसके विपरीत, एक रासायनिक स्थिर एजेंट के इंजेक्शन (यानी, पार से एजेंट को जोड़ने) sT अंतरिक्ष के माध्यम से एक आसान तरीका पीछे श्वेतपटल संशोधित प्रतिनिधित्व कर सकता है, एक यूवी प्रकाश स्रोत शुरू करने के लिए की जरूरत से परहेज । यह इंजेक्शन तकनीक अच्छी तरह से मोतियाबिंद सर्जरी4,5,6के रूप में आंखों प्रक्रियाओं के दौरान नेत्र संज्ञाहरण उत्प्रेरण का एक उपयोगी तरीका के रूप में जाना जाता है । Wollensak7 पहले एक sT इंजेक्शन का उपयोग glyceraldehyde का उपयोग वर्णित है (एक रासायनिक पार-अवधारणा में इसी तरह के एजेंट formaldehyde जारी एजेंटों (फारों) को जोड़ने के लिए इस अध्ययन में वर्णित) ठोस खरगोश श्वेतपटल और genipin है एफडी गिनी सूअरों8,9में अक्षीय लंबाई सीमा दिखाया गया है । इन जांचकर्ताओं photochemical CXL तकनीक पर एक घुलनशील रासायनिक एजेंट का उपयोग करने का एक स्पष्ट लाभ का प्रदर्शन किया है । इस प्रकार, scleral पार-फारों (यानी, TXL)10सहित कुछ प्रकार के एक इंजेक्शन रासायनिक एजेंट का उपयोग कर जोड़ने, एक व्यवहार्य उपचार विधि के निकट दृष्टि में देखा scleral बढ़ाव की प्रगति को रोकने के लिए प्रदान कर सकता है ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम एक रासायनिक पार सोडियम hydroxymethylglycinate (47) के समाधान को जोड़ने, cadaveric खरगोश आंखों के श्वेतपटल के लिए सेंट इंजेक्शन के माध्यम से दिया का उपयोग करें । हम इसी प्रकार के प्रोटोकॉल लागू किया है पहले सामयिक रासायनिक पार-कॉर्निया में जोड़ने के लिए । विशेष रूप से उन में पहले की रिपोर्ट अध्ययन, एकाग्रता पर निर्भर पार प्रभाव जोड़ने का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, एक प्रभाव है कि photochemical CXL के साथ अच्छी तरह से ऊपर फैले के रूप में थर्मल विकार विश्लेषण द्वारा निर्धारित की सीमा के साथ.11 .

यहां हम प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए पार-scleral ऊतक, थर्मल विकार स्कैनिंग Calorimetry (डीएससी), और दूसरी सुरीले पीढ़ी माइक्रोस्कोपी (SHGM) का उपयोग कर के लिए सेंट इंजेक्शन के माध्यम से दिया 47 के प्रभाव को जोड़ने का आकलन ।

अवकलन स्कैनिंग calorimetry (DSC), थर्मल विश्लेषण के रूप में भी जाना जाता है का उपयोग करना, एक थर्मल विकार संक्रमण मापा जाता है, जो scleral ऊतक के लिए fibrillar कोलेजन के गुणों द्वारा निर्देशित predominately है, क्योंकि वे थोक बहुमत का गठन प्रोटीन की । इस विधि कोलेजन आणविक संरचना की स्थिरता और पार से जुड़े बांड है कि कोलेजन तंतुओं, प्रधान तृतीयक प्रोटीन संरचना स्थिर मूल्यांकन करता है । DSC में हीटिंग के दौरान, एक महत्वपूर्ण संक्रमण तापमान प्राप्त होता है कि कोलेजन अणु के विकार में परिणाम, ट्रिपल कुंडलित के uncoiling में जिसके परिणामस्वरूप, एक प्रक्रिया है कि रूपों क्या सामांयतः जिलेटिन के रूप में जाना जाता है । इस थर्मल विकार कोलेजन अणु के साथ हाइड्रोजन बांड बाधित और प्रेरित पार के माध्यम से उच्च तापमान को स्थानांतरित कर सकते है12,13तरीकों को जोड़ने । इस विधि में कई दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है, विशेष रूप से और भौतिक उद्योग में प्रक्रियाओं है कि चमड़े बनाने शामिल हैं । हालांकि, इस विधि श्वेतपटल ऊतक निष्कर्षण की आवश्यकता है और इसलिए केवल एक पूर्व vivo तकनीक के रूप में उपयोगी हो सकता है ।

दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी माइक्रोस्कोपी (SHGM) गैर-centrosymmetric आणविक वातावरण के साथ, विशेष सामग्री के गैर रेखीय ऑप्टिकल गुण पर आधारित है. ऐसी सामग्रियों में तीव्र प्रकाश, उदाहरण के लिए लेजर द्वारा उत्पादित प्रकाश, स्वसहायता संकेतों, जिसमें घटना प्रकाश आवृत्ति में दोगुनी हो जाती है उत्पंन करता है । जैविक सामग्री है कि स्वसहायता समूहों के संकेत बनाने के लिए जाना जाता है कोलेजन, microtubules, और मांसपेशी मायोसिन हैं । उदाहरण के लिए, कोलेजन ८६० एनएम तरंग दैर्ध्य की एक अवरक्त प्रकाश के साथ उत्तेजित ४३० एनएम तरंग दैर्ध्य के साथ दिखाई रेंज में एक स्वसहायता समूहों संकेत फेंकना होगा । दूसरी सुरीले उत्पादन (स्वसहायता) सिग्नल इमेजिंग चिकित्सकीय कोलेजन पार से जोड़ने के मूल्यांकन के लिए एक आशाजनक तरीका है । यह 30 से अधिक वर्षों के लिए जाना जाता रहा है कि ऊतकों में कोलेजन तंतुओं का उत्सर्जन स्वसहायता समूहों14संकेत । हालांकि, केवल हाल ही में उच्च संकल्प छवियों के ऊतकों की एक किस्म में15 प्राप्त किया जा सकता है, पट्टा16, त्वचा, उपास्थि17, रक्त वाहिकाओं18, और कोलेजन जैल19में शामिल हैं ।

इस ज्ञान के आधार पर, इस अध्ययन के स्वसहायता समूहों संकेत के माध्यम से श्वेतपटल में प्रेरित परिवर्तन का मूल्यांकन करता है । परिणाम से संकेत मिलता है कि श्वेतपटल के 47 के संशोधन स्वसहायता समूहों ऊतक कोलेजन फाइबर बंडलों से उत्पादित संकेतों को बढ़ाता है (उच्च क्रम चतुर्धातुक कोलेजन तंतुओं के शामिल संरचना) और भी कोलेजन में एक संरचनात्मक सुघड़ परिवर्तन का उत्पादन फाइबर नेटवर्क, फाइबर बंडल में परिलक्षित "सीधे."

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं बरकरार नस्ल खरगोश सिर के भीतर cadaveric खरगोश आंखों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए सभी संस्थागत और राष्ट्रीय दिशानिर्देश का पालन किया गया ।

1. समाधान की तैयारी

  1. TXL के लिए एके 47 तैयारी:
    1. ०.२ मी एकाग्रता के सोडियम बिकारबोनिट समाधान (NaHCO3) के 1 मिलीलीटर तैयार आसुत जल के 1 मिलीलीटर में भंग NaHCO3 पाउडर का 0.0165 जी का उपयोग कर समाधान ।
    2. भंग ०.१०१६ आसुत जल के 1 मिलीलीटर में पाउडर सोडियम hydroxymethylglycinate (47) के मिलीग्राम ८०० mM 47 के अंतिम एकाग्रता पाने के लिए । ०.१ एम NaHCO3 और ४०० mM 47 के एक अंतिम एकाग्रता के लिए सोडियम बिकारबोनिट समाधान समायोजित करें । एके की सांद्रता पार से जोड़ने प्रभाव वांछित के आधार पर । प्रोटोकॉल में वर्णित यहां हम ४०, १००, और ४०० mM 47 का इस्तेमाल किया ।

2. TXL का उपयोग कर के लिए SubTenon के इंजेक्शन

  1. क्रमशः दो 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज (25G सुई) ४०० µ एल नियंत्रण और एके 47 समाधान के साथ भरें ।
  2. एक प्रोफ़ाइल विमान में एक तकिया की मदद से खरगोश के सिर प्लेस । स्टायरोफोम या एक पेपर स्टैक एक इष्टतम स्थिति में सिर को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. एक बाल चिकित्सा नेत्र जांच पड़ताल के साथ पलकें मुकर ।
  4. एक applanation tonometry डिवाइस का उपयोग कर प्रारंभिक intraocular दबाव (IOP) को मापने ।
  5. एक ऊतक मार्कर के साथ limbus के ऊपरी मध्य भाग पर लक्षित इंजेक्शन की साइट चिह्नित करें ।
  6. एक नेत्रश्लेष्मला संदंश (या दांतेदार दौर टिप के साथ किसी भी संदंश) के साथ इंजेक्शन की साइट के आसपास कंजाक्तिवा वापस लेना और कंजाक्तिवा के माध्यम से सुई डालने, Tenon के कैप्सूल में प्रवेश बस थोड़ा चिह्नित अंग साइट से परे (यानी, 2-3 मिमी से limbus) । कंजाक्तिवा में एक छोटा सा चीरा भी आईरिस कैंची के साथ बनाया जा सकता है ताकि Tenon के कैप्सूल के माध्यम से सुई के पारित होने की सुविधा के लिए ।
  7. एक बार Tenon के कैप्सूल के भीतर, सुई यह पक्ष के पक्ष में ले जाकर स्वतंत्र रूप से मोबाइल है कि सुनिश्चित करें. इस समय के दौरान, ग्लोब नहीं जाना चाहिए । यह उप-Tenon (sT) अंतरिक्ष में श्वेतपटल के ऊपर सुई की उचित स्थान की पुष्टि करता है ।
  8. सिरिंज से समाधान इंजेक्षन और सुई त्यागें. तुरंत इंजेक्शन के बाद, द्रव एक पूर्वकाल उभार कंजाक्तिवा (जैसे, chemosis) के माध्यम से देखा बनाने के सेंट अंतरिक्ष में जमा होगा ।
  9. यह दुनिया के एक अनजाने वेध के कारण नहीं बदला है कि यह पुष्टि करने के लिए IOP माप दोहराएँ ।
  10. ढक्कन वीक्षक निकालें, और के बारे में 2-3 मिनट के लिए बंद पलकें के माध्यम से डिजिटल मालिश करते हैं ।
  11. ३.५ घंटे (कमरे के तापमान = 18 डिग्री सेल्सियस), अगले कदम के लिए जाने से पहले की एक मशीन की अवधि के लिए सिर छोड़ दें ।

3. टिशू वडा

  1. पलकें पलक वीक्षक का उपयोग करने के क्रम में दुनिया के लिए उपयोग का अनुकूलन करने के लिए वापस लेना । आंख के आकार के अनुसार बेहतर आकार वीक्षक का चयन करें ।
  2. limbus के आसपास के कंजाक्तिवा को अलग कर । यह पहले से ही इंजेक्शन की साइट के पास incised किया गया है, तो यह लगभग 1x1 सेमी की एक इनोक्युलम आकार शामिल होगा circumferentially सीमाओं का विस्तार ।
  3. scleral प्रविष्टि के अपने स्थलों पर अतिरिक्त आंख की मांसपेशियों में कटौती ।
  4. संदंश के साथ गोलक तरक्की, यह पीछे की ओर से धक्का । इस पीछे ग्लोब के लिए उपयोग प्रदान करता है और नेत्र धमनी और दुनिया के पीछे ध्रुव के पास स्थित नस के साथ ऑप्टिक तंत्रिका के काटने की सुविधा होगी ।
  5. चिह्नित इंजेक्शन साइट सहित बाहरी सीमा के साथ, corneoscleral परिसर में कटौती । दाग अभी भी श्वेतपटल के शेष भाग पर दिखाई देना चाहिए ।
  6. ऊतक संदंश के साथ कर्षण लागू करके कॉर्पस vitreus और श्वेतपटल के भीतरी हिस्से से जुड़ी सभी परतों को हटा दें ।
    नोट: आगे कदम किया जा रहा निम्न कार्यविधियों पर निर्भर करते हैं: ४.०-DSC विश्लेषण, ५.०-स्वसहायता समूहों माइक्रोस्कोपी ।

4. क्षेत्रीय डीएससी विश्लेषण के लिए

  1. इलाज आंखों के लिए: कैंची के साथ शेष scleral कप से चार scleral क्षेत्रों में कटौती ताकि इंजेक्शन की साइट के ऊपरी क्षेत्र में स्थित है और केंद्रीय रूप से संरेखित । दोनों पार्श्व पक्षों से शेष 3 क्षेत्रों में कटौती (यानी, नाक और लौकिक), और नीचे ।
    नोट: (1-16) वर्गों में आगे विभाजित हैं जो सेक्टरों (1-4) की क्रमांकन चित्र 1aमें प्रदर्शित किया जाता है ।
  2. scleral क्षेत्रों में कटौती (1-4) छोटे चौकों (1-16) में लगभग 4 x 4 मिमी प्रत्येक । 1 सेक्टर 9 चौकों में विभाजित किया जाना चाहिए (इंजेक्शन की सटीक साइट एक व्यक्ति वर्ग [वर्ग 2] बनाने) । 2 चौकों (चौकों 10-11 और 12-13) और सेक्टर 4 में 3 चौकों (चौकों 14-16) में दो क्षेत्रों और 3 विभाजित ।
  3. प्रत्येक वर्ग को एक संख्या असाइन करें, जैसा कि चित्र 1aमें दिखाया गया है, ताकि इंजेक्ट किए गए क्षेत्र के स्थान से विश्लेषित ऊतक की दूरी को स्थानीयकृत किया जा सके ।
  4. नियंत्रण नेत्र के लिए: चार scleral क्षेत्रों (इलाज ऊतक के समान) में ऊतक विभाजित करने के बाद, निम्नलिखित स्थानों से ऊतक के वर्ग टुकड़े काट: शीर्ष क्षेत्र (सेक्टर 1) से 3 चौकों, प्रत्येक पक्ष से 1 (सेक्टरों 2 और 3), और 1 से निचला क्षेत्र (सेक्टर 4) ।
  5. शेष रेटिना और धमनियां परतों बंद परिमार्जन और हर बार ताजा पंजाबियों के साथ दो बार धोने, एक समय में लगभग 10 एस के लिए समाधान में जलमग्न टुकड़े छोड़कर ।

5. स्वसहायता समूहों इमेजिंग के लिए

  1. केंद्रीय रूप से गठबंधन इंजेक्शन की साइट के साथ एक 1 एक्स 1 सेमी क्षेत्र बनाने के लिए कैंची का उपयोग कर श्वेतपटल के ऊपरी हिस्से में कटौती ।
  2. शेष रेटिना और धमनियां परतों बंद परिमार्जन और ताजा पंजाबियों हर बार समाधान में लगभग 10 एस के लिए टुकड़े छोड़ने के साथ दो बार धोने ।
  3. 1 मिलीलीटर में ऊतक प्लेस-पंजाबियों समाधान के लिए परिवहन के लिए इमेजिंग सुविधा से भरा ट्यूबों । सभी प्रक्रियाओं, मशीन समय और गोलक के विच्छेदन के साथ शुरुआत के बाद एक घंटे के भीतर प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

6. माइक्रोस्कोप प्रोटोकॉल

नोट: इमेजिंग के लिए इस प्रोटोकॉल वापस श्वेतपटल ऊतक की कोलेजन से बिखरे हुए स्वसहायता समूहों संकेत लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के लिए सिलवाया है ।

  1. माइक्रोस्कोपी सेट अप
    1. को अधिकतम करने के लिए संकेत और संकल्प जब स्वसहायता समूहों माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक उद्देश्य लेंस का अनुकूलन करने के लिए अवरक्त प्रकाश संचारित और एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (NA) के साथ । हमारा उद्देश्य Nikon एपीओ LWD 25x/ना 1.1 जल विसर्जन है ।
    2. coverslip, ०.१७ मिलीमीटर की मोटाई है कि इस मामले में, नमूना की गहराई से मेल करने के लिए लेंस के सुधार कॉलर समायोजित करें ।
    3. माउंट 25x उद्देश्य लेंस और चिकनाई जल आधारित जेल के एक उदार राशि के नमूने बढ़ते से पहले इमेजिंग सतह को कवर करने के लिए जोड़ें । पानी आधारित जेल प्रयोग के दौरान लुप्त नहीं होगा और इसलिए छवि गुणवत्ता बनाए रखेंगे ।
    4. २ २५ मिमी गोल coverslips के बीच सुखाने के बिना पंजाबियों के साथ 1 मिलीलीटर ट्यूब से scleral ऊतक प्लेस (episcleral पक्ष नीचे) episclera और coverslip सतह के बीच अधिक से अधिक संपर्क प्रदान ।
      नोट: ऊतक भी coverslip पर खुला रखा जा सकता है । पंजाबियों की एक अच्छी रकम इमेजिंग के दौरान हाइड्रेटेड ऊतक रखना चाहिए । इस मामले में, cellchamber कोडांतरण के बाद ऊतक टुकड़ा और पंजाबियों जोड़ें ।
    5. एक 25 मिमी गोल coverslip, एक या एक सैंडविच तकनीक में रखकर सेल चैंबर इकट्ठा, चैंबर के नीचे भाग पर और ऊपर भाग पेंच नीचे क्रम में एक सील दौर चैंबर बनाने के लिए । एक शीर्ष coverslip इस्तेमाल किया जाता है, ताकि कृत्रिम रूप से समतल और ऊतक को नुकसान से बचने के लिए कसकर नीचे पेंच मत करो ।
    6. माइक्रोस्कोप मंच पर ऊतक नमूने के साथ सेल चैंबर माउंट ।
    7. पर संचारित प्रकाश के साथ आंख देखने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें ।
    8. स्थिति मंच और उद्देश्य की ऊंचाई को समायोजित इस तरह कि नमूना की निचली सतह ध्यान में है, के रूप में आंख टुकड़ा के माध्यम से उज्ज्वल क्षेत्र निरीक्षण द्वारा निर्धारित ।
    9. कंप्यूटर की निगरानी के अलावा सभी रोशनी बंद करो और एल्यूमीनियम पंनी शीट माइक्रोस्कोपी मंच पर लिपटी के साथ संभव के रूप में निगरानी से ज्यादा प्रकाश के रूप में ब्लॉक । किसी भी आवारा प्रकाश डिटेक्टरों तक पहुंचने कम शोर अधिग्रहण सुनिश्चित करेंगे, के रूप में GaAsP NDD डिटेक्टरों उच्च संवेदनशीलता है ।
    10. सॉफ्टवेयर के Ti पैड पैनल में जांच करें कि लेंस की परिभाषा सही है ।
    11. A1 कॉंपैक्ट GUI पैनल में, इमेजिंग के लिए IR लेजर चुनें, NDD डिटेक्टरों का चयन करें और DAPI चैनल है कि एक 400-450 एनएम bandpass फिल्टर के साथ सुसज्जित है चुनें ।
    12. A1 सांसद जीयूआई पैनल में, ८६० एनएम के लिए अवरक्त लेजर की तरंग दैर्ध्य सेट और शटर खुला ।
    13. इस प्रकार के रूप में A1 कॉंपैक्ट GUI पैनल में लेजर स्कैनिंग स्थिति सेट करें । का चयन करें: (क) Galvano स्कैनर, (ख) एकतरफ़ा स्कैनिंग, (ग) पिक्सेल आवास समय ६.२ µs, (घ) फ्रेम आकार १,०२४ x १,०२४ पिक्सल, (ई) लाइन 2x औसत
      नोट: Galvano स्कैनर और एकतरफ़ा स्कैनिंग बिंदु संरेखण द्वारा सटीक बिंदु सुनिश्चित करता है । दृश्य के पूर्ण क्षेत्र के लिए १,०२४ x १,०२४ का एक आकार ०.५ माइक्रोन का पिक्सेल आकार में अनुवाद करता है/pixel. लाइन औसत छवि में गोली शोर कम हो जाएगा ।
    14. लेजर शक्ति और डिटेक्टर लाभ का समायोजन करके A1 कॉंपैक्ट जीयूआई पैनल में इमेजिंग शर्तों सेट करें । वर्तमान छवि में पिक्सेल तीव्रता मानों का हिस्टोग्राम प्रदर्शित करने वाला लुक अप टेबल पैनल (लुट्यो) खोलें । "Find" मोड में लाइव इमेजिंग चालू करें और लेजर शक्ति और डिटेक्टर लाभ का समायोजन करके पिक्सेल मूल्यों की पहचान की श्रेणी को अधिकतम । संतृप्ति से बचें । विशिष्ट मूल्यों २.५% लेजर शक्ति रहे हैं, ८६० एनएम में २.३५ डब्ल्यू की कुल से, और १०० एचवी (डिटेक्टर लाभ) ।
    15. नोट: इस सेटअप के लिए, लेजर बिजली एक आंतरिक बिजली मीटर के साथ मापा ५.२ मेगावाट है । हर बार एक प्रयोग किया जाता है, फिर से लेजर प्रतिशत है कि आंतरिक शक्ति माप इमेजिंग सत्र के बीच ५.२ मेगावाट पर स्थिर है फिर से समायोजित करें । लेजर पावर सेट करते समय देखभाल की जानी चाहिए । गिरगिट द्वितीय लेजर ८०० एनएम पर एक 3 डब्ल्यू लेजर और एक 10% या उच्च शक्ति संभवतः ऊतक नुकसान पैदा कर सकता है ।
  2. छवि अधिग्रहण
    1. पूर्वावलोकन मोड में, XYZ ओवरव्यू उपकरण का उपयोग करके ऊतक क्षेत्र को स्कैन करें ।
    2. इमेजिंग करने के लिए कम संकल्प (२५६ x २५६ पिक्सल और कोई औसत लाइन) के लिए इस विधा में छवियों के अधिग्रहण की गति सेट ।
    3. 5 एक्स 5, 3 एक्स 3, या देखने के एकल क्षेत्रों पर कब्जा करने के लिए ऊतक की पूरी सतह को कवर । प्रत्येक स्थान पर, अवलोकन पर कब्जा करने से पहले, लाइव "स्कैन" मोड पर बारी और ध्यान में ऊतक लाने. ध्यान दें कि ऊतक के विभिंन क्षेत्रों अक्षीय दिशा में थोड़ा अलग स्थिति होगी ।
    4. एक फ्लैट क्षेत्र का पता लगाएं, जहां कोलेजन फाइबर देखने के पूरे क्षेत्र में देखा जाता है और डबल क्लिक करें कि अवलोकन उपकरण में स्थिति है कि विशेष स्थान के लिए मंच ले जाने के लिए ।
    5. लाइव "स्कैन" मोड पर चालू करें, इस तरह के नीचे विमान ध्यान में है कि उद्देश्य की जेड स्थिति को समायोजित करने और, Ti पैड में, इस नीचे परत के ऊपर ऑप्टिकल विमान 10-15 माइक्रोन ले जाने के लिए जेड ड्राइव का उपयोग करें ।
    6. १,०२४ x १,०२४ पिक्सल और 2x लाइन औसत के साथ उच्च संकल्प पर एक छवि प्राप्त, "कैप्चर" बटन का उपयोग कर ।
    7. "+" बटन का उपयोग कर XYZ सिंहावलोकन में स्थान सहेजें । यह सुनिश्चित करता है कि ऊतक के एक ही क्षेत्र पर कब्जा नहीं है ।
    8. ऊतक के प्रत्येक टुकड़े के लिए देखने के गैर अतिव्यापी क्षेत्रों के 10 छवियों पर कब्जा ।

7. डीएससी प्रोटोकॉल

नोट: जैसे ही ऊतक तैयारी पूरा हो गया है के रूप में इस कदम के लिए आगे बढ़ें, क्षेत्रीय डीएससी विश्लेषण के लिए, या ऊतक इमेजिंग के बाद जब SHGM किया जाता है.

  1. DSC पंस तैयार, तौला और लेबल ।
    नोट: यह कदम ऊतक विच्छेदन से पहले किया जाना चाहिए ताकि टिशू सुखाना को कम करने के लिए ।
  2. एक शोषक ऊतक के साथ प्रत्येक scleral वर्ग सूखी और यह एक DSC पैन के तल पर सपाट रखना दांतेदार संदंश का उपयोग कर ।
  3. अंदर ऊतक और ढक्कन समेटना के साथ पैन वजन और ऊतक गीला वजन प्राप्त करने के लिए कवर (नमूनों की द्रव्यमान 5 से 11 मिलीग्राम की सीमा में होना चाहिए).
    नोट: अगले ऊतक नमूने के लिए आगे बढ़ने से पहले समेटना का उपयोग कर प्रत्येक पैन सील. पंस भली सील कर रहे हैं, थर्मल विश्लेषण से पहले किसी भी पानी की हानि को रोकने ।
  4. एक बार नमूना समेटना है, यह डीएससी ट्रे पर अपने निर्धारित स्थान पर जगह है । वहीं कंट्रोल के लिए 6 नमूने लिए और 16 का इलाज आंखों के लिए होना चाहिए ।
  5. साधन प्रबंधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक विधि बनाएँ, ऊतक के वजन निर्दिष्ट है, और थर्मल निंनलिखित मापदंडों का उपयोग विश्लेषण चलाने: ४० के तापमान रेंज ८० डिग्री सेल्सियस, हीटिंग दर: 1 ° c/मिनट, हीट फ्लो: १७.३७ मेगावाट, गैस (एन2) प्रवाह: १९.८ मिलीलीटर/ गैस दबाव: २.२ बार ।
  6. एक बार पूरा, संक्रमण तापमान चोटी जो थर्मल विकार साधन सॉफ्टवेयर प्रबंधन का उपयोग होता है निकालने के द्वारा प्रत्येक नमूने के लिए डेटा का विश्लेषण ।

8. छवि विश्लेषण

  1. स्वसहायता संकेत
    1. प्रत्येक उपचार और उसके नियंत्रण, इस तरह की है कि छवि के क्षेत्र ज्यादातर कोलेजन फाइबर द्वारा कब्जा कर लिया है से सबसे अधिक प्रतिनिधि छवियों के कम से 5-10 का चयन करें ।
    2. ImageJ सॉफ्टवेयर में प्रत्येक छवि अपलोड करें और सक्रिय छवि के लिए विश्लेषण > माप का चयन करके औसत पिक्सेल तीव्रता मापने ।
    3. निकाले गए मूल्यों का मतलब पिक्सेल तीव्रता के रूप में रिपोर्ट कर रहे है और भी तीव्रता के हिस्टोग्राम की साजिश रचने द्वारा मेनू से चयन द्वारा दिखाया जा सकता है > हिस्टोग्राम का विश्लेषण।
    4. किसी Excel पत्रक का उपयोग करके, नमूना ID के अनुसार सभी मापी गई डेटा को दस्तावेज़ करने के लिए कोई तालिका बनाएँ.
    5. प्रत्येक उपचार और नियंत्रण शर्त के लिए पिक्सेल तीव्रता के माध्य और मानक विचलन की गणना करें ।
    6. छात्र टी परीक्षण का उपयोग करना, सांद्रता के सभी pairwise तुलना (यानी, ४० mm 47 बनाम 0 और ४०० mm 47 बनाम 0) के लिए मतभेदों की तुलना करें । [P ≤ 0.05] ।
  2. Waviness
    1. एक छवि का चयन करें कि कोलेजन फाइबर प्रदर्शित करता है । कम से कम ४० में प्रति नमूना 10 छवियों का विश्लेषण किया जाना चाहिए (प्रत्येक एकाग्रता के लिए एक नियंत्रण के नमूने सहित-) ।
    2. खोलें ImageJ > प्लगइंस > NeuronJ। NeuronJ को पूर्व स्थापना की आवश्यकता होती है ।
    3. एक खोला NeuronJ विंडो में खींचकर सभी imagesby अपलोड करें ।
    4. फाइबर के साथ अनुरेखण लाइनों बनाएँ, माउस के साथ फाइब्रिल के समोच्च निम्नलिखित (कलम ड्राइंग गोलियाँ इस्तेमाल किया जा सकता), कुल फाइबर की लंबाई की दूरी को मापने के लिए एम क्लिक करें ।
    5. एक स्पर्श सीधी रेखा आकर्षित और शुरुआत और पहले से तैयार फाइबर समोच्च के अंत से कनेक्ट करने के लिए "विकल्प" का चयन करें । अब क्लिक करें M को मापने के लिए अंत करने के लिए अंत लंबाई ।
    6. एक ही प्रक्रिया को प्रति छवि कम से 10 तंतुओं पर दोहराएं ।
    7. एक एक्सेल स्प्रेडशीट में 10 तंतुओं और इनपुट डेटा में से प्रत्येक से उन दो माप लीजिए, कुल फाइबर लंबाई (समोच्च) और अंत करने के लिए अंत लंबाई (सीधे जोड़ने लाइन) के रूप में लंबाई [वक्र] और लंबाई [रैखिक], क्रमशः व्यक्त ।
    8. गणना waviness सूचकांक (डब्ल्यू) सूत्र का उपयोग: w = लंबाई [वक्र]/लंबाई [रैखिक] ।
    9. सूत्र का उपयोग करके नियंत्रण नमूनों से छवियों के साथ इलाज के नमूनों की छवियों (47) से डेटा की तुलना waviness के% की गणना: (डब्ल्यू [47]-1)/(डब्ल्यू [नियंत्रण]-1)
    10. waviness सूचकांक (डब्ल्यू) के लिए एक pairwise टी परीक्षण प्रदर्शन के लिए सांख्यिकीय अंतर (पी-मूल्यों) कोलेजन फाइबर आकृति विज्ञान के विभिंन उपचार की स्थिति और नियंत्रण के बीच निर्धारित करने के लिए ।

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Representative Results

थर्मल विकार तापमान (Tm) एक परख विधि के रूप में TXL पार-प्रभाव जोड़ने का मूल्यांकन करने के लिए: खरगोश आंखों के 16 जोड़े की कुल TXL प्रक्रिया के लिए इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया । इस अध्ययन के एक प्रारंभिक भाग के रूप में, cadaveric खरगोश के सिर में सेंट अंतरिक्ष के माध्यम से एके पार से जोड़ने एजेंट के एक इंजेक्शन द्वारा प्रेरित पार जोड़ने प्रभाव का स्थानीयकरण मूल्यांकन किया गया था । प्रयोग के इस प्रकार के रोगियों के नैदानिक उपचार के लिए प्रासंगिकता है, एक से अधिक स्थानों में इंजेक्शन के बाद से श्वेतपटल के एक वांछित क्षेत्र को स्थिर करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।

के रूप में बुनियादी diffusivity सिद्धांतों के आधार पर भविष्यवाणी की जाएगी, प्रभाव के साथ इंजेक्शन की साइट पर सबसे बड़ा था आसंन क्षेत्रों में प्रेरित प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से, समाधान की एकाग्रता पर निर्भर करता है । चित्र 1a scleral क्षेत्रों के योजनाबद्ध स्थान (1-4 लाल खोखले संख्या फ़ॉन्ट में) का प्रतिनिधित्व करता है (आगे वर्गों में विभाजित (काली पतली संख्या फ़ॉन्ट में 1-16)) कि अलग थर्मल विकार विश्लेषण के साथ एक एकल एसटी इंजेक्शन के बाद से गुजरा रंग मानचित्रण सूचकांक । तालिका 1 इसके संगत नियंत्रण की तुलना में प्रत्येक क्रमांकित सेक्टर के लिए Tm मान में परिवर्तन दिखाता है । मान दोनों ४० mm और ४०० mm इंजेक्शन के लिए शामिल किए गए हैं और मानक त्रुटि माध्य के तीन स्वतंत्र निर्धारणों की एक न्यूनतम के लिए गणना शामिल हैं ।

आंकड़े 1b-C 47, ४० mm (आंकड़ा 1b) और ४०० mm (चित्रा 1C) के दो अलग सांद्रता का उपयोग परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं । चित्रा 1bमें, कम एकाग्रता ४० mM नमूना Tm में एक हल्के बदलाव जो वर्ग 2 (इंजेक्शन साइट) में उल्लेख किया गया था दिखाया । इसी तरह के बदलाव से सटे चौकों 1 और 3 (हल्का नीला) में देखा गया । सीमांत पाली चौकों में देखा जाता है 4 से 6 और 7 से 9 सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेदों के बिना इंजेक्शन वर्ग से । कोई Tm शिफ्ट कम चौकों में 14 से 16 है, जो सबसे दूर क्षेत्र का प्रतिनिधित्व किया इंजेक्शन साइट से दूर देखा गया था ।

के रूप में चित्रा 1Cमें दिखाया गया है, उच्च एकाग्रता (४०० mM) एक सांख्यिकीय अत्यधिक महत्वपूर्ण पार से जोड़ने प्रभाव था (नारंगी रंग के रूप में संकेत दिया) । संबद्ध छोटे मानक विचलन और p < ०.०५ के साथ Tm में एक बड़ा बदलाव देखा गया था, कम ४० mm एकाग्रता की तुलना में ४०० mm के प्रभाव में एक बड़ा अंतर को प्रतिबिंबित । सबसे नाटकीय प्रभाव सेक्टर 1 में ऊपरी ग्लोब में नोट किया गया था । शेष क्षेत्रों के संबंध में, एक कम प्रभाव चौकों में मनाया गया था 10 और 14 (जो पार के कुछ ट्रैकिंग के कारण किया गया है हो सकता है-द्रव पीछे जोड़ने) और चौकों में मनाया गया था कोई प्रभाव 11, 12, 13, 15, और 16. कुल मिलाकर, परस्पर जोड़ने के प्रभाव 2 क्षेत्रों में सीमांत थे और 3 कोई प्रभाव के साथ सेक्टर 4 में मनाया (यानी, इंजेक्शन साइट से सबसे दूर स्थान), ४० mM नमूना के समान । इन परिणामों का संकेत दिया है कि वहां एक ' ' प्रभाव के क्षेत्र ' ' था और पैटर्न के इस प्रकार के पार की एक एसटी इंजेक्शन एजेंट को जोड़ने के बाद की उंमीद की जा सकती है । यह ऊतक के एक विस्तृत क्षेत्र पर प्रभाव पैदा करने के क्रम में कई स्थानों में इंजेक्शन के लिए की जरूरत का संकेत सकता है ।

पार के अध्ययन बरकरार आंखों में प्रेरित 47 के दो सांद्रता के साथ TXL का मूल्यांकन प्रभाव को जोड़ने का भी प्रदर्शन किया गया । ऊतक के थर्मल विकार विश्लेषण है कि इस तरह के scleral पार से गुजर-जोड़ने किया गया था । क्रॉस-लिंकिंग समय तीन अलग सांद्रता, ४० (tm = 1.11 +/-1.2), १०० (tm = 5.12 +/-2.9), और ४०० (tm = 14.34 +/-1.1) mM 47 का उपयोग कर TXL के लिए ३.५ ज था । परिणाम से पता चला कि वहां एक एकाग्रता निर्भर एके 47 पार से जुड़े ऊतक में देखा प्रभाव है ।

दूसरी सुरीले पीढ़ी (स्वसहायता समूहों) एक विधि के रूप में TXL पार प्रभाव जोड़ने का मूल्यांकन करने के लिए इमेजिंग:

स्वसहायता समूहों सूक्ष्म चित्र स्वसहायता समूहों के संकेत और फाइबर बंडल waviness के पिक्सेल तीव्रता के लिए दोनों का विश्लेषण किया गया । पार की एक विस्तृत अवधि (४० से ४०० मिमी) सांद्रता को जोड़ने के क्रम में स्वसहायता समूहों संकेत परिवर्तन है कि पार से जोड़ने के प्रभाव की एक विस्तृत श्रृंखला पर हो सकता है का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हिस्टोग्राम विश्लेषण क्षमता का उपयोग करते हुए फिजी छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम में शामिल20, यह quantitate के लिए संभव था स्वसहायता समूहों द्वारा scleral ऊतक में उत्पादित संकेत सेंट इंजेक्शन, ४०० मिमी का उपयोग कर प्रेरित उन लोगों के लिए ४० mm पर प्रभाव की तुलना. ४० mm पर माध्य पिक्सेल intesities में औसत अंतर २८.३ mm नमूनों के लिए ३६१.४ ± ४०० की तुलना में ६६.३ ± २७.७ थे, करीब 6 गुना वृद्धि हुई है । यह ऊतक पार में वृद्धि के साथ मेल खाती है, से जोड़ने, Tm में इसी वृद्धि के बाद भी इन शर्तों के तहत उल्लेख किया गया । चित्रा 2 नियंत्रण से लिया श्वेतपटल के प्रतिनिधि स्वसहायता समूहों छवियों से पता चलता है (चित्रा 2a), ४० मिमी (चित्रा 2 बी), और ४०० मिमी (चित्रा 2c). साथ हिस्टोग्राम विश्लेषण, मतलब चमक सहित (या पिक्सेल तीव्रता) भी दिखाया गया है । विश्लेषण छवियों की कुल संख्या थी: ४० mM और ९८ के लिए १२० इसके नियंत्रण के लिए; १२१ अपने स्वयं के नियंत्रण के लिए ४०० मिमी और ९४ के लिए । टिशू इमेजिंग की गहराई episcleral सतह से 10 से 15 µm थी । हिस्टोग्राम विश्लेषण का परिणाम है, जो कई छवि क्षेत्रों के औसत शामिल है, संकेत दिया है कि पार के उच्च सांद्रता प्रभाव जोड़ने (चित्रा 3) अधिक पिक्सेल तीव्रता का उत्पादन किया ।

के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है, एक छवि विश्लेषण भी हृदय रक्त वाहिका साहित्य से अपनाया तरीकों के साथ प्रदर्शन किया गया था, ImageJ प्लगइन का उपयोग ' 'ंयूरॉन J' '21। हम waviness फैक्टर का अनुमान = लंबाई [वक्र]/Length [रैखिक] और हमने देखा कि पार से जोड़ने फाइबर बंडलों के सीधे परिणाम के रूप में ४० mm और ४०० mm पार से जुड़े श्वेतपटल बनाम अनुपचारित नियंत्रण श्वेतपटल में एक घटी हुई waviness% द्वारा संकेत (डब्ल्यू% = (डब्ल्यू [ 47]-1)/(W [नियंत्रण]-1), तालिका 2) । ४० और ४०० mM 47 इलाज नमूनों के बीच waviness में अंतर सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं था ।

Figure 1
चित्र 1 : sT इंजेक्शन के माध्यम से TXL प्रभाव का स्थानीयकरण ४० और ४०० mM 47 का उपयोग कर ।
(क) 4 scleral क्षेत्रों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (संख्या 1-4 बड़े लाल खोखले फ़ॉंट में), चौकों में विभाजित श्वेतपटल के साथ [संख्या 1-16 छोटे काले पतली फ़ॉंट में] (नहीं पैमाने पर तैयार) कि थर्मल विश्लेषण से गुजरा । इंजेक्शन साइट सेक्टर 1 में स्थित केंद्र (स्क्वायर 2) से मेल खाती है । थर्मल विकार क्रॉस जोड़ने TXL के प्रभाव के साथ (1b) ४० mM 47 और (1C) 400mM 47 । (घ) रंग (ख) और (ग)के लिए तापमान स्केल लीजेंड कोडित । यह आंकड़ा Zyablitskaya एट अल से22अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : श्वेतपटल के एसटी इंजेक्शन के माध्यम से TXL का उपयोग कर निम्नलिखित उत्पादित स्वसहायता समूहों संकेत चमक स्तर में एकाग्रता निर्भर बढ़ जाती है की प्रतिनिधि छवियों पूर्व वीवो . एके 47 की सांद्रता (ख) 40 मिमी और (ग) 400mM के रूप में दिखाया जाता है । प्रत्येक छवि एक ५० µm पैमाने पर पट्टी (सही निचले कोने) और मतलब पिक्सेल तीव्रता मूल्य (सही ऊपरी कोने)-निरपेक्ष मूल्यों शामिल हैं । यह आंकड़ा Zyablitskaya एट अल से22अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : परिवर्तन के बार चार्ट (Δ) स्वसहायता समूहों में संकेत पिक्सेल तीव्रता (के रूप में एक ही खरगोश सिर से एक बनती नियंत्रण की तुलना में) scleral बरकरार globes पार-sT इंजेक्शन के माध्यम से जुड़े (TXL) ४० और ४०० mM 47 समाधान के साथ । माध्य के मानक त्रुटि के साथ औसत मान थे: ४० मिमी के लिए ६६ ± २७.७ और ३६१ ± २८.३ के लिए ४०० मिमी । यह आंकड़ा Zyablitskaya एट अल से22अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : फाइबर waviness विश्लेषण का उदाहरण (रैखिकता द्वारा व्यक्त के रूप में). एक ५० µm पैमाने पर पट्टी (सही निचले कोने) के साथ ४० mM-47 एकाग्रता के लिए नियंत्रण के नमूने की छवि । यह आंकड़ा Zyablitskaya एट अलसे संशोधित किया गया है । अनुमति के साथ22। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : अनुसूचित जनजाति इंजेक्शन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । 1-3 क्रमांकित क्षेत्र चित्र 1aमें दर्शाए गए क्षेत्रों के अनुरूप हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

± Δ Tm
क्षेत्र 40mm 400mm
1 ३.४ ± २.८ २०.५ ± ०.६
2 ३.४ ± ०.५३ १९.५८ ± १.५
3 २.५ ± २.४७ १७.९९ ± ३.०६
4 ०.७२ ± ०.९ २०.३६ ± ०.१९
5 ०.८५ ± ०.५५ १९.११ ± १.३३
6 ०.५२ ± १.३५ १८.६६ ± ४.१
7 ०.७८ ± १.६ १८.४४ ± २.८
8 ०.५६ ± ०.९ १७.७७ ± २.६९
9 ०.२२ ± ०.६ १८.९२ ± २.६
10 ०.४६ ± 0 ८.७५ ± १०.५६
11 ०.४७ ± ०.१८ ०.६३ ± १.८४
12 ०.११ ± ०.०८ ०.६६ ± १.५२
13 ०.०८ ± ०.०५ ०.७१ ± २.१७
14 ०.२२ ± ०.७ ५.७१ ± ०.२९
15 ०.३२ ± ०.२ ०.२९ ± ०.७
16 ०.२४ ± ०.७३ ०.२६ ± ०.७९

तालिका 1: TXL प्रभाव अध्ययन के स्थानीयकरण के लिए DSC परिणाम । प्रत्येक नमूना क्षेत्र के लिए मानक त्रुटियों के साथ थर्मल पिघलने तापमान (ΔTm) में परिवर्तन के रूप में चित्र 1aमें दिखाया गया है । प्रत्येक मान अपने युग्मित नियंत्रण के लिए Tm ascompared में अंतर के रूप में व्यक्त की है और 3 स्वतंत्र निर्धारणों की एक ंयूनतम के एक औसत है ।

47, मिमी Waviness Waviness-% टी-टेस्ट बनाम [0 mM 47]
0 १.१०६ ± ०.०४४ १००
४० १.०६७ ± ०.०१७ ६३ p < ०.०२
४०० १.०५९ ± ०.००९ ५५ p < ०.००३
रैखिक फाइबर १.००० 0
सैद्धांतिक)

तालिका 2. फाइबर waviness विश्लेषण के परिणाम । TXL इंजेक्शन के क्षेत्र से स्वसहायता समूहों फाइबर waviness की डिग्री के लिए विश्लेषण किया गया ंयूरॉन जंमू सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । दस फाइबर प्रत्येक छवि से चयन किया गया और लगभग १०० फाइबर की कुल waviness की डिग्री के लिए विश्लेषण किया गया. माध्य की मानक त्रुटि के साथ औसत मान शामिल हैं ।

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Discussion

आयोजित प्रयोगों सबूत स्वसहायता के मूल्यांकन के लिए एक विधि के रूप में संकेत माइक्रोस्कोपी के उपयोग का समर्थन करते हुए दिखाया गया है श्वेतपटल में प्रभाव को जोड़ने, पार के लिए एक निगरानी उपकरण के रूप में इस तकनीक का उपयोग कर के भविष्य की संभावना स्थापना-उपचार को जोड़ने कि लक्ष्य कोलेजन प्रोटीन । नोट की, एक उपकरण पहले से ही नैदानिक उपयोग में है कि संभवतः इस स्वसहायता समूहों के संकेत पर कब्जा कर सकते हैं । हालांकि इस उपकरण मुख्य रूप से इमेजिंग त्वचा मानव dermis के लिए बनाया गया था, यह छवि कॉर्निया और श्वेतपटल23के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है ।

यह नियंत्रण और उपचारित नमूनों की तुलना करते समय समान स्कैनिंग और इमेजिंग शर्तों को बनाए रखने के लिए आवश्यक है । श्वेतपटल ऊतक में कोलेजन की दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी माइक्रोस्कोपी मल्टी-फोटॉन इमेजिंग, 800-900 एनएम तरंग दैर्ध्य रेंज में एक स्पंदित अवरक्त लेजर स्वरित्र के साथ संगत एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है, और ऐसे GaAsP के रूप में एक अति संवेदनशील डिटेक्टर गैर-स्कैन (NDD) डिटेक्टरों । इस पांडुलिपि में वर्णित दिशानिर्देश एक प्रारंभिक बिंदु हैं । शर्तों विशेष रूप से नए प्रयोगों के लिए या विभिंन प्रणालियों के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए ।

कॉर्निया और श्वेतपटल भी अध्ययन में समवर्ती मूल्यांकन किया गया है इस तकनीक का उपयोग कर24,25,26,27। जानते हुए भी कि स्वसहायता समूहों के संकेत आगे और पीछे दोनों दिशाओं में प्रचार, कई अध्ययनों से स्वतंत्र रूप से अपने मूल राज्य में corneal ऊतक की जांच की है28,29,30,31, ३२,३३,३४ और keratoconus में३५,३६ के रूप में अच्छी तरह से निंनलिखित CXL (नीचे चर्चा के रूप में) । इन अध्ययनों के परिणाम संकेत मिलता है कि corneal संकेत आगे बिखरे हुए दिशा में अनुकूलित है, जो समझ में आता है कॉर्निया पारदर्शिता और तथ्य यह है कि प्रकाश ऊतक के माध्यम से गुजरता को आगे बिखरे हुए सिस्टम में एक निगरानी हड़ताल दिया । आमतौर पर, स्वसहायता संकेत नीले दिखाई रेंज में है और बहुत कम हो जाएगा जब आंख श्वेतपटल की तरह एक अत्यधिक तितर बितर ऊतक के माध्यम से गुजर रहा है । एक परिणाम के रूप में, आगे बिखरे हुए स्वसहायता समूहों की पहचान ५० माइक्रोन या कम मोटाई में, साथ ही साथ एक विशेष ऑप्टिकल सेट अप के ऊतकों की एक पतली अनुभाग की आवश्यकता होगी । इसके विपरीत, वापस बिखरे हुए संकेत ऊतक अनुभाग के बिना एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के नियमित प्रकाश पथ के माध्यम से कब्जा कर लिया जा सकता है और इसलिए इस विधा पसंद है जब इमेजिंग श्वेतपटल ऊतक में 30-40 माइक्रोन की एक गहराई के लिए कोलेजन । इस अध्ययन में, हम संकेत घनत्व में एक एकाग्रता निर्भर वृद्धि नोट किया । यह काफी संभव है, तथापि, कि TXL श्वेतपटल की गहरी परतों पर अतिरिक्त और इसी तरह के प्रभाव पड़ा हो सकता है, और है कि प्रभाव अधिक स्पष्ट किया जा सकता है और विशेष रूप से उच्च एकाग्रता के साथ गहरी परतों को विस्तार । हालांकि, श्वेतपटल में और इस प्रारंभिक अध्ययन के प्रयोजनों के लिए सीमित स्वसहायता संकेत प्रवेश के कारण, हम सबसे अच्छी गुणवत्ता के चित्र है, जो सबसे सतही श्वेतपटल से प्राप्त किया गया के साथ काम करने के लिए चुना (15 µm गहराई) । भविष्य के अध्ययनों में, हम गहराई निर्भर प्रभाव TXL तरीकों के बाद इस पर विचार करेंगे के रूप में क्यों भी अधिक मतभेद ४० और ४०० mM इलाज नमूनों के बीच नहीं देखा गया के रूप में अतिरिक्त महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं ।

इसके अलावा, riboflavin CXL प्रेरित ऊतक पार-जोड़ने के मूल्यांकन के लिए स्वसहायता समूहों के उपयोग के बारे में, स्वसहायता समूह माइक्रोस्कोपी CXL कॉर्निया के riboflavin के बाद कई समूहों द्वारा सूचित किया गया है३७,३८,३९ , ४० , ४१. स्टीवन एट अल द्वारा एक अध्ययन में । ३७, corneal स्थिरीकरण CXL तकनीक का उपयोग कर एक ' ' homogenization ' ' के संकेत और ऊतक के नुकसान ' ' परतों ' ' या ' ' un' ' के परिणामस्वरूप गैर पार से जुड़े नमूनों में देखा । परिवर्तन के इन प्रकार, तथापि, यह भी एक corneal स्वसहायता समूहों के संकेतों पर IOP में परिवर्तन के प्रभाव का मूल्यांकन अध्ययन में उल्लेख किया गया, तकनीकी कलाकृतियों की संभावना स्थापना । फाइब्रिल से संगठन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उच्च क्रम फाइबर बंडल/lamellar संगठन के दृष्टिकोण, श्वेतपटल और कॉर्निया काफी अलग है और बहुत इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन से ऐसे मतभेदों के बारे में जाना जाता है । दो ऊतकों फाइब्रिल पैकिंग, जो फाइब्रिल व्यास वितरण (श्वेतपटल के लिए कॉर्निया और चर व्यास तंतुओं के लिए छोटी सी वर्दी तंतुओं) और अंतर-फाइब्रिल रिक्ति (कॉर्निया और श्वेतपटल के लिए चर के लिए वर्दी) शामिल है के संबंध में अलग । के रूप में अच्छी तरह से, lamellar शीट्स (कॉर्निया) बनाम फाइबर बंडलों (श्वेतपटल) में उच्च क्रम संगठन काफी अलग है । इस तरह के संरचनात्मक मतभेदों को इन दो ऊतकों द्वारा उत्पादित स्वसहायता समूहों संकेतों में परिलक्षित होते हैं । इस प्रकार, पार से प्रेरित परिवर्तन जोड़ने अलग लेकिन समानांतर तरीके में स्वसहायता संकेत बदल सकते हैं । दूसरे शब्दों में, श्वेतपटल में तंतुओं के ' ' सीधे ' ' इस अध्ययन में मनाया, और ' ' homogenization ' ' में संकेत के कॉर्निया साहित्य में रिपोर्ट, दोनों कोलेजन पार से जोड़ने के संशोधन के परिणाम थे । इस प्रकार, कॉर्निया में ' ' homogenization ' ' प्रभाव किसी तरह से ' ' सीधे श्वेतपटल है कि यहां सूचित किया गया है के ' ' सीधा प्रभाव के अनुरूप हो सकता है ।

तंत्र है कि इस सीधे TXL द्वारा उत्पादित प्रभाव में परिणाम स्पष्ट नहीं वर्तमान अध्ययन के आधार पर कर रहे हैं । एक संभावना हो सकती है कि ऊतक किसी तरह ' ' एक यांत्रिक ' ' भरी हुई स्थिति में ' ' फिक्स्ड ' ' । यह धारणा है कि प्रेरित ' ' फाइब्रिल और फाइबर स्थिरीकरण ' ' हुआ था समर्थन करेंगे । intraocular दबाव की संभावना में परिवर्तन के बाद से IOP पर नजर रखी थी और एसटी इंजेक्शन के बाद और स्थिर बनी इस आशय में योगदान नहीं किया । कुल मिलाकर, इन टिप्पणियों का महत्व स्पष्ट नहीं है और आगे की पढ़ाई आवश्यक हो जाएगा । नोट, अलग इमेजिंग तकनीक जैसे Brillouin माइक्रोस्कोपी४२, जो पार के मात्रात्मक उपाय प्रदान करने के लिए दिखाया गया है जोड़ने (के रूप में कतरनी मापांक द्वारा निर्धारित) निम्नलिखित CXL photochemistry स्वसहायता समूहों के साथ निष्कर्षों की पुष्टि करने में उपयोगी हो सकता है इस अध्ययन में इमेजिंग । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि श्वेतपटल४३के रूप में अत्यधिक तितर बितर ऊतकों के साथ इसके उपयोग, तकनीकी संशोधनों की आवश्यकता है और पार से जुड़े scleral ऊतक के साथ मांय नहीं किया गया है ।

लेजर ध्रुवीकरण और स्वसहायता माइक्रोस्कोपी एक महत्वपूर्ण मुद्दा है । लेजर प्रकाश रैखिक ध्रुवीकरण और एसएचजी संकेत प्रसार की दिशा के लिए सीधा उन्मुख है और xy में कुछ कोण पर प्रत्येक कोलेजन फाइबर के लिए विमान. इस प्रकार, xy में फाइबर-विमान है कि अच्छी तरह से गठबंधन कर रहे है और बिल्कुल सीधा ध्रुवीकरण प्रकाश के लिए, अंय कोणों पर उन की तुलना में एक उच्च स्वसहायता समूहों के संकेत का उत्पादन होगा, घटना प्रकाश (यानी, z-विमान), जो उत्पादन करेगा के लिए समानांतर सहित निंनतम स्वसहायता संकेत (विनाशकारी हस्तक्षेप के कारण) । श्वेतपटल ऊतक के संबंध में, कोलेजन फाइबर एक सूक्ष्म स्तर पर विभिन्न कोणों पर उन्मुख कर रहे हैं, हालांकि पसंदीदा शारीरिक फाइबर झुकाव ग्लोब स्थान के आधार पर मौजूद करने के लिए जाना जाता है. इस प्रकार, के बाद से स्वसहायता समूहों के संकेत का उत्पादन xy-प्रत्येक फाइबर के विमान कोण के आधार पर भिंन होगा, समग्र संकेत है कि जो उत्पादन किया जाएगा से कम होगा अगर सभी कोलेजन फाइबर बिल्कुल एक ही कोण पर गठबंधन (एक ऊतक में थे जैसे एक पट्टा के रूप में , उदाहरण के लिए) । इस प्रकार, इस अध्ययन में, नमूना छवि की जा रही प्रकृति के कारण, ध्रुवीकरण की दिशा जानबूझकर निर्धारित नहीं था, लेकिन अध्ययन भर में लगातार रखा गया था । इसके अलावा, हम इलाज और नियंत्रण globes से समान scleral क्षेत्रों से ऊतकों को प्राप्त करने के लिए ध्यान रखा, नमूनों के बीच फाइबर अभिविन्यास में किसी भी मतभेद को कम करने. अंत में, हम नमूना प्रति १०० छवियों पर विश्लेषण के क्रम में तीव्रता मूल्यों को प्राप्त करने के लिए । यह व्यापक मूल्यांकन किसी भी ंयायपालिका स्वसहायता समूहों संकेत है कि पंजीकृत किया गया है हो सकता है सामान्यीकृत किया जाना चाहिए । यह कहा जा रहा है, यह संभव है कि "फाइबर सीधे" कि हम पार से जुड़े नमूनों में मनाया का एक परिणाम के रूप में (ऊपर वर्णित), फोकल विमान में "का एक बड़ा अनुपात" तंतुओं स्वसहायता समूहों में वृद्धि के लिए योगदान हो सकता है संकेत के रूप में अच्छी तरह के रूप में वृद्धि हुई अधिक से अधिक xy-विमान संरेखण से स्वसहायता समूहों का संकेत है । इन संभावनाओं के दोनों प्रेरित पार-प्रभाव को जोड़ने की अभिव्यक्ति होगी ।

पार के एक क्षेत्रीय विश्लेषण परिवर्तन जोड़ने (टीएम द्वारा) के एक sT इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था । जैसा कि उंमीद थी, पार के स्तर को जोड़ने प्रभाव इंजेक्शन के क्षेत्र में केंद्रित था । कम या कोई पार से जोड़ने प्रभाव सीधे विपरीत क्षेत्र में नोट किया गया था (दूर दूर) इंजेक्शन से, क्या प्रभाव के स्थानीयकरण के बारे में जाना जाता है के साथ संगत के रूप में अनुसूचित जनजाति इंजेक्शन के रूप में अल्ट्रासाउंड स्थानीयकरण द्वारा दिखाया गया४४, ४५ और गणना टोमोग्राफी४६।

अंत में, के बारे में पार से जोड़ने चिकित्सा और निकट दृष्टि, कोलेजन पार-कॉर्निया के जोड़ने keratoconus, पोस्ट LASIK keratectasias, pellucid सीमांत अध: पतन (PMD) सहित corneal स्थिरीकरण के उपचार में व्यापक उपयोग मिल रहा है, और के रूप में एक अपवर्तन शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को सहायक४७. पार से जोड़ने के साथ corneal रोग के इलाज की सफलता आंख के पीछे करने के लिए इस उपचार के दृष्टिकोण को लागू करने की खोज के लिए नेतृत्व किया है और, विशेष रूप से, श्वेतपटल, उच्च अदूरदर्शिता2में अक्षीय बढ़ाव को सीमित करने के लिए, एक अवधारणा है कि वापस चला जाता है चिकित्सकीय पार से बहुत जल्द चरणों को जोड़ने की अवधारणा४८,४९।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक Tongalp Tezel, एमडी, सेंट इंजेक्शन के बारे में परामर्श के लिए धंयवाद; Theresa Swayne, पीएचडी, स्वसहायता समूहों माइक्रोस्कोपी के बारे में परामर्श के लिए; और जिमी दुओंग से डिजाइन और जैव सांख्यिकी संसाधन और कोलंबिया विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर में Irving संस्थान के जैव सांख्यिकीय कोर सुविधा ।

अंधापन को रोकने के लिए अनुसंधान द्वारा भाग में समर्थित और स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा NCRR UL1RR024156, नेि P30 EY019007, NCI P30 CA013696, और नेि R01EY020495 (डीसीपी) । कोलंबिया विश्वविद्यालय से संबंधित बौद्धिक संपदा के मालिक: अमेरिका पेटेंट जारी नहीं: ८,४६६,२०३ और नहीं: ९,१२५,८५६ । अंतरराष्ट्रीय पेटेंट लंबित: पीसीटी/US2015/020276.

चित्र हर्बर्ट Irving व्यापक कोलंबिया विश्वविद्यालय में कैंसर केंद्र, NIH अनुदान #P30 CA013696 (राष्ट्रीय कैंसर संस्थान) द्वारा समर्थित के फोकल और विशेष माइक्रोस्कोपी साझा संसाधन में एकत्र किए गए । इस फोकल माइक्रोस्कोप को NIH ग्रांट #S10 RR025686 के साथ खरीदा गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V EMD Millipore, Massachusetts, USA Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate  Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe BD Eclipse, NJ, USA Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1
Rabbit head La Granja poultry Outbred Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2
Tono-pen  Reichter Technologies Depew, NY IOP measurements - protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler Perkin-Elmer Waltham, MA, USA Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4
Pyris software  Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA Ver 11.0  protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP Nikon Instruments, Melville, NY, USA A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.
GenTeal  Alcon, Fort Worth, TX  B000URVDQ8 Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II  Coherent, Santa Clara,CA, USA Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber Thermo Fisher Scientific Inc A7816 Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5 Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA GG-25-1.5 protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E Nikon Instruments, Melville, NY, USA protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector Nikon Instruments, Melville, NY, USA Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system Nikon Instruments, Melville, NY, USA Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8
NIS Elements software Nikon Instruments, Melville, NY, USA Ver 4.3 refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ National Institute of Health  protocol step 9.1.2
NeuronJ Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel  Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA Ver 14 protocol step 9.2.8

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दवा मुद्दा १३१ सोडियम hydroxymethylglycinate ऊतक पार से जोड़ने उच्च अदूरदर्शिता श्वेतपटल दूसरी सुरीले पीढ़ी संकेत थर्मल विकार तापमान अवकलन स्कैनिंग calorimetry खरगोश आंखें
दूसरे चिकित्सीय ऊतक के मूल्यांकन के लिए एक उपकरण के रूप में खरगोश श्वेतपटल में दूसरी सुरीले पीढ़ी संकेतों को पार से जोड़ने (TXL) निकट दृष्टि के लिए
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Zyablitskaya, M., Munteanu, E. L., Nagasaki, T., Paik, D. C. Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia. J. Vis. Exp. (131), e56385, doi:10.3791/56385 (2018).

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