Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Omfattende protokol til prøven og proces knoglemarven til at måle målbare Residual sygdom og Leukemic stamceller i akut Myeloid leukæmi

Published: March 5, 2018 doi: 10.3791/56386
Automatic Translation
*1,2, *3, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2,4, 1, 3, 1
1Department of Hematology, VU University Medical Center, 2Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 3Janssen Research & Development, LLC, 4Princess Máxima Center for Pediatric Oncology
* These authors contributed equally

Summary

Påvisning af minimal eller målelige residual sygdom (MRD) er en vigtig prognostiske biomarkør for raffinering risikovurdering og forudsige tilbagefald i akut myeloid leukæmi (AML). Disse omfattende retningslinjer og anbefalinger med bedste praksis for konsekvente og nøjagtige identifikation og detektion af MRD, kan støtte effektive AML behandling beslutninger.

Abstract

Svar kriterier i akut myeloid leukæmi (AML) er for nylig blevet genoprettet, med morfologiske undersøgelse udnyttet til at bestemme, om patienterne har opnået komplet remission (CR). Cirka vil halvdelen af de voksne patienter, som er indrejst CR tilbagefald indenfor 12 måneder på grund af udkommet af resterende AML celler i knoglemarven. Kvantitering af disse resterende leukæmiceller, kendt som minimal eller målelige residual sygdom (MRD), kan være en solid biomarkør for forudsigelse af disse tilbagefald. Retrospektiv analyse af flere undersøgelser har desuden vist, at tilstedeværelsen af MRD i knoglemarven af AML patienter korrelerer med dårlig overlevelse. Ikke alene er den samlede leukemic befolkning, afspejles af celler husly en leukæmi forbundet immun-fænotype (LAIP), forbundet med kliniske resultater, men så er de umodne lavfrekvente delpopulation af leukæmi stamceller (LSC), som begge kan være overvåget gennem flowcytometri MRD eller MRD-lignende metoder. Tilgængeligheden af følsomme assays, der muliggør påvisning af resterende leukæmiceller (stem) på grundlag af sygdoms-specifikke eller sygdom-associerede funktioner (unormal molekylære markører eller afvigende immunophenotypes) har drastisk forbedret MRD vurdering i AML. Men i betragtning af de iboende heterogenitet og kompleksiteten af AML som en sygdom, metoder til prøveudtagning knoglemarven og udføre MRD og LSC analyse bør harmoniseres når det er muligt. I dette manuskript vi beskrive en detaljeret metode til passende knoglemarvspunktat prøveudtagning, transport, prøve behandling for optimal flerfarvet flow flowcytometri vurdering, og gating strategier for at vurdere MRD og LSC til støtte i terapeutiske beslutningstagning for AML patienter.

Introduction

Akut myeloid leukæmi (AML) er en malignitet i knoglemarven karakteriseret ved defekter i programmet modning med unormale spredning og ophobning af myeloide stamceller, hæmning af normale bloddannelsen, og i sidste ende knoglemarv svigt . Sygdommen er yderst heterogene morfologi, immunophenotype, cytogenetisk, Molekylær aberrationer og gen expression underskrifter samt behandlingsrespons og behandling resultatet1,2. Nuværende ledelse omfatter induktion kemoterapi med formålet at opnå komplet remission (CR), efterfulgt af efter remission behandling, som er i vid udstrækning styret af resultaterne af molekylære, cytogenetisk og immunophenotypic undersøgelser og består af enten flere kurser for yderligere kemoterapi eller (autologe eller allogene) stamcelle transplantation3. Trods høje remission satser efter intensiv kemoterapi i op til 90%, 5-års overlevelsen hos voksne er kun ca 30-40%, overvejende på grund af udviklingen af relapses, som er almindeligt resistente over for kemoterapi og dermed meget vanskelige at behandle. Resultatet i børn er bedre, selv om ca. en tredjedel også tilbagefald. Derfor, tidlig påvisning af overhængende tilbagefald vil udfylde et udækket medicinsk behov og kan lede efter remission terapi4.

Residual sygdom efter terapi kan afspejle summen af alle diagnose og efter diagnose modstand mekanismer/faktorer; Derfor kan dens måling være prognostiske og medvirkende til at lede behandling. Muligheden for defining residual sygdom (tidligere kaldet minimal residual sygdom og nu omhandlet som målelige residual sygdom eller MRD) langt under det morfologiske kriterium 5% blast celler er skiftende landskab af risiko classification. De to metoder for det meste bruges til at registrere MRD i øjeblikket flow flowcytometri-baserede og molekylær-baserede, sidstnævnte vil blive vurderet af reverse transkriptase PCR (RT-qPCR)5 eller selv i en tidlig fase af næste generation sequencing (NGS). Mange undersøgelser hos voksne såvel som børn vist allerede, at forskellige MRD tilgange giver stærke prognostiske oplysninger i AML både efter induktion og konsolidering terapi6,7, og en ny definition af sygdom byrde ( overlegen i forhold til morfologiske CR) er nu fremstår8. Dette tyder på, at MRD vurderet af flow og/eller molekylærbiologiske teknikker skal blive, og i virkeligheden er allerede ved at blive, standard i alle kliniske forsøg med AML.

Dette manuskript beskrives detaljeret flow flowcytometri procedure for at opnå en nøjagtig og reproducerbar immunophenotypic karakterisering af MRD i knoglemarven prøver, herunder knoglemarv prøveudtagning og behandlingen procedurer forud flowcytometri. Tilgængeligheden af god kvalitet knoglemarv prøver på diagnose og opfølgning er afgørende for succes af denne måling på tværs af kliniske websteder og kliniske forsøg. I virkeligheden, er disse pre analytiske overvejelser også af vital betydning for Molekylær (PCR og NGS) MRD tilgange. Immunophenotypic karakterisering af MRD kombineres anderledes udtrykt markører med normal myeloid og stamfader markører, til at identificere en leukæmi-associerede immunophenotype (LAIP)9. MRD måler resulterende af mange faktorer, der påvirker svar til terapi, som iboende eller erhvervede leukæmi medicinresistens, farmakodynamik og kinetik af terapi, immun overvågning og overholdelse. MRD er derfor en meget stærk efter diagnose prognostiske parameter tilknyttet klinisk resultat når dichotomized på en cut-off niveau bestemt af modtageren af drift karakteristiske (ROC) analyse. Vores voksen AML kohorte af HOVON 42a undersøgelse, cut-off er indstillet på 0,1% af LAIP positive celler/samlede hvide blodlegemer. Brug dette kriterium til bestemmelse af negative vs positive MRD status, kan en gruppe af patienter identificeres som har et betydeligt forværret relapse forekomsten, tilbagefald-omkostningsfrit og samlet overlevelse6. Derudover beskriver vi måling af umodne, resistente leukæmiceller med stamcelle-lignende funktioner (CD34 + CD38-leukæmi stamceller, eller LSC), som tilbyder en stærk prædiktor af patienten resultat10. Sammen LAIP og LSC tilgange form flow cytometric MRD tilgang. LAIP tilgangen er velegnet til ca 90% af patienterne, mens LSC tilgang kan anvendes i omkring 80% af patienterne. Sammen over 95% af patienterne kan evalueres for enten en parameter eller begge dele.

Endelig, denne publikation indeholder en detaljeret operationelle beskrivelse for at vurdere MRD ved flowcytometri. Dette omfatter: 1) harmonisering og/eller standardisering af knoglemarven prøveudtagningsprocedurer, 2) prøven transport vejledning 3) detaljeret beskrivelse af leukemic celle påvisning med FACS ved hjælp af flere antistof paneler herunder enkelt celle tube tilgange at karakterisere LSC, 4) set-up af FACS maskiner for standardiserede målinger, 5) analytiske programmer for MRD målinger og 6) analytiske programmer for LSC påvisning.

Vi tilstræber at vise alle facetter af proceduren herunder for prøveforberedelse, da der diskuteres sjældent, mens det er vigtigt for kvaliteten af det endelige resultat. Knoglemarvstransplantation aspiration og biopsi er kliniske procedurer, der anvendes til at evaluere den hæmatopoietisk celler i knoglemarven. Disse udføres sammen med en komplet blodtælling (CBC) og blod smear. Den optimale metode for knoglemarvstransplantation aspiration er afgørende for præcis diagnose og opfølgning for MRD måling. En vellykket knoglemarvspunktat indeholder derudover bør nok celler for at udføre LAIP, og LSC flow analyse (mindst 10 millioner levedygtige celler). Her beskriver vi metoden for at udføre en knoglemarvstransplantation aspiration og give retningslinjer, som bør resultere i passende celle prøveudtagning (og begrænse mulighederne for blodfortynding) behov for præcis diagnose og yderligere forskning. Disse præ analytiske overvejelser er også af vital betydning for Molekylær (PCR og NGS) MRD tilgange. Alle prøver for Immunofænotypning skal behandles fortrinsvis inden for 24 timer af samling. Selv om ikke anbefalelsesværdig, kan knoglemarv og perifert blodprøver stadig være behandlet og analyseret når der holdes op til 72 timer ved stuetemperatur. Derudover skal alle handlings med materialet udføres under sterile forhold, således at kryopræservering af sterile celler for senere forskning/kvalitetsvurdering etc.

Protocol

Protokollen følger retningslinjerne i koden forskning og videnskabsetisk Komité for VU University Medical Center.

1. knoglemarven aspiration og prøve forberedelse

  1. Patient og materielle forberedelse
    1. Udfyld en eller to 10 mL sprøjter med 1% lidocain ved hjælp af en 16-gauge kanyle. Erstatte nål til en 21-gauge kanyle.
    2. Sat to dråber 5% EDTA på et urglas.
    3. Opsætning af glas dias (n = 15 med konsekvent patient nummerering og dato) for smøre præparater.
    4. Placer patienten i laterale decubitus holdning. Find posterior superior iliaca rygsøjlen og markere med pen.
      Bemærk: I almindelighed, posterior superior iliaca rygsøjlen er beliggende dels bredde distalt for crista crest og dels bredde lateral til midterlinjen. Hos kvinder, kan den faktiske rygsøjlen være en smule mere laterale, i nogle lidt mere mediale mænd.
    5. Desinficere huden med klorhexidin 0,5-1% i ethanol fra den planlagte biopsi område udad i cirkler.
    6. Lukke op pakken sterile handsker, sat på de sterile handsker og fastsætte pakke på bordet for at oprette et sterilt felt. Åbn pakken med aspiration nålen og placere det på det sterile felt.
    7. Infiltrere hud og subkutane væv og endelig periosteum. På periosteum, administrere lidokain på en sådan måde, at et areal på 1 cm i diameter har været bedøvede.
      Bemærk: Tilstrækkelig forvaltning af lidocain at periosteum er en af de vigtigste faktorer for patientens komfort. Teste, om periosteum har været tilstrækkeligt bedøvede ved at trykke den planlagte biopsi placering med indførte nålen og spørge, hvis patienten føler nogen smerte. Note: børn er fuldt bedøvede under hele proceduren.
    8. Hold aspirat nål (15 Ga x 2,8") med den proksimale ende i palm og pegefinger mod siden af den nål metal skaft nær spidsen; denne stilling giver bedre kontrol.
    9. Indføre nål med en roterende bevægelse (af hurtigt skiftende Curveball/supinating bevægelse) gennem huden mod iliaca rygsøjlen og bringe nålen i kontakt med den bageste iliaca rygsøjlen.
    10. Sikre at nålen er introduceret til området bedøvede af periosteum; patienten skal føle kun pres og ingen smerter. Hvis patienten føler smerte, enten flytte nålen, eller administrere flere lidocain.
    11. Med blid, men fast tryk, forhånd nålen mens dreje det i en vekslende med uret-counter uret bevægelse. Indgangen ind i marv hulrum er generelt fundet ved nedsat modstand.
    12. Fjern stylet fra nålen. Vedhæfte en 10 mL tomme sprøjte til nålen.
    13. Anvende undertryk ved tilbagetrækning sprøjte stemplet med en blid trække. Advar patienten, at de kan føle en kramper fornemmelse og smerter, når marv er indsugning. Hvis ikke nok knoglemarv knoglesplinter er frigivet, bør en anden aspiration udføres med en hurtig uafgjort. De fleste knoglesplinter bliver i de første 1-2 mL fremstillet af de oprindelige træk. Opsug kun 1-2 mL for at undgå fortynding af prøven.
      Bemærk: Fortynding vil resultere i blodfortynding og kan forvirre MRD resultater).
    14. Fjern sprøjten og erstatte stylet i aspiration nålen. Skubbe en del af marven i et urglas og resten i en 8 mL tube belagt med heparin.
      Bemærk: Invertere hver tube umiddelbart efter markedsføring marv aspirat ind i modellen røret at sikre passende antikoagulation. Knoglemarven koagulation er ofte årsag til upassende materiale. Yderligere knoglemarv kan være aspireres fra det samme sted, men helst, nålen er avanceret 5-10 mm, før en ny aspirat er taget. Helst bør ikke mere end 2 trækker per indsættelse niveau tages. Sørg for at markere rør med stigende tal, der repræsenterer først, anden og/eller på hinanden følgende trækker. Det er fælles regel til at bruge den første drage til de mest relevante diagnostiske analyse.
    15. Alternativt, trække nålen fra stedet, indsættelse og genindføre det i marv hulrum et par millimeter fra det oprindelige sted, indsættelse og Gentag proceduren.
      Bemærk: Ikke Opsug mere end 1-2 mL per træk, at undgå betydelig blod kontaminering.
    16. Gentag så ofte som materiale er nødvendig. Når tilstrækkeligt materiale til den specifikke kliniske undersøgelse protokol er indsugning fjerne knoglemarv nålen.
      Bemærk: I tilfælde af langsom eller ellers vanskeligt knoglemarv forhåbninger kan brugen af sprøjter, der blev præ blussende med antikoagulans være nyttige. I tilfælde af en tør tryk, udføre en trephine biopsi, som er omfattet af dette manuskript.
  2. Forberedelse af udstrygningspræparater til morfologiske undersøgelse
    1. For optimal morfologiske vurdering, udvælge knoglesplinter (f.eks. ved hjælp af en plastik spatel) fra aspirat i urglas og placere dem på et glas dias.
    2. Anbring forsigtigt et andet glas dias over dias med marv og forsigtigt glide; undgå ethvert pres.
      Bemærk: Kun i tilfælde af meget store knoglemarv knoglesplinter let kan være pres, for at mindske tykkelsen af celle spredning. Procedure fordelene ved hjælp fra en assistent, der kan håndtere modellen rør. Præcis mærkning af rør med patient nummer og antallet af sekventielle knoglemarv lodtrækningen er afgørende.
    3. Tør diaset grundigt, og derefter udføre kan Giemsa Grünwald farvning (se tabel over materialer). Undersøge under lysmikroskop for morfologi (Se figur 1).
      Bemærk: Figur 1A viser udstrygningspræparater af sunde knoglemarv består af forskellige funktionelle celletyper mens figur 1B en AML patienten med overvejende leukemic eksplosionerne. For at bedre definere de resterende leukemic byrde, skal Immunofænotypning udføres.

2. transport af materiale til videre forarbejdning

  1. Forberedelse af prøverne til transport
    1. For at sikre, at materialet ikke vil lække og rørene ikke vil bryde, sikre korrekt pakning (Se figur 2).
      Bemærk: Fra vores og andre oplevelser levedygtigheden af cellerne er bedst bevaret når knoglemarven opbevares ved stuetemperatur. For langsigtet transport opnås dette bedst ved hjælp af en stuetemperatur 'gel-pack' til støtte i temperatur stabilitet under transit.
    2. Label pakker og tilføje de korrekte former for at undgå tab af pakken, langvarig transport eller skift af patienter.
      Bemærk: Dette skal mindst indeholde: (formular 1) patientdata. Dette bør omfatte undersøgelse antallet og almindeligt 'Fødsel dato'. Afgørende for den rigtige behandling af materialet efter ankomst til den modtagende lab, er en tydelig redegørelse for specifikt anmodet laboratorieanalyse (Molekylær diagnostik, Immunofænotypning, MRD etc.) på denne form. (Skema 2) Adresse og telefon nummer på en kontaktperson, og når nødvendigt, papirer til told. For at undgå at miste pakker med posten, meddeler den afsendende laboratorium altid det modtagende lab, som en prøve er blevet sendt. Brug af "track og trace" anbefales.
  2. Modtager prøver fra andre institutter
    1. Sørg for, at passende logistikken er på plads på instituttet til at modtage prøven i laboratoriet, så snart det er leveret ved Institut.
      Bemærk: For optimal logistiske organisation helst en central laboratoriet er påkrævet, som modtager og indsamler alle materiale fra det lokale klinik og fra eksterne hospitaler. Navnlig er tildeling protokoller for distribution og klar kommunikation med de udøvende laboratorier afgørende.
    2. Efter at have modtaget prøverne, præcist Bemærk den passende nummerering i papirudgave former og en sikret database, der indeholder vigtige områder såsom MRD id-nummer, Trial specifikke id-nummer, Hospital registreringsnummer, sender institute, fødselsdato, materiale type (benmarv eller perifere blod), hvide blodlegemer (WBC), datoen for knoglemarvstransplantation aspiration, datoen for måling af prøven og eventuelle relevante bemærkninger om kvaliteten af målingen.
      Bemærk: Fortrinsvis, denne database er også udstyret til at indeholde supplerende data (eller være knyttet til andre databaser) af analyseresultater og yderligere patientdata som opfølgning data.

3. flow Flowcytometret Setup

Bemærk: Dette afsnit er baseret på Euroflow instruktioner. 11

  1. Oprettet af photomultiplier (PMT) spændinger til FCS SSC parametre og target fluorescens kanaler
    1. For FCS SSC parametre opstart flow Flowcytometret og udføre den "forskellige Setup og Tracking (CST)" køre på flow forskellige med CST perler (se tabel over materialer). Lyse røde blodlegemer fra raske donorer (beskrevet i afsnit 4.1).
      1. Oprette et nyt eksperiment (i menuen: eksperiment, nye eksperimentere, Vælg blindprøve) ved hjælp af producentens software (se tabel over materialer) med en Forward scatter (FSC) versus sidelæns scatter (SSC) dot plot til at konfigurere parametrene FSC og SSC. Navn dette eksperiment FSC/SCC ydelse med datoen. Brug først de aktuelle forskellige indstillinger (højreklik: "Anvend aktuelle CST"). Disse indstillinger er blevet genereret med CST ydeevne kontrol bruge CST-kalibrering perler (se tabel over materialer). Justere FSC og SSC for at visualisere lymfocytter i "globale eksperimentindstillinger". Bemærk: i vores flow Flowcytometret disse er 285 V og 400 V henholdsvis. Afkrydse "Aktiverer erstatning": inspektør/Instrument indstillinger/kompensation.
      2. For at vurdere størrelsen på de celler (FSC) og nøjagtighed (SSC) mængden start måling umærkede perifere blodceller af funktionen "erhverve celler". Gate lymfocytter og justere/ultra-fine-tune FSC og SSC spændinger til at nå følgende gennemsnitlige målværdierne for gated lymfocyt befolkning: FSC: 100.000 (range 95,000-105.000); SSC: 15.000 (range 13.000-17.000).
      3. Erhverve og registrere data ved at måle mindst 10.000 begivenheder. Kontrollere betyder FSC og SSC målværdier for gated lymfocytter og re-justere hvis det er nødvendigt.
    2. For at oprette målet fluorescens bruge kanaler ydelse spændinger 8-peak regnbuen perler kalibrering partikler (se tabel over materialer).
      1. Oprette et nyt eksperiment på FACS for 7-toppe. Oprette en regneark "Target gennemsnitlige fluorescerende intensitet (MFI)" med alle nødvendige dot parceller (n = 2; FSC versus SSC, FITC versus PE), histogrammer (n = 8, et histogram for hvert fluorescens detektor) og statistikker, der viser referencen spidsværdier (MFI og variationskoefficient (CV)) for hver kanal, fluorescens.
      2. Forberede frisk en oploesning indeholdende 1 dråbe (± 60 µL) af regnbuen perler i 1 mL af dH2O. forsigtigt vortex at blande perler i løsning.
      3. Bruge indstillingerne ydelse af FSC/SSC spændinger fra oven og start måling fluorescens af regnbuen perler ved hjælp af funktionen "erhverve" (uden optagelse) på "LOW" strømningshastighed med en tærskel på 5.000. Brug knappen"rektangulære gate" til gate singlet perler befolkning P1 i FSC versus SSC dot plot. Gate 7th PEAK - befolkningen P2 i FITC versus PE dot plot.
      4. Fortsætte erhvervelse af 7-toppe Rainbow perle suspension og justere/ultra-fine-tune ydelse spændinger i alle fluorescens kanaler til at nå målet MFI værdier ifølge kommenteret MFI target kanaler som forsynet med perlerne.
      5. Brug "Post" til at indsamle data for ca. 10.000 begivenheder og kontrollere MFI for de 7th Peak perler. Rette ydelse spændinger, hvis nødvendigt. Når målet MFI værdier for de 7th Peak er nået, post/overskrive filen for de endelige ydelse værdier.
      6. Gemme de endelige ydelse værdier og navngive filen ydelse Setup med den dato, som bliver gemme i kataloget over producentens software. Brug denne ydelse opsætning for at korrigere spill over for hver fluorescens dye.
  2. Fluorescens kompensation indstillinger
    1. Mærke en tube for kontrolelementet unstained og hver fluorokrom konjugeret antistof (se tabel S1 for de anvendte fluorokromer). Der afpipetteres 100 µL af buffer i hver tube.
    2. Vortex hætteglas med flerfarvet kompensation perler (se tabel over materialer) grundigt og derefter tilføje 1 fuld dråbe (± 60 µL) af disse perler til hver tube.
      Bemærk: Undgå dryp perler ned side af røret samtidig tilføjer dem til hver tube. Dette kan føre til lavt perle koncentration og kan påvirke resultaterne af matrixen kompensation.
    3. Pipette den passende mængde beregnet for en test af fluorokrom-konjugeret antistof tilstrækkelig (hvilket ville være tilstrækkelig til at plette 106 celler) i den tilsvarende tube og vortex grundigt. Læg ikke antistof unstained kontrol tube. Inkuber i 15-30 min. i mørke ved stuetemperatur (RT).
    4. Der tilsættes 4 mL af vaskebuffer (fosfatbufferet saltopløsning (PBS)/0.05% azide-0.1% human serumalbumin (HSA) (se tabel over materialer)) til hver tube. Der centrifugeres rør på 300g i 10 min. Fjern supernatanten og resuspenderes perle ved at tilføje 0,2 mL af vaskebuffer i hver tube. Vortex rør grundigt.
    5. Åbn producentens analyse software (se tabel over materialer) og oprette et nyt eksperiment (i menuen: eksperiment, nye eksperimentere, Vælg blindprøve) og omdøbe som kompensation filen med dags dato.
    6. Gå til "forskellige indstillinger" og bruge indstillingen ydelse fra afsnit 3.1. Være sikker på at tærsklen i FSC 5.000 og kompensation værdier af alle de anvendte fluorokromer er nul.
    7. Oprette kompensation kontrolelementer, herunder label-specifikke rør, efter behov. Sørg for at medtage en unstained kontrol. Vælg fra menuen: eksperiment, Kompensationsopsætning, oprette kompensation kontrol.
    8. Indlæse unstained kontrol tube og justere P1 gate omkring singlet perle befolkning og sikre, at P1 gate indeholder kun singlet perler.
    9. Højreklik på P1-porten og vælge "Anvend til alle kompensation kontrol". Registrere data for alle enkelt mærket fluorescens rør. Kontroller, at P2 gate omfatter befolkningens positive på hvert fluorescens histogram. Hvis det er nødvendigt, justere porten.
    10. Beregne erstatningen. Vælg eksperiment, Kompensationsopsætning, beregning af kompensationen.
    11. Hvis beregningen af kompensationen ikke er vellykket, vises en fejlmeddelelse. Foretag de nødvendige justeringer, og Genberegn. Når beregningen af kompensationen er vellykket, vises en dialogboks bede om navnet på Kompensationsopsætning.
    12. Angiv et navn (for eksempel YY-MM-DD 8 farve setup) og klik på link og gemme. Kompensationsopsætning vil også blive gemt til kompensation setup katalog.
      Bemærk: De samme indstillinger kan bruges til alle eksperimenter ved hjælp af den samme fluorophores.

4. flow flowcytometri vurdering (LAIP, og LSC)

Bemærk: Her vi beskrive bulk lysis procedure før farvning, som gør det muligt for at plette en foretrukne koncentration af WBC. De fleste MRD protokoller Brug denne fremgangsmåde, selv om nogle har med held brugt andre muligheder såsom farvning før lysering. Hele knoglemarv farvning før lysis minimerer præferentielle celle tab12, men har Ulempen, uforudsigelig, for lav celle koncentrationer.

  1. Bulk lysering af celler
    Bemærk: Hold unmanipulated prøverne vandret på RT, når strømmen cytrometric erhvervelse ikke kan udføres samme dag for at starte proceduren for hele den næste dag.
    1. Resuspend antikoaguleret knoglemarv prøven homogenitet af invertere prøven flere gange. Bestemme den koncentration af knoglemarv celler (hvide blodlegemer (WBC)) ved hjælp af en celle tælle kammer med celle farvning Tuerk løsning (se tabel over materialer).
    2. Med pipette overfoeres den nødvendige mængde af knoglemarv ind i en separat 15 mL rør. Mængden af celler er afhængig af antallet af særskilte farvnings-rør; Brug cirka 2 x 106 hvide blodlegemer LAIP målinger og 8 x 106 hvide blodlegemer for måling af LSC tube for én farvning (et rør).
    3. Lyse røde blodlegemer ved at tilføje lysing løsning (se tabel over materialer). Nødvendige volumen af lysing løsning bør være 10 gange mængden af cellesuspension.
    4. Bland forsigtigt, ved inversion og inkuberes i 10 min. ved RT. Der centrifugeres i 7 min. 800g på RT. udsmid supernatanten (f.eks. med en vakuumpumpe eller Pasteur pipette). Resuspenderes celle i fosfatbufferet saltopløsning (PBS)/0.05% azide-0.1% human serumalbumin (HSA) (se tabel over materialer) på RT. Brug den maksimale mængde af røret.
    5. Der centrifugeres i 7 min. 800g på RT. supernatanten (f.eks. med en vakuumpumpe eller Pasteur pipette). Genopslæmmes celle pellet i PBS/0.05% azide-0.1% HSA til en celle koncentration af 100 x 106 WBC/mL, og opdele over antallet af planlagte rør.
  2. Farvning af celler til flowcytometri
    1. Med pipette overfoeres monoklonalt antistof (MoAb) cocktail løsning bland i passende fluorescens-aktiveret celle sidesorteringen (FACS) rør og inkuberes med mængden knoglemarven cellerne i 15 min. i mørke.
      Bemærk: Dette er meget vigtigt, når tandem-farvestoffer anvendes. For eksempel, se blandinger af panelerne standardly bruges i vores laboratorium (tabel S1).
    2. Vask celler med 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% har. Der centrifugeres celler i 5 min på 400g. Kassér supernatanten (f.eks. med en vakuumpumpe eller Pasteur pipette) og resuspend celle pellet i 300 µL PBS/0.05% azide-0.1%HSA.
    3. LSC måling: resuspenderes celle i 400 µL PBS/0.05% azide-0.1% HSA og tilføje 4 µL af blanke perler (f.eks. Spherotech, se tabel over materialer) at bruge som negativ kontrol befolkning i analysen.
    4. Åbn MRD eller Lexmark Løsningscenter eksperiment lay-out på FACS (se tabel over materialer) og foranstaltning for MRD mindst 100.000 WBC gated begivenheder for måling af AML patientprøver på diagnose og 1 X 106 WBC for AML prøver på opfølgning. For Løsningscenter måle eksperimenter mindst 4 x 106 WBC både diagnose og opfølgning for en pålidelig LSC resultat.
    5. Gemme data ved hjælp af et standardiseret passende filnavn til analyse af resultaterne. Foretage en opgørelse over de forskellige målte markører på AML celler og stamceller AML (positive, negative, over/under udtryk) og gemme disse data i kladden lab.
    6. Der er ingen diagnose LAIP rådighed, måle alle 4 rør på opfølgning til at sikre, at enhver mulig målbare LAIP kan identificeres i en forskellig fra normal tilgang.
    7. Vælg den mest pålidelige LAIP(s)13 etableret på diagnose og erhverve så mange begivenheder som muligt, men > mindsteantal defineret.

5. identifikation af leukæmi forbundet Immuno-fænotyper (LAIP): analyser af forskellige cellepopulationer

Bemærk: FCS filer kan analyseres med flere softwareprogram for optimal visualisering af de forskellige cellepopulationer (se tabel over materialer).

  1. Hvide blodlegemer befolkning
    1. Gate CD45 positive celler og levedygtige vises cellerne, udelade lav FSC (ikke-levedygtige celler, erythroid celler) inden for FSC/SSC plot; disse indeholder WBC (figur 3Ajeg). Vis WBC og bruge en af de primitive markører (for eksempel CD34; Figur 3Aii) at hjælpe med at fastslå den endelige placering af eksplosionerne i de CD45dim område (figur 3Aiii).
    2. Gate CD45dim celler og tilbage gate celler i FSC/SSC plot (figur 3Bjeg). Fjerne CD34 gate (figur 3Bii) mens rapportering % celler i dette gate som % Blaster i jeres befolkning træ i programmet. Vis eksplosionerne i et SSC/CD34 plot og gate CD34 positive celler (Figure3Biii).
  2. Lymfocytter
    1. Bruge lymfocytter som en intern kontrol: myeloide befolkninger som en negativ kontrol og lymfoide befolkning som en positiv kontrol.
    2. Start fra befolkningens hvide blodlegemer (figur 4A). Gate lymfocytter som CD45høj/SSClav befolkningen (figur 4B).
    3. Sørg for, at der er ingen myeloide celler i porten brug af CD34, CD117, CD13 eller CD33 og gate for CD13 negative/CD33 negative celler (figur 4C-E). Kalde denne befolkning 'lymfocytter' i træet befolkning (figur 4F).
  3. LAIP på diagnose
    1. Gate eksplosionerne og efterfølgende CD34 positive celler i en SSC/CD34 plot og kalde disse primitive markør i træet befolkning.
    2. Afbilde de primitive celler, i dette tilfælde CD34-positive og lymfocytter i en ny plot med en lymfoide markør (CD7) mod en myeloid markør (CD33). Gate afvigende befolkningen (Se retningslinjer supplerende fil 1) og kalder dem «LAIP positive» i træet befolkning.
      NOTE: Den endelige valgt LAIP er rapporteret som % LAIP på befolkningens blast. Følsomhed, specificitet og stabilitet af LAIPs kan etableres kun af personale med stor erfaring i MRD målinger. Summen af disse parametre bestemmer kvaliteten af LAIP. Eksempler på fire forskellige LAIP vurderinger på diagnosetidspunktet er vist i figur 5 A-D.
    3. Fastsætte udtrykket af LAIPs (% Blaster) og bevare disse data i en database eller excel-fil.
    4. Gøre rapporter om FACS analyser og noter af de LAIPs, der skal anvendes på MRD målinger.
      Bemærk: Definitionen af LAIPs er tilladt i et team af eksperter, da det er et væsentligt element for nøjagtige MRD målinger på følge op.
  4. MRD på opfølgning
    1. Gate eksplosionerne som beskrevet i 5.1 men alt efter tidspunkt efter terapi; korrekt vurdering af denne port kan være udfordrende. Fokus på LAIP fænotype, der var etableret på diagnose og gate umodne befolkningen.
    2. Som beskrevet i 5.1. Find den korrekte blast gate baseret på den definerede aberrancy og være opmærksom på regenererende knoglemarv og normal udtryk for at gate dem ud
    3. Gentag den samme gating strategi på alle opfølgende punkter og bestemme MRD som procentdelen af LAIP celler i befolkningens hele hvide blodlegemer. Se eksempler på figur 6A og 6B.
    4. Rapport MRD positivitet når % af MRD er ≥ 0,1% af de hvide blodlegemer. Udskrive analyserede data i et standardformat at diskutere ugentligt med MRD team. Registrere resultaterne efter enighed. Lad resultaterne være godkendt af tilsynsførende før kommunikere resultaterne til klinikerne.

6. analyse af Stem cell MRD (LSC enkelt rør)14

  1. Analyser af Løsningscenter på diagnose og opfølgning
    1. Gate blast celler, som beskrevet i afsnit 5.1.
    2. Som potentielle negative kontrol for CD38-gate røde blodlegemer-fraktion (dvs. resterende røde blodlegemer efter lysis, karakteriseret som VSKlav/FSClav og CD45negative). Hvis det er nødvendigt, kan døde celler og celle fragmenter udelukkes af en ekstra gate i dette plot.
    3. Afgøre inden for indgangen leukemic blast delpopulation med udtryk for CD34. Vælg inden for denne befolkning CD34+ CD38- celler (brug som cut-off: øvre grænse af Tom kalibrering perler for tærskel bestemmelse (se tabel over materialer), rød-fraktion eller brug 103 som skæringspunkt). Kalde denne befolkning 'CD38lav ophav' (figur 7).
      Bemærk: Se supplerende fil 1 for yderligere oplysninger om indstillingen CD38-cut offline niveauer.
    4. Afgøre inden for denne CD38lav befolkning den sande CD34 + CD38meget lave stamceller befolkningen, ved hjælp af medianen af den røde brøkdel, den nederste kant af Tom kalibrering perler eller vælge 102 som skæringspunkt (figur 7 ). Se supplerende fil 1 for yderligere oplysninger om indstilling af CD38-cut offline niveauer.
    5. Inden for begge populationer, gate leukemic stamcellerne vs de normale hæmatopoietisk stamceller (LSC vs HSC) ved at analysere hver leukemic markør i panelet (dvs. CD45RA, combi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 og CD56 alle i PE), CD123, CD33 og CD44).
    6. Plot stamcelle markør af interesse versus andre stamcelle markør til at sammenligne positivitet/negativitet positivitet/negativitet andre markører og finjustere LSC versus HSC frekvens.
    7. Rapporter procentdelen af umodne Blaster, lymfocytter, CD34 + celler. For alle separate markører, en liste over det samlede antal CD38lav og CD38verylow og antallet af CD38lav og CD38verylow som er markør positiv (og dermed neoplastiske).
    8. Vælg for markør der bedst adskiller normale hæmatopoietisk stamceller vs leukemic stamceller til yderligere analyse. Beregne procentdelen af LSC og HSC som procentdel af samlede WBC.
      Bemærk: En procentdel af LSC ≥ 0,004% er rapporteret som LSC positive på diagnosen, mens cut-off er 0,0001% på opfølgning. Afvigende stamceller gating i opfølgende prøver er den samme analyse som på diagnose, men celle numre i stamceller populationer kan være meget lille. Dermed nødvendigheden af at erhverve nok begivenheder.

Representative Results

I 90% af AML patienter kan mindst én LAIP identificeres. Generere de nøjagtige procenter af LAIP + celler af de primitive blast celler på diagnose, en passende indstilling af blast gate er afgørende og behov for kontrol som visualiseret i figur 3. Et eksempel på hver enkelt patient husly en bestemt type af aberrancy på de CD34 + primitive celler er visualiseret i figur 5. Til måling af MRD på opfølgning, de tidligere definerede LAIP + celler er gated og defineret som procentdel af LAIP + celler af WBC. Indstillingen af denne port er derfor afgørende for at opnå de rigtige MRD resultater. Figur 6 viser en patient, der forbliver i komplet remission og en patient, der relapses efter at have MRD positive resultater (≥ 0,1%) efter den anden cyklus af induktion terapi.

Den nuværende protokol er kun egnet til at definere stamceller i CD34 + celler, da grundig karakterisering af dette rum har vist, at befolkningens CD38 havne den mest potente stamceller som brøk. For at adskille LSC fra HSC inden for denne fraktion, anvendes yderligere markører. Oftest valgte markører til at skelne LSC er CD45RA og combi kanalen husly 6 specifikke LSC markører mærket med PE. Baseret på yderligere kliniske evalueringer, en cut-off niveau af ≥ 0,004% blev defineret som LSC-positive og var forbundet med dårligere overlevelse på diagnosen, mens en cut-off niveau af 0,0001% blev brugt på follw-up10.

Figure 1
Figur 1 : Knoglemarven smear. A) sund donor og B) AML patienten (FAB 5 undertype). Giemsa pletten vist på 100 x forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Rette indpakningsmateriale for biologiske væsker. Flere oplysninger om de regler og bestemmelser om transport af biologiske væsker kan findes på hjemmesiden15 af Centers for Disease Control og forebyggelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Gating strategi for at definere blast celler. A) Gating CD45dim, B) Gating CD34 + Blaster.

Figure 4
Figur 4 : Gating lymfocytter. A) blå celler er WBC vist i FSC/SSC plot, B) grønne celler er lymfocytter karakteriseret ved CD45høj/SSClav, C) eksempler på negativitet til CD34, D) negativitet for CD117 og E) negativitet til CD13, F) de forskellige celletyper er vist i en Oversigt over befolkningen træ. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : LAIPs på AML diagnose. A) LAIP baseret på tværs af slægt aberrancy (CD7 på CD33 udtrykker celler), B) LAIP baseret på asynkron differentiering (CD11b på CD13 udtrykker celler), C) LAIP baseret på overekspression i forhold til normale celler (CD34meget højt på CD13 udtrykker celler), D). LAIP baseret på underexpression i forhold til normale celler (HLA-DRlave om CD33 udtrykker celler). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : LAIP følges under terapi. A) LAIP definition på diagnose (CD34 +/ CD13 / CD33-) og tab af LAIP under opfølgning i en patient, der forblev i kontinuerlig komplet remission, B) LAIP definition på diagnose (CD117 +/ CD7 +/ CD33 +) og persistens af LAIP under opfølgning i en patient der recidiverende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Stem cell gating. En) Gating af de forskellige CD34 +/ CD38 populationer baseret på perler (CD38lav er under den øverste kant af perler, mens CD38meget lav er defineret som de sande negative celler repræsenterer Løsningscenter og er placeret under medianværdien af perlerne), B) to eksempler på patienter med sondringen mellem HSC og LSC på opfølgning baseret på CD45RAneg og CD45RApos udtryk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1. Venligst klik her til downoad denne fil.

Supplerende fil 2. Venligst klik her til downoad denne fil.

Supplerende fil 3. Venligst klik her til downoad denne fil.

Discussion

Rigelig data er tilgængelige, viser bevis for MRD positivitet er forbundet med dårlig overlevelse, og derfor MRD vurdering kan forbedre patientens resultatet med yderligere prognostiske information hvorpå kliniske beslutninger kan træffes. En sammenhængende og harmoniseret metode til immuno-fænotypiske vurdering af MRD er derfor afgørende at i sidste ende forbedre patienternes terapi. Dette er også vigtigt, når man sammenligner kliniske studier på tværs af forskellige kliniske websteder, og kan i sidste ende hjælp i kliniske beslutning at gøre og tjener som en surrogat kliniske slutpunkt for samlet overlevelse. Forestillingen om, at solid retningslinjer er berettiget til nøjagtige og ensartede MRD målinger har ført til en samordnet indsats af europæisk leukæmi netværk (ELN) design topmoderne retningslinjer. Dette omfattende dokument vil blive offentliggjort sent-2017 og vil være medvirkende til mange studiegrupper og laboratorier bevæger sig fremad.

Kritiske trin i protokollen

En vigtig og ofte overset aspekt af MRD analyse er virkningen af prøven kvalitet på nøjagtig bestemmelse af MRD. Dette er mere synlige, når materialet skal transporteres til andre institutter i globale kliniske forsøg givet de yderligere operationelle overvejelser, der skal tages i betragtning i denne indstilling. For at mindske risikoen for blande patient er information og rettidig levering af prøver passende administration afgørende. Igen, på dette stadium af transport korrekte former og/eller indførsel til elektroniske hospitalssystemer med klare opgaver af den ønskede analyse er påkrævet. At bemærke stage på terapi af MRD prøveudtagning er også afgørende, da det kan være relevante for klinisk beslutningstagning (for eksempel efter andet kursus af terapi) og bør derfor defineres klart. Brug af mock data (som for eksempel januar 1 pr. fødselsår) øger risikoen for blande patienter eller analyser. Hvis det kræves af loven, bør en alternativ anonyme måde identifikationsmedlemsstaten anvendes.

Alle prøver for Immunofænotypning skal behandles fortrinsvis inden for 24 timer af samling. Selv om ikke anbefalelsesværdig, kan knoglemarv og perifert blodprøver stadig være behandlet og analyseret når der holdes op til 72 timer ved stuetemperatur. Derudover alle handlings med materialet kan bedst udføres under sterile betingelser, så yderligere kryopræservering af celler i (lokale) biobanker er fortsat relevante: mange kliniske undersøgelser har yderligere analyser for yderligere at undersøge leukæmiceller med respekt til molekylære, immuno-fænotypiske og funktionelle funktioner skal udføres på et senere tidspunkt. Detaljerne i biobanking er dog ikke omfattet af dette manuskript.

Bruge MRD som et diagnostisk redskab indebærer, at der skal et akkrediteret laboratorium, ikke kun for flowcytometri, men også hvad angår kvalitetskontrol af MRD vurdering. Dette kan kræve distribuere prøver til specifik referencelaboratorier eller (re) analyserer flow filer med MRD målinger af reference hold.

Denne artikel beskriver de vigtigste handlinger fra knoglemarven aspirat samling til bestemmelse af MRD i kliniske prøver - der kræver en hel gruppe af eksperter med specifikke opgaver, ansvarsområder, og med hyppige kommunikation til effektiv karakterisering og analyse. Da hver opgave er afgørende for proceduren, anbefales det at have god logistik herunder protokoller på hvert laboratorium og tilstrækkelig back-up personale, der er specielt uddannet til opgaven. Hertil kommer, da der er nogle relativt subjektive trin i en del af procedurerne (især LAIP, og LSC afvigende markør identifikation), er det vigtigt at have drøftelser om det endelige resultat af holdet, og har den endelige rapport er godkendt af et team af vejledere. Nuværende indsats forfølger computer softwareudvikling, der vil hjælpe med at standardisere (LAIP og LSC) MRD analyse.

Ændring og fejlfinding

Hvert lab kan have sit eget sæt af antistoffer, der kan bruges til at definere de forskellige delpopulationer, selv om at have en standardiseret rygraden af markører er afgørende for sammenlignelige resultater, som skitseret i ELN topmoderne retningslinjer for MRD målinger dokument nævnt ovenfor. Uanset de valgte markører, der er nogle spørgsmål, som kan vanskeliggøre analyse af resultaterne og skal tages i betragtning.

Begrænsninger af teknikken

Identifikation af LAIP, og LSC afvigende markør udtryk er først vurderes på diagnose og overvåges over tid (under og efter behandling) for nøjagtig karakterisering af MRD fænotype. Mens over 95% af patienterne kan blive evalueret via LAIP eller LSC (eller begge), stadig nogle patienter har ingen definerede LAIPs eller ingen CD34 + CD38-LSCs eller præsentere med CD34 negative eksplosioner, eller har en manglende diagnose prøve. I disse tilfælde, er det stadig værd at forsøge at måle MRD med et panel af antistoffer så bredt som antallet ledige celler giver mulighed for og derefter vælge den mest pålidelige (giver den stærkeste skelnen mellem leukemic celler) LAIP. I betragtning af at en del af de patienter, der i sidste ende tilbagefald ikke helt ligner diagnose immunophenotype, på grund af heterogenitet af AML sygdom, måle et bredt panel af antistoffer på MRD anbefales under alle omstændigheder. Disse immunophenotypic forskydninger omfatter blast celler og LSCs og har vist sig at forekomme under terapi16 og den målbare sygdom kan være baseret på disse såkaldte kommende populationer. På dette tidspunkt dog er det ikke fastslået, om alle immunophenotypic delpopulationer vil føre til sygdom tilbagefald, og er derfor ikke almindelig praksis at rapportere MRD skræddersyet-terapi baseret på disse celler i kliniske forsøg. Det er vigtigt at bemærke, at risikoen for manglende LSC på grund af befolkningen forskydninger er reduceret med en tube tilgang, hvor de vigtigste aberrancy definerende markører er i én flowcytometri (PE) kanal14.

Betydning med hensyn til eksisterende metoder

De i denne protokol beskrevne metode bygger på definitionen af en eller flere LAIPs, hvilke celler der følges under terapi. En ulempe ved denne metode er, at det har for nylig vist sig at LAIP kan ændres under behandlingen. Denne måde nogle kommende populationer med forskellige afvigende markører kan blive savnet. For at omgå dette, ville det være bedst at måle alle afvigende markører i stedet for kun dem, der findes på diagnosen. Dette ville derefter være svarende til den "forskellige fra normal" fremgangsmåde, der bruges af flere laboratorier17.

Fremtidige ansøgninger

For nylig, MRD har fået ekstra opmærksomhed for romanen kliniske forsøgsdesign. I æra af specialiserede behandlingsmuligheder og målrettede medicinsk behandling, brugen af MRD som et resultat foranstaltning vil reducere den tid, det tager at etablere klinisk effekt af nye behandlinger, i sidste ende giver mulighed for hurtigere indførelse af et presserende behov for terapeutisk muligheder i klinikken. Betydningen af passende logistik og praktisk udførelse af en harmoniseret MRD vurdering er afgørende for fremtidig AML behandling succes som FDA undersøger i øjeblikket muligheden for at bruge MRD som en surrogat slutpunkt i stedet for samlet overlevelse måler18.

Disclosures

Antistof cocktails bruges til validering af stamceller rør i flere uafhængige institutter blev venligst leveret af BD. Forfatterne har intet at afsløre om dette håndskrift.

Acknowledgments

Denne forskning har været støttet af hollandske Cancer Society (ALPE 2013-6371) og Egbers foundation for VONK. Vi takker den hollandske AML-MRD arbejdsgruppe for samarbejdet og frugtbare drøftelser for kontinuerlig forbedring og standardisering af AML-MRD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Biosciences 120995496,060996589 and 013729 FACS Canto II 
BD Biosciences 555360 CD7 FITC
DAKO F076701 CD2 FITC
Sanquin M1613 CD36 FITC
BD Biosciences 332778 CD15 FITC
BD Biosciences 335039 CD45RA FITC
BD Biosciences 345810 CD56 PE
BD Biosciences 337899 CD22 PE
BD Biosciences 345785 CD14 PE
Miltenyi Biotec 130-080-801 CD133 PE
BD Biosciences 562566 Clec12a PE
BD Biosciences 565568 Tim-3 PE
BD Biosciences 332774 CD7 PE
BD Biosciences 333142 CD11b PE
BD Biosciences 337899 CD22 PE
BD Biosciences 345810 CD56 PE
BD Biosciences 347222 CD34 PERCP-CY5.5
BD Biosciences 558714 CD123 PERCP-CY5.5
Beckman Coulter B49221 CD117 PE-CY7
BD Biosciences 562854 CD33 BV421
BD Biosciences 345791 CD19 APC
BD Biosciences 333143 CD11b APC
BD Biosciences 345800 CD33 APC
BD Biosciences 345807 CD38 APC
BD Biosciences 641411 HLA-DR APC-H7
BD Biosciences 560532 CD44 APC-H7
BD Biosciences 562596 CD13 BV421
BD Biosciences 348811 CD34 PE-CY7
Beckman Coulter A96416 CD45 Krome Orange
BD Biosciences 655873 CD45 HV500c
BD Biosciences 655051 CST beads 
BD Biosciences 555899 Pharm lysing solution
BD Biosciences 644204 Multicolor CompBeads
BD Biosciences 655051 CST beads
BD Biosciences FACSDiva software
Cytognos Infinicyt 
Spherotech Euroflow RCP-30-5a
Sigma-Aldrich Tuerk solution
Spherotech BCP-100-5 Blank Calibration Particles Beads
         HSA
         Azide
         ddH2O

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood. 129 (4), 424-447 (2017).
  2. Zwaan, C. M., et al. Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia. J Clin Oncol. 33 (27), 2949-2962 (2015).
  3. Cornelissen, J. J., et al. The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach. Nat Rev Clin Oncol. 9 (10), 579-590 (2012).
  4. Grimwade, D., Freeman, S. D. Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for "prime time"? Hematology. 2014 (1), 222-233 (2014).
  5. Krönke, J., et al. Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group. J Clin Oncol. 29 (19), 2709-2716 (2011).
  6. Terwijn, M., et al. High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study. J Clin Oncol. 31 (31), 3889-3897 (2013).
  7. van der Velden, V. H. J., et al. Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol. Leukemia. 24 (9), 1599-1606 (2010).
  8. Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. MRD in AML: time for redefinition of CR? Blood. 121 (12), 2166-2168 (2013).
  9. Feller, N., et al. MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 18 (8), 1380-1390 (2004).
  10. Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
  11. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
  12. Paietta, E. Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept? Bone Marrow Transplant. 29 (6), 459-465 (2002).
  13. Loken, M. R., et al. Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group. Blood. 120 (8), 1581-1588 (2012).
  14. Zeijlemaker, W., et al. A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia. Leukemia. 30 (2), 439-446 (2015).
  15. Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing. , https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html (2017).
  16. Bachas, C., et al. The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse. Leukemia. 26 (6), 1313-1320 (2012).
  17. Ravandi, F., et al. Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia. Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).
  18. Hourigan, C. S., et al. Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).

Tags

Kræftforskning sag 133 akut myeloid leukæmi målelige residual sygdom leukemic stamceller knoglemarvstransplantation aspiration leukæmi associerede immunophenotype fluorescens-aktiveret celle sorteringsanlæg analyse
Omfattende protokol til prøven og proces knoglemarven til at måle målbare Residual sygdom og Leukemic stamceller i akut Myeloid leukæmi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cloos, J., Harris, J. R., Janssen,… More

Cloos, J., Harris, J. R., Janssen, J. J. W. M., Kelder, A., Huang, F., Sijm, G., Vonk, M., Snel, A. N., Scheick, J. R., Scholten, W. J., Carbaat-Ham, J., Veldhuizen, D., Hanekamp, D., Oussoren-Brockhoff, Y. J. M., Kaspers, G. J. L., Schuurhuis, G. J., Sasser, A. K., Ossenkoppele, G. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (133), e56386, doi:10.3791/56386 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter