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Cancer Research

测定急性髓系白血病可测残留病和白血病干细胞的骨髓标本和过程综合协议

Published: March 5, 2018 doi: 10.3791/56386
Automatic Translation
*1,2, *3, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2,4, 1, 3, 1
1Department of Hematology, VU University Medical Center, 2Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 3Janssen Research & Development, LLC, 4Princess Máxima Center for Pediatric Oncology
* These authors contributed equally

Summary

检测微量或可测量残留疾病 (MRD) 是一种重要的预后标志物, 用于提炼风险评估和预测急性髓细胞白血病 (AML) 复发。这些全面的指导方针和建议采用最佳做法, 以一致和准确地识别和检测 MRD, 有助于作出有效的反洗钱治疗决定。

Abstract

急性髓细胞白血病 (AML) 的反应标准最近被重新建立, 通过形态学检查, 以确定患者是否已达到完全缓解 (CR)。由于骨髓中残留的 AML 细胞的生长, 进入 CR 的成年患者中约有一半将在12月内复发。这些剩余的白血病细胞的定量, 被称为最小或可测量的残留疾病 (MRD), 可以是一个强大的生物标志物预测这些复发。 此外, 对几项研究的回顾性分析表明, 在 AML 患者骨髓中, MRD 的存在与生存率的低下有关。不仅是白血病的总人数, 所反映的细胞与白血病相关的免疫表型 (LAIP), 与临床结果, 但也同样是不成熟的低频亚群白血病干细胞, 这两者都可以通过流式细胞仪或类似于 mrd 的方法进行监测。根据疾病特异性或与疾病相关的特征 (异常的分子标记或异常免疫表型) 检测残留白血病 (干细胞) 的敏感性化验有了显著的改善。在 AML。然而, 考虑到 AML 作为一种疾病的固有的异质性和复杂性, 在可能的情况下应协调骨髓取样方法和执行 MRD 和细胞分析法。在这篇手稿中, 我们描述了充足的骨髓穿刺取样, 运输, 样本处理的最佳多色流式细胞术评估的详细方法, 和门策略评估的 MRD 和细胞, 以帮助治疗决策为 AML 患者。

Introduction

急性髓系白血病 (AML) 是一种恶性肿瘤的骨髓的特点是缺陷的成熟程序, 与异常增殖和积累的髓祖细胞, 抑制正常造血, 最终骨髓衰竭.这种疾病在形态学、免疫表型、细胞遗传学、分子畸变、基因表达特征以及治疗反应和治疗结果方面高度异构,1,2。目前的管理包括诱导化疗, 目的是实现完全缓解 (CR), 其次是缓解后治疗, 这主要是由分子, 细胞遗传学和免疫表型研究的结果, 包括任何若干疗程的额外化疗或 (自体或同种异体) 干细胞移植3。 尽管在90% 的密集化疗后的高缓解率, 成人5年存活率仅约 30%-40%, 主要是由于复发的发展, 通常是耐化疗, 从而很难治疗。结果在孩子是更好的, 虽然大约一第三也复发。因此, 及早发现即将复发将填补未满足的医疗需求, 并可能指导缓解后治疗4。

治疗后残留疾病可能反映所有诊断和诊断后耐药性机制/因素的总和;因此, 它的测量可能是预后的, 有助于指导治疗。defining 残留疾病的可能性 (以前称为最小残留疾病, 现在称为可测量残留疾病或 MRD) 远远低于5% 个爆炸细胞的形态学标准是改变风险 classification 的景观。目前主要用于检测 MRD 的两种方法是基于流式细胞仪和分子基础的, 后者由逆转录酶 PCR (RT qPCR)5评估, 或者, 尽管在过早阶段, 由下一代测序 (。许多成人和儿童的研究已经表明, 在归纳和整合治疗后, 各种 MRD 方法在反洗钱中提供了强有力的预后信息6,7, 以及疾病负担的新定义 (优于形态学 CR) 现在正在出现8。这表明, 通过流动和/或分子技术评估的 MRD 应该成为, 事实上已经成为标准的每一个临床试验中的 AML。

本文讨论了详细的流式细胞术程序, 以获得准确和可重复的免疫表型特征的骨髓标本, 包括骨髓取样和处理程序前流式细胞术。高质量的骨髓样本在诊断和随访中的可用性对于这项测量在临床和临床试验中的成功至关重要。事实上, 这些前期分析的考虑对于分子 (PCR 和) MRD 的方法也是至关重要的。对于 MRD 的免疫表型特征, aberrantly 表达标记与正常髓样和祖标记结合, 以确定白血病相关的免疫表型 (LAIP)9。MRD 测量影响治疗反应的许多因素的结果, 如内在或获得的白血病耐药性, 治疗的药效学和动力学, 免疫监视和依从性。因此, MRD 是一个很强的后诊断预后参数相关的临床结果时, dichotomized 的截止水平, 由接受手术的特点 (ROC) 分析。对于我们的成人 AML 队列的 HOVON 42a 研究, 切断水平是设置在0.1% 的 LAIP 阳性细胞/总白细胞。使用这个标准来确定阴性与阳性的 MRD 状态, 一组患者可以确定谁有明显更严重的复发率, 无复发和整体生存6。此外, 我们描述的测量不成熟, 耐药白血病细胞的干细胞样特征 (CD34+CD38 白血病干细胞, 或), 它提供了一个强有力的预测患者的结果10。LAIP 和细胞方法一起形成了流程。LAIP 方法适用于大约90% 的患者, 而在约80% 的患者中, 可采用方法。95% 以上的病人可以为一个参数或两者一起评估。

最后, 本刊物提供了一个详细的操作描述, 以评估 MRD 的流式细胞术。这包括: 1) 骨髓取样程序的统一和/或标准化, 2) 样品运输指南 3) 使用多种抗体板 (包括单细胞管法) 对白血病细胞检测的详细描述4) 为标准测量、5) 对 MRD 测量的分析程序和 6) 对检测的分析程序建立了对其进行标准化测试的流化机的特征。

我们的目的是显示过程的所有方面, 包括样品准备, 因为这是很少讨论, 而它是一个重要的问题, 最终结果的质量。骨髓穿刺和活检是用于评估骨髓造血细胞的临床程序。这些与完整的血液计数 (CBC) 和血液涂片一起执行。骨髓穿刺的最佳方法是准确诊断和随访对 MRD 测量的关键。此外, 一个成功的骨髓穿刺应该包含足够的细胞来执行 LAIP 和外流分析 (至少1000万活细胞)。在这里, 我们描述了执行骨髓穿刺的方法, 并提供了指导, 这应该导致足够的细胞取样 (并限制血液稀释的可能性), 以进行准确的诊断和额外的研究。这些前期分析的考虑对于分子 (PCR 和) MRD 的方法也是至关重要的。所有免疫分型的标本应优先处理24小时内收集。虽然不能推荐, 但在常温下, 骨髓和外周血标本仍可进行处理和分析。此外, 所有搬运与材料应在无菌条件下进行, 以使不育细胞的低温保存, 以供日后研究/质量评估等。

Protocol

该议定书遵循了《大学医学中心研究守则》和研究伦理学委员会的指导方针。

1. 骨髓穿刺和样品制备

  1. 病人和材料准备
    1. 用16口径针填充一或两个10毫升注射器与1% 利多卡因。更换21口径针针。
    2. 在手表玻璃上放两滴 5% EDTA。
    3. 设置玻璃幻灯片 (n=15 与一致的病人编号和日期) 的涂片准备。
    4. 放置病人在侧压位位置。定位上髂后脊柱, 用笔标记。
      注: 一般情况下, 髂后上棘位于髂嵴远端, 一只手宽侧向中线。在女性中, 实际的脊柱可能会更横向一些, 在一些男性更内侧一些。
    5. 对皮肤进行消毒, 用 0.5-1% 乙醇, 从预期的活检区域向外圆周。
    6. 打开包装的无菌手套, 戴上无菌手套, 放下包装在桌子上, 创建一个无菌的领域。用吸针打开包裹, 放到不育的田地。
    7. 浸润皮肤和皮下组织, 最后骨膜。在骨膜, 管理利多卡因这样的方式, 一个面积的1厘米直径已被麻醉。
      注: 充分管理利多卡因对骨膜是最重要的因素之一, 病人的舒适性。通过使用所介绍的针头穿刺活检部位来测试骨膜是否被充分麻醉, 并询问病人是否感到疼痛。注意: 在整个手术过程中, 儿童完全被麻醉。
    8. 将吸针 (15 Ga x 2.8 英寸) 与手掌的近端和食指靠近尖端的针的金属轴一侧;这个位置可以更好的控制。
    9. 引入旋转运动的针头 (通过快速交替 pronating/supinating 运动) 通过皮肤向髂脊柱, 并使针与髂后脊柱接触。
    10. 确保将针头引入到骨膜的麻醉区;病人应该感到只有压力, 没有疼痛。如果病人感到疼痛, 要么重新定位针头, 要么管理更多的利多卡因。
    11. 使用温和但坚定的压力, 前进的针, 而旋转在一个交替顺时针逆时针运动。进入骨髓腔通常是通过抵抗力降低来检测的。
    12. 从针上取出鞘。将10毫升空注射器连接到针头上。
    13. 用温和的拉力取出注射器柱塞来施加负压。警告病人, 当骨髓被吸入时, 他们可能会感到抽筋的感觉和疼痛。如果没有足够的骨髓骨针被释放, 另一个愿望应该进行一个快速绘制。大多数骨针将在第一个1-2 毫升获得从最初的拉动。只吸入1-2 毫升以避免稀释样品。
      注: 稀释会导致血液稀释, 并可能混淆 MRD 结果)。
    14. 取出注射器, 将鞘替换成吸入针。将一部分骨髓喷射到手表玻璃中, 其余的部分放入8毫升的肝素管。
      注: 在将骨髓穿刺入标本管后, 立即反转每根管, 以确保充分抗凝。骨髓凝固往往是不适当材料的原因。额外的骨髓可以从同一个部位吸气, 但最好是, 在新的抽吸之前, 针是提前5-10 毫米。最好不要超过2绘制每个插入级别应采取。请确保用越来越多的数字标记管道, 表示第一个、第二个和/或连续绘制。使用第一个绘图进行最相关的诊断分析是常见的规则。
    15. 或者, 从插入处收回针头, 并将其重新引入骨髓腔, 离原插入位置几毫米, 然后重复该过程。
      注: 不要吸入超过1-2 毫升每拉, 以避免严重的血液污染。
    16. 经常重复, 因为需要材料。当充足的材料为具体临床研究协议是吸气去除骨髓针。
      注意: 如果骨髓渴望缓慢或其他困难, 使用用抗凝剂预冲洗的注射器可能会有帮助。在干水龙头的情况下, 进行骨髓活检, 这是在本手稿的范围之外。
  2. 形态学检查用涂片的制备
    1. 为了获得最佳的形态学评估, 从玻璃杯中取出骨针 (例如使用塑料铲), 然后将它们放在玻片上。
    2. 轻轻地将另一张玻璃幻灯片放在幻灯片上, 然后轻轻滑动;避免任何压力。
      注: 只有在非常大的骨髓骨针轻微的压力可以施加, 以减少细胞扩散的厚度。这个程序得益于一个能处理标本管的助手的帮助。准确的标签的管与病人数量和数量的顺序骨髓绘制是至关重要的。
    3. 彻底烘干幻灯片, 然后执行可能姬姆萨 Grünwald 染色 (见材料表)。在光学显微镜下检查形态学 (请参见图 1)。
      注意:图 1A显示了由不同功能细胞类型组成的健康骨髓的涂片, 而图 1B是以白血病为主要爆炸的 AML 患者。为了更好地定义残余的白血病负担, 免疫分型需要进行。

2. 运输材料作进一步处理

  1. 运输样品的准备
    1. 为了确保材料不会泄漏, 管道不会破裂, 请确保正确的包装 (参见图 2)。
      注: 从我们和其他人的经验, 细胞的生存能力最好保存时, 骨髓保持在室温下。对于长期运输, 这是最好的实现使用室温 ' 凝胶包装 ', 以帮助在温度稳定的运输过程中。
    2. 标签包装, 并添加正确的形式, 以避免丢失的包装, 延长运输或切换病人。
      注意: 这至少应该包含: (表 1) 患者数据。这应该包括研究数字和通常的 ' 出生日期 '。在到达接收实验室后, 对材料进行正确处理是必要的, 这是明确要求的实验室分析 (分子诊断, 免疫分型, MRD 等) 在这一形式。(表格 2)联系人的地址和电话号码, 必要时, 海关的文件。为避免邮件中丢失包, 发送实验室总是通知接收实验室已发送样品。建议使用 "跟踪和跟踪"。
  2. 接收来自其他研究所的样品
    1. 确保在研究所提供适当的后勤服务, 以便在实验室内尽快收到样品。
      注: 为优选的后勤组织优选一个中央实验室是需要的, 接受和收集所有材料从地方诊所和从外部医院。特别是, 为分发和与执行实验室明确沟通提供协议至关重要。
    2. 在收到样品后, 准确地记下在硬拷贝表单中适当的编号和一个安全数据库, 其中包含诸如 MRD id 号、试验专用 id 号、医院注册号、发送机构、出生日期、材料等重要字段。类型 (骨髓或外周血), 白血球计数 (白细胞), 骨髓穿刺日期, 样品的测量日期和任何与测量质量有关的备注。
      注: 优选的是, 该数据库还配备了包含其他数据 (或链接到其他数据库) 的分析结果, 以及进一步的病人数据, 如后续数据。

3. 流式细胞仪设置

注: 本节基于 Euroflow 指令。11

  1. 为 FCS 的 SSC 参数和目标荧光通道设置光电倍增管 (PMT) 电压
    1. 对于 FCS SSC 参数启动流式细胞仪, 并执行 "细胞仪设置和跟踪 (cst)" 运行在流式细胞仪与 CST 珠 (见材料表)。溶解健康捐献者的红细胞 (4.1 节中所述)。
      1. 创建一个新的实验 (在菜单: 实验, 新的实验, 选择空白实验) 使用制造商的软件 (见材料表) 与 Sideward 散射 (SSC) 点图, 以建立 FSC 和 SSC 参数。用日期来命名这个实验 FSC/SCC PMT。首先使用当前的细胞仪设置 (右键单击: "应用当前科技委")。这些设置是使用 cst 校准珠 (见材料表) 在 cst 的性能检查中产生的。调整 FSC 和 SSC, 以可视化淋巴细胞在 "全球实验设置"。注: 在我们的流式细胞仪中, 这些分别为285伏和400伏。检查 "启用补偿" 在: 督察/仪器设置/补偿。
      2. 评估细胞的大小 (FSC) 和粒度 (SSC) 开始测量未标记的裂解外周血细胞的 "获取细胞" 功能。门淋巴细胞和调整/微调 FSC 和 SSC 电压达到以下平均目标值为门控淋巴细胞人口: FSC: 10万 (范围 9.5万-10.5万);SSC: 1.5万 (范围 1.3万-1.7万)。
      3. 通过测量至少1万个事件获取和记录数据。验证门控淋巴细胞的平均 FSC 和 SSC 目标值, 必要时重新调整。
    2. 为设置目标荧光通道 PMT 电压使用8峰值彩虹珠校准粒子 (见材料表)。
      1. 创建一个新的实验, 对7峰的外地资产管制。创建工作表 "目标平均荧光强度 (多边计划)" 与所有必要的点地块 (n=2;FSC 与 SSC, FITC 对 PE), 直方图 (n=8; 每一个荧光探测器的一个直方图) 和统计显示参考峰值 (多边基金会和变化系数 (CV)) 为每个荧光通道。
      2. 在1毫升的 dH2o 轻轻涡旋, 在溶液中混合珠子, 新的溶液中含有1滴 (60 µL) 的彩虹珠。
      3. 使用以上的 FSC/SSC 电压的 PMT 设置, 并开始测量彩虹珠子的荧光, 方法是使用 "获取" 功能 (不记录) 在 "低" 流速, 阈值为5000。使用 "矩形门按钮" 在 FSC 与 SSC 点图中 P1 单线珠填充。门的 7th峰值人口 P2 在 FITC 与 PE 点剧情。
      4. 继续获得7峰彩虹珠悬浮和调整/微调 PMT 电压在所有荧光通道, 以达到目标的多边计划的价值, 根据注明的多边计划的目标渠道提供的珠子。
      5. 使用 "记录" 收集大约1万个事件的数据, 并检查 7th峰值珠子的多边信贷。如有必要, 更正 PMT 电压。达到了 7th峰值的目标 "协议" 值后, 记录/覆盖最终 PMT 值的文件。
      6. 保存最终的 pmt 值, 并用日期命名文件 PMT 安装程序, 将保存在制造商软件的目录中。使用此 PMT 设置来纠正每个荧光染料的溢出。
  2. 荧光补偿设置
    1. 标签一管为无瑕控制和每个 fluorochrome 共轭抗体 (参见表 S1 为使用的荧光)。吸管100µL 的缓冲进入每管。
    2. 旋涡的多色补偿珠瓶 (见材料表) 彻底, 然后添加1全滴 (60 µL) 这些珠子的每管。
      注: 避免将珠子滴在管子的一侧, 同时将其添加到每管。这可能导致低珠浓度, 并可能影响补偿矩阵的结果。
    3. 吸管适当的容量计算为一测试 fluorochrome 共轭抗体充足 (将足够着色 106细胞) 入相应的管子和漩涡彻底地。不要增加无瑕控制管的抗体。在室温下 (RT) 在黑暗中孵化15至30分钟。
    4. 添加4毫升的洗涤缓冲液 (磷酸盐缓冲盐水 (PBS)/0.05% azide-0.1%human 血清白蛋白 (见材料表)) 每管。离心管在 300g为10分钟. 去除上清液并并用重悬珠粒, 在每管中加入0.2 毫升洗涤缓冲器。彻底涡流管。
    5. 打开制造商的分析软件 (见材料表), 并创建一个新的实验 (在菜单: 实验, 新的实验, 选择空白实验), 并改名为补偿文件与当前日期。
    6. 转到 "细胞仪设置", 并使用3.1 节中的 PMT 设置。确保 FSC 中的阈值为 5000, 所有使用的荧光的补偿值为零。
    7. 根据需要创建补偿控制, 包括特定于标签的管。一定要包括无瑕控件。从菜单中选择: 实验、补偿设置、创建补偿控制。
    8. 负载无瑕控制管和调整 P1 门周围的单线珠人口, 并确保 P1 门只包含单线珠。
    9. 右键单击 P1 门, 然后选择 "应用于所有补偿控制"。记录所有单标记荧光管的数据。验证 P2 门是否包含每个荧光直方图上的正种群。如果需要调整门。
    10. 计算补偿。选择实验, 补偿设置, 计算补偿。
    11. 如果补偿计算不成功, 将显示一条错误消息。进行必要的调整, 然后重新计算。当补偿计算成功时, 将出现一个对话框, 提示输入补偿设置的名称。
    12. 输入名称 (例如 YY-DD 8 颜色设置) 并单击、链接和保存。补偿设置也将保存到补偿设置目录中。
      注意: 相同的设置可以用于所有使用相同显影的实验。

4. 流式细胞仪评估 (LAIP 和方法)

注: 在这里, 我们描述的散装裂解过程前染色, 这使染色的首选浓度的白细胞。大多数的 MRD 协议使用这种方法, 虽然有些已经成功地使用了其他选项, 如染色前溶解。全骨髓染色在裂解前最大限度地减少优先细胞损失12, 但有不可预知的, 太低的细胞浓度的缺点。

  1. 细胞大量裂解
    注: 保持 unmanipulated 样品水平在 RT, 当流 cytrometric 收购不能在同一天进行, 以启动整个过程的第二天。
    1. 并用重悬抗凝骨髓标本, 通过多次反转样品, 使其均匀。用细胞染色赫尔穆特·蒂尔克溶液的细胞计数室测定骨髓细胞 (白细胞计数) 的浓度 (见材料表)。
    2. 吸管所需的骨髓体积成一个单独的15毫升管。细胞数量取决于分离的染色管的数量;为一染色 (一管) 使用大约 2 x 106白细胞为 LAIP 测量和 8x106白血球细胞为测量的对地管。
    3. 溶解红细胞通过添加株溶藻溶液 (见材料表)。所需的株溶藻溶液体积应为细胞悬浮量的10倍。
    4. 轻轻混合, 通过反转和孵化10分钟在 RT。离心机7分钟800g 在 RT. 丢弃上清 (例如用真空泵或巴斯德吸管)。并用重悬细胞颗粒在磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)/0.05% azide-0.1%human 血清白蛋白 (见材料表) 在 RT. 使用管的最大容积。
    5. 离心机7分钟800g 在 RT. 丢弃上清 (例如用真空泵或巴斯德吸管). 将 PBS/0.05% azide-0.1%hsa 中的细胞颗粒重新悬浮到 100x106的细胞浓度, 并除以预期管数。
  2. 流式细胞术细胞的染色
    1. 吸管单克隆抗体 (摩押) 鸡尾酒解决方案混合到适当的荧光活化细胞分选机管和孵化与裂解骨髓细胞在黑暗中15分钟。
      注意: 当使用串联染料时, 这一点非常重要。例如, 请参阅我们实验室使用的面板标准的混合 (表 S1)。
    2. 用3毫升 PBS/0.05% azide-0.1%has 清洗细胞。在 400g上离心单元格5分钟。放弃上清 (例如用真空泵或巴斯德吸管) 和并用重悬细胞颗粒在300µL PBS/0.05% 叠氮化物0.1%HSA。
    3. 用于并用重悬测量: 在分析中使用400µL PBS/0.05% azide-0.1%hsa 中的细胞颗粒, 加上4µL 的空白珠 (如 Spherotech, 见材料表) 作为阴性对照种群。
    4. 在检测和 1X106白细胞的后续行动中, 打开用于测量 aml 患者样品的至少10万个白细胞门控事件的 mrd 或多项试验。对于在诊断和跟踪可靠的4x10 结果时, 至少对6白细胞进行了实验测量。
    5. 使用标准化的适当文件名保存数据以分析结果。清点反洗钱细胞和反洗钱干细胞 (阳性、阴性、过/下表达) 的不同测量标记, 并将这些数据存储在实验室日志中。
    6. 如果没有诊断 LAIP 可用, 测量所有4管在后续行动, 以确保任何可能的可测量的 LAIP 可以确定在不同的从正常的方法。
    7. 选择在诊断时建立的最可靠的 LAIP13 , 并获取尽可能多的事件, 但 > 定义的最小数字。

5. 白血病相关免疫表型 (LAIP) 的鉴别: 不同细胞群的分析

注意: FCS 文件可以用几个软件程序进行分析, 以实现不同细胞群体的最佳可视化 (见材料表)。

  1. 白血球数量
    1. 门 CD45 阳性细胞和可行的出现细胞, 留出低 fsc (非生存细胞, 红细胞) 内的 fsc/SSC 地块;这些包含白细胞 (图 3Ai)。显示白细胞并使用一个原始标记 (例如 CD34;图 3Aii) 帮助确定爆炸在 de CD45dim 区域中的最终位置 (图 3Aiii)。
    2. CD45dim 单元格和后浇门在 FSC/SSC 图中的单元格 (图 3Bi)。删除 CD34 门 (图 3Bii), 同时将此门中的%cells 报告为程序中的人口树中的%blasts。在 SSC/CD34 图中显示爆炸, 并将 CD34 阳性单元格 (Figure3比尔) 放在门上。
  2. 淋巴细胞
    1. 用淋巴细胞作为内部控制: 髓细胞作为阴性对照和淋巴种群作为一种积极的控制。
    2. 从白血球数量 (图 4A) 开始。门淋巴细胞为 CD45高/SSC低人口 (图 4B)。
    3. 请确保门中没有髓细胞, 使用 CD34、CD117、CD13 或 CD33 和门来 CD13 negative/CD33 阴性细胞 (图 4-c)。在 "人口树" (图 4F) 中调用此填充 "淋巴细胞"。
  3. LAIP 诊断
    1. 门的爆炸和随后的 CD34 阳性细胞在一个 SSC/CD34 的情节和调用这些 ' 原始标记 ' 在人口树。
    2. 绘制原始细胞, 在这种情况下 CD34 阳性, 和淋巴细胞在一个新的情节与淋巴标记 (CD7) 对髓系标记 (CD33)。门异常的人口 (参见为指南补充文件 1) 并且叫他们 ' LAIP 正面 ' 在人口树。
      注: 最后选择的 LAIP 被报告为 LAIP 对爆炸种群的%。LAIPs 的敏感性、特异性和稳定性, 只有在 MRD 测量方面有丰富经验的人员才能建立。这些参数的总和决定了 LAIP 的质量。图 5 -d中给出了诊断四种不同 LAIP 评估的示例。
    3. 确定 LAIPs 的表达式 (在爆炸中%), 并将这些数据保留在数据库或 excel 文件中。
    4. 报告 LAIPs 的分析和必须在 MRD 测量中使用的注释。
      注: LAIPs 的定义在专家组中得到授权, 因为它是在后续行动中精确的 MRD 测量的基本特征。
  4. MRD 在后续
    1. 门的爆炸如5.1 所述, 但取决于治疗后的时间点;正确评估这道门可能会有挑战性。关注在诊断和门不成熟人群中建立的 LAIP 表型。
    2. 如5.1 所述。根据定义的偏航找到正确的浇口, 并注意再生骨髓和正常表达, 以便将其门外。
    3. 在所有随访点重复相同的门控策略, 并确定 MRD 是整个白细胞人群中 LAIP 细胞的百分比。有关图 6A和6B的示例, 请参见。
    4. 报告 mrd 阳性, 当% 的 mrd 是≥0.1% 的白细胞。以标准格式打印分析数据, 每周与 MRD 团队讨论。在达成共识后登记结果。在将结果传达给临床医生之前, 让上级授权结果。

6. 干细胞 MRD (单管) 的分析14

  1. 诊断与随访中的检测分析
    1. 浇炸细胞如第 5 . 1 节所述。
    2. 作为潜在的阴性控制 CD38-, 门红色细胞-分数 (即在裂解后剩余的红细胞, 特征为 SSC低/FSC低和 CD45阴性)。如果需要, 死细胞和细胞碎片可以被排除在这个情节额外的门。
    3. 在白血病爆炸门之内确定亚人口以 CD34 的表示。在此填充中选择 CD34+ CD38 单元格 (用作截止: 空白校准珠的上边框用于阈值确定 (参见材料表)、红色分数或使用 10 3作为截止点)。调用此填充 "CD38低祖" (图 7)。
      注: 有关设置 CD38 级别的详细信息, 请参阅补充文件1。
    4. 在该 CD38低人口中确定真正的 CD34+CD38非常低干细胞填充, 使用红色分数的中点, 空白校准珠的下边框或选择 102作为截止点 (图7).有关设置 CD38 级别的详细信息, 请参阅补充文件1。
    5. 在这两种人群中, 通过分析面板中所提供的每个白血病标记 (即 CD45RA、combi-6 (CLEC12A、TIM-3、CD7、CD11b、CD22 和 CD56 全部在 PE)、CD123、CD33 和 CD44), 将白血病干细胞与正常造血干细胞 (细胞间与 HSC) 结合在一起。
    6. 绘制感兴趣的干细胞标记与其他干细胞标记, 比较阳性/阴性与其他标记的阳性/阴性, 并微调与 HSC 频率。
    7. 报告未成熟的爆炸, 淋巴细胞, CD34+ 细胞的百分比。对于所有单独的标记, 请列出 CD38低和 CD38verylow的总数, 以及 CD38低和 CD38verylow (这些标记为正数 (从而导致肿瘤) 的数目。
    8. 选择最能区分正常造血干细胞与白血病干细胞的标记物进行进一步分析。计算在全白细胞中的百分比和 HSC 的百分比。
      注: 在诊断时, ≥0.004% 的中度的百分比被报告为 "对位" 阳性, 而截止时间为0.0001%。异常干细胞在后续样品中的浇口与诊断相似, 然而, 干细胞种群中的细胞数可能非常小。因此, 必须获得足够的事件。

Representative Results

在90% 的 AML 患者中至少可以发现一个 LAIP。为了在诊断时生成原始爆炸细胞的 LAIP + 细胞的准确百分比, 必须在图 3中直观地确定爆破闸门的适当设置。在图 5中, 在 CD34+ 基元单元格中窝藏特定类型偏航的每个患者的示例都将被可视化。为在后续行动中测量 MRD, 早期定义的 LAIP + 细胞被门控, 并被定义为 LAIP + 细胞的百分比. 因此, 这门的设置是至关重要的, 以取得正确的 MRD 结果。图 6显示了在第二个循环诱导治疗后, 患者在完全缓解后复发, 患者在有了 MRD 阳性结果 (≥ 0.1%) 后反复发作。

目前的协议只适用于定义 CD34+ 细胞中的干细胞, 因为对这一舱室的深入描述表明, CD38 种群的干细胞, 如分数。为了在这一小部分中分离出 HSC, 使用额外的标记。通常选择的标记区分 CD45RA 和组合信道窝藏6个特定的, 标记为 PE 标记。根据进一步的临床评价, ≥0.004% 的截止水平被定义为 "内联" 阳性, 并与诊断中的生存率差有关, 而在以雷锋10中使用了0.0001% 的截止水平.

Figure 1
图 1:骨髓涂片.A) 健康捐献者和 B) 反洗钱患者 (5 亚型)。姬姆萨染色显示在100x 倍放大。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 正确的生物液体包装材料.关于运输生物液体的规则和条例的更多细节可以在疾病控制和预防中心的网站15中找到。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 用于定义爆破单元的浇口策略.A) 门 CD45dim, B) 浇 CD34+ 爆炸。

Figure 4
图 4: 门控淋巴细胞.A) 蓝细胞是在 FSC/SSC 图中显示的白血球, B) 绿色细胞是以 CD45高/SSC低为特征的淋巴细胞, C) 为 CD117 和 E) 负性的阴性的例子 CD13, F) 不同的细胞类型显示在一个概述人口树。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: LAIPs 在 AML 诊断中的应用.A) 基于十字血统偏航 (CD7 CD33 表达单元), B) LAIP 基于异步分化 (CD11b 表达细胞), C) CD13 基于表达比正常细胞 (LAIP非常高的 CD34 表达细胞), D)LAIP 基于 underexpression 比较正常细胞 (HLA-DR低在 CD33 表达细胞)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: LAIP 在治疗过程中遵循.a) LAIP 在诊断方面的定义 (CD34+/CD13+/CD33) 和在随访过程中 LAIP 在持续完全缓解、B) LAIP 诊断的定义 (CD117+/CD7+/CD33+) 和持续 LAIP 在患者随访中的连续性复发.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 干细胞门控.A) 基于珠子的不同 CD34+/CD38 种群的门控 (CD38低位于珠子的上部边界下面, 而 CD38非常低被定义为代表该边缘的真实负单元格, 位于珠子的中点以下), B) 二根据 CD45RA阴性和 CD45RApos表达式, 在后续行动中区分 HSC 和 "内星" 的患者的例子。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

有充足的数据可以证明 mrd 阳性与生存不良有关, 因此 mrd 评估可以通过提供额外的预后信息来提高患者预后, 从而可以做出临床决定。因此, 对 MRD 进行免疫表型评估的一致统一方法对于最终改善患者治疗至关重要。在比较不同临床部位的临床研究时, 这一点也很重要, 最终可能有助于临床决策, 并作为总生存的替代临床终点。有必要为精确和一致的 MRD 测量提供坚实的指导方针, 这一概念导致欧洲白血病网络 (民族解放军) 协同行动, 设计了艺术指南的现状。这份全面的文件将 late-2017 出版, 将有助于许多研究小组和实验室向前迈进。

议定书内的关键步骤

mrd 分析的一个重要而经常被忽视的方面是样品质量对 mrd 准确测定的影响。鉴于在这一背景下需要考虑到额外的操作考虑, 在全球临床试验中必须将材料运送到其他研究所, 这一点更明显。为了减少混淆患者信息和及时提供样本的风险, 适当的管理是至关重要的。再次, 在运输的这个阶段, 正确的形式和/或导入到电子医院系统中, 要求分析的明确任务是必需的。注意到对 MRD 取样治疗的阶段也至关重要, 因为它可能与临床决策有关 (例如在第二疗程后), 因此应明确界定。模拟数据的使用 (例如, 出生年的 1月1日) 增加了混合病人或分析的风险。如法律要求, 应采用另一种匿名的身份查验方式。

所有免疫分型的标本应优先处理24小时内收集。虽然不能推荐, 但在常温下, 骨髓和外周血标本仍可进行处理和分析。此外, 所有搬运的材料都可以在无菌条件下进行, 因此 (局部) 生物库细胞的进一步超低温保存仍然是相关的: 许多临床研究还有进一步的分析, 以进一步研究白血病细胞与关于分子、免疫表型和功能性功能, 将在稍后阶段进行。然而, biobanking 的细节不在本手稿的范围之内。

使用 mrd 作为诊断工具意味着它需要一个认可的实验室, 不仅用于流式细胞术, 而且还涉及对 MRD 评估的质量控制。这可能需要向特定的参考实验室分发样本, 或者 (重新) 通过参考小组的 MRD 测量来分析流程文件。

本文介绍了从骨髓穿刺收集到测定临床样品中的 MRD 的最重要的行动-需要一整个专家小组的具体任务, 责任, 并经常沟通, 以有效表征和分析。由于每项任务对程序都至关重要, 因此建议在每个实验室都有健全的后勤, 包括各项议定书, 以及为这项任务专门培训的足够的备份人员。此外, 由于部分程序中有一些相对主观的步骤 (特别是 LAIP 和的异常标记识别), 因此必须对团队的最终结果进行讨论, 并有一个小组授权的最终报告。主管.目前的努力正在寻求计算机软件开发, 这将有助于标准化 (LAIP 和) MRD 分析。

修改和疑难解答

每个实验室都可以有它自己的一套抗体, 可以用来定义不同的亚人口, 虽然有一个标准化的标志骨干是必不可少的可比结果, 如民族解放军的艺术准则的《 MRD 测量文件》概述上文所述。无论选择的标记有哪些问题, 都可以使分析结果变得困难, 需要加以考虑。

技术的局限性

在诊断和监测期间 (在治疗期间和之后), 首先评估 LAIP 和基因检测异常标记表达的鉴别, 以准确描述 MRD 表型。虽然超过95% 的患者可以通过 LAIP 或 (或两者) 评估, 但仍有一些患者没有定义的 LAIPs 或没有 CD34+CD38 肝干细胞或存在 CD34 阴性爆炸, 或有一个失踪的诊断样本。 在这些情况下, 仍然值得尝试和测量 MRD 与一个抗体的面板广泛, 因为可用细胞的数量允许, 然后选择最可靠 (给予白血病细胞最强的区别) LAIP。考虑到最终复发患者的比例并不完全类似于诊断免疫表型, 由于 AML 疾病的异质性, 因此建议在 MRD 测量一个广泛的抗体组。这些免疫表型转移包括爆炸细胞和肝干细胞, 并已被证明发生在治疗16和重大疾病可能基于这些所谓的即将到来的人群。然而, 目前还没有确定所有免疫表型的亚人口是否会导致疾病复发, 因此不常见的做法是报告根据这些细胞在临床试验中的 MRD 定制疗法。重要的是要注意到, 由于人口转移而导致的缺音的风险减少了, 其中最重要的偏航定义标记在一个流式细胞仪 (PE) 通道14中的一个管方法。

关于现有方法的意义

本协议中描述的方法依赖于一个或多个 LAIPs 的定义, 在治疗过程中遵循细胞。这种方法的缺点是最近已经表明 LAIP 可能会在治疗过程中发生变化。这样, 一些有不同异常标记的即将到来的人群可能会被遗漏。为了规避这种情况, 最好是测量所有异常标记, 而不是仅检测诊断结果。这将类似于几个实验室17使用的 "不同于正常" 方法。

未来应用

近年来, 在新的临床试验设计中, MRD 受到了格外的关注。在专门治疗方案和靶向药物治疗的时代, 使用 MRD 作为结果措施将减少建立新治疗的临床疗效所需的时间, 最终允许更快地引入急需的治疗方法。选择进入诊所。适当的后勤和实际执行统一的 MRD 评估的意义对今后的反洗钱治疗成功至关重要, 因为 FDA 目前正在调查使用 MRD 作为替代终点的可行性, 而不是全面生存。度量值18。

Disclosures

屋宇署亲切地提供了若干独立研究所用于证实干细胞管的抗体鸡尾酒。作者对这篇手稿没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到荷兰癌症协会 (阿尔卑斯 2013-6371) 和 VONK Egbers 基金会的支持。我们感谢荷兰反洗钱组织工作组的协作和卓有成效的讨论, 以持续改进和标准化反洗钱。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Biosciences 120995496,060996589 and 013729 FACS Canto II 
BD Biosciences 555360 CD7 FITC
DAKO F076701 CD2 FITC
Sanquin M1613 CD36 FITC
BD Biosciences 332778 CD15 FITC
BD Biosciences 335039 CD45RA FITC
BD Biosciences 345810 CD56 PE
BD Biosciences 337899 CD22 PE
BD Biosciences 345785 CD14 PE
Miltenyi Biotec 130-080-801 CD133 PE
BD Biosciences 562566 Clec12a PE
BD Biosciences 565568 Tim-3 PE
BD Biosciences 332774 CD7 PE
BD Biosciences 333142 CD11b PE
BD Biosciences 337899 CD22 PE
BD Biosciences 345810 CD56 PE
BD Biosciences 347222 CD34 PERCP-CY5.5
BD Biosciences 558714 CD123 PERCP-CY5.5
Beckman Coulter B49221 CD117 PE-CY7
BD Biosciences 562854 CD33 BV421
BD Biosciences 345791 CD19 APC
BD Biosciences 333143 CD11b APC
BD Biosciences 345800 CD33 APC
BD Biosciences 345807 CD38 APC
BD Biosciences 641411 HLA-DR APC-H7
BD Biosciences 560532 CD44 APC-H7
BD Biosciences 562596 CD13 BV421
BD Biosciences 348811 CD34 PE-CY7
Beckman Coulter A96416 CD45 Krome Orange
BD Biosciences 655873 CD45 HV500c
BD Biosciences 655051 CST beads 
BD Biosciences 555899 Pharm lysing solution
BD Biosciences 644204 Multicolor CompBeads
BD Biosciences 655051 CST beads
BD Biosciences FACSDiva software
Cytognos Infinicyt 
Spherotech Euroflow RCP-30-5a
Sigma-Aldrich Tuerk solution
Spherotech BCP-100-5 Blank Calibration Particles Beads
         HSA
         Azide
         ddH2O

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References

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Tags

癌症研究 问题 133 急性髓系白血病 可测量残留疾病 白血病干细胞 骨髓吸入 白血病相关免疫表型 荧光活化细胞分选分析
测定急性髓系白血病可测残留病和白血病干细胞的骨髓标本和过程综合协议
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Cloos, J., Harris, J. R., Janssen,… More

Cloos, J., Harris, J. R., Janssen, J. J. W. M., Kelder, A., Huang, F., Sijm, G., Vonk, M., Snel, A. N., Scheick, J. R., Scholten, W. J., Carbaat-Ham, J., Veldhuizen, D., Hanekamp, D., Oussoren-Brockhoff, Y. J. M., Kaspers, G. J. L., Schuurhuis, G. J., Sasser, A. K., Ossenkoppele, G. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (133), e56386, doi:10.3791/56386 (2018).

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