Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Omfattande protokoll till prov och processen benmärg för att mäta mätbara kvarvarande sjukdom och leukemiska stamceller i akut myeloisk leukemi

Published: March 5, 2018 doi: 10.3791/56386
Automatic Translation
*1,2, *3, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2,4, 1, 3, 1
1Department of Hematology, VU University Medical Center, 2Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 3Janssen Research & Development, LLC, 4Princess Máxima Center for Pediatric Oncology
* These authors contributed equally

Summary

Detektering av minimal eller mätbara kvarvarande sjukdom (MRD) är en viktig prognostisk biomarkörer för raffinering riskbedömning och förutsäga återfall i akut myeloisk leukemi (AML). Dessa omfattande riktlinjer och rekommendationer med bästa praxis för konsekventa och korrekta identifiering och detektering av MRD, kan hjälpa att göra effektiva AML behandlingsbeslut.

Abstract

Kriterier för respons i akut myeloisk leukemi (AML) har nyligen återinförts, med morphologic undersökning används för att avgöra huruvida patienter som uppnått komplett remission (CR). Cirka återfaller hälften av de vuxna patienter som angett CR inom 12 månader på grund av utväxten av kvarvarande AML celler i benmärgen. Kvantitering av dessa återstående leukemiceller, som kallas minimal eller mätbara kvarvarande sjukdom (MRD), kan vara en robust biomarkör för förutsägelse av dessa skov. Retrospektiv analys av flera studier har dessutom visat att förekomsten av MRD i benmärgen av AML patienter korrelerar med dålig överlevnad. Inte bara är leukemiska totalbefolkningen, återspeglas av celler hysa en leukemi associerade immun-fenotyp (LAIP), associerade med kliniska resultat, men så är den omogna lågfrekventa subpopulationen av leukemi stamceller (LSC), vilka båda kan vara övervakas genom flödescytometri MRD eller MRD-liknande metoder. Tillgången till känsliga analyser som möjliggör detektering av kvarvarande leukemiceller (stem) på grundval av sjukdomsspecifika eller sjukdomsassocierade funktioner (onormal molekylära markörer eller avvikande immunophenotypes) har drastiskt förbättrat MRD bedömning i AML. Men bör med tanke på den inneboende heterogenitet och komplexiteten av AML som en sjukdom, metoder för provtagning av benmärg och utföra MRD och LSC analys harmoniseras när det är möjligt. I detta manuskript vi beskriva en detaljerad metod för adekvat benmärgsaspirat provtagning, transport, prova behandling för optimal flerfärgade flöde flödescytometri bedömning och gating strategier för att bedöma MRD och LSC i stöd i terapeutiska beslutsfattandet hos patienter med AML.

Introduction

Akut myeloisk leukemi (AML) är en malignitet i benmärgen kännetecknas av defekter i programmet mognad, med onormal spridning och ackumulering av myeloida stamceller, hämning av normal blodbildning, och slutligen benmärgssvikt . Sjukdomen är ytterst heterogen avseende morfologi, immunophenotype, cytogenetik, molekylär avvikelser och gen uttryck signaturer samt behandlingssvar och behandling resultatet1,2. Nuvarande hantering omfattar induktionskemoterapi i syfte att uppnå komplett remission (CR), följt av efter eftergift behandling, som till stor del styrs av resultaten av molekylära, cytogenetiska och immunophenotypic studier och består av antingen flera kurser med ytterligare kemoterapi eller (autologa eller allogena) stamceller transplantation3. Trots hög remission priser efter intensiv kemoterapi av upp till 90%, 5-års överlevnad hos vuxna är endast ca 30-40%, huvudsakligen på grund av utvecklingen av skov som är vanligen resistenta mot kemoterapi och därmed mycket svåra att behandla. Resultatet hos barn är bättre, även om ungefär en tredjedel också återfall. Därför tidig upptäckt av nära förestående återfall kommer att fylla ett ouppfyllt medicinskt behov och kan vägleda efter remission therapy4.

Kvarvarande sjukdom efter behandling kan återspegla summan av alla diagnos och efter diagnos motstånd mekanismer/faktorer. därav kan dess mätning vara prognostiska och instrumentellt för att styra behandlingen. Möjligheten att definiera kvarvarande sjukdom (tidigare kallat minimal residual sjukdom och nu avses som mätbara kvarvarande sjukdom eller MRD) långt under 5% blast celler morfologiska kriteriet är föränderliga landskapet av risk classification. För närvarande är de två metoder som oftast används för att upptäcka MRD flöde flödescytometri- och molekylär-baserade, den senare att utvärderas av omvänt transkriptas PCR (RT-qPCR)5 eller, även om i ett tidigt skede av nästa generation sequencing (NGS). Många studier på vuxna såväl som barn visat redan att olika MRD metoder ge stark prognostisk information i AML både efter induktions- och konsolideringsbehandling terapi6,7, och en ny definition av sjukdom börda ( överlägsen till morfologiska CR) framstår nu8. Detta tyder på att MRD bedömas av flödet och/eller molekylära tekniker bör bli, och i själva verket redan blir, standard i varje klinisk prövning i AML.

Detta manuskript diskuterar detaljerad flödesdata flödescytometri förfarandet för att få en exakt och reproducerbar immunophenotypic karakterisering av MRD i benmärgen prover, inklusive benmärg provtagning och bearbetningsmetoder som föregår flödescytometri. Tillgängligheten av bra kvalitet benmärgen prover vid diagnos och uppföljning är avgörande för framgången för denna mätning över kliniska platser och kliniska prövningar. I själva verket är dessa pre analytiska överväganden också av avgörande betydelse för molekylär (PCR- och NGS) MRD metoder. För immunophenotypic karakterisering av MRD kombineras aberrantly uttryckta markörer med normal myeloisk och stamceller markörer, identifiera en leukemi-associerade immunophenotype (LAIP)9. MRD mäter resultanten av många faktorer som påverkar behandlingssvaret, som inneboende eller förvärvade leukemi läkemedelsresistens, farmakodynamik och kinetik av terapi, immun övervakning och efterlevnad. MRD är därför en mycket stark efter diagnos prognostiska parametern är associerad med kliniska utfallet när dichotomized på en cut-off nivå bestäms av mottagaren-drift kännetecken (ROC) analys. För våra vuxna AML kohort av HOVON 42a studie, cut-off nivån ligger på 0,1% av LAIP positiva celler/total vita blodkroppar. Använder detta kriterium för att fastställa negativa vs positiv MRD status, kan en grupp av patienter identifieras som har en betydligt sämre återfall incidens, skovfria och total överlevnad6. Dessutom beskriver vi mätning av omogna, resistenta leukemiceller med stamceller-liknande funktioner (CD34 + CD38-leukemi stamceller eller LSC), som erbjuder en stark prediktor för patientens resultatet10. Tillsammans LAIP och LSC närmar sig form metoden flöde flödescytometrisk MRD. Metoden LAIP är lämplig för ungefär 90% av patienterna, medan de LSC kan tillämpas i cirka 80% av patienterna. Grupp över 95% av patienterna kan utvärderas för antingen en parameter eller båda.

Slutligen, denna publikation beskriver detaljerade operativa för att bedöma MRD av flödescytometri. Detta omfattar: (1) harmonisering och standardisering av förfaranden för provtagning av benmärg, 2) prov transport vägledning 3) detaljerad beskrivning av leukemic cell detektion med FACS använder flera antikropp paneler inklusive enda cell tube strategier att karakterisera Lexmark Utskriftsassistent, 4) uppbyggnaden av FACS maskiner för standardiserade mätningar, 5) analytiska program för MRD mätningar och 6) analytiska program för LSC upptäckt.

Vi strävar efter att visa alla aspekter av förfarandet även provberedningen eftersom det är sällan diskuteras även om det är en viktig fråga för kvaliteten på det slutliga resultatet. Benmärg aspiration och biopsi är kliniska rutiner används för att utvärdera de hematopoetiska cellerna i benmärgen. Dessa utförs tillsammans med en fullständig blodstatus (CBC) och blod smeta. Den optimala metoden för benmärg aspiration är avgörande för korrekt diagnos och uppföljning för MRD mätning. Dessutom bör en framgångsrik benmärgsaspirat innehålla tillräckligt med celler för att utföra den LAIP och LSC Flödesanalys (minst 10 miljoner viabla celler). Här beskriver vi metoden för att utföra en benmärg aspiration och ge riktlinjer som bör leda till adekvat cell provtagning (och begränsa risken för hemodilution) behövs för korrekt diagnostik och ytterligare forskning. Dessa pre analytiska överväganden är även av avgörande betydelse för molekylär (PCR- och NGS) MRD metoder. Alla prover för immunophenotyping bör behandlas företrädesvis inom 24 h av samling. Även om det inte rekommenderas, kan fortfarande benmärg och perifert blodprover bearbetas och analyseras när förvaras upp till 72 h vid omgivande temperatur. Dessutom bör alla hanteringar med materialet utföras under sterila förhållanden och för att möjliggöra Frysförvaring av sterila celler för senare forskning/kvalitetsbedömning etc.

Protocol

Protokollet följer riktlinjerna för forskning koden och den forskningsetisk kommittén för VU University Medical Center.

1. benmärg aspiration och prov förberedelse

  1. Patienten och materiella beredning
    1. Fyll en eller två 10 mL-sprutor med 1% lidokain med en 16-gauge nål. Byt nål en 21-gauge nål.
    2. Sätt två droppar av 5% EDTA på ett urglas.
    3. Ställa in objektglas (n = 15 med konsekvent patienten numrering och datum) för utstryk förberedelserna.
    4. Placera patienten i laterala decubitus position. Leta upp den bakre överlägsna iliaca ryggraden och markera med penna.
      Obs: I allmänhet, den bakre överlägsna iliaca ryggraden är beläget å ena sidan bredd distala till höftbenskammen och å ena sidan bredd sidled med mittlinjen. Hos kvinnor, kan faktiska ryggraden vara lite mer lateral, hos vissa män som är lite mer mediala.
    5. Desinficera huden med klorhexidin 0,5-1% i etanol från området avsedda biopsi som är passiv i cirklar.
    6. Öppna paketet med sterila handskar, satte på de sterila handskarna och fastställa paketet på bordet för att skapa ett sterilt fält. Öppna paketet med aspiration nålen och placera den på det sterila fältet.
    7. Infiltrera hud och subkutan vävnad och slutligen periostet. På periostet, administrera lidokain på ett sådant sätt att en yta på 1 cm diameter har varit sövd.
      Obs: Adekvat tillförsel av lidokain till periostet är en av de viktigaste faktorerna för patientkomfort. Testa om periostet har varit tillräckligt sövd genom att trycka på den avsedda biopsi platsen med introducerade nålen och frågar om patienten upplever smärta. Notera: barn är helt sövd under hela förfarandet.
    8. Håll aspirera nålen (15 Ga x 2.8 ”) med den proximala änden i handflatan och pekfinger mot sida nålens metall axel nära spetsen; Denna position ger bättre kontroll.
    9. Införa nålen med en roterande rörelse (av snabbt växlande pronera/supinating rörelse) genom huden mot iliaca ryggraden och föra nålen i kontakt med den bakre iliaca ryggraden.
    10. Säkerställa att det är nålen införs i området sövda i periostet; patienten bör känna endast trycket och ingen smärta. Om patienten upplever smärta, antingen flytta nålen eller administrera mer lidokain.
    11. Med mjuka men bestämda tryck, förväg nålen samtidigt vrida det i en alternerande medurs-counter medurs. Hänrycka in i märgen hålrummet upptäcks generellt genom minskad motståndskraft.
    12. Avlägsna mandrängen från nålen. Bifoga en 10 mL tomma sprutan på nålen.
    13. Tillämpa undertryck genom att dra tillbaka sprutkolven med en mild pull. Varna patienten att de kan känna en Kramp känsla och smärta när märgen är att vara aspirerade. Om inte tillräckligt benmärgen benbalkar släpps, bör en annan aspiration utföras med en snabb dra. De flesta benbalkar blir de första 1-2 mL erhålls från inledande pull. Aspirera endast 1-2 mL för att undvika att späda provet.
      Obs: Utspädning kommer att resultera i hemodilution och kan blanda ihop MRD resultat).
    14. Ta bort sprutan och Byt ut mandrängen i aspiration nålen. Mata ut en del av märgen i en klocka-glas och resten i en 8 mL rör belagda med heparin.
      Obs: Invertera varje rör omedelbart efter att placera benmärgsextrakt i provrör att säkerställa adekvat antikoagulation. Benmärgen koagulation är ofta orsaken till olämpligt material. Ytterligare benmärgen kan vara aspirerade från samma plats, men helst nålen är avancerad 5-10 mm innan en ny aspirera fattas. Helst bör inte mer än 2 dragningar per införande nivå tas. Se till att markera rören med ökande siffror som representerar först, andra eller på varandra följande dragningar. Det är vanlig regel att använda det första bytet för den mest relevanta diagnostiska analysen.
    15. Alternativt, dra tillbaka nålen från insättningspunktens plats och återinföra det i benmärg hålighet några millimeter från den ursprungliga insättning platsen och upprepa proceduren.
      Obs: Inte aspirera mer än 1-2 mL per drag, att undvika betydande blod kontaminering.
    16. Upprepa så ofta material behövs. När tillräckligt underlag för specifika kliniska studieprotokollet är aspirerade nålen benmärg.
      Obs: Vid långsam eller annars svårt benmärgen ambitioner användning av sprutor som var före spolas med antikoagulantia kan vara till hjälp. Vid en torr kran, utför en trephine biopsi som är utanför räckvidden för detta manuskript.
  2. Förberedelse av cellprov för morphologic bedömning
    1. För optimal morfologisk bedömning, plocka ut benbalkar (t.ex. med en plast spatel) från aspirera i watch-glaset och placera dem på en glasskiva.
    2. Placera försiktigt en annan glasskiva över bilden med märg och skjut försiktigt; Undvik alla påtryckningar.
      Obs: Endast vid mycket stora benmärgen benbalkar lätt tryck kan utövas, för att minska tjockleken på cell spridning. Förfarandet fördelarna med hjälp av en assistent som kan hantera preparatet rören. Korrekt märkning av rören med patient nummer och antal sekventiell benmärgen dragningen är avgörande.
    3. Torka i bilden ordentligt och sedan utföra kan Giemsa Grünwald färgning (se tabell material). Undersöka under mikroskopet ljus för morfologi (se figur 1).
      Obs: Figur 1A visar utstryk av friska benmärgen bestående av olika funktionella celltyper medan figur 1B en AML patient med huvudsakligen leukemiska Blaster. För att bättre definiera resterande leukemiska bördan, behöver immunophenotyping utföras.

2. transport av material för vidare bearbetning

  1. Beredningen av proverna för transport
    1. För att kontrollera att materialet inte kommer att läcka och rören inte kommer att bryta, säkerställa rätt förpackning (se figur 2).
      Obs: Från våra och andra upplevelser livskraften hos cellerna bevaras bäst när benmärgen hålls vid rumstemperatur. För långsiktiga transport uppnås detta bäst med hjälp av en rumstemperatur 'gel-pack' till stöd i temperaturstabilitet under transporten.
    2. Etikettera paket och lägga till de rätta formerna för att undvika förlust av paketet, långvarig transport eller växling av patienter.
      Obs: Detta bör åtminstone innehålla: (blankett 1) patientdata. Detta bör omfatta studienummer och vanligen 'Datum för födelse'. Viktigt för rätt bearbetning av materialet efter ankomsten till den mottagande lab, är ett tydligt uttalande av specifikt önskade laboratorieanalyser (molekylär diagnostik, immunophenotyping, MRD etc.) i det här formuläret. (Blankett 2) Adress och telefon antalet en kontaktperson, och när behov legitimationshandlingar för tullfrågor. För att undvika att förlora paket med posten, meddelar skicka laboratoriet alltid mottagande labbet som ett prov har sänts. Rekommenderas användning av ”spår och spår”.
  2. Ta emot prover från andra institut
    1. Se till att lämplig logistiken är på plats vid Institutet att få provet vid laboratoriet så snart som den levereras vid Institutet.
      Obs: För optimal logistisk organisation helst ett centrallaboratorium krävs, som tar emot och samlar in allt material från den lokala kliniken och från externa sjukhus. I synnerhet är det viktigt att tilldela protokoll för distribution och tydlig kommunikation med executive laboratorier.
    2. Efter att ha mottagit proverna, noggrant Observera lämpliga numreringen i papperskopia former och en skyddad databas som innehåller viktiga områden såsom MRD ID-nummer, rättegång särskilda ID-nummer, sjukhuset registreringsnummer, skicka institute, födelsedatum, material typ (benmärg eller perifert blod), antal vita blodkroppar (WBC), datum för benmärg aspiration, datum för mätning av provet och eventuella kommentarer som är relevanta för kvaliteten på mätningen.
      Obs: Helst denna databas är även utrustad för att innehålla tilläggsdata (eller kopplas till andra databaser) av analysresultat, och ytterligare patientdata såsom uppföljningsdata.

3. flöde Cytometer Setup

Obs: Detta avsnitt är baserad på Euroflow instruktioner. 11

  1. Set up av fotomultiplikatorn (PMT) spänningar för FCS SSC parametrar och målet fluorescens kanaler
    1. För FCS SSC parametrar startar upp flödescytometer och utföra ”Cytometer Setup och spårning (CST)” kör på flödescytometer med CST pärlor (se tabell material). Lysera röda blodkroppar från en frisk givare (beskrivs i avsnitt 4.1).
      1. Skapa ett nytt experiment (i menyn: Experiment, nya Experiment, Välj Tom experiment) med tillverkarens programvara (se tabell material) med en framåt scatter (FSC) kontra sidled spridningsdiagram för (SSC) dot för att ställa in parametrarna FSC och SSC. Namnge detta experiment FSC/SCC PMT med datum. Först använda de aktuella inställningarna för cytometer (rätt klick: ”tillämpa nuvarande CST”). Dessa inställningar har genererats med den CST prestanda Kontrollera använder CST-kalibrering pärlor (se tabell material). Justera FSC och SSC för att visualisera lymfocyter i ”globalt experiment inställningar”. Obs: i vårt flödescytometer dessa är 285 V och 400 V respektive. Bocka av ”aktivera ersättning”: inspektör/Instrument inställningar/ersättning.
      2. För att bedöma storleken på celler (FSC) och granularitet (SSC) lyserat börja mäta omärkt perifera blodkroppar av funktionen ”förvärva celler”. Utfärda utegångsförbud för av lymfocyter och justera/fine-tune FSC och SSC spänningar att nå de följande genomsnittliga målvärdena för gated lymfocyter befolkningen: FSC: 100.000 (intervall 95.000-105.000); SSC: 15.000 (intervall 13.000-17.000).
      3. Förvärva och registrera data genom att mäta minst 10.000 händelser. Kontrollera genomsnittliga FSC och SSC målvärden för gated lymfocyter och justera om nödvändigt.
    2. För att ställa in målet fluorescensen använda kanaler PMT spänningar 8-peak rainbow pärlor kalibrering partiklar (se tabell material).
      1. Skapa ett nytt experiment på FACS för 7-toppar. Skapa ett kalkylblad ”Target genomsnittlig fluorescerande intensitet (MFI)” med alla nödvändiga dot tomter (n = 2; FSC kontra SSC, FITC kontra PE), histogram (n = 8; ett histogram för varje fluorescensdetektor) och statistik som visar hänvisningen toppvärden (MFI och variationskoefficienten (CV)) för varje kanal som fluorescens.
      2. Förbereda färska en lösning innehållande 1 droppe (± 60 µL) av rainbow pärlor i 1 mL dH2O. försiktigt vortex att blanda pärlor i lösning.
      3. Använda PMT inställningarna av FSC/SSC spänningar från ovan och börja mäta fluorescensen av rainbow pärlor med hjälp av funktionen ”förvärva” (utan inspelning) med ”låg” flödeshastighet med ett tröskelvärde på 5 000. Använd knappen ”rektangulära gate” Gate singlet pärlor befolkningen P1 i FSC kontra SSC dot tomt. Utfärda utegångsförbud för den 7: e PEAK - befolkningen P2 i FITC kontra PE dot tomt.
      4. Fortsätt förvärvet av 7-peaks Rainbow pärla fjädring och justera/fine-tune PMT spänningar i alla fluorescens kanaler når målvärden MFI enligt de kommenterad MFI mål kanalerna enligt med pärlor.
      5. Använda ”Record” för att samla in data av cirka 10 000 händelser och kontrollera MFI för den 7: e topp pärlor. Rätta PMT spänningar om nödvändigt. En gång målet MFI värden för 7th topp nås, post/skriva över filen PMT slutvärdena.
      6. Spara PMT slutvärdena och döp filen till PMT Setup med det datumet, som kommer att spara i katalogen av tillverkarens programvara. Använda denna PMT-installation för att korrigera utsläppet över för varje fluorescens färgämne.
  2. Fluorescens ersättning inställningar
    1. Märka en tub för ofärgade kontrollen och varje fluorokrom konjugerad antikropp (se tabell S1 för de begagnade fluorokromer). Pipettera 100 µL buffert i varje rör.
    2. Vortex injektionsflaskan med multicolor ersättning pärlor (se tabell material) grundligt och sedan lägga till 1 full droppe (± 60 µL) av dessa pärlor i varje rör.
      Obs: Undvik droppande pärlorna längs sidan av röret när du lägger till dem till varje rör. Detta kan leda till låg pärla koncentration och kan påverka resultaten av matrisen ersättning.
    3. Pipett som lämplig volym beräknas för ett test av fluorokrom-konjugerad antikropp tillräckligt (vilket skulle vara tillräckligt att färga 106 celler) in i motsvarande tube och vortex grundligt. Lägg inte antikropp ofärgade kontroll röret. Inkubera i 15-30 min i mörker vid rumstemperatur (RT).
    4. Tillsätt 4 mL tvättbuffert (fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS)/0.05% azide-0.1% humant serumalbumin (HSA) (se tabell material)) till varje rör. Centrifugera rören på 300g för 10 min. avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten pärla genom att tillföra 0,2 mL av tvättlösning till varje rör. Vortex rören grundligt.
    5. Öppna tillverkarens analysprogramvara (se tabell av material) och skapa ett nytt experiment (i menyn: Experiment, nya Experiment, Välj Tom experiment) och döp som ersättning-fil med dagens datum.
    6. Gå till ”cytometer inställningar” och använda inställningen PMT från avsnitt 3.1. Vara säker på att tröskelvärdet i FSC är 5.000 och kompensationsvärden för alla de begagnade fluorokromer är noll.
    7. Skapa ersättning kontroller, inklusive etikett-specifika rör, som behövs. Var noga med att inkludera en ofärgade kontroll. Välj från menyn: Experiment, kompensationsinställningar, skapa ersättning kontroller.
    8. Ladda den ofärgade kontrollrör och justera P1 grinden runt singlet pärla befolkningen och se till att utfärda utegångsförbud för P1 innehåller endast singlet pärlor.
    9. Högerklicka på P1 grinden och välj ”applicera till alla ersättning kontroller”. Registrera data för alla enda märkt fluorescens rören. Verifiera att P2 gate omfattar positiva befolkningen på varje fluorescens histogrammet. Vid behov justera grinden.
    10. Beräkna ersättning. Välj Experiment, kompensationsinställningar, beräkna ersättning.
    11. Om ersättning beräkningen inte är framgångsrika, visas ett felmeddelande. Göra nödvändiga justeringar och omberäkna. När ersättning beräkningen lyckas visas en dialogruta återkommande erbjudanden för namnet för kompensationsinställningar.
    12. Ange ett namn (till exempel åå-MM-DD 8 färg setup) och klicka på länken och spara. Kompensationsinställningar sparas också i ersättning installationen katalogen.
      Obs: Samma inställningar kan användas för alla experiment med den samma fluorophores.

4. flödet flödescytometri bedömning (LAIP och LSC)

Obs: Här beskriver vi bulk lysis förfarandet innan färgning, vilket gör för att färga en rekommenderad koncentration av WBC. De flesta MRD protokoll använder denna metod även om vissa har framgångsrikt använt andra alternativ såsom färgning innan lysis. Hela benmärgen färgning innan lysis minimerar förmånliga cell förlust12, men har nackdelen att oförutsägbara, för låg cell koncentrationer.

  1. Bulk lys av celler
    Obs: Hålla omanipulerat proverna horisontella RT, när flödet cytrometric förvärv inte kan utföras samma dag för att börja hela förfarandet nästa dag.
    1. Resuspendera Antikoagulerat benmärgen provet homogenitet genom att vända provet flera gånger. Bestämma koncentrationen av benmärgsceller (vita blodkroppar (WBC)) med hjälp av en cell som räknar kammare med cell färgning Tuerk lösning (se tabell material).
    2. Pipettera behövs volymen av benmärgen in en separat 15 mL tub. Mängden celler är beroende av antalet separata färgning rör; Använd ca 2 x 106 vita blodkroppar för LAIP mätningar och 8 x 106 vita blodkroppar för mätning av LSC röret för en färgning (ett rör).
    3. Lysera röda blodkroppar genom att lägga till lyseringslösning lösning (se tabell material). Volym som krävs av lyseringslösning lösning bör vara 10 gånger volymen av cellsuspensionen.
    4. Blanda försiktigt genom inversion och inkubera i 10 min vid RT. Centrifugera under 7 min 800g på RT. Kassera supernatanten (e.g. med en vakuumpump eller Pasteur-pipett). Återsuspendera cellpelleten i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS)/0.05% azide-0.1% humant serumalbumin (HSA) (se tabell material) på RT. användning den högsta volymen av röret.
    5. Centrifugera under 7 min 800g på RT. avlägsna supernatanten (e.g. med en vakuumpump eller Pasteur-pipett). Återsuspendering cellpelleten i PBS/0.05% azide-0.1% HSA till en cell koncentration på 100 x 106 WBC/mL och dela över antalet avsedda rör.
  2. Färgning av celler för flödescytometri
    1. Pipettera monoklonal antikropp (MoAb) cocktail lösning blanda in i lämpliga fluorescens-aktiverad cell sorterare (FACS) rören och inkubera med lyserat benmärgsceller för 15 min i mörker.
      Obs: Detta är mycket viktigt när tandem-färgämnen används. Exempelvis se mixar av panelerna standardmässigt används i vårt laboratorium (tabell S1).
    2. Tvätta cellerna med 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% har. Centrifugera cellerna för 5 min vid 400g. Kassera supernatanten (e.g. med en vakuumpump eller Pasteur-pipett) och Omsuspendera cellpelleten i 300 µL PBS/0.05% azide-0.1%HSA.
    3. LSC mätning: Återsuspendera cellpelleten i 400 µL PBS/0.05% azide-0.1% HSA och tillsätt 4 µL av Tom pärlor (t.ex. Spherotech, se tabell material) att använda som negativ kontroll befolkningen i analysen.
    4. Öppna MRD eller LSC experiment lay-out på FACS (se tabell av material) och åtgärd för MRD minst 100.000 WBC gated händelser för mätning av AML patientprover vid diagnosen och 1 X 106 WBC för AML prover vid uppföljningen. För Lexmark Utskriftsassistent mäta experiment minst 4 x 106 WBC både vid diagnostik och uppföljning av ett tillförlitligt LSC-resultat.
    5. Spara data med hjälp av ett standardiserat lämpligt filnamn för analys av resultaten. Göra en inventering av de olika uppmätta markörerna på AML cellerna och AML stamcellerna (positiv, negativ, över/under uttryck) och lagra dessa data i journalen lab.
    6. Om det finns ingen diagnos LAIP tillgängliga, mäta alla 4 rör på uppföljning säkerställer att alla möjliga mätbara LAIP kan identifieras i en olika-från-normal inställning.
    7. Välj den mest tillförlitliga LAIP(s)13 etablerat vid diagnos och skaffa sig så många evenemang som möjligt, men > minsta tal definieras.

5. identifiering av leukemi associerade Immuno-fenotyper (LAIP): analyser av olika cellpopulationer

Obs: FCS filer kan analyseras med flera program för optimal visualisering av de olika cellpopulationer (se tabell material).

  1. Vita blodkroppar befolkningen
    1. Utfärda utegångsförbud för CD45 positiva cellerna och livskraftig visasende cellerna, lämnar ut låg FSC (icke-viabla celler, erytroid celler) i FSC/SSC tomt; dessa innehåller WBC (figur 3Ajag). Visa WBC och använda en av de primitiva markörerna (till exempel CD34; Figur 3Aii) att hjälpa till att fastställa den slutliga ståndpunkten av sprängningarna i de CD45dim område (figur 3Aiii).
    2. Utfärda utegångsförbud för CD45dim celler och tillbaka gate cellerna i FSC/SSC tomten (figur 3Bjag). Ta bort CD34 grinden (figur 3Bii) medan rapportering % cellerna i denna grind som % Blaster i ditt befolkningen träd i programmet. Visa Blaster i en SSC/CD34 tomt och gate CD34 positiva cellerna (figur3Biii).
  2. Lymfocyter
    1. Använda lymfocyter som intern kontroll: myeloisk populationer som en negativ kontroll och lymfatisk populationer som positiv kontroll.
    2. Starta från vita blodkroppar befolkningen (figur 4A). Gate-lymfocyter som CD45hög/SSClåg befolkningen (figur 4B).
    3. Kontrollera att det finns ingen myeloida celler i utfärda utegångsförbud för med CD34, CD117, CD13 eller CD33 och utfärda utegångsförbud för CD13 negativ/CD33 negativa celler (figur 4C-E). Kalla denna population 'lymfocyter' i trädet befolkningen (figur 4F).
  3. LAIP vid diagnos
    1. Utfärda utegångsförbud för sprängningarna och därefter CD34 positiva cellerna i ett SSC/CD34 tomt och kallar dessa 'primitiva markör' i trädet befolkningen.
    2. Rita de primitiva cellerna, i detta fall CD34 positiva och lymfocyter i en ny tomt med en lymfoida markör (CD7) mot en myeloisk markör (CD33). Utfärda utegångsförbud för den avvikande populationen (se riktlinjer kompletterande fil 1) och kallar dem 'LAIP positiv' i trädet befolkningen.
      Obs: Den slutliga valt LAIP redovisas som % LAIP på blast befolkningen. Känslighet, specificitet och stabiliteten i LAIPs kan fastställas av personal med gott om erfarenhet i MRD mätningar. Summan av dessa parametrar avgör kvaliteten på LAIP. Exempel på fyra olika LAIP bedömningar vid diagnos ges i figur 5 A-D.
    3. Fastställa ett uttryck för LAIPs (% på Blaster) och bevara dessa data i en databas eller excel-fil.
    4. Gör rapporter FACS analyser och anteckningar i de LAIPs som måste användas på MRD mätningar.
      Obs: Definitionen av LAIPs är auktoriserad i ett team av experter eftersom det är en viktig funktion för noggranna MRD mätningar på Följ upp.
  4. MRD vid uppföljning
    1. Gate Blaster enligt beskrivningen i 5.1 men beroende på den tidpunkten efter terapi; korrekt bedömning av denna grind kan vara utmanande. Fokusera på den LAIP fenotyp som upprättades vid diagnos och gate omogna befolkningen.
    2. Enligt beskrivningen i 5.1. Hitta rätt blast grinden baserat på de definierade aberrancy och vara medveten om regenererande benmärg och normal uttryck för att utfärda utegångsförbud för ut dem
    3. Upprepa samma gating strategi alls uppföljande punkter och avgöra MRD som procentuella andelen LAIP celler i hela vita blodkroppar befolkningen. Se exempel figur 6A och 6B.
    4. Rapportera MRD positivitet när % av MRD är ≥ 0,1% av de vita blodkropparna. Skriva ut analyserade data i ett standardformat för att diskutera varje vecka med MRD-teamet. Registrera resultaten efter konsensus uppnås. Låt resultaten godkännas av handledaren innan kommunicera resultat att klinikerna.

6. analys av Stem cell MRD (LSC enda Tube)14

  1. Analyser av Lexmark Utskriftsassistent på diagnos och uppföljning
    1. Gate blast cellerna som beskrivs i avsnitt 5.1.
    2. Som potentiell negativ kontroll för CD38-, gate erytrocyter-fraktionen (dvs kvarvarande röda blodkroppar efter Lys, karakteriseras som SSClåg/FSClåg och CD45negativa). Om nödvändigt, kan döda celler och cell fragment uteslutas genom en extra grind i denna tomt.
    3. Inom den leukemiska blast gaten fastställa subpopulationen med uttryck av CD34. Välj inom denna population av CD34+ CD38– celler (använda som cut-off: övre gränsen av Tom kalibrering pärlor för bestämning av tröskeln (se tabell material), den röda-fraktionen eller användning 103 som brytpunkten). Kalla denna population 'CD38låg föräldraparets' (figur 7).
      Obs: Se kompletterande fil 1 för ytterligare information om inställningen CD38-pre-cut-off nivåerna.
    4. Bestämma inom denna CD38låg population sant CD34 + CD38mycket låg stamceller befolkningen, med hjälp av medianen för den röda fraktionen, den nedre gränsen av Tom kalibrering pärlor eller välja 102 som brytpunkt (figur 7 ). Se kompletterande fil 1 för ytterligare information om anger nivån på CD38-pre-cut-off.
    5. Inom båda populationerna, gate leukemiska stamcellernas vs. de normala hematopoetiska stamcellerna (LSC vs HSC) genom att analysera varje leukemiska markör i panelen (dvs CD45RA, combi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 och CD56 allt i PE), CD123, CD33 och CD44).
    6. Rita stamcells markör sevärdheter kontra andra stamcells markör att jämföra positivitet/negativitet med positivitet/negativitet av andra markörer och finjustera LSC kontra HSC frekvens.
    7. Rapportera procentuella andelen omogna Blaster, lymfocyter, CD34 + celler. För alla separata markörer, lista det totala antalet CD38låg och CD38verylow och antalet CD38låg och CD38verylow som markör positiva (och således neoplastiska).
    8. Välj för markören som bäst särskiljer normala hematopoetiska stamceller vs. leukemiska stamceller för ytterligare analys. Beräkna procentandelen LSC och HSC som procentandel av totala WBC.
      Obs: En procentandel av LSC ≥ 0,004% redovisas som LSC positiv vid diagnos, medan cut-off är 0,0001% vid uppföljningen. Avvikande stamceller gating i uppföljande prover är liknande analys som vid diagnos, men cell nummer i stem cellpopulationer kan vara mycket små. Därav nödvändigheten av att förvärva tillräckligt händelser.

Representative Results

I 90% av AML patienter kan minst en LAIP identifieras. För att generera korrekta procentsatserna för LAIP + celler av primitiva blast celler vid diagnos, lämplig inställning av utfärda utegångsförbud för blast är avgörande och behöver kontroll som visualiseras i figur 3. Ett exempel på varje patient som härbärgerat en viss typ av aberrancy i CD34 + primitiva celler är visualiseras i figur 5. För mätning av MRD på uppföljning, tidigare definierade LAIP + cellerna är gated och definieras som andelen LAIP + celler av WBC. Därför är fastställande av denna grind avgörande för att uppnå rätt MRD resultat. Figur 6 visar en patient som finns kvar i fullständig remission och en patient som återfall efter att ha MRD positiva resultat (≥ 0,1%) efter den andra cykeln av induktionsbehandling.

Det nuvarande protokollet är bara lämpligt att definiera stamceller i CD34 + celler, eftersom grundlig karakterisering av kupén har visat att CD38-befolkningen hamnar den mest potenta stamcellen som bråk. För att skilja LSC från HSC inom denna fraktion, används ytterligare markörer. Oftast valda markörer att skilja LSC är CD45RA och kanalen combi härbärgerat 6 specifika LSC markörer märkt med PE. Baserat på ytterligare kliniska utvärderingar, en cut-off nivå på ≥ 0,004% definierades som LSC-positiv och förknippades med sämre överlevnad vid diagnos medan en cut-off nivå på 0,0001% användes på Följ upp10.

Figure 1
Figur 1 : Benmärg utstryk. (A) friska givare och B) AML patienten (FAB 5 subtyp). Giemsa fläcken visas på 100 x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Korrigera förpackningsmaterial för biologiska vätskor. Mer information om de regler och bestämmelser för transport av biologiska vätskor kan hittas på webbplatsen15 av centra för sjukdomskontroll och förebyggande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Gating strategi för att definiera blast celler. (A) Gating CD45dim, B) Gating CD34 + Blaster.

Figure 4
Figur 4 : Gating lymfocyter. (A) blå celler är WBC visas i FSC/SSC tomt, B) gröna celler lymfocyter kännetecknas av CD45hög/SSClåg, C) exempel på negativitet för CD34, D) negativitet för CD117 och E) negativitet för CD13, (F) de olika celltyper visas i en Översikt över befolkningen träd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : LAIPs vid AML diagnos. (A) LAIP baserat på cross härstamning aberrancy (CD7 på CD33 uttrycker celler), B) LAIP baserat på asynkron differentiering (CD11b på CD13 uttrycker celler), C) LAIP baserat på överuttryck jämfört med normala celler (CD34mycket hög på CD13 uttrycker celler), (D). LAIP utifrån underexpression jämfört med normala celler (HLA-DRlåg på CD33 uttrycker celler). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : LAIP följde under terapi. (A) LAIP definition vid diagnos (CD34 + / CD13 +/ CD33-) och förlust av LAIP under uppföljning hos en patient som kvarstod i kontinuerlig fullständig remission, B) LAIP definition vid diagnos (CD117 +/ CD7 +/ CD33 +) och ihållande LAIP under uppföljning hos en patient som recidiverande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Stamceller gating. En) Gating av de olika CD34 + / CD38 populationer baserat på pärlor (CD38låg understiger den övre gränsen av pärlor, medan CD38mycket låg definieras som de sanna negativa celler representerar Lexmark Utskriftsassistent och finns under medianen av pärlor), B) två exempel på patienter med åtskillnad mellan HSC och LSC vid uppföljning utifrån CD45RAneg och CD45RApos uttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här att downoad filen.

Kompletterande fil 2. Vänligen klicka här att downoad filen.

Kompletterande fil 3. Vänligen klicka här att downoad filen.

Discussion

Gott om data är tillgängliga som visar bevis för MRD positivitet att förknippas med dålig överlevnad och därför MRD bedömning kan förbättra patientens resultat genom att tillhandahålla ytterligare prognostisk information som kliniska beslut kan göras. En enhetlig och harmoniserad metod för immuno-fenotypisk bedömning av MRD är därför nödvändigt att i slutändan förbättra patientens behandling. Detta är också viktigt när man jämför kliniska studier på olika kliniska webbplatser, och kan slutligen hjälp i kliniska beslut att göra och tjänstgör som ett surrogat kliniskt effektmått för total överlevnad. Uppfattningen att fasta riktlinjer är garanterade för exakt och konsekvent MRD mätningar har lett till en samordnad åtgärd av Europeiska leukemi nätverk (ELN) design toppmoderna riktlinjer. Detta omfattande dokument blir publicerade sent-2017 och kommer att vara avgörande för många studiecirklar och laboratorier framåt.

Kritiska steg i protokollet

En viktig, och ofta förbisedd aspekt av MRD analys är effekterna av provets kvalitet på noggrann bestämning av MRD. Detta är mer uppenbart när materialet har transporteras till andra institut i globala kliniska prövningar ges ytterligare operativa överväganden som behöver beaktas i denna miljö. För att minska risken för att blanda upp patienten är information och snabb leverans av prover lämpliga administrationen avgörande. Igen, i detta skede av transporten den korrekta former och/eller import till elektroniska sjukhus system med tydliga uppdrag av den önskade analysen krävs. Att notera scenen vid terapi av MRD provtagning är också avgörande, eftersom det kan vara relevant för kliniska beslutsfattandet (till exempel efter fortsättningskurs terapi) och bör därför definieras tydligt. Användning av mock data (såsom till exempel 1 januari per Födelseår) ökar risken för sammanblandning av patienter eller analyser. Om lagen, ska ett alternativt anonymiserat sätt för identifiering användas.

Alla prover för immunophenotyping bör behandlas företrädesvis inom 24 h av samling. Även om det inte rekommenderas, kan fortfarande benmärg och perifert blodprover bearbetas och analyseras när förvaras upp till 72 h vid omgivande temperatur. Dessutom alla hanteringar med materialet kan bäst utföras under sterila förhållanden och så vidare Frysförvaring av celler i (lokala) biobanker förblir relevanta: många kliniska studier har ytterligare analyser att ytterligare utreda leukemiceller med avseende på molekylär, immuno-fenotypisk och funktionella funktioner ska utföras i ett senare skede. Detaljer för biobanker är emellertid inte omfattas av detta manuskript.

Använda MRD som ett diagnostiskt verktyg innebär att den behöver ett ackrediterat laboratorium, inte bara för flödescytometri, men också angående kvalitetskontroll av MRD bedömning. Detta kan kräva distribuerar prover till specifika referenslaboratorier eller (åter) analysera flödet filer med MRD mätningarna av referens lag.

Den här artikeln beskrivs de viktigaste åtgärderna från benmärgen aspirera samling till bestämning av MRD i kliniska prover - som kräver ett helt team av experter med specifika uppgifter, ansvar, och med täta kommunikation för effektiv karakterisering och analys. Eftersom varje aktivitet är avgörande för förfarandet, rekommenderas att ha ljud logistik inklusive protokoll vid varje laboratorium och tillräckligt säkerhetskopiera med personal som har utbildats speciellt för uppgiften. Dessutom, eftersom det finns några relativt subjektiva steg i en del av förfaranden (särskilt LAIP och LSC avvikande markör identifiering), är det viktigt att ha diskussioner om slutresultatet av team, och har slutrapporten godkänts av ett team av handledare. Aktuella insatser bedriver Datorprogramvarautveckling som hjälper dig att standardisera (LAIP och LSC) MRD analys.

Ändring och felsökning

Varje labb kan ha sin egen uppsättning av antikroppar som kan användas för att definiera de olika subpopulationsna även om ha en standardiserad ryggrad av markörer är nödvändigt för jämförbara resultat, som beskrivs i ELN toppmoderna riktlinjerna för MRD mätningar dokument som beskrivs ovan. Oberoende av valda markörer finns det vissa frågor som kan försvåra analysen av resultaten och behöver beaktas.

Begränsningar av tekniken

Identifiering av LAIP och LSC avvikande markör uttryck är först bedömas vid diagnos och övervakas över tiden (under och efter behandling) för korrekt karakterisering av MRD fenotypen. Medan över 95% av patienterna kan utvärderas via LAIP eller LSC (eller båda), fortfarande vissa patienter har inga definierade LAIPs eller ingen CD34 + CD38-LSCs presentera med CD34 negativa Blaster eller ha ett saknas diagnos prov. I dessa fall är det fortfarande värt att prova och mäta MRD med en panel av antikroppar så bred som antalet tillgängliga celler tillåter och välj sedan den mest tillförlitliga (ger den starkaste skillnaden av leukemiska celler) LAIP. Med tanke på att en andel patienter som i slutändan återfall inte helt liknar diagnos immunophenotype, på grund av heterogenitet AML sjukdom, mäta en bred panel av antikroppar på MRD rekommenderas ändå. Dessa immunophenotypic förändringar inkluderar blast celler och LSCs och har visat sig inträffa under terapi16 och mätbara sjukdomen kan baseras på dessa så kallade kommande populationer. Vid denna tid men har det inte fastställts om alla immunophenotypic delpopulationer kommer att leda till återfall, och är därför inte vanligt att rapportera MRD skräddarsydda-terapi baserad på dessa celler i kliniska prövningar. Det är viktigt att notera att risken för saknas LSC på grund av befolkningen skiftar minskas med metoden en tub där de viktigaste aberrancy definiera markörerna är i en flödescytometri (PE) kanal14.

Betydelse med avseende på befintliga metoder

Den metod som beskrivs i detta protokoll är beroende av definitionen av en eller flera LAIPs, vilka celler följs under behandling. En nackdel med denna metod är att det har nyligen visat att LAIP kan förändras under behandlingen. Detta sätt vissa kommande populationer med olika avvikande markörer kan missas. För att kringgå detta, skulle det vara bäst att mäta alla avvikande markörer i stället för endast de som finns vid diagnos. Detta skulle då vara liknande den ”skiljer sig från normal” strategi som används av flera laboratorier17.

Framtida tillämpningar

Nyligen, MRD har fått extra uppmärksamhet för romanen klinisk rättegång design. I en tid präglad av specialiserade behandlingsalternativ och riktade läkemedelsbehandling, användning av MRD som ett resultat kommer att minska den tid som behövs för att fastställa kliniska effekten av nya behandlingar, slutligen möjliggör snabbare införande av brådskande terapeutiska alternativ till kliniken. Betydelsen av lämplig logistik och praktiska utförandet av en harmoniserad MRD bedömning är avgörande för framtida AML behandlingframgång som FDA undersöker för närvarande möjligheten att använda MRD som surrogat effektmått i stället för total överlevnad mäter18.

Disclosures

Antikropp cocktails används för validering av stamceller röret i flera oberoende institut var vänligen tillhandahållen av BD. Författarna har ingenting att avslöja i förhållande till detta manuskript.

Acknowledgments

Denna forskning har stötts av holländska Cancer Society (ALPE 2013-6371) och Egbers stiftelse för VONK. Vi tackar arbetsgruppen holländska AML-MRD för samarbetet och givande diskussioner för kontinuerlig förbättring och standardiseringen av AML-MRD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Biosciences 120995496,060996589 and 013729 FACS Canto II 
BD Biosciences 555360 CD7 FITC
DAKO F076701 CD2 FITC
Sanquin M1613 CD36 FITC
BD Biosciences 332778 CD15 FITC
BD Biosciences 335039 CD45RA FITC
BD Biosciences 345810 CD56 PE
BD Biosciences 337899 CD22 PE
BD Biosciences 345785 CD14 PE
Miltenyi Biotec 130-080-801 CD133 PE
BD Biosciences 562566 Clec12a PE
BD Biosciences 565568 Tim-3 PE
BD Biosciences 332774 CD7 PE
BD Biosciences 333142 CD11b PE
BD Biosciences 337899 CD22 PE
BD Biosciences 345810 CD56 PE
BD Biosciences 347222 CD34 PERCP-CY5.5
BD Biosciences 558714 CD123 PERCP-CY5.5
Beckman Coulter B49221 CD117 PE-CY7
BD Biosciences 562854 CD33 BV421
BD Biosciences 345791 CD19 APC
BD Biosciences 333143 CD11b APC
BD Biosciences 345800 CD33 APC
BD Biosciences 345807 CD38 APC
BD Biosciences 641411 HLA-DR APC-H7
BD Biosciences 560532 CD44 APC-H7
BD Biosciences 562596 CD13 BV421
BD Biosciences 348811 CD34 PE-CY7
Beckman Coulter A96416 CD45 Krome Orange
BD Biosciences 655873 CD45 HV500c
BD Biosciences 655051 CST beads 
BD Biosciences 555899 Pharm lysing solution
BD Biosciences 644204 Multicolor CompBeads
BD Biosciences 655051 CST beads
BD Biosciences FACSDiva software
Cytognos Infinicyt 
Spherotech Euroflow RCP-30-5a
Sigma-Aldrich Tuerk solution
Spherotech BCP-100-5 Blank Calibration Particles Beads
         HSA
         Azide
         ddH2O

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood. 129 (4), 424-447 (2017).
  2. Zwaan, C. M., et al. Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia. J Clin Oncol. 33 (27), 2949-2962 (2015).
  3. Cornelissen, J. J., et al. The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach. Nat Rev Clin Oncol. 9 (10), 579-590 (2012).
  4. Grimwade, D., Freeman, S. D. Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for "prime time"? Hematology. 2014 (1), 222-233 (2014).
  5. Krönke, J., et al. Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group. J Clin Oncol. 29 (19), 2709-2716 (2011).
  6. Terwijn, M., et al. High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study. J Clin Oncol. 31 (31), 3889-3897 (2013).
  7. van der Velden, V. H. J., et al. Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol. Leukemia. 24 (9), 1599-1606 (2010).
  8. Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. MRD in AML: time for redefinition of CR? Blood. 121 (12), 2166-2168 (2013).
  9. Feller, N., et al. MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 18 (8), 1380-1390 (2004).
  10. Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
  11. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
  12. Paietta, E. Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept? Bone Marrow Transplant. 29 (6), 459-465 (2002).
  13. Loken, M. R., et al. Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group. Blood. 120 (8), 1581-1588 (2012).
  14. Zeijlemaker, W., et al. A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia. Leukemia. 30 (2), 439-446 (2015).
  15. Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing. , https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html (2017).
  16. Bachas, C., et al. The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse. Leukemia. 26 (6), 1313-1320 (2012).
  17. Ravandi, F., et al. Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia. Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).
  18. Hourigan, C. S., et al. Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).

Tags

Cancerforskning fråga 133 akut myeloisk leukemi mätbara kvarvarande sjukdom leukemiska stamceller benmärg aspiration leukemi associera immunophenotype fluorescens-aktiverad cell sorterare analys
Omfattande protokoll till prov och processen benmärg för att mäta mätbara kvarvarande sjukdom och leukemiska stamceller i akut myeloisk leukemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cloos, J., Harris, J. R., Janssen,… More

Cloos, J., Harris, J. R., Janssen, J. J. W. M., Kelder, A., Huang, F., Sijm, G., Vonk, M., Snel, A. N., Scheick, J. R., Scholten, W. J., Carbaat-Ham, J., Veldhuizen, D., Hanekamp, D., Oussoren-Brockhoff, Y. J. M., Kaspers, G. J. L., Schuurhuis, G. J., Sasser, A. K., Ossenkoppele, G. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (133), e56386, doi:10.3791/56386 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter