Summary
我们描述的粉扑技术, 其中的药理试剂可以在整个细胞膜片钳记录, 并突出了各方面的特点, 这是至关重要的成功。
Abstract
在脑切片中进行全细胞膜膜片钳记录时, 常用的是药理学管理方法。在电生理记录中, 药物应用的最佳方法之一是粉扑技术, 可用于研究药理试剂对脑切片神经元活动的影响。粉扑应用的最大优点是在记录部位周围的药物浓度迅速增加, 从而防止了膜受体的脱敏。粉扑应用的成功使用需要注意以下因素: 药物的浓度、粉扑微的参数、粉扑微的尖端与记录的神经元之间的距离、持续时间和压力驱动粉扑 (磅每平方英寸, psi)。本文介绍了一个 step-by 步骤的过程, 记录全细胞电流诱导的膨化γ-丁酸 (GABA) 的一个神经元的前额皮质切片。值得注意的是, 同样的程序可以适用于其他脑区, 如海马和纹状体, 以及不同的准备, 如细胞培养。
Introduction
膜片钳技术是研究神经元电信号的主要工具, 在二十世纪七十年代1,2中得到了发展。这项技术的一个主要优点是它提供了有关特定治疗 (例如, 药理学) 如何能够实时改变神经元功能或通道的知识3。脑切片全细胞记录中神经元功能的药理学评价需要应用药物, 如激动剂或特定受体的拮抗药, 来记录神经元。此方法允许识别在应用特定药物后发生的神经元改变, 从而更好地理解神经元的生理和病理特性4。虽然药理学管理可以通过灌注5或粉扑6进行, 后者是优势技术。特别是: (i) 粉扑应用迅速增加了在记录的神经元周围的药物浓度到一个水平, 使膜受体的脱敏被阻止;(ii) 药物膨化量极低, 因此对沐浴液的影响不大, 因而减少了被管理的化学药品对脑切片的不良影响;(iii) 粉扑协议可以设定和保存, 使实验非常精确地重现;(iv) 粉扑的应用代表了激动剂/拮抗药的经济用途, 特别是在这种试剂昂贵或难以获得的情况下。
在这里, 我们将专注于记录在急性制备的脑切片中, 由 GABA 引起的全细胞电流, 这种制备具有相对保存完好的脑回路的优点。我们如何进行粉扑诱导的抑制电流7将在本文中介绍。通过使用铯 (Cs+) 的内部解决方案, 并持有 0 mV 的神经元, 我们将引入 GABA-粉扑诱发抑制突触后电流 (eIPSCs) 与适当的技术细节。应用脂多糖 (lps) 注射液诱发的小鼠抑郁症模型, 结果表明, 与汽车控制相比, lps 注射的小鼠 eIPSC 振幅明显降低.我们的意图是, 这篇文章应该显示如何粉扑技术是广泛适用于研究, 以评估的影响, 任何化学物质, 化合物或药物的神经元活动的脑切片。
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Protocol
动物住房和所有动物实验都是按照华南师范大学动物研究伦理委员会批准的程序进行的, 根据国家研究所设立的动物保育指南。健康.
1. 准备解决方案
- 准备500毫升标准人工脑脊液 (ACSF), 其中包含我们发布的工作中所描述的组件 7 中列出的 表 1 。
- 使用干净的玻璃烧杯与去离子水, 准备一个新的 ACSF 解决方案。用去离子水和干前的清洁铲子添加氯化钠, 氯化钾, NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , MgSO 4 , d-葡萄糖, 并添加 CaCl 2 后冒泡的解决方案与 95% O 2 /5% CO 2 混合物为〜20分钟 (详见表 1) 到500毫升的去离子水。搅拌直到完全溶解.
- 确保 ACSF 完全清除, 无需任何降水。然后将 pH 值调整到 7.2-7.4。气泡的气体混合物由 95% O 2 和 5% CO 2 组成, 用于 ~ 20 min.
- 在 表 2 中描述了包含化学品的250毫升切片切割解决方案 7 。
- 添加氯化钾, 氯化镁 2 , NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , 胆碱和 #183; Cl, d-葡萄糖, 并添加 CaCl 2 最后, 如1.1.1 中所示, 到250毫升的去离子水和溶解, 在1.1.1 和1.1.2 中描述.
- 冒泡后 95% O 2 /5% CO 2 , 将解决方案放在冷冻库中15-20 分钟, 以便切割解决方案变得 ice-cold 和部分冻结.
注意: 我们在1-2 月大的小鼠制作切片时使用这种切削液;该公式可能不同于2月以上的小鼠. - 在无菌内毒素-游离等渗盐水 (0.9% 氯化钠) 中溶解, 制备 LPS 溶液。LPS 是管理腹腔 (0.5 毫克/千克), 并开始记录2小时后.
2。前额叶皮质切片的制备
- 从冰箱中取出切削液, 然后质, 以获得一层泥浆。以 95% O 2 /5% CO 2 将解决方案放在冰和气泡上。
- 使用大而锋利的剪刀, 快速斩首描述的鼠标 9 , 并立即将头放入一个充满 ice-cold (0-4 和 #176; C) 切割液的烧杯中.
- 用细剪刀把头骨的顶端沿中线 caudal-to-nasal, 去掉侧面的颅骨部分。用细刮刀取出大脑, 然后滴入 ice-cold 切割液中.
注: 步骤 2.2-2.3 必须迅速完成 (理想情况下, #60; 1 分钟). - 将大脑放在 9 cm 培养皿的盖子上, 装满冰块。用 ice-cold 切削液冲洗大脑。用刀片切断小脑和嗅球.
- 将氰胶水应用于 vibratome 的标本持有人。小心地将脑块放在胶水滴上, 侧一侧向上, 并立即浸入 ice-cold 切割液中.
- 将 vibratome 的刀片式服务器调整到15和 #176 的角度; 参照水平平面, 准备350和 #181; m 冠状脑切片 (叶片振动频率 = 85 赫兹, 速度 = 0.1 毫米/秒).
- 使用吸管, 将切片转移到充满 ACSF 的恢复腔中, 孵育1小时 (在 RT), 持续冒泡 95% O 2 /5% CO 2 。
3。全细胞贴片记录
- 根据拉拔器操作手册中的特定指南, 将玻璃硼硅 micropipettes 用作记录电极或粉扑 micropipettes。对于记录电极, 尖端电阻是在范围4-6 米和 #8486;, 而粉扑 micropipettes 有尖端直径的范围2-5 和 #181; M.
- 添加 Na + 通道拦截器 (TTX, 1 和 #181; M), 以阻止快速 Na + 和 #160; 通道和因此行动电位, ACSF 和保持这个解决方案的恒定流速2-3 毫升/分钟在记录室, 由蠕动泵入房间和愿望。气泡的 ACSF 与 95% O 2 /5% CO 2 不断确保切片的可行性.
- 使用改良的巴斯德吸管将脑切片转入记录室, 其尖端被切割以适合切片大小。用带有平行尼龙线的铂片锚片覆盖切片, #8805; 2 毫米分开, 以保持在平台上的切片.
- 用内部解决方案填充记录微 7 ( 表 3 ), 用 GABA 在10和 #181; m、50和 #181; m 和100和 #181; m (溶解于 ACSF), 或 ACSF 作为车辆控制.
- 为了防止碎片堵塞, 在将记录电极浸入 ACSF 中之前, 使用1毫升注射器应用光正压。使用显微镜下的微 (4x 物镜), 定位记录电极和粉扑微, 使提示出现在显示器的视频图像的中心 ( 图 1 a ).
- 调整显微镜焦距 (40x 物镜), 同时逐渐降低粉扑微, 并将其置于记录神经元的45和 #176 的角度;。保持微和20-40 和 #181 之间记录的神经元之间的距离; m ( 图 1 B )。慢慢地和小心地接近神经元与记录电极, 然后释放正压。通过连接到电极托架的油管上的微弱和短暂的吸力来制造一个千兆欧姆的密封.
- 保持0毫伏的电压。在千兆欧姆密封形成后, 手动或自动补偿快、慢的电容。然后应用一个简短的和强吸力通过上述油管进入全细胞模式.
- 在电压钳模式下记录 eIPSC。使用 Picospritzer 控制的低气体压力 (氮气, 4-6 psi) 到粉扑微采用主8电压步进发生器提供单或配对 GABA 粉扑 ( 图 2 ).
- 更改粉扑持续时间以获得最佳的 eIPSC 结果 ( 图 3 ) 并测量 LPS 诱发的抑郁症模型 ( 图 4 ) 中的 eIPSC.
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Representative Results
这种粉扑技术可以让研究人员研究药物对特定神经元表面特殊受体的影响。在这篇文章中, 我们关注的电流介导 GABA 受体。图 1显示了粉扑和记录 micropipettes。为了消除对 ACSF 和蔗糖泡芙 (图 2A) 所产生的物理压力的记录神经元的任何影响, 将其用作控件。gaba 粉扑 (黑色) 引起的反应可以被 gaba 受体抑制剂阻断, 如 picrotoxin 所报告的10, 而基线条件可以通过 ACSF 洗 (蓝色) 恢复, 如图 2B所示。值得注意的是, 无论是 ACSF 还是蔗糖粉扑都不能诱发反应, 这表明 gaba 泡芙引起的反应是生理性的, 是由位于记录细胞表面的 gaba 受体介导的。剂量和粉扑-持续时间响应曲线显示在图 3中。
LPS 已被证明可以改变神经元活动和动物行为, 但它对 GABA 受体介导的反应的影响是不清楚的。当我们比较在 lps 注射和车辆控制小鼠的脑切片中 GABA 泡诱导的电流时, 我们观察到 lps 治疗引起的 IPSC 振幅明显降低 (图 4)。
图 1.微和记录电极的图示。
(A)粉扑和记录 micropipettes 之间的距离。(B)在脑切片表面上的微 (左) 和记录电极 (右)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.GABA 粉扑诱导的 IPSC Picrotoxin 阻断。
(A)膨化 ACSF 和蔗糖 (50 µM) 不会引起任何反应。(B)膨化50µM GABA 诱导 IPSC (黑色) (粉扑持续时间 = 200 毫秒, 4-6 psi) 在 ACSF 含有 TTX (1 µM), CNQX (20 µM) 和 AP5 (50 µM), 以阻止动作电位和兴奋电流介导的 AMPA 和 NMDA 受体。gaba 诱导的 IPSC 被阻断的应用 gaba 受体抑制剂, 100 µM picrotoxin (红色)。IPSC 洗后恢复 picrotoxin。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.剂量和粉扑-持续时间响应曲线。
(A)样本干细胞, 由10、50和100µM GABA (粉扑持续时间 = 50 毫秒, 4-6 psi) 引起。(B)粉扑持续时间响应曲线。黑色, n = 11;红色, n = 8;蓝色, n = 10;多项式拟合。数据显示为多种实验手段 (8 ≤ n ≤11);误差线表示扫描电镜. (C)由 GABA (50 µM) 喷出的重复电流, 在 inter-puff 间隔 1, 2 或 3 s (粉扑持续时间 = 100 毫秒, 4-6 psi)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4. 与车辆控制相比, LPS 注射小鼠的 eIPSC 振幅降低.
在 LPS 注射与控制神经元 (生理盐水、19.74 ± 1.93 pA/pF) 中, 膨化 GABA 可显著降低 IPSC 振幅;LPS, 14.10 ± 1.30 pA/pF;p = 0.02)。请单击此处查看此图的较大版本.
| 物质 | 克/摩尔 | 浓度 (mM) | 重量 (克/升) |
| nacl | 58.443 | 119 | 6.9547 |
| 氯化钾 | 74.551 | 2。5 | 0.1864 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1 | 0.1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26。2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1。3 | 0.1565 |
| d-葡萄糖 | 198.17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110.98 | 2。5 | 0.2775 |
表1。记录 ACSF。
| 物质 | 克/摩尔 | 浓度 (mM) | 重量 (克/升) |
| 氯化钾 | 74.551 | 2。5 | 0.1864 |
| 氯化镁2 | 95.211 | 7 | 0.6665 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| 胆碱·cl | 139.63 | 115 | 16.0575 |
| d-葡萄糖 | 198.17 | 7 | 1.3872 |
| CaCl2 | 110.98 | 0。5 | 0.0555 |
表2。切片切割解决方案。
| 物质 | 克/摩尔 | 浓度 (mM) | 重量 (克/升) |
| 葡萄糖酸铯 | 328.052 | 100 | 32.8052 |
| 海 | 168.36 | 5 | 0.8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2.3830 |
| 氯化镁2 | 95.211 | 2 | 0.1904 |
| CaCl2 | 110.98 | 1 | 0.1110 |
| BAPTA | 476.43 |
表3。内部解决方案的整个细胞补丁录音。
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Discussion
粉扑应用广泛用于评价突触后受体功能3,4,7, 但在每个实验中都需要精确的控制。我们在这里描述了一个涉及全细胞贴片钳夹的过程, 它显示了 GABA-粉扑诱导的前额皮质脑切片中的干细胞 (即 eIPSCs)。记录电极的电阻约为5ω, 而粉扑 micropipettes 的尖端直径约为2-5 µm. 粉扑压力介于 4-6 psi 之间: 这一范围是至关重要的, 因为较高的压力可能导致神经元损伤, 而较低的压力会导致后突触后 GABA 受体激活不足。从粉扑微到神经元的水平距离约为20-40 µm (1-2 神经元的直径), 微与切片表面之间的夹角约45°。粉扑微的尖端是垂直20-40 µm 以上的切片 (z-axis)。粉扑持续时间应在10-150 毫秒. 在上述情况下, 10-50 µM 氨基丁酸的喷吹诱导了适当的神经元反应, 得到的 eIPSC 振幅和动力学参数是可重现的。虽然这里描述的协议重点在粉扑应用到一个切片补丁, 它也适合在神经元文化的记录, 如我们的发布工作7所示。
我们也在这里显示 eIPSCs 的结果, 由双粉扑应用 GABA。配对脉冲协议被广泛用于评估前属性7,11, 但可能的突触后效应, 如神经递质受体结合率和结合亲和力的变化, 这可能影响配对脉冲比, 不能通过前配对脉冲刺激来确定。本文所描述的协议提供了一种方法来阐明突触后的改变, 以响应配对甚至脉冲列车刺激。lps 注射小鼠前额叶皮质 eIPSC 振幅的降低表明, GABA 受体的改变水平或活动可能是 lps 诱发的行为改变的基础。
虽然, 与大多数药物传递技术一样, 很难知道确切的 gaba 浓度到达目标细胞, 仍然有可能保持在一定水平的 gaba 浓度的组织通过符合类型micropipettes 使用, 并与粉扑驱动压力和距离等参数。在我们的情况下, 膨化液的体积约1.1 µL 在100毫秒的时间。因此, 膨化允许进行定量研究7,12。
从急性前额叶皮质中制备健康的脑切片对于我们所描述的粉扑记录过程是至关重要的, 应牢记以下几点。首先, 解剖大脑并快速分离前额皮质 (#60; 1 分钟), 然后在 ice-cold 切割液中保持脑块不超过1分钟。接下来, 紧紧地把大脑块粘在 vibratome 的标本架上, 否则大脑块会在剖切过程中漂浮。vibratome 的速度和频率应设置为生成均匀、健康的切片。必须努力在0-4 ° c 下进行所有上述程序, 以尽量减少神经元的兴奋性。
值得注意的是, 我们在本文中描述的切削液应该用于1-2 月大的小鼠。对于年龄较大的小鼠 (即 #62; 3 月), 应按照描述的13替换裁剪解决方案。粉扑技术适用于一系列的膜片钳实验, 涉及药理治疗, 也可以用来测试药物对任何神经元的电活动的影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢以下组织: 中国国家自然科学基金 (31171018, 31171355), 广东省自然科学基金 (2013KJCX0054), 广东科学与技术部 (2014A030313418、2014A030313440) 和广州科技局 (201607010320)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
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