Summary
Les auteurs décrivent la technique puff, par lequel les réactifs pharmacologiques peuvent être administrés pendant l’enregistrement de patch-clamp de la cellule entière et mettre en évidence les différents aspects des caractéristiques qui sont indispensables à son succès.
Abstract
Gestion pharmacologique est couramment utilisée dans le cadre de cellules entières patch clamp enregistrement dans des tranches de cerveau. Une des meilleures méthodes de demande de drogue au cours de l’enregistrement électrophysiologique est la technique de souffle, qui peut être utilisée pour étudier l’effet de réactifs pharmacologiques sur des activités neuronales dans des tranches de cerveau. Le plus grand avantage d’application bouffée, c’est que la concentration du médicament autour du site d’enregistrement augmente rapidement, ce qui empêche une désensibilisation des récepteurs membranaires. Utilisation efficace d’application feuilletée implique une attention particulière aux éléments suivants : la concentration de la drogue, les paramètres de la micropipette bouffée, la distance entre l’extrémité d’une micropipette feuilletée et le neurone enregistré et la durée et pression au volant la bouffée (livres par pouce carré, lb/po2). Cet article décrit une procédure étape par étape pour l’enregistrement des germes entiers courants induits par bouffées d’acide gamma - aminobutyrique (GABA) sur un neurone d’une tranche de cortex préfrontal. Notamment, la même procédure peut être appliquée avec des modifications mineures aux autres régions du cerveau comme l’hippocampe et le striatum et aux préparations différentes, telles que les cultures de cellules.
Introduction
La technique de patch clamp, un outil de base pour l’étude des signaux électriques dans les neurones, a été développée dans les années 19701,2. Un avantage majeur de cette technique est qu’elle fournit des connaissances sur les traitements spécifiques (p. ex., pharmacologiques) peuvent altérer les fonctions neuronales ou canaux en temps réel3. Évaluation pharmacologique de fonction neuronale au cours de l’enregistrement dans une tranche de cerveau cellule entière exige que la demande de drogues, telles que les agonistes ou antagonistes des récepteurs spécifiques, les neurones en cours d’enregistrement. Cette méthode permet l’identification des altérations neuronales qui se produisent après l’application d’un médicament spécifique, conduisant ainsi à une meilleure compréhension des propriétés physiologiques et pathologiques des neurones4. Bien que l’administration pharmacologique peut être effectuée via une perfusion5 ou feuilletée6, ce dernier est la technique supérieure. En particulier : (i) puff demande rapidement augmentations de drogue concentration autour du neurone enregistrée à un niveau tel que la désensibilisation des récepteurs membranaires est empêchée ; (ii) le volume de drogue soufflé est extrêmement faible, de sorte qu’il y a peu d’effet sur la solution du bain, ce qui réduit donc les éventuels effets indésirables des produits chimiques administrées sur des tranches de cerveau ; (iii) le protocole bouffée peut être défini et enregistré, rendant l’expérience très exactement reproductible ; (iv) feuilletée représente une utilisation économique des agonistes/antagonistes, en particulier lorsque ces réactifs sont coûteux ou difficiles à obtenir.
Ici, nous nous concentrerons sur l’enregistrement des germes entiers courants induits par bouffées GABA en tranches de cerveau parfaitement préparés, une préparation qui a l’avantage des circuits du cerveau relativement bien préservé. Comment nous effectuons courants inhibiteurs induits par bouffée7 seront décrites dans cet article. À l’aide de césium (Cs+)-basé des solutions internes et maintenant les neurones à 0 mV, nous allons introduire GABA-pouf évoquée par courants postsynaptiques inhibitrices (eIPSCs) avec des détails techniques appropriés. À l’aide d’un modèle murin de la dépression induite par le lipopolysaccharide (LPS) injection8, nous montrons que l’eIPSC amplitude évoquée par une bouffée de GABA est considérablement réduit dans les tranches des souris injectées LPS par rapport aux commandes du véhicule. Notre intention est que cet article devrait montrer comment la technique de la bouffée est largement applicable à des études visant à évaluer l’effet des produits chimiques, composés ou médicaments sur des activités neuronales dans des tranches de cerveau.
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Protocol
Au logement des animaux et animaux de toutes les expériences ont été effectuées conformément aux procédures approuvées par le Comité d’éthique pour la recherche animale à l’Université normale de Chine du Sud, selon les lignes directrices établies par l’Institut National de protection des animaux Santé.
1. préparation des Solutions
- préparer 500 mL de standard artificiel liquide céphalo-rachidien (FSCA) contenant les composants décrits dans notre ouvrage publié 7 comme indiqué au tableau 1.
- Verre propre utilisation béchers avec de l’eau déionisée pour préparer une nouvelle solution de fsca. Nettoyer les spatules avec de l’eau déminéralisée et sécher avant d’utiliser ajouter NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glucose et ajoutez le CaCl 2 après avoir propagé la solution avec 95 % O 2 / 5 % CO 2 mélange pendant environ 20 min (comme indiqué au tableau 1) dans 500 mL d’eau désionisée. Remuer jusqu'à ce que complètement dissous.
- S’assurer que le FSCA est complètement effacer sans aucune précipitation. Puis, ajustez le pH à 7,2 – 7,4. Bulle avec un mélange de gaz composé de 95 % d’O 2 et 5 % CO 2 pendant environ 20 min.
- Préparer 250 mL de solution de découpe tranche contenant les produits chimiques 7 décrit dans le tableau 2.
- Ajouter KCl, MgCl 2 NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glucose et ajoutez le CaCl 2 modifié comme indiqué dans 1.1.1, à 250 mL d’eau désionisée et dissoudre comme décrit en 1.1.1 et 1.1.2.
- Après barbotage avec 95 % O 2 / 5 % de CO 2, placer la solution dans un congélateur pendant 15-20 min pour que la solution de découpe devient glacée et partiellement gelé.
Remarque : Nous utilisons cette solution de découpe en tranches de 1-2 mois-vieilles souris ; la formule peut être différent pour les souris âgées de 2 mois. - Solution de LPS préparer par dissolution dans une solution saline stérile exempt d’endotoxine isotonique (0,9 % NaCl). LPS est administré par voie intrapéritonéale (0,5 mg/kg) et commencer l’enregistrement 2 h plus tard.
2. Préparation de tranches de Cortex préfrontal
- prendre la solution de découpe sortis du congélateur et homogénéiser pour obtenir une barbotine. Placer la solution sur la glace et bouillonner constamment avec 95 % O 2 / 5 % de CO 2.
- à l’aide de ciseaux grande, forte, rapidement décapiter une souris comme décrit 9 et immédiatement mis la tête dans un bécher rempli de glacee (0-4 ° C) solution de découpe.
- Couper le haut du crâne le long de la ligne médiane en direction caudale-à-nez avec des ciseaux fins et enlever les parties latérales de crâne. Enlever le cerveau avec une fine spatule déposer en solution de découpe glacee.
Remarque : Les étapes 2.2-2.3 doivent se faire rapidement (idéalement < 1 min). - Placer le cerveau sur le couvercle d’une boîte de Pétri 9 cm rempli de glaçons. Rincez le cerveau avec la solution de coupe glacée. Couper le cervelet et le bulbe olfactif avec une lame de rasoir.
- Colle cyanoacrylate appliquer au modèle détenteur d’un vibratome. Placez soigneusement le bloc du cerveau sur la goutte de colle, rostral face vers le haut et plonger immédiatement dans la solution de découpe glacee.
- Régler le support de lame de la vibratome à un angle de 15° par rapport à l’horizontale et se préparer à 350 µm tranches de cerveau coronale (fréquence de vibration de lame = 85 Hz, vitesse = 0,1 mm/s).
- à l’aide d’une pipette, transfert les tranches dans la chambre de récupération remplis de FSCA, incuber pendant 1 heure (à la droite) avec un bouillonnement constant de 95 % O 2 / 5 % de CO 2.
3. Cellule entière Patch enregistrement
micropipettes de- faire verre borosilicaté pour utilisation comme électrodes d’enregistrement ou feuilletée micropipettes conformément aux lignes directrices spécifiques du tire-câble manuel. Pour l’enregistrement des électrodes, résistances de pointe sont de l’ordre de 4-6 M Ω, tandis que feuilletée micropipettes ont des diamètres de pointe dans la gamme de 2 à 5 µm.
- Ajouter bloqueur des canaux Na + (TTX, 1 µM), au canal rapide Na + + bloc et donc de potentiels d’action, de l’ACSF et maintenir un débit constant de cette solution de 2 à 3 mL/min dans la chambre d’enregistrement, par une pompe péristaltique dans la chambre et l’aspiration hors de lui. Bulle le FSCA avec 95 % O 2 / 5 % de CO 2 en permanence pour assurer la viabilité des tranches de.
- Transférer une tranche de cerveau dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pipette Pasteur modifiée dont pointe fine a été coupé à la taille de la tranche. Couvrir la tranche avec une ancre platine tranche avec des fils de nylon parallèles espacées ≥ espacés de 2 mm pour contenir la tranche sur la plate-forme.
- Remplir la micropipette enregistrement avec solution interne 7 (tableau 3) et remplir les micropipettes bouffée de GABA à 10 µM, 50 µM et 100 µM (dissous dans l’ACSF) ou fsca comme excipient.
- Pour éviter l’obstruction par des débris, appliquez une légère pression positive à l’aide d’une seringue de 1 mL avant d’immerger l’électrode d’enregistrement dans le fsca. À l’aide d’un micromanipulateur sous un microscope (objectif 4 x), positionner la micropipette d’électrode et feuilletée enregistrement afin que les pointes apparaissent au centre de l’image vidéo dans le moniteur ( Figure 1 A).
- Ajuster la mise au point du microscope (40 objectif x) tout en réduisant progressivement la micropipette feuilletée et placez-le au-dessus du neurone d’enregistrement à un angle de 45°. Maintenir la distance entre l’extrémité de la micropipette feuilletée et le neurone a enregistré entre 20 à 40 µm ( Figure 1 B). Lentement et soigneusement approcher le neurone avec l’électrode d’enregistrement et puis relâchez la pression positive. Appliquer une succion faible et brève à travers le tuyau connecté au porte-électrode pour créer un joint de giga ohms.
- Maintenir la tension à 0 mV. Après la formation du sceau giga ohms, compenser rapide et lente capacitance manuellement ou automatiquement. Appliquez ensuite une brève et forte aspiration dans la tubulure mentionnée ci-dessus pour accéder au mode cellule entière. Mode de
- enregistrement eIPSC en voltage clamp. Appliquer la pression faible de gaz (azote, 4 à 6 lb/po2) à la micropipette feuilletée à l’aide un Picospritzer contrôlée par un générateur d’étape de tension 8 Master pour livrer GABA simple ou jumelé bouffées ( Figure 2).
- Modifier la durée de la bouffée pour obtenir les meilleurs résultats d’eIPSC ( Figure 3) et de mesurer l’eIPSC dans le modèle de la dépression induite par LPS ( Figure 4).
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Representative Results
La technique de souffle permet aux chercheurs d’étudier l’effet des médicaments sur des récepteurs particuliers sur la surface d’un neurone donné. Dans cet article, nous nous concentrons sur les courants médiées par les récepteurs GABA. La figure 1 illustre les micropipettes feuilletée et enregistrement. Pour éliminer tout effet sur les neurones enregistrés la pression physique générée par le souffle, le FSCA et bouffées de saccharose (Figure 2A) sont utilisées comme témoins. La réponse induite par une bouffée de GABA (noire) peut être bloquée par un inhibiteur des récepteurs GABA, comme la picrotoxine comme signalé10, tandis que l’état initial peut être récupéré par le FSCA de wash-out (bleu), comme illustré à la Figure 2B. Notamment, l’ACSF, ni une bouffée de saccharose induit une réponse, suggérant que les réponses induites par GABA bouffées sont physiologiques et sont médiés par les récepteurs de GABA situés sur la surface de la cellule enregistrée. Les courbes de réponse dose et bouffée sont indiquées à la Figure 3.
LPS s’est avéré altérer les activités neuronales et du comportement animal, mais son effet sur les réponses de médiée par les récepteurs GABA n’était pas bien connue. Lorsqu’on compare les courants induits par les souffles de GABA dans des tranches de cerveau de LPS à injection et souris de contrôle de véhicule, nous observons des amplitudes IPSC considérablement réduits suite à un traitement LPS (Figure 4).
Figure 1 . Diagramme de l’électrode d’une micropipette et enregistrement de bouffée.
(A) la distance entre le souffle et enregistrement micropipettes. (B) la micropipette feuilletée (à gauche) et l’électrode d’enregistrement (à droite) sur la surface d’une tranche de cerveau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Blocus de picrotoxine d’IPSC induite par bouffée de GABA.
(A) FSCA de souffler et de saccharose (50 µM) n’induit aucune réponse. (B) soufflant 50 µM GABA induit un IPSC (noir) (feuilletée durée = 200 ms, 4 à 6 lb/po2) à FSCA contenant TTX (1 µM), CNQX (20 µM) et AP5 (50 µM) pour bloquer les potentiels d’action et courant excitateur médiée par les récepteurs AMPA et NMDA. L’IPSC induite par le GABA est bloqué par l’application de bain d’un inhibiteur du récepteur GABA, 100 picrotoxine µM (rouge). L’IPSC récupère après lavage de la picrotoxine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Dose et bouffée courbes de réponse.
(A) échantillon CISP induite par 10, 50 et 100 µM GABA (feuilletée durée = 50 ms, 4 à 6 lb/po2). Courbes de réponse-bouffée (B) . Noir, n = 11 ; rouge, n = 8 ; bleu, n = 10 ; polynôme de s’adapter. Les données apparaissent comme le moyen d’expériences multiples (8 ≤ n ≤11) ; barres d’erreur indiquent SEM. (C) répétitif courants évoqués par GABA (50 µM) choux à intervalles inter bouffées de 1, 2 ou 3 s (feuilletée durée = 100 ms, 4 à 6 lb/po2). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . eIPSC amplitude est réduite chez les souris LPS-injecté par rapport aux commandes du véhicule.
Bouffées de GABA induit une amplitude IPSC significativement réduite en LPS-injecté vs neurones de contrôle (solution saline, 19,74 ± 1.93 pA/pF ; LPS, 14.10 ± 1,30 pA/pF ; p = 0,02). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Substance | g/mol | Concentration (mM) | Poids (g/L) |
| NaCl | 58.443 | 119 | 6.9547 |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1 | 0.1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26.2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0.1565 |
| D-glucose | 198.17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110.98 | 2.5 | 0.2775 |
Le tableau 1. FSCA enregistrement.
| Substance | g/mol | Concentration (mM) | Poids (g/L) |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0.6665 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0,1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Choline· CL | 139.63 | 115 | 16.0575 |
| D-glucose | 198.17 | 7 | 1.3872 |
| CaCl2 | 110.98 | 0,5 | 0.0555 |
Le tableau 2. Solution de découpe Slice.
| Substance | g/mol | Concentration (mM) | Poids (g/L) |
| Gluconate de CS | 328.052 | 100 | 32.8052 |
| CsCl | 168.36 | 5 | 0.8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2.3830 |
| MgCl2 | 95.211 | 2 | 0.1904 |
| CaCl2 | 110.98 | 1 | 0.1110 |
| BAPTA | 476.43 |
Tableau 3. Solution interne pour des enregistrements de patch de cellules entières.
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Discussion
Puff demande est largement utilisé pour évaluer des récepteurs post-synaptiques fonction3,4,7, mais nécessite un contrôle précis pour chaque expérience. Nous décrivons une procédure impliquant patch de cellules entières de serrage, qui démontre le que GABA-pouf induit CISP (p. ex., eIPSCs) dans des tranches de cerveau cortical préfrontal. La résistance de l’électrode d’enregistrement est MΩ environ 5, tandis que le diamètre de la pointe de micropipettes bouffée est sur 2 à 5 µm. Puff pression se situe entre 4 à 6 lb/po2 : cette gamme est critique, car une pression plus élevée peut causer des dommages neuronaux, tandis que peut entraîner une pression plus basse activation des récepteurs GABA post-synaptiques insuffisante. La distance horizontale de la pointe de la micropipette feuilletée au neurone enregistré est de 20 à 40 µm (le diamètre des neurones 1-2) et l’angle entre la surface d’une micropipette et tranche de bouffée est d’environ 45°. La pointe de la micropipette bouffée est verticalement de 20 à 40 µm au-dessus de la tranche (axe z). La bouffée devrait être dans la gamme 10-150 m dans les circonstances ci-dessus, bouffées de 10 à 50 µM GABA induisent une réponse neuronale appropriée et l’amplitude de l’eIPSC et les paramètres cinétiques obtenus sont reproductibles. Bien que le protocole décrit ici se concentre sur demande feuilletée à un patch de tranche, il est également adapté aux enregistrements dans les cultures de neurones, comme indiqué dans notre ouvrage publié7.
Nous démontrons également eIPSCs résultant de l’application jumelé-pouf de GABA. Impulsions pairées protocoles ont été largement utilisées pour évaluer les propriétés présynaptique7,11, mais effets postsynaptiques possibles, tels que les changements neurotransmetteur-récepteur liaison et taux d’affinité, susceptibles d’influencer ratios d’impulsions pairées, ne peut être déterminée par la stimulation d’impulsions pairées présynaptique. Le protocole décrit dans cet article permet d’élucider les altérations postsynaptiques en réponse à des stimuli couplés entre eux et même train d’impulsions. La réduction de l’amplitude d’eIPSC dans le cortex préfrontal des souris injectées LPS suggère que les niveaux altérées ou l’activité des récepteurs GABA pourrait sous-tendent induite par LPS des changements comportementaux.
Bien que, comme pour la plupart techniques d’administration de médicaments, il est difficile de connaître la concentration exacte de GABA pour atteindre la cellule cible, il est toujours possible de maintenir la concentration de GABA à certains niveaux dans les tissus en étant cohérente avec le type de micropipettes utilisés, et avec des paramètres tels que puff entraînement de pression et de la distance. Dans notre cas, le volume de solution soufflé est environ 1,1 µL à 100 ms durée. Ainsi, soufflant permet des études quantitatives effectuées7,,12.
La préparation des tranches de cerveau sain du cortex préfrontal aiguë est critique pour la bouffée d’enregistrement procédure que nous décrivons, et les points suivants devraient garder à l’esprit. Tout d’abord, disséquer le cerveau et séparer le cortex préfrontal rapidement (< 1 min) et puis garder le bloc de cerveau dans la solution de découpe glacée pendant pas plus de 1 min. Ensuite, bien coller le bloc du cerveau sur le dessus de la porte-échantillon de vibratome, ou sinon le bloc du cerveau peut-être flotter pendant la découpe. La vitesse et la fréquence de la vibratome devraient être réglés pour déclencher même, tranches en bonne santé. Effort il faut faire effectuer tous au-dessus des procédures à 0-4 ° C pour réduire au minimum l’excitabilité neuronale.
Il est à noter que la solution de découpe nous décrivons dans cet article devrait être utilisée pour 1-2 mois-vieilles souris. Pour les souris âgées (c.-à-d. > 3 mois), la solution de découpe doit être remplacée comme décrit13. La technique de la bouffée est applicable à un éventail d’expériences de patch clamp impliquant des traitements pharmacologiques et peut également être utilisée pour tester l’effet des drogues sur l’activité électrique des neurones.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les organisations suivantes : Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (31171018, 31171355), la Science et la Division de la technologie du Guangdong (2013KJCX0054), la Fondation de sciences naturelles pour la Province du Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440) et Guangzhou Science et technologie Bureau (201607010320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
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