Summary
हम कश तकनीक का वर्णन है, जिसके द्वारा औषधीय एजेंट पूरे सेल पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के दौरान प्रशासित किया जा सकता है, और सुविधाओं है कि इसकी सफलता के लिए महत्वपूर्ण है के विभिंन पहलुओं पर प्रकाश डाला ।
Abstract
औषधीय प्रशासन आमतौर पर प्रयोग किया जाता है जब पूरे सेल पैच-दबाना मस्तिष्क स्लाइस में रिकॉर्डिंग का आयोजन । electrophysiological रिकॉर्डिंग के दौरान दवा आवेदन का सबसे अच्छा तरीकों में से एक कश तकनीक है, जो मस्तिष्क स्लाइस में न्यूरॉन्स गतिविधियों पर औषधीय रिएजेंट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कश आवेदन का सबसे बड़ा लाभ यह है कि रिकॉर्डिंग साइट के आसपास दवा एकाग्रता तेजी से बढ़ जाती है, इस प्रकार झिल्ली रिसेप्टर्स के नुकसान को रोकने. पफ आवेदन के सफल प्रयोग निम्नलिखित तत्वों के लिए सावधान ध्यान शामिल है: दवा की एकाग्रता, पफ micropipette के मापदंडों, एक कश micropipette की नोक और ंयूरॉन के बीच की दूरी दर्ज की गई, और अवधि और दबाव (प्रति वर्ग इंच पाउंड, साई) कश ड्राइविंग । यह आलेख वर्णन करता है कि पूरे सेल धाराओं एक अग्रिम cortical टुकड़ा के एक ंयूरॉन पर गामा aminobutyric एसिड (गाबा) puffing द्वारा प्रेरित रिकॉर्डिंग के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया । विशेष रूप से, एक ही प्रक्रिया ऐसे हिप्पोकैंपस और striatum के रूप में अंय मस्तिष्क क्षेत्रों में मामूली संशोधनों के साथ लागू किया जा सकता है, और सेल संस्कृतियों के रूप में विभिंन तैयारी, ।
Introduction
पैच-दबाना तकनीक, न्यूरॉन्स में विद्युत संकेतों की जांच के लिए एक प्राथमिक उपकरण, 1970 के दशक में विकसित किया गया था1,2. इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह कैसे विशिष्ट उपचार (जैसे, औषधीय) पर ज्ञान प्रदान करता है ंयूरॉन कार्यों या वास्तविक समय में चैनल3बदल सकते हैं । एक मस्तिष्क टुकड़ा में पूरे सेल रिकॉर्डिंग के दौरान न्यूरॉन समारोह के औषधीय मूल्यांकन एगोनिस्ट या विशिष्ट रिसेप्टर्स के विरोधी के रूप में दवाओं के आवेदन की आवश्यकता है, न्यूरॉन्स दर्ज किया जा रहा. इस विधि ंयूरॉन परिवर्तन है कि एक विशिष्ट दवा के बाद आवेदन हो की पहचान की अनुमति देता है, इस प्रकार के शारीरिक और रोग के गुणों की एक बेहतर समझ के लिए अग्रणी4ंयूरॉंस । हालांकि औषधीय प्रशासन या तो छिड़काव5 या पफ6के माध्यम से आयोजित किया जा सकता है, बाद बेहतर तकनीक है । विशेष रूप से: (i) पफ आवेदन तेजी से बढ़ जाता है के चारों ओर दवा एकाग्रता दर्ज की ंयूरॉन एक स्तर पर ऐसी है कि झिल्ली रिसेप्टर्स की संवेदनशीलता को रोका; (ii) मादक द्रव्यों की मात्रा बहुत कम है, इसलिए है कि स्नान के समाधान पर थोड़ा प्रभाव है, जो इसलिए मस्तिष्क के स्लाइस पर प्रशासित रसायनों के किसी भी अवांछनीय प्रभाव कम कर देता है; (iii) कश प्रोटोकॉल सेट और बचाया जा सकता है, प्रयोग बहुत ठीक प्रतिलिपि बनाने; (iv) कश आवेदन एगोनिस्ट के किफायती उपयोग का प्रतिनिधित्व करता है/विशेष रूप से, जहां इस तरह के रिएजेंट महंगे है या प्राप्त करने के लिए मुश्किल है ।
यहां, हम तीव्रता से तैयार मस्तिष्क स्लाइसें, एक तैयारी है कि अपेक्षाकृत अच्छी तरह से संरक्षित मस्तिष्क सर्किट का लाभ दिया है में गाबा puffing द्वारा प्रेरित पूरे सेल धाराओं रिकॉर्डिंग पर ध्यान केंद्रित करेंगे । हम कश प्रेरित निरोधात्मक धाराओं कैसे आचरण7 इस लेख में वर्णित किया जाएगा । सीज़ियम का उपयोग करके (Cs+)-आंतरिक समाधान आधारित है, और 0 एमवी पर ंयूरॉंस पकड़, हम गाबा-पफ निरोधात्मक postsynaptic धाराओं (eIPSCs) के साथ उचित तकनीकी जानकारी पैदा शुरू होगा । lipopolysaccharide (एलपीएस) इंजेक्शन8द्वारा प्रेरित अवसाद के एक माउस मॉडल का उपयोग करना, हम बताते हैं कि एक गाबा पफ द्वारा पैदा eIPSC आयाम काफी एलपीएस के स्लाइस में कम है-वाहन नियंत्रण की तुलना में चूहों इंजेक्शन. हमारा इरादा यह है कि इस लेख दिखाना चाहिए कि कैसे कश तकनीक व्यापक रूप से किसी भी रसायनों, यौगिकों या मस्तिष्क स्लाइस में ंयूरॉंस की गतिविधियों पर दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के उद्देश्य से अध्ययन के लिए लागू है ।
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Protocol
पशु आवास और सभी पशु प्रयोग दक्षिण चीन सामान्य विश्वविद्यालय में पशु अनुसंधान के लिए आचार समिति द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार आयोजित किए गए, जिसके अनुसार राष्ट्रीय संस्थान द्वारा स्थापित पशु देखभाल के लिए दिशानिर्देश Health.
< p class = "jove_title" > 1. समाधान की तैयारी- मानक कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) की ५०० मिलीलीटर तैयार करें जिसमें हमारे प्रकाशित कार्य में वर्णित घटक < सुप वर्ग = "xref" > 7 को तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है ।
- एक ताजा ACSF समाधान तैयार करने के लिए पानी के साथ स्वच्छ ग्लास यूरिन का उपयोग करें । NaCl जोड़ने के लिए उपयोग करने से पहले spatulas पानी और सूखी के साथ साफ KCl, णः 2 पो 4 , NaHCO 3 , MgSO 4 , D-ग्लूकोज, और जोड़ CaCl 2 के साथ हल bubbling के बाद ९५% O 2 /5% कं 2 के लिए मिश्रण ~ 20 मिनट (के रूप में तालिका 1 में विस्तृत) के लिए ५०० मिलीलीटर पानी की एमएल । हलचल जब तक पूरी तरह भंग.
- सुनिश्चित ACSF किसी भी वर्षा के बिना पूरी तरह से स्पष्ट है । उसके बाद 7.2-7.4 करने के लिए पीएच समायोजित करें । एक गैस मिश्रण के साथ बुलबुला ९५% O 2 और 5% CO 2 के लिए ~ 20 min. से बना
- टुकड़े काटने के २५० मिलीलीटर तैयार रसायनों से युक्त समाधान < सुप क्लास = "xref" > 7 में वर्णित टेबल 2 .
- जोड KCl, MgCl 2 , णः 2 पो 4 , NaHCO 3 , choline & #183; Cl, D-ग्लूकोज और CaCl 2 जोड़ें पिछले 1.1.1 में संकेत के रूप में, २५० के लिए पानी की मिलीलीटर और भंग 1.1.1 और 1.1.2 में वर्णित के रूप में ।
- ९५% O 2 /5% कं 2 के साथ bubbling के बाद, समाधान एक फ्रीजर में 15-20 मिनट के लिए जगह है ताकि काटने समाधान बर्फ ठंडा और आंशिक रूप से जमे हुए हो जाता है ।
नोट: हम 1-2 महीने पुराने चूहों से स्लाइस बनाते समय इस कटिंग समाधान का उपयोग करते हैं; सूत्र 2 महीने से पुराने चूहों के लिए अलग हो सकता है. - बाँझ endotoxin मुक्त isotonic खारा (०.९% NaCl) भंग करके एलपीएस समाधान तैयार. एलपीएस intraperitoneally प्रशासित है (०.५ मिलीग्राम/) और रिकॉर्डिंग शुरू 2 ज बाद में ।
- काटने समाधान फ्रीजर से बाहर ले जाओ और homogenize एक कीचड़ प्राप्त करने के लिए । बर्फ और बुलबुला पर समाधान प्लेस लगातार ९५% के साथ O 2 /5% कं 2 .
- बड़ी, तीखी कैंची का उपयोग करते हुए, जल्दी से एक माउस के रूप में वर्णित के रूप में decapitate < सुप वर्ग = "xref" > ९ और तुरंत सिर को बर्फ से भरे चोंच में डालकर ठंडा करें (0-4 & #176; C) कटिंग सॉल्यूशन.
- ठीक कैंची के साथ एक caudal-नाक दिशा में midline के साथ खोपड़ी के ऊपर काट और पार्श्व खोपड़ी भागों को हटा दें । एक ठीक रंग के साथ मस्तिष्क निकालें और बर्फ ठंड काटने समाधान में छोड़ दें ।
नोट: 2.2 कदम-2.3 तेजी से किया जाना चाहिए (आदर्श रूप में & #60; 1 min). - को बर्फ से भरे 9 सेमी पेट्री डिश के ढक्कन पर ब्रेन प्लेस करते हैं । बर्फ के साथ मस्तिष्क कुल्ला-ठंड काटने समाधान । एक उस्तरा ब्लेड के साथ सेरिबैलम और घ्राण बल्ब कट ।
- एक vibratome के नमूना धारक को cyanoacrylate गोंद लागू होते हैं । ध्यान से गोंद की बूंद पर मस्तिष्क ब्लॉक जगह है, rostral ओर, और तुरंत बर्फ में डूब-ठंड काटने समाधान ।
- को vibratome के ब्लेड धारक को 15 & #176 के कोण पर समायोजित करें; क्षैतिज विमान के संदर्भ में और ३५०-& #181 तैयार करें; एम कोरोनर मस्तिष्क स्लाइसें (ब्लेड कंपन आवृत्ति = ८५ हर्ट्ज, गति = ०.१ mm/
- एक पिपेट का उपयोग कर, वसूली ACSF से भरा चैंबर में स्लाइस हस्तांतरण, 1 ज के लिए मशीन (RT) में लगातार bubbling के साथ ९५% O 2 /5% कं 2 .
- रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड या पफ micropipettes खींचने आपरेशन मैनुअल में विशिष्ट दिशा निर्देशों के अनुसार के रूप में उपयोग के लिए कांच borosilicate micropipettes बनाते हैं । रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए, टिप resistances रेंज में हैं 4-6 m & #8486;, जबकि पफ micropipettes रेंज में टिप व्यास है 2-5 & #181; M.
- न + चैनल अवरोधक (TTX, 1 & #181; M), तेज न + & #160; चैनल और इस प्रकार कार्रवाई की क्षमता, ACSF करने के लिए और इस समाधान के एक निरंतर प्रवाह की दर को बनाए रखने के लिए 2-3 एमएल/मिनट रिकॉर्डिंग चैंबर में, सिकुड़नेवाला पंप द्वारा चैंबर में और इससे बाहर आकांक्षा । बुलबुला ACSF के साथ ९५% O 2 /5% कं 2 लगातार स्लाइस की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए ।
- रिकॉर्डिंग चैंबर में एक मस्तिष्क टुकड़ा हस्तांतरण एक संशोधित पाश्चर पिपेट जिसका ठीक टिप टुकड़ा आकार फिट करने के लिए काट दिया गया था का उपयोग कर । समानांतर नायलॉन धागे के साथ एक प्लैटिनम टुकड़ा लंगर के साथ टुकड़ा कवर & #8805; 2 मिमी के अलावा मंच पर टुकड़ा पकड़ के लिए ।
- को आंतरिक समाधान के साथ रिकॉर्डिंग micropipette भरें < सुप वर्ग = "xref" > ७ ( टेबल ३ ), और इस कश micropipettes को गाबा के साथ भरें 10 & #181; m, ५० & #181; मी, और १०० & #181; m (ACSF में भंग), या ACSF के रूप में वाहन नियंत्रण.
- मलबे के साथ रुकावट को रोकने के लिए, प्रकाश सकारात्मक दबाव ACSF में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड विसर्जित करने से पहले एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर लागू होते हैं । एक माइक्रोस्कोप के तहत एक micromanipulator का उपयोग करना (4x उद्देश्य लेंस), की स्थिति रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और पफ micropipette ताकि सुझावों की निगरानी में वीडियो छवि के केंद्र में दिखाई देते हैं (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा १ a ).
- माइक्रोस्कोप फोकस (40x वस्तुनिष्ठ लेंस) को समायोजित करते हुए धीरे-धीरे पफ micropipette को कम करते हुए उसे ४५ & #176 के कोण पर रिकॉर्डिंग न्यूरॉन के ऊपर रखें;. कश micropipette की नोक के बीच दूरी रखो और ंयूरॉन के बीच दर्ज 20-40 & #181; m (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ बी ). धीरे और सावधानी से रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ ंयूरॉन दृष्टिकोण और फिर सकारात्मक दबाव जारी. एक गीगा-ओम सील बनाने के लिए इलेक्ट्रोड धारक से जुड़े टयूबिंग के माध्यम से एक कमजोर और संक्षिप्त चूषण लागू करें.
- 0 एमवी पर वोल्टेज बनाए रखें । गीगा-ओम सील के गठन के बाद, तेजी से और धीमी गति से मैन्युअल या स्वचालित रूप से क्षमता के लिए क्षतिपूर्ति । फिर पूरे सेल मोड में प्राप्त करने के लिए ऊपर उल्लेख किया टयूबिंग के माध्यम से एक संक्षिप्त और मजबूत चूषण लागू होते हैं ।
- वोल्टेज-क्लैंप मोड में रिकॉर्ड eIPSC । लागू करें कम गैस दबाव (नाइट्रोजन, 4-6 psi) पफ micropipette के लिए एक मास्टर द्वारा नियंत्रित एक Picospritzer का उपयोग 8 वोल्टेज कदम जनरेटर एकल या युग्मित गाबा कश उद्धार करने के लिए (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २ ).
- को सर्वश्रेष्ठ eIPSC परिणाम प्राप्त करने के लिए पफ अवधि परिवर्तित करें (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ) और eIPSC-प्रेरित अवसाद मॉडल में एलपीएस को मापने (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 4 ).
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Representative Results
कश तकनीक शोधकर्ताओं ने एक दिया ंयूरॉन की सतह पर विशेष रिसेप्टर्स पर दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है । इस अनुच्छेद में, हम गाबा रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता धाराओं पर ध्यान केंद्रित. चित्रा 1 पफ और रिकॉर्डिंग micropipettes से पता चलता है । के दर्ज ंयूरॉंस पर किसी भी प्रभाव को खत्म करने के लिए शारीरिक पफ द्वारा उत्पंन दबाव, ACSF और सुक्रोज puffs (चित्रा 2ए) नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है । एक गाबा पफ (काला) द्वारा प्रेरित प्रतिक्रिया इस तरह के रूप में picrotoxin के रूप में एक गाबा रिसेप्टर अवरोधक, द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है10, जबकि आधार रेखा हालत ACSF वॉश आउट (नीला) द्वारा पुनर्प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में चित्रा 2बीमें दिखाया गया. विशेष रूप से, न तो एक ACSF और न ही एक सुक्रोज कश एक प्रतिक्रिया लाती है, सुझाव है कि गाबा puffs द्वारा प्रेरित प्रतिक्रियाओं शारीरिक और गाबा दर्ज सेल की सतह पर स्थित रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं. खुराक और कश अवधि प्रतिक्रिया curves चित्रा 3में दिखाए जाते हैं ।
एलपीएस को न्यूरॉन गतिविधियों और जानवरों के व्यवहार को बदलने के लिए दिखाया गया है, लेकिन गाबा रिसेप्टर पर इसके प्रभाव-मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं अच्छी तरह से ज्ञात नहीं था. हम एलपीएस इंजेक्शन और वाहन नियंत्रण चूहों के मस्तिष्क स्लाइस में गाबा puffs द्वारा प्रेरित धाराओं की तुलना करते हैं, हम एलपीएस उपचार के कारण काफी कम IPSC आयाम का पालन (चित्रा 4).
चित्र 1 . पफ micropipette और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के आरेख ।
(क) कश और रिकॉर्डिंग micropipettes के बीच की दूरी । (ख) कश micropipette (बाएं) और एक मस्तिष्क टुकड़ा की सतह पर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (दाएं) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . गाबा पफ द्वारा प्रेरित IPSC की Picrotoxin नाकाबंदी ।
(क) कश ACSF और सुक्रोज (५० µ m) कोई प्रतिक्रिया लाती है । (ख) puffing ५० µ एम गाबा एक IPSC (काला) लाती है (पफ अवधि = २०० ms, 4-6 psi) में ACSF युक्त TTX (1 µ एम), CNQX (20 µ m) और AP5 (५० µ m) को ब्लॉक करने के लिए कार्रवाई क्षमता और उत्तेजक AMPA और एनएमडीए रिसेप्टर्स द्वारा वर्तमान मध्यस्थता. गाबा प्रेरित IPSC एक गाबा रिसेप्टर अवरोधक के स्नान आवेदन द्वारा अवरुद्ध है, १०० µ एम picrotoxin (लाल). IPSC picrotoxin के बाहर धोने के बाद ठीक हो जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 . खुराक और कश-अवधि प्रतिक्रिया घटता ।
(क) नमूना IPSCs द्वारा प्रेरित 10, ५०, और १०० µ एम गाबा (पफ अवधि = ५० ms, 4-6 psi). (ख) कश-अवधी प्रतिक्रिया घटता है । काला, n = 11; लाल, n = 8; नीला, n = 10; बहुपद फिट. डेटा एकाधिक प्रयोगों के साधन के रूप में दिखाया जाता है (8 ≤ एन ≤ 11); त्रुटि पट्टियां SEM. (C) इंगित करता है) द्वारा अंतर-1, 2 या 3 s (पफ अवधि = १०० ms, 4-6 psi) की (५० µ m) में puffs द्वारा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 . eIPSC आयाम एलपीएस-इंजेक्शन चूहों में वाहन नियंत्रण की तुलना में कम है ।
puffing गाबा एलपीएस में एक काफी कम IPSC आयाम लाती-बनाम नियंत्रण ंयूरॉंस इंजेक्शन (खारा, १९.७४ ± १.९३ फिलीस्तीनी अथॉरिटी/ एलपीएस, १४.१० ± १.३० pA/पीएफ; p = ०.०२) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| पदार्थ | जी मोल/ | एकाग्रता (मिमी) | वजन (जी एल/ |
| nacl | ५८.४४३ | ११९ | ६.९५४७ |
| kcl | ७४.५५१ | २.५ | ०.१८६४ |
| णः2पो4 | १३७.९९ | 1 | ०.१३८० |
| NaHCO3 | ८४.००७ | २६.२ | २.२०१० |
| MgSO4 | १२०.३६६ | १.३ | ०.१५६५ |
| D-ग्लूकोज | १९८.१७ | 11 | २.१७९९ |
| CaCl2 | ११०.९८ | २.५ | ०.२७७५ |
तालिका 1. रेकॉर्डिंग ACSF.
| पदार्थ | जी मोल/ | एकाग्रता (मिमी) | वजन (जी एल/ |
| kcl | ७४.५५१ | २.५ | ०.१८६४ |
| MgCl2 | ९५.२११ | 7 | ०.६६६५ |
| णः2पो4 | १३७.९९ | १.२५ | ०.१७२५ |
| NaHCO3 | ८४.००७ | 25 | २.१००२ |
| choline· सीएल | १३९.६३ | ११५ | १६.०५७५ |
| D-ग्लूकोज | १९८.१७ | 7 | १.३८७२ |
| CaCl2 | ११०.९८ | ०.५ | ०.०५५५ |
तालिका 2. स्लाइस काटना समाधान ।
| पदार्थ | जी मोल/ | एकाग्रता (मिमी) | वजन (जी एल/ |
| सीएस gluconate | ३२८.०५२ | १०० | ३२.८०५२ |
| CsCl | १६८.३६ | 5 | ०.८४१८ |
| HEPES | २३८.३०१ | 10 | २.३८३० |
| MgCl2 | ९५.२११ | 2 | ०.१९०४ |
| CaCl2 | ११०.९८ | 1 | ०.१११० |
| BAPTA | ४७६.४३ |
तालिका 3. पूरे सेल पैच रिकॉर्डिंग के लिए आंतरिक समाधान ।
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Discussion
पफ आवेदन व्यापक रूप से postsynaptic रिसेप्टर फंक्शन3,4,7का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन प्रत्येक प्रयोग में सटीक नियंत्रण की आवश्यकता है । हम यहां एक पूरे-सेल पैच clamping, जो गाबा-कश प्रेरित IPSCs (यानी, eIPSCs) में भिड़ना cortical मस्तिष्क स्लाइसें को दर्शाता है शामिल प्रक्रिया का वर्णन । रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध के बारे में 5 MΩ है, जबकि पफ micropipettes के टिप व्यास के बारे में 2-5 µm है । पफ प्रेशर 4-6 psi के बीच है: इस रेंज में एक उच्च दबाव के कारण न्यूरॉन की क्षति हो सकती है, जबकि एक कम दबाव में परिणाम हो सकता है, महत्वपूर्ण है postsynaptic गाबा रिसेप्टर्स की अपर्याप्त सक्रियण. दर्ज ंयूरॉन को पफ micropipette की नोक से क्षैतिज दूरी के बारे में 20-40 µm (1-2 ंयूरॉंस के व्यास) है, और कश micropipette और टुकड़ा सतह के बीच कोण के बारे में ४५ ° है । कश micropipette की नोक खड़ी 20-40 स्लाइस (z-अक्ष) से ऊपर µm है । कश अवधि सीमा में होना चाहिए 10-150 ms. उपरोक्त परिस्थितियों के तहत, 10-50 µ एम गाबा के कश एक उपयुक्त ंयूरॉन प्रतिक्रिया प्रेरित और eIPSC आयाम और काइनेटिक मापदंडों प्राप्त प्रतिलिपि हैं । हालांकि प्रोटोकॉल यहां वर्णित पफ आवेदन पर एक टुकड़ा पैच करने के लिए केंद्रित है, यह भी ंयूरॉन संस्कृतियों में रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त है, के रूप में हमारे प्रकाशित काम में दिखाया7।
हम भी गाबा के युग्मित-कश आवेदन से उत्पन्न eIPSCs यहाँ दिखा. युग्मित-पल्स प्रोटोकॉल व्यापक रूप से presynaptic गुण7,11का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन संभव postsynaptic प्रभाव, न्यूरोट्रांसमीटर-रिसेप्टर बाइंडिंग दर और बाध्यकारी संबंध में परिवर्तन के रूप में, जो प्रभावित कर सकता युग्मित-नाड़ी अनुपात, presynaptic बाँधा-नाड़ी उत्तेजना द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता. इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल एक तरह से जोड़ा और यहां तक कि पल्स ट्रेन उत्तेजनाओं के जवाब में postsynaptic परिवर्तन स्पष्ट प्रदान करता है । एलपीएस इंजेक्शन चूहों के आकडे प्रांतस्था में eIPSC आयाम में कमी का पता चलता है कि बदल स्तर या गाबा रिसेप्टर्स की गतिविधि एलपीएस प्रेरित व्यवहार परिवर्तन आबाद हो सकता है.
हालांकि, के रूप में सबसे अधिक दवा वितरण तकनीकों के साथ, यह सही गाबा एकाग्रता लक्ष्य सेल तक पहुँचने पता करने के लिए मुश्किल है, यह अभी भी ऊतक में कुछ स्तरों पर गाबा की एकाग्रता को बनाए रखने के लिए संभव है के प्रकार के साथ संगत जा रहा द्वारा micropipettes इस्तेमाल किया, और इस तरह के कश ड्राइव दबाव और दूरी के रूप में मापदंडों के साथ । हमारे मामले में, puffed समाधान की मात्रा के बारे में १०० ms अवधि में १.१ µ l है । इस प्रकार, puffing मात्रात्मक अध्ययन करने के लिए7,12प्रदर्शन की अनुमति देता है ।
तीव्र आकडे प्रांतस्था से स्वस्थ मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी कश रिकॉर्डिंग प्रक्रिया हम वर्णन के लिए महत्वपूर्ण है, और निंनलिखित बातों को ध्यान में वहन किया जाना चाहिए । सबसे पहले, मस्तिष्क को टुकड़े और ललाट प्रांतस्था को जल्दी से अलग कर दें (& #60; 1 min) और फिर मस्तिष्क ब्लॉक को आइस-कोल्ड कटिंग सॉल्यूशन में 1 मिनट से अधिक न रखें । अगला, कसकर vibratome के नमूना धारक के शीर्ष पर मस्तिष्क ब्लॉक, या अंयथा मस्तिष्क ब्लॉक अनुभाग के दौरान नाव हो सकती है गोंद । गति और vibratome की आवृत्ति भी, स्वस्थ स्लाइसें उत्पंन करने के लिए सेट किया जाना चाहिए । प्रयास करने के लिए 0-4 डिग्री सेल्सियस से ऊपर सभी प्रक्रियाओं के संचालन के लिए किया जाना चाहिए न्यूरॉन्स को कम करने के लिए उत्तेजित ।
यह ध्यान देने योग्य है कि हम इस लेख में वर्णन काटने समाधान 1-2 महीने पुराने चूहों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए लायक है । पुराने चूहों के लिए (अर्थात & #62; 3 माह), काटने का समाधान13वर्णित के रूप में प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए । कश तकनीक पैच-दबाना औषधीय उपचार के प्रयोगों की एक सीमा के लिए लागू है, और भी किसी भी ंयूरॉंस की विद्युत गतिविधि पर दवाओं के प्रभाव का परीक्षण किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक निंनलिखित संगठनों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा: चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३११७१०१८, ३११७१३५५), गुआंग्डोंग (2013KJCX0054) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्रभाग, गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ( 2014A030313418, 2014A030313440), और गुआंगज़ौ विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो (२०१६०७०१०३२०) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
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