Summary
薬理学的試薬が全細胞パッチ ・ クランプ記録中に投与することができ、その成功に不可欠な機能のさまざまな側面を強調、パフの手法について述べる。
Abstract
薬理学的管理は、全細胞パッチク脳スライス内の記録を行う場合に通常使用されます。電気生理学的記録中に新薬承認申請の最善の方法の 1 つは、パフの技術は、薬理学的試薬の脳スライスにおける神経活動に及ぼす影響を研究するためです。パフ アプリケーションの最大の利点はこのように膜受容体の脱感作を防止記録サイト中薬物濃度が急速に増大します。パフのアプリケーションの使用の成功は、次の要素に注意: 薬の濃度、パフ マイクロ ピペット、パフ ピペットと記録、ニューロンの先端と期間の間の距離のパラメーターとパフを運転圧力 (1 平方インチあたりポンド psi)。この資料では、γ-アミノ酪酸 (GABA) 前頭皮質スライスのニューロンに息を切らしによって引き起こされる全細胞の流れを記録するためのステップバイ ステップの手順を説明します。特に、海馬、線条体など他の頭脳区域、細胞培養などの異なる製剤にもマイナー変更と同じ手順を適用できます。
Introduction
パッチ ・ クランプの技術、神経細胞の電気信号を調査するための主要なツールは、1970 年代の1,2で開発されました。この手法の主な利点は、どのように特定の治療法の知識を提供すること (例えば、薬理学的) 神経機能やリアルタイムに3チャンネルに変更可能性があります。全細胞脳スライス内の記録の中に神経細胞の機能薬理学的評価には、記録されているニューロンにアゴニストまたは特定の受容体の拮抗薬などの薬物のアプリケーションが必要です。このメソッドは、次のニューロン4の生理学的および病理学的特性のよりよい理解につながる特定の薬剤のアプリケーションに発生する神経の変化の識別を許します。薬理学的管理は、5またはパフ6を灌流といずれかを介して行うことができるが、後者より優れたテクニックです。特に: アプリケーションを急速にパフ (i) 増加薬濃度レベルに記録されたニューロンの膜受容体の脱感作を防止; その(ii) パフ薬物の量は非常に低く、したがって脳のスライスに投与された化学物質の任意の望ましくない影響を軽減入浴ソリューションで少し効果があるよう(iii) パフのプロトコルは、設定、保存、作る実験を非常に正確に再現。(パフ iv) アプリケーションは、アゴニスト/拮抗薬、特に、このような試薬が高価なまたは入手困難の経済的な使用を表します。
ここでは、鋭く準備脳スライス、比較的保存状態の良い脳の回路の利点は、準備で GABA を吹き込むことによって引き起こされる細胞流れを記録に焦点を当てます。パフ誘発抑制電流7を行う方法は、この資料に記載されます。セシウム (Cs+) を使用して-0 でニューロンを押しベースの内部ソリューション、mV、GABA パフ誘発を紹介する適切な技術的な詳細と抑制性シナプス電流 (eIPSCs)。リポ多糖 (LPS) 注入8、我々 は、eIPSC を示す誘発性うつ病のマウスモデルを用いた GABA パフにより誘発される振幅が大幅に車両のコントロールと比較して組合を注入したマウスのスライスで減少します。我々 の意図は、この資料ではパフ手法は脳スライスにおける神経活動の化学物質や化合物の薬剤効果の評価を目的とした研究に広く適用できる方法を表示する必要がありますです。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物飼育および南中国師範大学、国立研究所によって確立された動物のケアのためのガイドラインによると動物の研究のための倫理委員会によって承認された手続きに従って実験を行ったすべての動物健康.
1 です。 ソリューションの準備
- 表 1 に記載されている当社の出版された仕事の 7 で説明したコンポーネントを含む人工の標準の脳脊髄液 (アプライド) の準備 500 mL。
- 使用きれいなガラス ビーカーを脱イオン水新鮮なアプライド溶液を調製します。脱イオン水でへらをきれいにし、NaCl、KCl、NaH を追加する使用する前に乾燥 2 PO 4 NaHCO 3 MgSO 4、D-グルコース、95% O 2/5% ソリューションを持つバブル後 CaCl 2 を追加、CO 2 脱イオン水 500 ml (としての詳細な表 1) 〜 20 分のための混合物。完全に溶解するまで攪拌します 。 任意の沈殿せずオフに
- 、アプライドは完全にことを確認します。7.2 7.4 に pH を調整します。95% O 2 と 5% CO 2 〜 20 分のための混合ガス気泡
- スライス切断溶液について、表 2 の化学物質 7 250 mL を準備します。
- KCl、MgCl 2 NaH 2 PO 4 NaHCO 3 choline·Cl、D-グルコースを追加し、最後 250 mL の脱イオン水を 1.1.1 に示すように CaCl 2 を追加、1.1.1、1.1.2 で説明されているように溶解します 。
- 95% O 2/5% をバブル後の CO 2、冷たいと凍結切削ソリューションになるように 15 ~ 20 分冷凍庫にソリューションを配置します
。 注: 我々 は 1-2 か月からのスライスを作るときこの切削ソリューションを使用-古いマウス;2 か月より古いマウスの式が異なる場合があります 。
- エンドトキシン等張生理食塩水に溶解することにより準備組合ソリューション (0.9 %nacl)。LPS は腹腔内投与 (0.5 mg/kg)、2 h を後で記録を開始します 。
2。前頭野スライスの準備
- 冷凍庫から切削ソリューションを取るし、スラッシュを取得するホモジナイズしてください。氷上ソリューションを配置し、常にバブルの 95% O 2/5% CO 2.
- 大規模な鋭いはさみを使用して、すばやく説明 9 としてマウスの首をはねるし、すぐに氷が入ったビーカーに頭を入れて (0-4 ° C) 切削ソリューションです 。
- 高級はさみで鼻尾側方向に正中線に沿って頭蓋骨の上部を切り取り、外側頭蓋部分を削除します。冷たい切削ソリューションに高級ヘラとドロップで脳を削除します
。 メモ: 手順 2.2 2.3 急速に実行する必要があります (理想的には < 1 分) です 。
- は、氷を入れた 9 cm シャーレの蓋の脳を配置します。冷たい切削ソリューションで脳をすすいでください。小脳およびかみそりの刃と嗅球切断します 。
- 試料へ適用シアノアクリ レート系接着剤、vibratome のホルダーです。慎重に、吻側側の接着剤のドロップに脳ブロックを配置し、すぐに冷たい切削溶液に浸します 。
- 水平平面と 15 度の角度に vibratome のブレード ホルダーを調整し、コロナ脳スライス 350 μ m を準備 (翼振動周波数 = 85 Hz、速度 0.1 mm/s を =).
- 定数バブルで 95% O 2/5% (RT) で 1 時間インキュベート アプライド、満ちている回復室にスライス転送ピペットを使用して、CO 2.
3。全細胞パッチ記録
- 作るガラス ホウケイ酸用マイクロ ピペットについて電極として使用または引き手操作マニュアルの特定のガイドラインに従ってマイクロ ピペットをパフします。電極、チップ抵抗は 4-6 M の範囲の Ω、パフ用マイクロ ピペットは、2-5 μ m 範囲の先端の直径を持っている 。
- は、ブロック高速 Na + チャネルおよびこうして活動電位、アプライドに + Na チャンネル遮断薬 (TTX、1 μ M) を追加し、商工会議所に蠕動ポンプによって録音室で 2-3 mL/分のこの溶液の一定流量を維持それを吸引。バブルのアプライド 95% O 2/5% CO 2 スライスの存続させるため常にします 。
- は、スライスのサイズに合わせてカットされた微細先端変更したパスツール ピペットを使用して録音室に脳スライスを転送します。間隔の並列ナイロン スレッドでプラチナ スライス アンカーでスライスをカバー ≥ プラットフォーム上のスライスを保持するために 2 mm を離れてします 。
- 記録マイクロ ピペットを詰めて内部ソリューション 7 (表 3)、10 の μ M、50 μ M、100 μ M (アプライドで解散) や車両制御としてアプライドで GABA とパフ マイクロ ピペットを埋める 。
- の破片との閉塞を防ぐために、アプライドに記録電極を浸す前に 1 mL の注射器を使用して光の肯定的な圧力を適用されます。顕微鏡 (4 x 対物レンズ)、マイクロマニピュレーターを使用してヒント ( 図 1 A) のモニターで、ビデオ画像の中央に表示されるように記録電極とパフのマイクロ ピペットを置きます 。
- はパフ マイクロ ピペットを徐々 に削減しながら顕微鏡焦点 (40 x 対物レンズ) を調整し、45 ° の角度で記録ニューロン上に配置します。パフ マイクロ ピペットの先端と 20-40 μ m ( 図 1 B) 間に記録されたニューロンとの間の距離を保ちます。ゆっくりと慎重に記録電極を神経細胞にアプローチし、肯定的な圧力を離します。ギガ オーム シールを作成する電極ホルダーに接続されているチューブを弱いと簡単な吸引を適用します 。
- 維持 0 時電圧 mV。ギガ オーム シールの形成後、高速を補うため、手動でまたは自動的に容量を低下します。全体セル モードに入る上記チューブを介して簡潔で強力な吸引を適用します 。
- 電圧クランプのレコード eIPSC モード。マスター 8 ステップ電圧によって制御される Picospritzer を使用してシングルまたはペアの GABA のパフ ( 図 2) を実現するパフ ピペットに低ガス圧 (窒素、4-6 psi) を適用します 。
- ベスト eIPSC 結果 ( 図 3) を取得し、LPS 誘導性うつ病モデル ( 図 4) で eIPSC を測定パフ期間を変更します 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
パフ テクニックは、薬の特定の神経細胞の表面に特定の受容体に及ぼす影響の研究に研究できます。この記事では、GABA 受容体を介した電流に着目します。パフと録音用のマイクロ ピペットを図 1に示します。パフは、アプライドによって生成された物理的な圧力の記録されたニューロンに影響を排除するために、ショ糖パフ (図 2A) がコントロールとして使用されます。一方、図 2Bに示すように、アプライド ウォッシュ アウト (ブルー) によって基準状態を回復できます、報告10、ピクロトキシンなどの GABA 受容体阻害剤による GABA パフ (黒) による応答をブロックできます。特に、アプライドもショ糖パフ誘発応答、GABA パフ反応は生理学的な記録された細胞の表面にある GABA 受容体を介したを示唆しています。線量とパフ期間応答曲線は図 3のとおりです。
神経活動と動物の行動を変更する組合が示されているが、GABA 受容体を介した反応への影響はよく知られていなかった。LPS 投与の脳スライスの GABA パフと車両制御マウスによって引き起こされる流れを比較すると、LPS 治療 (図 4) のため大幅に削減の IPSC 振幅を遵守します。
図 1.パフ マイクロ ピペットと記録電極の図。
(A)パフとレコーディング用マイクロ ピペットの距離。(B) (左) パフ ピペットと脳スライスの表面に記録電極を (右)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.ピクロトキシンによる GABA パフ IPSC の封鎖。
(A)息を切らしアプライドとスクロース (50 μ M) 反応を誘導しません。(B)息を切らし 50 μ M GABA 誘導、IPSC (ブラック) (パフ期間 = 200 ms、4-6 psi) TTX を含むアプライドで (1 μ M)、CNQX (20 μ M) と AP5 AMPA および NMDA 受容体を介した活動電位と興奮性電流をブロックする (50 μ M)。GABA 誘起 IPSC は、GABA 受容体阻害剤, (赤) 100 μ M ピクロトキシンの風呂アプリケーションによってブロックされます。IPSC はピクロトキシンのウォッシュ アウト後回復します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.線量とパフ期間応答曲線。
10、50、および 100 μ M GABA による(A)サンプル Ips (パフ期間 = 4-6 psi 50 ms)。(B)パフ期間応答曲線。黒、n = 11;赤、n = 8;青、n = 10;多項式フィット。複数の実験 (8 ≤ n ≤11); の手段としてデータが表示されます。誤差範囲を示す 1、2 または 3 秒間パフ間隔で GABA (50 μ M) パフにより誘発される SEM. (C)反復的な電流 (パフ期間 = 100 ms、4-6 psi)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4. 車両のコントロールと比較して LPS 投与マウスにおける eIPSC の振幅を減少します。
IPSC 振幅を大幅に削減を誘導する GABA を膨化制御ニューロン (生理食塩水、19.74 ± 1.93 pA/pF; 対組合注入LP、14.10 ± 1.30 pA/pF;p = 0.02)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 物質 | g/mol | 濃度 (mM) | 重量 (g/L) |
| 塩化ナトリウム | 58.443 | 119 | 6.9547 |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1 | 0.1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26.2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0.1565 |
| D-グルコース | 198.17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110.98 | 2.5 | 0.2775 |
表 1。録音アプライド。
| 物質 | g/mol | 濃度 (mM) | 重量 (g/L) |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0.6665 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Choline·Cl | 139.63 | 115 | 16.0575 |
| D-グルコース | 198.17 | 7 | 1.3872 |
| CaCl2 | 110.98 | 0.5 | 0.0555 |
表 2。スライス切削ソリューションです。
| 物質 | g/mol | 濃度 (mM) | 重量 (g/L) |
| Cs グルコン酸 | 328.052 | 100 | 32.8052 |
| CsCl | 168.36 | 5 | 0.8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2.3830 |
| MgCl2 | 95.211 | 2 | 0.1904 |
| CaCl2 | 110.98 | 1 | 0.1110 |
| これら | 476.43 |
表 3。内部ソリューション全体細胞のパッチの録音です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
パフ アプリケーション シナプス後受容体機能3,4、7の評価に広く使用、各実験では正確なコントロールが必要です。GABA パフ前頭皮質脳スライスの Ips (すなわち、eIPSCs) の誘導を示す細胞パッチクを含む手順をご紹介します。記録電極の抵抗が約 5 MΩ、パフ用マイクロ ピペットの先端の直径は 2-5 μ m パフ圧力 4 6 psi 間は: この範囲は重要なより低い圧力で発生する可能性より高い圧力は神経の損傷を引き起こす可能性がありますシナプスの GABA 受容体の不十分な活性化。記録されたニューロンにパフ ピペットの先端からの水平距離については 20-40 μ m (1-2 神経細胞の直径)、およびパフ マイクロ ピペットとスライス面の間の角度は約 45 °。パフ ピペットの先端がスライス (z 軸) 上垂直方向に 20-40 μ m です。パフの期間は上記の状況では、10-50 μ M の GABA のパフの下 10 150 さんは適切なニューロンの応答と eIPSC の振幅を誘導し、再現可能な速度論的パラメーターの取得範囲のはずです。プロトコルはパフ スライス パッチ適用に焦点を当ててをここで説明する、それは私たちの出版された仕事の7に示すようと神経の文化でのレコーディングに適したも。
我々 はまた eIPSCs GABA のペア パフ アプリケーションから結果ここに表示されます。対パルス プロトコルはシナプス前プロパティ7,11, が、神経伝達物質受容体結合率と結合親和性、影響を与えることができるの変更など、可能なシナプス効果の評価に広く使用されています。対パルス比は、シナプス刺激によって決定できません。この資料で説明されているプロトコルは、ペアともパルス刺激に対する応答のシナプスの変化を明らかにする方法を提供します。LPS 投与マウスの前頭前野における eIPSC 振幅の減少では、変更されたレベルや GABA 受容体の活性が LPS 誘導性の行動の変化の根底にあることを示唆しています。
型と一致して、組織の特定のレベルで GABA の濃度を維持することも可能だが、ほとんどの薬剤配布方法と同様に、標的細胞に到達する正確な GABA 濃度を知ることは困難です、マイクロ ピペットを使用し、駆動圧力と距離のパフとしてこのようなパラメーターを持つ。私たちのケースでパフスリーブのソリューションのボリュームは 100 ms の持続期間で約 1.1 μ L です。このように、息を切らして実行7,12定量的研究をことができます。
パフを記録の手順を説明して、次の点を念頭に置く必要があります健康な脳スライス急性前頭前野からの準備が重要です。まず、脳を解剖し、前頭前野を迅速に分離 (< 1 分)、1 分以上の冷たい切削ソリューションで脳ブロックを保ちます。次に、しっかりと接着剤の vibratome、試料ホルダーの上に脳ブロックまたはセクショニング中脳ブロックのフロートの可能性がありますそれ以外の場合。でも、健康的なスライスを生成する速度と、vibratome の周波数設定してください。上記のすべての 0 - 4 の手順を実施する努力を行う必要があります ° C 神経細胞の興奮を抑える。
それは 1-2 か月のこの記事で述べる切削ソリューションを使用することは注目に値する-古いマウス。古いマウスの (すなわち > 3 ヵ月)、説明13として切削ソリューションを置き換える必要があります。シュー テクニックはパッチ ・ クランプ実験薬理学的治療の範囲に適用され、薬のすべてのニューロンの電気的活動に及ぼす影響をテストする場合にも使用できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は以下の組織を感謝したい: 国家自然科学基金、中国の (31171018、31171355)、科学技術広東部 (2013KJCX0054)、広東省の自然科学基礎 (2014A030313418、2014A030313440)、広州科学と技術局 (201607010320)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
- Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33 (2012).
- Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
- Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
- Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
- Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
- Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
- Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
- Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
- Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).
