Summary
Descrevemos a técnica de sopro, pelo qual reagentes farmacológicos podem ser administrados durante a gravação de células inteiras remendo-braçadeira e destacam vários aspectos dos recursos que são cruciais para seu sucesso.
Abstract
Administração farmacológica é comumente usada quando conduzindo a célula inteira remendo-braçadeira gravação em fatias de cérebro. Um dos melhores métodos de aplicação da droga durante a gravação eletrofisiológica é a técnica de sopro, que pode ser usada para estudar o efeito dos reagentes farmacológicos na actividade neuronal em fatias de cérebro. A maior vantagem do aplicativo de sopro é que a concentração do fármaco em torno do local de gravação aumenta rapidamente, evitando assim a dessensibilização de receptores de membrana. Envolve a utilização bem sucedida da aplicação de sopro cuidadosa atenção aos seguintes elementos: a concentração da droga, os parâmetros da micropipeta de sopro, a distância entre a ponta de uma micropipeta de sopro e o neurônio gravada e a duração e pressão dirigindo o puff (libras por polegada quadrada, psi). Este artigo descreve um procedimento passo a passo para a gravação de células inteiras correntes induzidas pelo ácido gama - aminobutírico (GABA) para um neurônio de uma fatia de cortical pré-frontal de sopro. Notavelmente, o mesmo procedimento pode ser aplicado com pequenas modificações para outras áreas do cérebro como o hipocampo e o corpo estriado e diferentes preparações, tais como culturas de células.
Introduction
A técnica da remendo-braçadeira, uma ferramenta principal para investigar sinais elétricos nos neurônios, foi desenvolvida na década de 1970,1,2. Uma grande vantagem desta técnica é que ele fornece conhecimento sobre tratamentos específicos como (por exemplo, farmacológico) podem alterar funções neuronais ou canais em tempo real3. Avaliação farmacológica da função neuronal durante a gravação em uma fatia do cérebro células inteiras requer a aplicação de drogas, tais como agonistas ou antagonistas dos receptores específicos, para os neurônios sendo gravada. Este método permite a identificação de alterações neuronais que ocorrem após a aplicação de uma droga específica, conduzindo assim a uma melhor compreensão das propriedades dos neurônios4fisiológicas e patológicas. Embora a administração farmacológica pode ser realizada através de qualquer perfusão5 ou sopro6, o último é a técnica superior. Em particular: (i) soprar o aplicativo rapidamente aumenta de droga concentração ao redor do neurônio gravado para um nível tal que a dessensibilização dos receptores de membrana é impedida; (ii) o volume de droga inchado é extremamente baixo, para que haja pouco efeito sobre a solução de banho, o que reduz, portanto, quaisquer efeitos indesejáveis das substâncias químicas administradas em fatias do cérebro; (iii) o protocolo de sopro pode ser definido e salvo, tornando a experiência muito precisamente reprodutíveis; (iv) sopro aplicativo representa o uso econômico dos agonistas/antagonistas, particularmente onde tais reagentes são caros ou difíceis de obter.
Aqui, nos concentraremos na gravação de células inteiras de correntes induzidas por sopro GABA em fatias de cérebro perfeitamente preparados, uma preparação que tem a vantagem de circuitos cerebrais relativamente bem preservada. Como conduzimos induzida por sopro inibitório correntes7 serão descritos neste artigo. Usando o césio (Cs+)-com base em soluções internas e segurando os neurônios em 0 mV, apresentaremos GABA-sopro evocado correntes pós-sináptico inibitórias (eIPSCs) com detalhes técnicos apropriados. Usando um modelo do rato da depressão induzida pela injeção de lipopolissacarídeo (LPS)8, mostramos que o eIPSC amplitude evocada por um sopro de GABA é significativamente reduzida em fatias de ratos LPS-injetados em comparação aos controles do veículo. Nossa intenção é que este artigo deve mostrar como a técnica de sopro é amplamente aplicável a estudos que visam avaliar o efeito de drogas, compostos ou produtos químicos na actividade neuronal em fatias de cérebro.
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Protocol
Alojamento dos animais e animais de todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com os procedimentos aprovados pelo Comitê de ética para pesquisas com animais em South China Normal University, de acordo com as orientações para o cuidado Animal estabelecidos pelo Instituto Nacional de Saúde.
1. preparação de soluções
- preparar 500 mL de padrão artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) que contém os componentes descritos no nosso trabalho publicado 7 conforme listado na tabela 1.
- Limpo vidro uso copos com água desionizada para preparar uma solução ACSF fresca. Limpar a espátula com água desionizada e seque antes de usar para adicionar NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glicose e adicione o CaCl 2 após ter alternassem a solução com 95% O 2 / 5% CO 2 mistura de ~ 20 min (como detalhado na tabela 1) a 500 mL de água desionizada. Mexa até dissolver totalmente.
- Assegure a ACSF está completamente limpo sem nenhuma precipitação. Em seguida, ajuste o pH para 7,2-7,4. Bolha com uma mistura gasosa composta de 95% O 2 e 5% CO 2 ~ 20 min.
- Preparar 250 mL de solução de corte fatia contendo os produtos químicos 7 descritas na tabela 2.
- Adicionar KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glicose e adicionar o CaCl 2 último conforme indicado em 1.1.1, para 250 mL de água desionizada e dissolver conforme descrito em 1.1.1 e 1.1.2.
- Depois borbulhando com 95% O 2 / 5% de CO 2, coloque a solução em um congelador por 15-20 min para que a solução de corte torna-se gelada e parcialmente congelado.
Nota: Usamos esta solução de corte ao fazer fatias de 2-1 mês-velhos ratos; a fórmula pode ser diferente para os ratos mais de 2 meses. - Solução de preparar LPS pela dissolução em solução salina isotônica livre de endotoxinas estéril (0,9% NaCl). LPS é administrado intraperitonealmente (0,5 mg/kg) e começar a gravar 2h depois.
2. Preparação de fatia de córtex pré-frontal
- tirar a solução de corte do freezer e homogeneizar para obter uma lama. Coloque a solução no gelo e bolha constantemente com 95% O 2 / 5% de CO 2.
- Usando tesouras grandes e afiadas, rapidamente decapitar um rato como descrito 9 e imediatamente colocar a cabeça para um copo cheio de gelado (0-4 ° C) solução de corte.
- Cortar a parte superior do crânio ao longo da linha mediana em uma direção caudal-para-nasal com uma tesoura bem e retire as partes laterais do crânio. Retire o cérebro com uma espátula fina e gota em solução de corte gelada.
Nota: Passos 2.2-2.3 devem ser feitos rapidamente (idealmente < 1 min). - Coloque o cérebro na tampa de um prato de Petri de 9cm cheio de gelo. Lave o cérebro com solução de corte bem gelada. Cortar o cerebelo e o bulbo olfatório com uma lâmina de barbear.
- Cola de cianoacrilato de aplicar ao modelo titular de um vibratome. Cuidadosamente coloque o bloco de cérebro na gota de cola, rostral para cima e imediatamente mergulhe na solução de corte gelada.
- Ajustar o suporte da lâmina do vibratome a um ângulo de 15° em relação ao plano horizontal e preparar 350-µm fatias coronais do cérebro (frequência de vibração da lâmina = 85 Hz, velocidade = 0,1 mm/s).
- Usando uma pipeta, transferência as fatias para a câmara de recuperação cheia de ACSF, incubar durante 1 h (RT) com a constante subida de 95% O 2 / 5% de CO 2.
3. Gravação de Patch de células inteiras
Micropipetas de- fazer vidro borosilicato para usar como gravação eletrodos ou puff, micropipetas de acordo com as orientações específicas no Manual de operação do extrator. Para gravação de eletrodos, as resistências de ponta são na faixa de 4-6 M Ω, enquanto o sopro micropipetas têm diâmetros de ponta na faixa de 2 a 5 µm.
- Adicionar bloqueador dos canais de Na + (TTX, 1 µM), canal de at + bloco rápido e, portanto, potenciais de ação, a ACSF e manter uma taxa de fluxo constante desta solução de 2-3 mL/min na câmara de gravação, por bomba peristáltica na câmara e aspiração fora disso. Bolha a ACSF com 95% O 2 / 5% de CO 2 constantemente para garantir a viabilidade das fatias.
- Transferir uma fatia do cérebro para a câmara de gravação usando uma pipeta de Pasteur modificada cuja ponta fina foi cortada para caber o tamanho da fatia. Cobrir a fatia com uma âncora de platina fatia com fios de nylon paralelas espaçados ≥ 2mm separados para segurar a fatia na plataforma.
- Preencher a micropipeta de gravação com solução interna 7 (tabela 3) e preencher as Micropipetas de sopro com GABA a 10 µM, 50 µM e 100 µM (dissolvido em ACSF) ou ACSF como controle de veículo.
- Para evitar bloqueio com detritos, aplique uma leve pressão positiva, utilizando uma seringa de 1 mL antes imergindo o eletrodo gravação na ACSF. Usando um micromanipulador sob um microscópio (lente da objetiva x 4), posicione a micropipeta de eletrodo e puff de gravação para que as dicas aparecem no centro da imagem de vídeo no monitor ( Figura 1 A).
- Ajustar o foco do microscópio (40 x da lente objetiva) reduzindo gradualmente a micropipeta de sopro e colocá-lo acima do neurônio de gravação em um ângulo de 45°. Manter a distância entre a ponta da micropipeta sopro e o neurônio gravado entre 20-40 µm ( Figura 1 B). Aproximar-se lentamente e com cuidado o neurônio com o eletrodo de gravação e em seguida, solte a pressão positiva. Aplique uma sucção fraca e breve através do tubo conectado ao suporte de eletrodo para criar um selo de giga-ohm.
- Manter a tensão em 0 mV. Após a formação do selo giga ohms, compensar rápido e lento capacitância manualmente ou automaticamente. Em seguida, aplicar uma breve e forte sucção através da tubulação mencionada acima para entrar no modo de células inteiras. Modo de
- eIPSC de registro em tensão-braçadeira. Aplique uma pressão baixa de gás (nitrogênio, 4-6 libras por polegada quadrada) a micropipeta de sopro usando um Picospritzer controlado por um gerador de passo mestre 8 tensão para entregar a única ou a par GABA sopros ( Figura 2).
- Alterar a duração do sopro para obter os melhores resultados de eIPSC ( Figura 3) e medir a eIPSC no modelo de depressão induzida por LPS ( Figura 4).
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Representative Results
A técnica de sopro permite aos pesquisadores estudar o efeito das drogas sobre os receptores específicos na superfície de um determinado neurônio. Neste artigo, enfocamos as correntes mediadas por receptores GABA. A Figura 1 mostra as micropipetas puff e gravação. Para eliminar qualquer efeito sobre os neurônios gravados da pressão física gerada pelo puff, ACSF e sopros de sacarose(Figura 2)são usados como controles. A resposta induzida por um sopro de GABA (preto) pode ser bloqueada por um inibidor de receptores GABA, como Picrotoxina como relatado10, enquanto a condição de base pode ser recuperada pelo ACSF lavagem-para fora (azul), como mostrado na Figura 2B. Notavelmente, uma ACSF nem um sopro de sacarose induz uma resposta, sugerindo que respostas induzidas por sopros de GABA são fisiológicas e são mediadas por receptores GABA localizados na superfície da célula gravada. As curvas de resposta de dose e duração do sopro são mostradas na Figura 3.
LPS foi mostrado para alterar a actividade neuronal e comportamento animal, mas seu efeito sobre as respostas de mediada por receptores GABA não era bem conhecido. Quando comparamos as correntes induzidas por sopros de GABA em fatias de cérebro de LPS-injetados e ratos de controle do veículo, observamos amplitudes IPSC significativamente reduzidas devido ao tratamento de LPS (Figura 4).
Figura 1 . Diagrama do eléctrodo sopro micropipeta e gravação.
(A) a distância entre o puff e Micropipetas de gravação. (B) a micropipeta de sopro (à esquerda) e o eletrodo de gravação (à direita) na superfície de uma fatia do cérebro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Bloqueio de Picrotoxina de IPSC induzida pelo sopro de GABA.
(A) sopro ACSF e sacarose (50 µM) não induz a nenhuma resposta. (B) soprando 50 µM GABA induz um IPSC (preto) (sopro duração = 200 ms, 4-6 libras por polegada quadrada) no ACSF contendo TTX (1 µM), CNQX (20 µM) e AP5 (50 µM) para bloquear os potenciais de ação e corrente excitatória mediada por receptores GABA e NMDA. O IPSC induzida por GABA é bloqueada por aplicação de banho de um inibidor de receptor GABA, 100 Picrotoxina µM (vermelho). O IPSC recupera depois da lavagem de Picrotoxina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Curvas de resposta de dose e duração do sopro.
(A) amostra IPSCs induzido por 10, 50 e 100 µM GABA (sopro duração = 50 ms, 4-6 libras por polegada quadrada). (B) curvas de resposta de Puff-duração. Preta, n = 11; vermelho, n = 8; azul, n = 10; polinômio de cabe. Dados são mostrados como o meio de vários experimentos (≤11 n ≤ 8); barras de erro indicam SEM. (C) correntes repetitivas evocadas por GABA (50 µM) sopros em intervalos inter folhados de s 1, 2 ou 3 (sopro duração = 100 ms, 4-6 libras por polegada quadrada). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . eIPSC amplitude é reduzida em ratos LPS-injetados em comparação aos controles do veículo.
GABA de sopro induz uma significativamente reduzida amplitude IPSC em LPS-injetados vs neurônios de controle (solução salina, 19,74 ± 1,93 pA/pF; LPS, 14.10 ± 1,30 pA/pF; p = 0,02). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Substância | g/mol | Concentração (mM) | Peso (g/L) |
| NaCl | 58.443 | 119 | 6.9547 |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| NaH2PO4 | 137,99 | 1 | 0.1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26.2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0.1565 |
| D-glicose | 198.17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110.98 | 2.5 | 0.2775 |
Tabela 1. ACSF gravação.
| Substância | g/mol | Concentração (mM) | Peso (g/L) |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0.6665 |
| NaH2PO4 | 137,99 | 1.25 | 0.1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Choline· CL | 139.63 | 115 | 16.0575 |
| D-glicose | 198.17 | 7 | 1.3872 |
| CaCl2 | 110.98 | 0,5 | 0.0555 |
Tabela 2. Solução de corte da fatia.
| Substância | g/mol | Concentração (mM) | Peso (g/L) |
| Gluconato de CS | 328.052 | 100 | 32.8052 |
| CsCl | 168.36 | 5 | 0.8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2.3830 |
| MgCl2 | 95.211 | 2 | 0.1904 |
| CaCl2 | 110.98 | 1 | 0.1110 |
| BAPTA | 476.43 |
Tabela 3. Solução interna para gravações de remendo de células inteiras.
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Discussion
Aplicação de sopro é amplamente utilizada para avaliar a função de receptor pós-sináptico3,4,7, mas requer um controle preciso em cada experimento. Descrevemos aqui um procedimento envolvendo células inteiras remendo de aperto, que demonstra o que Puff GABA induzida IPSCs (i.e., eIPSCs) em fatias de cérebro cortical pré-frontal. A resistência do eletrodo gravação é cerca de 5 MΩ, enquanto o diâmetro da ponta de Micropipetas de sopro é sobre pressão de 2-5 µm. Puff é entre 4-6 libras por polegada quadrada: esta escala é fundamental, pois uma pressão mais elevada pode causar dano neuronal, enquanto uma pressão mais baixa pode resultar em insuficiente ativação dos receptores de GABA pós-sináptica. A distância horizontal da ponta da micropipeta do sopro para o neurônio gravado é sobre 20-40 µm (o diâmetro de 1-2 neurônios) e o ângulo entre a superfície de micropipeta e fatia de sopro é cerca de 45°. A ponta da micropipeta sopro é verticalmente de 20-40 µm acima a fatia (eixo z). A duração do sopro deve estar no intervalo 10-150 ms. sob as circunstâncias acima, sopros de 10-50 µM GABA induzir resposta neuronal apropriada e a amplitude de eIPSC e parâmetros cinéticos obtidos são reprodutíveis. Embora o protocolo descrito aqui centra-se na aplicação de sopro para um patch de fatia, também é adequado para gravações em culturas neuronal, como mostrado no nosso trabalho publicado7.
Também mostramos aqui eIPSCs resultante da aplicação de puff emparelhado do GABA. Emparelhado-pulso protocolos têm sido amplamente utilizados para avaliar Propriedades pré-sináptica7,11, mas possíveis efeitos pós-sinápticos, tais como mudanças no neurotransmissor-receptor taxa e vinculação afinidade de ligação, que poderia influenciar rácios de pulso pareado, não pode ser determinado pela estimulação pré-sináptica de pulso emparelhado. O protocolo descrito neste artigo fornece uma maneira para elucidar alterações pós-sinápticas em resposta aos estímulos do trem de pulso emparelhados e mesmo. A redução na amplitude de eIPSC no córtex pré-frontal de LPS-injetados ratos sugere que níveis alterados ou atividade de receptores GABA pode fundamentam mudanças comportamentais induzida por LPS.
Embora, como com a maioria das técnicas de entrega de droga, é difícil saber a concentração exacta de GABA atingindo a célula de destino, ainda é possível manter a concentração de GABA em certos níveis no tecido, sendo consistente com o tipo de Micropipetas usado, e com parâmetros tais como puff pressão e distância. No nosso caso, o volume de solução inchado é cerca de 1,1 µ l a duração de 100 ms. Assim, soprar permite estudos quantitativos ser realizada7,12.
A preparação de fatias de cérebro saudável do córtex pré-frontal aguda é fundamental para o processo de gravação ' puff descrevemos, e devem ter em conta os seguintes pontos. Primeiro, dissecar o cérebro e separar o córtex pré-frontal rapidamente (< 1 min) e em seguida, manter o bloco do cérebro em solução de corte bem gelada para não mais de 1 min. Em seguida, firmemente cola o bloco do cérebro na parte superior do suporte de amostra de vibratome, ou caso contrário o bloco do cérebro pode flutuar durante o corte. A velocidade e a frequência do vibratome devem ser definidos para gerar mesmo, fatias saudáveis. Devem envidar-se esforços para conduzir todos acima procedimentos em 0-4 ° C para minimizar a excitabilidade neuronal.
É interessante notar que a solução de corte que descrevemos neste artigo deve ser usada por 2-1 mês-velhos ratos. Para os ratos mais velhos (ou seja, > 3 meses), a solução de corte deve ser substituída como descrito13. A técnica de sopro é aplicável a uma gama de experiências de remendo-braçadeira envolvendo tratamentos farmacológicos e também pode ser usada para testar o efeito das drogas sobre a atividade elétrica de neurônios qualquer.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer as seguintes organizações: Nacional Natural Science Foundation da China (31171018, 31171355), a ciência e a tecnologia de divisão de Guangdong (2013KJCX0054), a Fundação ciência Natural da província de Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440) e a ciência de Guangzhou e tecnologia Bureau (201607010320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
- Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33 (2012).
- Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
- Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
- Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
- Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
- Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
- Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
- Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
- Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).
