Summary
Describimos la técnica de soplo, que reactivos farmacológicos pueden ser administrados durante la grabación de la abrazadera del remiendo de célula entera y resaltar diversos aspectos de las características que son cruciales para su éxito.
Abstract
Administración farmacológica es de uso general cuando se realizan células completas-abrazadera del remiendo en rebanadas de cerebro. Uno de los mejores métodos de aplicación de la droga durante la grabación electrofisiológica es la técnica de soplo, que puede utilizarse para estudiar el efecto de reactivos farmacológicos en actividades neuronales en rebanadas de cerebro. La mayor ventaja del uso del hojaldre es que la concentración del fármaco en el sitio de grabación aumenta rápidamente, evitando así la desensibilización de receptores de membrana. Exitosa aplicación del soplo implica especial atención a los siguientes elementos: la concentración del fármaco, los parámetros de la micropipeta de hojaldre, la distancia entre la punta de una micropipeta de hojaldre y la neurona registrada y la duración y presión conduce el soplo (libras por pulgada cuadrada, psi). Este artículo describe un procedimiento paso a paso para registrar celulares corrientes inducidas por ácido gamma - aminobutírico (GABA) en una neurona de un segmento cortical prefrontal de soplar. En particular, el mismo procedimiento se puede aplicar con pequeñas modificaciones a otras áreas del cerebro como el hipocampo y el striatum y a diferentes preparaciones, tales como los cultivos celulares.
Introduction
La técnica de patch-clamp, una herramienta primaria para la investigación de las señales eléctricas en las neuronas, se desarrolló en la década de 19701,2. Una gran ventaja de esta técnica es que proporciona conocimiento sobre tratamientos específicos cómo (por ejemplo, farmacológicas) pueden alterar las funciones neuronales o canales en tiempo real3. Evaluación farmacológica de la función neuronal durante la grabación en una rebanada del cerebro de células completas requiere la aplicación de fármacos, como agonistas o antagonistas de receptores específicos, las neuronas se registran. Este método permite la identificación de alteraciones neuronales que ocurren después de la aplicación de un medicamento específico, lo que conduce a una mejor comprensión de las propiedades fisiológicas y patológicas de las neuronas4. Aunque la administración farmacológica puede llevarse a cabo mediante perfusión5 o soplo6, este último es la técnica superior. En particular: () aplicación de hojaldre rápido aumenta la droga concentración alrededor de la neurona grabada a un nivel tal que se evita la desensibilización de los receptores de membrana; (ii) el volumen de droga inflado es extremadamente bajo, por lo que hay poco efecto en la solución del baño, que por lo tanto reduce los efectos indeseables de las sustancias químicas administradas en rebanadas de cerebro; (iii) el protocolo de hojaldre puede ser establecido y guardado, haciendo el experimento precisamente reproducible; (iv) puff aplicación representa uso económico de agonistas/antagonistas, especialmente donde tales reactivos son caros o difíciles de conseguir.
Aquí, nos centraremos en la grabación de celulares corrientes inducidas por GABA el soplar en rebanadas de cerebro agudo preparado, una preparación que tiene la ventaja de circuitos cerebrales relativamente bien conservado. Cómo llevamos a cabo corrientes inhibitorios inducidos por el soplo7 se describen en este artículo. Utilizando cesio (Cs+)-soluciones internas y el mantenimiento de las neuronas a 0 mV, presentamos GABA-puff evocado inhibitorias postsynaptic corrientes (eIPSCs) con las características técnicas adecuadas. Utilizando un modelo de ratón de la depresión inducida por lipopolisacárido (LPS) inyección8, se muestra que el eIPSC amplitud evocada por un soplo de GABA se reduce significativamente en rebanadas de ratones inyectados por LPS comparados con el control del vehículo. Nuestra intención es que este artículo debería mostrar cómo la técnica de soplo es ampliamente aplicable a estudios dirigidos a evaluar el efecto de productos químicos, compuestos o drogas sobre actividades neuronales en rebanadas de cerebro.
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Protocol
y todos los animales se realizaron experimentos de acuerdo con procedimientos aprobados por el Comité de ética para la investigación animal en South China Normal University, según las directrices para el cuidado del Animal establecido por el Instituto Nacional de Salud.
1. preparación de soluciones
- preparar 500 mL de estándar artificial líquido cerebroespinal (ACSF) que contiene los componentes se describe en nuestro trabajo publicado 7 como se indica en la tabla 1.
- Uso limpia vidrio vasos de precipitados con agua desionizada para preparar una solución fresca de la ACSF. Limpiar espátulas con agua desionizada y seque antes de usar Añadir NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glucosa y añadir CaCl 2 después de haber burbujas la solución con 95% O 2 / 5% CO 2 mezcla de ~ 20 minutos (como indica en la tabla 1) a 500 mL de agua desionizada. Revolver hasta que esté disuelto completamente.
- Asegurar la ACSF es completamente clara sin ninguna precipitación. Luego, ajustar el pH a 7.2-7.4. Burbuja con una mezcla de gases compuesta de 95% O 2 y 5% CO 2 ~ 20 min
- Preparar 250 mL de solución de corte de rebanada que contienen los productos químicos 7 descritos en la tabla 2.
- Añadir KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glucosa y añadir CaCl 2 últimos como se indica en 1.1.1, a 250 mL de agua desionizada y disolver como se describe en 1.1.1 y 1.1.2.
- Después de burbujeo con 95% O 2 / 5% CO 2, coloque la solución en el congelador durante 15-20 min para que se convierte en la solución de corte parcialmente congelados y helados.
Nota: Utilizamos esta solución de corte al hacer rodajas de 1-2 mes-ratones del viejo; la fórmula puede variar para los ratones mayores de 2 meses. - Solución de LPS preparar disolviendo en solución salina libre de endotoxina isotónica estéril (0.9% NaCl). LPS es administrado por vía intraperitoneal (0, 5 mg/kg) y comenzar a grabar 2 h más tarde.
2. Preparación de Corteza Prefrontal
- tomar la solución de corte fuera del congelador y homogeneizar para obtener un granizado. Coloque la solución en hielo y burbujas constantemente con 95% O 2 / 5% CO 2.
- Con unas tijeras grandes y afiladas, rápidamente decapitar un ratón como descrito 9 e inmediatamente puso la cabeza en un vaso llenado de frías (0-4 ° C) solución de corte.
- Cortar la parte superior del cráneo a lo largo de la línea media en dirección caudal nasal con tijeras finas y retirar las porciones lateral del cráneo. Quitar el cerebro con una espátula fina y colocar en solución de corte helada.
Nota: Pasos 2.2-2.3 deben realizarse rápidamente (idealmente < 1 min). - Poner el cerebro en la tapa de un plato de Petri de 9 cm con hielo. Lavar el cerebro con la solución de corte helado. Corta el cerebelo y el bulbo olfatorio con una cuchilla de afeitar. Titular de
- Aplicar pegamento del cianocrilato a la muestra de un vibratome. Coloque cuidadosamente el bloque del cerebro sobre la gota de pegamento, lado rostral y sumerja inmediatamente en la solución helada corte.
- Ajustar el sujetador de la cuchilla de vibratome a un ángulo de 15° en relación con el plano horizontal y preparar 350 μm rebanadas de cerebro coronales (frecuencia de la vibración de la lámina = 85 Hz, velocidad = 0,1 mm/s).
- Con una pipeta, transfiera las rebanadas en la cámara de recuperación llenan con ACSF, incubar durante 1 h (a RT) con burbujeo constante de 95% O 2 / 5% CO 2.
3. Grabación de parche de celulares
- hacer vidrio Micropipetas de borosilicato para utilizar como electrodos de grabación o puff Micropipetas según las directrices específicas en el Manual de operación del tirador. Para la grabación de los electrodos, las resistencias de punta están en el rango 4-6 M Ω, mientras que el soplo Micropipetas tienen diámetros de punta en el rango de 2-5 μm.
- Agregar bloqueador de canales de Na + (TTX, 1 μm), bloque rápido Na + de canales y así los potenciales de acción, a la ACSF y mantener un flujo constante de esta solución de 2-3 mL/min en la sala de grabación, por bomba peristáltica en la cámara de y aspiraciones de ella. Burbuja la ACSF con 95% O 2 / 5% CO 2 constantemente para garantizar la viabilidad de las rodajas de.
- Transferir un trozo de cerebro en la sala de grabación con una pipeta Pasteur modificada cuya punta fina fue cortada para ajustarse al tamaño de rebanada. Cubre la rebanada con un ancla de platino rebanada con hilos de nylon paralelo espaciados ≥ 2 mm aparte hacer la rebanada en la plataforma de.
- Llenar la micropipeta de grabación con solución interna 7 (tabla 3) y se llenan de las Micropipetas puff GABA en 10 μm, 50 μm y 100 μm (disuelto en ACSF) o ACSF como control del vehículo.
- Para evitar la obstrucción con residuos, aplique ligera presión positiva utilizando una jeringa de 1 mL antes de sumergir el electrodo de la grabación en la ACSF. Utilizando un micromanipulador bajo un microscopio (objetivo del x 4), colocar la micropipeta de electrodo y puff de grabación para que aparezcan las puntas en el centro de la imagen en el monitor ( figura 1 A).
- Ajustar el enfoque del microscopio (objetivo x 40) reduciendo gradualmente la micropipeta de hojaldre y colocar por encima de la neurona de la grabación en un ángulo de 45°. Mantener la distancia entre la punta de la micropipeta de hojaldre y la neurona registrada entre 20-40 μm ( figura 1 B). Lenta y cuidadosamente abordar la neurona con el electrodo de la grabación y luego suelte la presión positiva. Aplicar una succión débil y breve a través del tubo conectado a la pinza portaelectrodos para crear un sello de giga ohmios.
- Mantener la tensión a 0 mV. Después de la formación del sello giga ohmios, compensar rápido y lento capacitancia manualmente o automáticamente. Luego aplicar una succión breve y fuerte a través del tubo mencionado arriba para entrar en la célula entera. Modo de
- eIPSC de registro en la abrazadera de tensión. Presión baja de gas (nitrógeno, 4-6 psi) se aplican a la micropipeta de hojaldre utilizando un Picospritzer controlado por un generador de paso de voltaje Master 8 para entregar GABA unitarios o emparejado soplos ( figura 2).
- Cambiar la duración del soplo para obtener los mejores resultados de la eIPSC ( figura 3) y medir el eIPSC en el modelo de la depresión inducida por LPS ( figura 4).
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Representative Results
La técnica de soplo permite a los investigadores a estudiar el efecto de las drogas en particular receptores en la superficie de una neurona determinada. En este artículo, nos centramos en corrientes mediadas por receptores de GABA. La figura 1 muestra las Micropipetas puff y grabación. Para eliminar cualquier efecto en las neuronas registradas de la presión física generado por el soplo, ACSF y soplos de sacarosa (figura 2A) se utilizan como controles. La respuesta inducida por un soplo de GABA (negro) puede ser bloqueada por un inhibidor de la GABA-receptor, como picrotoxin divulgado10, mientras que la condición de línea de base puede ser recuperada por ACSF derrubio (azul), como se muestra en la figura 2B. En particular, ni un ACSF ni un soplo de sacarosa induce una respuesta, sugiriendo que las respuestas inducidas por GABA soplos son fisiológicas y son mediadas por receptores GABA ubicados sobre la superficie de la célula grabada. Las curvas de respuesta de dosis y duración del soplo se muestran en la figura 3.
LPS se ha demostrado para alterar actividades neuronales y comportamiento de los animales, pero no era muy conocido su efecto sobre las respuestas mediadas por el receptor de GABA. Al comparar las corrientes inducidas por GABA soplos en rebanadas de cerebro de la inyección de LPS y los ratones de control de vehículo, observamos las amplitudes IPSC redujo significativamente debido al tratamiento de LPS (figura 4).
Figura 1 . Diagrama del electrodo puff micropipeta y grabación.
(A) la distancia entre el hojaldre y Micropipetas de grabación. (B) la micropipeta de puff (izquierda) y el electrodo de la grabación (derecha) en la superficie de un trozo de cerebro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Bloqueo de Picrotoxin de IPSC inducida por el soplo de GABA.
(A) ACSF soplar y sacarosa (50 μm) no induce ninguna respuesta. (B) soplar 50 μm GABA induce un IPSC (negro) (duración del soplo = 200 ms, 4-6 psi) en ACSF con TTX (1 μm), CNQX (20 μm) y AP5 (50 μm) para bloquear los potenciales de acción y corriente excitatorio mediada por receptores AMPA y NMDA. El IPSC inducida por el GABA está bloqueado por el uso del baño de un inhibidor del receptor de GABA, 100 picrotoxin μm (rojo). El IPSC se recupera después de derrubio de picrotoxin. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Curvas de respuesta de dosis y duración del soplo.
(A) muestra IPSCs inducida por 10, 50 y 100 μm GABA (duración del soplo = 50 ms, 4-6 psi). (B) curvas de duración del soplo. Negro, n = 11; rojo, n = 8; azul, n = 10; polinomio de ajuste. Se muestran datos como el medio de varios experimentos (8 ≤ n ≤11); barras de error indican SEM. (C) corrientes repetitivas evocadas por GABA (50 μm) soplos soplo entre intervalos de 1, 2 o 3 s (puff duración = 100 ms, 4-6 psi). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . eIPSC amplitud es reducida en los ratones inyectados por LPS comparados con el control del vehículo.
Que sopla GABA induce una reducción significativa amplitud IPSC en inyección de LPS vs las neuronas de control (solución salina, 19.74 ± 1.93 pA/pF; LPS, 14.10 ± 1.30 pA/pF; p = 0,02). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Sustancia | g/mol | Concentración (mM) | Peso (g/L) |
| NaCl | 58.443 | 119 | 6.9547 |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1 | 0.1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26.2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0.1565 |
| D-glucosa | 198.17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110.98 | 2.5 | 0.2775 |
Tabla 1. Grabación ACSF.
| Sustancia | g/mol | Concentración (mM) | Peso (g/L) |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0.6665 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Choline· Cl | 139.63 | 115 | 16.0575 |
| D-glucosa | 198.17 | 7 | 1.3872 |
| CaCl2 | 110.98 | 0.5 | 0.0555 |
Tabla 2. Solución del corte de la rebanada.
| Sustancia | g/mol | Concentración (mM) | Peso (g/L) |
| Gluconato de CS | 328.052 | 100 | 32.8052 |
| CsCl | 168.36 | 5 | 0.8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2.3830 |
| MgCl2 | 95.211 | 2 | 0.1904 |
| CaCl2 | 110.98 | 1 | 0.1110 |
| BAPTA | 476.43 |
Tabla 3. Solución interna para grabaciones de celulares parche.
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Discussion
Aplicación de hojaldre es ampliamente utilizado para evaluar la función de receptores postsinápticos3,4,7, pero requiere un control preciso en cada experimento. Aquí describimos un procedimiento que implica sujeción parche de células enteras, que demuestra que GABA-puff inducida IPSCs (es decir, eIPSCs) en rebanadas de cerebro cortical prefrontal. La resistencia del electrodo de registro es MΩ cerca de 5, mientras que el diámetro de la punta de Micropipetas puff es acerca de 2-5 μm. Puff presión es entre 4-6 psi: esta gama es fundamental, ya que una presión más alta puede causar daño neuronal, mientras que una presión más baja puede resultar en insuficiente activación de los receptores postsinápticos de GABA. La distancia horizontal desde la punta de la micropipeta de hojaldre a la neurona registrada es de 20-40 μm (el diámetro de las neuronas de 1-2) y el ángulo entre la superficie de la micropipeta y rebanada de hojaldre es de unos 45°. La punta de la micropipeta de hojaldre es vertical 20-40 μm por encima de la rebanada (eje z). La duración del soplo debe ser en el rango de 10-150 ms. en las circunstancias anteriores, soplos de 10-50 μm GABA induce una respuesta neuronal apropiada y la amplitud de eIPSC y parámetros cinéticos obtenidos son reproducibles. Aunque el protocolo descrito aquí se centra sobre aplicación de hojaldre a un parche de la rebanada, es también conveniente para grabaciones en cultivos neuronales, como se muestra en nuestro trabajo publicado7.
También mostramos aquí eIPSCs resultantes de la aplicación de hojaldre maridado de GABA. Protocolos de junto-pulso han sido ampliamente utilizados para evaluar propiedades presináptica7,11, pero posibles efectos postsinápticos, como cambios en el neurotransmisor-receptor tasa y atascamiento afinidad de Unión, que podría influir en ratios de junto-pulso, no se puede determinar por el estímulo de junto-pulso presináptico. El protocolo descrito en este artículo proporciona una forma de dilucidar alteraciones postsinápticos en respuesta a estímulos apareados y hasta tren de pulsos. La reducción en la amplitud de eIPSC en la corteza prefrontal de los ratones inyectados por LPS sugiere que niveles alterados o actividad de los receptores GABA podría subyacen cambios conductuales inducidos por LPS.
Aunque, como con más técnicas de la administración de drogas, es difícil saber la concentración exacta de GABA llegando a la célula diana, todavía es posible mantener la concentración de GABA en ciertos niveles en el tejido por ser consistente con el tipo de utilizan Micropipetas y con parámetros tales como puff accionamiento presión y distancia. En nuestro caso, el volumen de solución inflado es aproximadamente 1,1 μl a 100 ms de duración. Así, el soplar permite estudios cuantitativos se realizan7,12.
La preparación de rodajas de cerebro sano de la corteza prefrontal aguda es fundamental para el soplo grabación procedimiento Describimos, y los siguientes puntos deben tenerse en cuenta. En primer lugar, diseccionar el cerebro y separar rápidamente la corteza prefrontal (< 1 min) y luego mantener el bloque del cerebro en la solución de corte fría durante no más de 1 minuto. A continuación, pegar firmemente el bloque del cerebro sobre las mordazas de vibratome, o de lo contrario el bloque de cerebro puede flotar durante el seccionamiento. La velocidad y la frecuencia de la vibratome deben establecerse para generar incluso, rodajas saludables. Deben realizar esfuerzos para llevar a cabo todos los anteriores procedimientos de 0-4 ° C para reducir al mínimo la excitabilidad neuronal.
Cabe señalar que la solución de corte que se describe en este artículo debe utilizarse 1-2 mes-ratones del viejo. Para los ratones más viejos (es decir, > 3 meses), la solución de corte debe reemplazarse como descrito13. La técnica de soplo es aplicable a una variedad de experimentos de patch-clamp con tratamientos farmacológicos y también puede utilizarse para probar el efecto de fármacos sobre la actividad eléctrica de cualquier neuronas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a las siguientes organizaciones: Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (31171018, 31171355), la ciencia y la tecnología de división de Guangdong (2013KJCX0054), la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440) y Guangzhou ciencia y Technology Bureau (201607010320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
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