ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
I denne undersøgelse præsenterer vi en let og effektiv procedure til evaluering af forstyrrelser af blod - hjerne barrieren neurodegenerative betingelser. For at nå vores mål, vi infunderes høj molekylvægt fluorescein isothiocyanat mærket (FITC)-albumin i mus jugularis vene og vurderet dets lækage i hjernen parenkym af Fluorescens mikroskopi.
Abstract
Afbrydelse af blod - hjerne barrieren (BBB) integritet er et fælles træk for forskellige neurologiske og neurodegenerative sygdomme. Selv om samspillet mellem foruroliget BBB homøostase og patogenesen af hjernen lidelser har brug for yderligere undersøgelse, kan udvikling og validering af en pålidelig procedure til præcist afsløre BBB ændringer være afgørende og repræsenterer en nyttig værktøj for potentielt forudsige sygdom målrettet progression og udvikling af terapeutiske strategier.
Her præsenterer vi en let og effektiv procedure for evaluering BBB lækage i neurodegenerative tilstand, som det forekommer i en prækliniske musemodel af Huntingtons sygdom, hvor fejl i permeabilitet af BBB er klart påviselige precociously i sygdommen. Specifikt, den høj molekylvægt fluorescein isothiocyanat mærket (FITC)-albumin, som er i stand til at krydse BBB kun når sidstnævnte er nedsat, er akut infunderet i en mus halsfedt og dens fordeling i distrikterne vaskulære eller parenkymalt bestemmes derefter af Fluorescens mikroskopi.
Ophobning af grøn fluorescerende-albumin i hjernen parenkym fungerer som et indeks af afvigende BBB permeabilitet, og når quantitated ved hjælp af billede Jørgensen forarbejdning software, er rapporteret som grøn fluorescens intensitet.
Introduction
Homøostase i centralnervesystemet (CNS) er en forudsætning for korrekt kommunikation og funktionen af de neuronale celler. CNS parenkym er stramt afspærret fra periferien af i endothelial blod - hjerne barrieren (BBB), som repræsenterer grænsefladen mellem de perifere blodbanen og hjernen og spiller en central rolle i cross-talk mellem disse to distrikter1 ,2. BBB er en kompleks og dynamisk tredimensional struktur hovedsagelig består af specialiserede mikro-fartøj endotelceller (ECs) knyttet til hinanden gennem intercellulære junctional komplekser - stramme kryds (TJs) - og omgivet af pericytes, neuron slutninger og astrocyte fod processer1,2.
Fysiologiske betingelser, ekstremt lav permeabilitet af intakt BBB sikrer en streng regulering af transport af næringsstoffer og andre molekyler ind og ud af hjernen, og giver CNS med en enestående beskyttelse mod ændringer i de sammensætning af blodet, som kan påvirke neurale aktivitet og mod potentiale perifere fornærmelser1,2,3.
Afbrydelse af BBB integritet og dets øget permeabilitet har længe været kendt at udgøre et centralt element for mange neurologiske og neurodegenerative lidelser4 herunder Huntington's chorea (HD)5,6, men , uanset om sådan en dysfunktion er en forårsagende fænomen eller en propagative begivenhed i sygdomsforløbet er stadig uklart. Timingen af BBB opdeling er også fortsat undvigende, men nye beviser af vores gruppe og andre angiver forstyrret BBB integritet ikke repræsenterer en sen begivenhed i sygdomsprogression, men snarere et tidligt trin6,7 , 8, der kan have langsigtede konsekvenser.
Med dette i tankerne er det vigtigt at precociously afsløre BBB opdeling i neurodegeneration for at udvikle strategier nyttigt at forudsige sygdomsprogression og hjerneskade og udvikle alternative og mere målrettede interventioner i stand til med succes afbøde de kliniske konsekvenser af sådanne forstyrrelser. Pålidelig billeddannelse af BBB værdiforringelse er derfor af stor betydning i både eksperimentelle forskning og kliniske behandling af hjernesygdomme.
I dette papir beskriver vi en vellykket og enkel procedure for evaluering af BBB permeabilitet i en HD musen model ved hjælp af en høj molekylvægt fluorescein isothiocyanat mærket-albumin (FITC-albumin). Ekstravasation af FITC-albumin, som normalt ikke kan krydse barrieren, ind i hjernen parenkym blev målt som et indeks af BBB lækage. Denne teknik er let at tilpasse til rotter og andre patologiske tilstande præget af cerebrovasculature værdiforringelse9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle procedurer på dyr blev godkendt af IRCCS Neuromed Animal Care Review Board og ved " Istituto Superiore di Sanità " (autorisationsnummer: 1163/2015-PR) og var i overensstemmelse med retningslinjerne i EU direktiv 2010 / 63/EU for dyreforsøg.
1. fremstilling af FITC-albumin løsning til at blive injiceret i halsfedt
Bemærk: alle eksperimenter blev udført i manifest (11 - uger gamle) HD R6/2-mus og i alder og køn-matchede wild-type (WT) kontrol littermates.
- Opløse FITC-albumin pulver (Se Tabel af materialer) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) på 10 mg/ml.
Bemærk: Optimale resultater, dette bør være forberedt friske for hver mærkning reaktion.
2. Forberedelse af udstyr til at blive brugt under operation
- lægge ud de tidligere autoklaveres kirurgiske instrumenter (Se Tabel of Materials).
- Rense den kirurgiske bænk med alkohol (70% ethanol opløsning). Forberede den kirurgisk område (45 cm x 45 cm) med en kirurgisk sterile engangs håndklæde drapere og konfigurere operativsystemet stereomikroskopet.
3. Kirurgisk Procedure for FITC-albumin Infusion i halsfedt
- optager mus kropsvægt for anæstesi.
- Anesthetize mus med en intraperitoneal injektion (i.p) af en passende dosis ketamin (100 mg/kg) - xylazin (10 mg/kg) løsning.
- Skærm animalske sedation af blid tå knivspids trække refleks som påvist i Walantus et al. 11 , 12.
- opstille den bedøvede mus i en opad liggende stilling og løse de fire ben og hale på den kirurgiske workbench med selvklæbende tape.
- Efter musen er sikret, omhyggeligt barbere den passende kirurgiske margin på halsen med en elektrisk barbermaskine (Se Tabel af materialer) og desinficere det med povidon-jod løsning og 70% ethanol.
- Tørre udsatte glatbarberet overfladen med bomuld svaberprøver.
- Forsigtigt trække glatbarberet huden op og lave en 1,5 cm lange langsgående snit, af skalpel, i midclavicular linje starter midt på brystkassen og udvide til lige under halsen.
- Forsigtigt strække apart bindevæv med pincet under mikroskopisk observation (5 X forstørrelse) at udsætte den eksterne halsfedt.
- Sikre en tilstrækkelig plads til højre og til venstre for halsfedt at lette indføringen af 30½ G kanyle til infusion af FITC-albumin løsning.
- Indsprøjtes dyret intravenøst (lige halsfedt) langsomt (over 3 min) med 100 µL af 10 mL/kg FITC-albumin ved hjælp af 30½ G kanyle.
- Efter 15 minutter, aflive mus ved halshugning, hurtigt fjerne hjernen fra kraniet som tidligere beskrevet 13 og fordybe den i 15 min. i mindst 10 x mængden af selve hjernen af pre kølet isopentane.
- Flytte isopentane frosne hjerne ind en pre kølet røret og gemme det i et-80 ° C fryser indtil histologiske skæring.
4. Histologiske skæring af hjernen infunderes med FITC-albumin
- Embed frosne hjernen i optimal opskæring temperatur (OCT) sammensatte (Se Tabel af materialer) forud for kryostaterne skæring.
- Seriefremstillede skåret hjernen i 20 µm tykt sektioner, med en kryostaten (Se Tabel af materialer), og montere dem på glas objektglas.
- Udføre den FITC-Albumin/laminin Co farvning ved hjælp af en særlig anti-laminin antistof (se tabel af materialer) som tidligere beskrevet 6.
- Kort, inkuberes sektioner med primær antistof anti-laminin (pAb 1:1000) natten over og fortsætte med passende sekundær antistof konjugeret med Cy3.
- Coverslip glider med montering medium indeholdende 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (absorption peak = 360 nm; emission peak = 460 nm (Se Tabel of Materials).
- Forlade diaset til tørre natten over ved 4 ° C i mørke.
- Overholde fluorescens farvning under et fluorescens mikroskop (Se Tabel af materialer) på 20 X forstørrelse udstyret med begge FITC (absorption peak = 495 nm; emission peak = 525 nm) og Cy3 filtre (absorption peak = 550 nm; emission Peak = 570 nm).
- For at se prøverne straks efter farvning, sikre coverslip i hjørnerne ved hjælp af neglelak og undersøge dem under mikroskop som ovenfor (4.3.3).
5. Indstilling af fluorescens mikroskop og erhvervelse af farvebilleder
- oprettet fluorescens mikroskop som følger.
- Tænd fluorescens lampe ca 10 minutter før brug. Tænde mikroskopet, den tilsluttede computer og det digitale kamera. Køre billede analyse software (Se Tabel of Materials).
- Bruge det passende mål for optimale signal samling og rumlige opløsning, og vælg passende filtre.
- Erhvervelse af farvebilleder
- Vælg kommandoen [live] på billede analyse software (Se Tabel af materialer) og angive de optimale belysning parametre for hvert filter.
- Vælg kommandoen [fryse] at tage én kanal farvebillede og tilføje skalalinjen (' Edit > brænde skala ')
- Gemme hvert billede i den ' .tiff ' format.
- Flette kanaler til et enkelt billede ved at vælge ' fil > Flet kanal ' og gemme den i den
- tiff ' format.
- Erhverve mindst fire 24 bit farve billeder (2200 µm x 3400 µm) pr. hjerne Skive (6 dele pr. slide).
6. Vurdering af FITC-albumin ekstravasation
- analysere fluorescens-intensiteten for hver enkelt kanal ved hjælp af den frit tilgængelige ImageJ 14 , 15.
- Normalisere samlede fluorescerende signal intensiteten af FITC-albumin af den samlede CY3-Laminin fluorescerende intensitet pr. hvert billede og rapportere den røde albumin uden for fartøjerne som grøn fluorescens intensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ordentlig infusion af FITC-albumin i halsfedt resultater i ekstravasation af grønne fluorescens tracer fra blodbanen til hjernen parenchymawhen BBB er kompromitteret6. Fysiologiske betingelser, distribution af infunderet fluorescerende albumin er begrænset til indersiden af hjernen blodkar og intet signal i den omkringliggende perivascular område og/eller hjernen parenkym er påviselige (figur 1A, micrographs på den Top). Omvendt, når BBB er kompromitteret neuro-patologiske betingelser, FITC-albumin viser en diffus fluorescens mønster langs perivascular rum og i hjernen parenkym (figur 1A, micrographs på bunden). Co farvning med den vaskulære markør, der laminin, bruges til at klart lokalisere site af FITC-albumin ophobning (figur 1A). Øget grøn fluorescens intensitet udsendes af FITC-albumin i kompromitteret BBB blev vurderet ved hjælp af en billedbehandling software (Se Tabel af materialer) og rapporteret som grøn fluorescens intensitet (N = 3; 0.3112 vs 0.5765; ***, p = 0,0004, Parrede T-test) (figur 1B). FITC-albumin intensitet var normaliseret som nævnt ovenfor.
Figur 1: FITC-Albumin ekstravasation som markør for BBB skader. (A) repræsentative fluorescens micrographs af hjernen snit frosset organmateriale viser differentieret fordeling af grøn fluorescerende albumin under både fysiologiske (øverst) og patologiske forhold (nederst). Rød farvning repræsenterer vaskulære markør laminin. Eksponering gange: DAPI 20 ms, FITC 500 ms, Tx rød 60 ms. skala bar = 100 µm (Flet monografi). (B) denne graf viser en kvantificering af de grønne fluorescens udledes af FITC-albumin, som er rapporteret som grøn fluorescens intensitet (Se trin 6.2), i både fysiologiske (sund BBB) og patologiske forhold (kompromitteret BBB). N = 3. Data repræsenteres som betyder ± SD, *** p = 0,0004 (uparret T-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den teknik vi beskrive her er primært nyttig til påvisning af BBB lækage under hjernen sygdomstilstande. BBB dysfunktion er ved at vinde opmærksomhed som en fælles funktion af forskellige neurologiske sygdomme4. Vi har tidligere brugt denne metode til at beskrive den tidlige derangement af BBB integritet i en musemodel af en sjælden neurodegenerativ sygdom som HD6.
Denne metode tager fordel af den relative enkelhed og effektivitet af den procedure, som giver præcise og pålidelige resultater. Det repræsenterer en meget følsomme prækliniske forskningsværktøj og er nyttigt for hastighed og umiddelbarhed, der tilbydes i kvalitativt vurdere BBB afbrydelse af simple visualisering af grønne fluorescens i sektioneret hjernevæv. Men når det kombineres med biokemisk og molekylær analyse, teknikken har succes med at give kvantitative oplysninger om de strukturelle og funktionelle integritet af vaskulære endotel TJs og tillader analyse af korrelationen mellem BBB forstyrrelser med hjernen homøostase.
Selv om det ikke kan give nogen oplysninger om BBB ultrastruktur, kan protokollen beskrevet her resultere i mindre dyrt og tid-krævende procedurer i forhold til andre metoder såsom høj opløsning elektronmikroskopi16, 17. Desuden, på grund af dens nemme anvendelse og reproducerbarhed, proceduren kan være nyttig til overvågning progressive læsioner af hjernen Vaskulaturen der karakteriserer neurodegenerative lidelse prækliniske modeller.
En stor styrke vurderingen af BBB afbrydelse af et fluorescens-baseret tilgang ligger i potentiale til at undersøge rollen af subtile ændringer i BBB funktion til fælles og sjældne neurologiske lidelser og til sidst til direkte test i realtid effekten af BBB-påvirke narkotika eller endogene molekyler når den anvendes fra blodet eller hjernen rum. Selv om proceduren ikke kan endnu oversættes til mennesker, har det potentiale til at give indikationer for udviklingen af nye hjernen røbestoffer skal anvendes i klinisk praksis i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af "Fondazione Neuromed" og finansieret af det italienske sundhedsministerium "Ricerca Corrente" til V.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
References
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
Tags
Neurovidenskab sag 129 blod - hjerne barrieren (BBB) BBB permeabilitet FITC-albumin neurodegeneration intravenøs injektion musen modelErratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
