ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
In deze studie presenteren wij een gemakkelijke en efficiënte procedure voor de beoordeling van de verstoring van de bloed - hersenbarrière neurodegeneratieve omstandigheden. Onze om doel te bereiken, we geïnfundeerd ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne isothiocyanaat geëtiketteerd (FITC)-albumine in muis jugular ader en de lekkage in de hersenen parenchym door fluorescentie microscopie geëvalueerd.
Abstract
Verstoring van de bloed - hersenbarrière (BBB) integriteit is een gemeenschappelijk kenmerk voor verschillende neurologische en neurodegeneratieve aandoeningen. Hoewel het samenspel tussen verontrust BBB homeostase en de pathogenese van hersenafwijkingen verder onderzoek moet, kunnen de ontwikkeling en validatie van een betrouwbare procedure nauwkeurig detecteren BBB wijzigingen doorslaggevend zijn en vertegenwoordigen een nuttig instrument voor het voorspellen van potentieel ziekte gerichte progressie en de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
Hier presenteren we een gemakkelijke en efficiënte procedure voor het beoordelen van BBB lekkage in een neurodegeneratieve aandoening zoals die voorkomen in een preklinische muismodel van de ziekte van Huntington, waarin gebreken in de doorlaatbaarheid van BBB zijn duidelijk waarneembaar precociously in de ziekte. In het bijzonder de ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne isothiocyanaat geëtiketteerd (FITC)-albumine, die in staat is om over te steken de BBB alleen wanneer deze bijzondere waardevermindering heeft ondergaan, is acuut geïnfundeerd in de halsslagader van een muis en de distributie in de districten vasculaire of parenchymal vervolgens wordt bepaald door fluorescentie microscopie.
Accumulatie van groen fluorescent-albumine in de hersenen parenchym fungeert als een index van afwijkende BBB permeabiliteit en, wanneer de quantitated met behulp van J beeld processing software, wordt gerapporteerd als groene fluorescentie intensiteit.
Introduction
Homeostase binnen het centrale zenuwstelsel (CNS) is een voorwaarde voor de goede communicatie en de functie van de neuronale cellen. De CNS parenchym is strak afgesloten vanuit de periferie door het endotheel bloed - hersenbarrière (BBB), die vertegenwoordigt de interface tussen de perifere bloedbaan en de hersenen en speelt een centrale rol in de cross-talk tussen deze twee wijken1 ,2. De BBB is een complex en dynamisch driedimensionale structuur hoofdzakelijk samengesteld uit gespecialiseerde micro-schip endotheliale cellen (ECs) aan elkaar gekoppeld via intercellulaire regulates complexen - strakke kruispunten (TJs) - en omringd door pericytes, neuron uitgangen en Astrocyt voet processen1,2.
Onder fysiologische omstandigheden, de extreem lage permeabiliteit van de intact BBB zorgt voor de strikte regelgeving voor het vervoer van voedingsstoffen en andere moleculen in en uit de hersenen en de CNS biedt een unieke bescherming tegen veranderingen in de samenstelling van het bloed dat van invloed kan zijn op neurale activiteit en tegen potentiële perifere beledigingen1,2,3.
Verstoring van BBB integriteit en de verbeterde permeabiliteit heeft al lang bekend bij een sleutelelement vormen voor veel neurologische en neurodegeneratieve stoornissen4 met inbegrip van de ziekte van Huntington (HD)5,6, echter , een propagative gebeurtenis in de loop van de ziekte is nog steeds onduidelijk of deze een dysfunctie is een oorzakelijke fenomeen. De timing van BBB verdeling ook blijft ongrijpbaar, opkomende bewijs van onze fractie e.a. blijkt evenwel dat verstoord BBB integriteit niet leidt tot een late evenement in de progressie van de ziekte, maar eerder een begin stap6,7 , 8, die op lange termijn gevolgen kan hebben.
Met dit in gedachten is het belangrijk te onthullen precociously BBB verdeling in neurodegeneratie teneinde strategieën handig te voorspellen van de progressie van de ziekte en schade aan de hersenen en aan het ontwikkelen van alternatieve en meer gerichte interventies kunnen met succes beperking van de klinische gevolgen van een dergelijke verstoring. Betrouwbare beeldvorming van BBB bijzondere waardevermindering is daarom van groot belang in zowel experimenteel onderzoek en klinische behandeling van hersenziekten.
In deze paper beschrijven we een succesvolle en eenvoudige procedure voor de evaluatie van de permeabiliteit van de BBB in een muismodel HD met behulp van de ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne isothiocyanaat geëtiketteerd-albumine (FITC-albumine). Extravasation van FITC-albumine, die normaal gesproken niet de barrière, in de hersenen parenchym kruisen werd gemeten als een index van BBB lekkage. Deze techniek is gemakkelijk aanpasbaar aan ratten en andere pathologische condities gekenmerkt door cerebrovasculature bijzondere waardevermindering9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle procedures op dieren werden goedgekeurd door de IRCCS Neuromed Animal Care Review Board en " Istituto Superiore di Sanità " (nummer toestaan: 1163/2015-PR) en werden overeenkomstig de richtsnoeren van de EU richtlijn 2010 / 63/EU voor dierproeven.
1. bereiding van FITC-albumine-oplossing voor injectie in de halsslagader
Opmerking: alle experimenten werden uitgevoerd in manifest (11 - week oud) HD R6/2-muizen en in leeftijd en geslacht-matched wild-type (WT) controle nestgenoten.
- Los FITC-albumine poeder (Zie Tabel van materialen) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 10 mg/ml.
Opmerking: Voor een optimaal resultaat dit moet voorbereid zijn zoet elke etikettering reactie.
2. Voorbereiding van apparatuur om te worden gebruikt tijdens operatie
- Lay-out de eerder gesteriliseerde met autoclaaf chirurgische instrumenten (Zie Tabel of Materials).
- Schoon de chirurgische bankje met alcohol (70% ethanol oplossing). Voorbereiden van het chirurgische gebied (45 x 45 cm) met een chirurgische steriele wegwerp handdoek draperen en het opzetten van de operationele stereomicroscoop.
3. Chirurgische ingreep voor de FITC-albumine infusie in de halsslagader
- opnemen muis lichaamsgewicht voor anesthesie.
- Verdoving muis met een intraperitoneale injectie (i.p) een passende dosis van Ketamine (100 mg/kg) - xylazine (10 mg/kg) oplossing.
- Monitor dierlijke sedatie door zachte teen snuifje terugtrekken reflex zoals aangetoond in Walantus et al. 11 , 12.
- plaats van de narcose muis in een liggende positie van de gezicht-omhooggaande en herstellen van de vier poten en de staart op de chirurgische werkbank met plakband.
- Nadat de muis is beveiligd, zorgvuldig scheren de juiste chirurgische marge op de hals met een elektrisch scheerapparaat (Zie Tabel van materialen) en het desinfecteren met Povidon-jodium oplossing en 70% ethanol.
- Droog het blootgestelde geschoren oppervlak met katoenen wissers.
- Voorzichtig optrekken het geschoren huid en maken een 1,5 cm lange longitudinale insnijding door scalpel, in de midclavicular lijn vanaf midden op de thorax en uit te breiden tot net onder de hals.
- Zorgvuldig apart bindweefsel te rekken met een tang onder microscopische observatie (5 X vergroting) om de externe halsslagader bloot.
- Zorgen voor een voldoende ruimte aan de rechterkant en aan de linkerkant van de halsslagader ter vergemakkelijking van het inbrengen van de naald van de 30½ G voor de infusie van de FITC-albumine oplossing.
- Het dier intraveneus injecteren (rechts halsslagader) langzaam (meer dan 3 min) met 100 µL van 10 mL/kg FITC-albumine met behulp van de 30½ G naald.
- Na 15 minuten de muis door onthoofding euthanaseren, snel verwijderen van de hersenen van de schedel als eerder beschreven 13 en dompel het gedurende 15 min. in minstens 10 x het volume van de hersenen zelf van vooraf gekoeld tolueen.
- De tolueen bevroren hersenen in een vooraf gekoeld buis verplaatsen en op te slaan in een vriezer-80 ° C tot histologische segmenteren.
4. Histologische afdelen van hersenen doordrenkt met FITC-albumine
- Embed bevroren hersenen in optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde (Zie Tabel van materialen) voorafgaand aan de cryostaat segmenteren.
- Serieel snijd de hersenen in 20 µm dik secties, met een cryostaat (Zie Tabel of Materials), en mount ze in Microscoop glas dia's.
- Voeren de FITC-albumine/laminin-kleuring voor de mede met behulp van een specifieke anti-laminin antistof (zie tabel van materialen) zoals eerder beschreven 6.
- Kort, incubeer secties met het primaire antilichaam anti-laminin (pAb 1:1000) afgelopen nacht en ga verder met passende secundair antilichaam geconjugeerd met Cy3.
- Dekglaasje aan dia's met montage medium dat 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (absorptie piek = 360 nm, uitstoot piek = 460 nm (Zie Tabel of Materials).
- Laat de dia aan droge overnachting bij 4 ° C in het donker.
- Observeren de fluorescentie kleuring onder een fluorescentie Microscoop (Zie Tabel van materialen) bij 20 X vergroting uitgerust met beide FITC (absorptie piek = 495 nm, uitstoot piek = 525 nm) en Cy3 filters (absorptie piek = 550 nm, emissie piek = 570 nm).
- Om de monsters te bekijken onmiddellijk na de kleuring, secure het dekglaasje aan op de hoeken gebruikmakend van nagellak en onderzoeken ze onder de Microscoop als hierboven (4.3.3).
5. Instelling van de fluorescentie Microscoop en verwerving van kleurenafbeeldingen
- de fluorescentie Microscoop als volgt instellen.
- Inschakelen de fluorescentie lamp ongeveer 10 minuten vóór gebruik. Inschakelen van de Microscoop, de aangesloten computer en de digitale camera. Uitvoeren van de software van de analyse van de afbeelding (Zie Tabel of Materials).
- Gebruik van de juiste doelstelling voor optimale signaal collectie en ruimtelijke resolutie, en selecteren van geschikte filters.
- Aanschaf voor kleurenbeelden
- de [live] opdracht in de software van de analyse van het beeld selecteren (Zie Tabel van materialen) en stel de parameters van de optimale verlichting voor elk filter.
- Selecteer de [freeze] opdracht om het kleurenbeeld enkellijns en toevoegen van de schaal-bar (' bewerken > branden schaal ')
- Slaat u elke afbeelding in de ' .tiff ' formaat.
- Kanalen samenvoegen in een enkele afbeelding door te selecteren ' bestand > samenvoegen kanaal ' en sla het in de
- tiff ' formaat.
- Verwerven een minimum van vier vierentwintig bitskleuren pictures (2200 µm x 3400 µm) per segment van de hersenen (6 afdelingen per dia).
6. Beoordeling van FITC-albumine Extravasation
- analyseren van de intensiteit van de fluorescentie voor elk één kanaal met behulp van de vrij beschikbare ImageJ 14 , 15.
- De totale fluorescent signaal intensiteit van de FITC-albumine door de totale CY3-Laminin fluorescerende intensiteit per elke afbeelding te normaliseren en verslag van de extravasated albumine buiten de vaartuigen als groene fluorescentie intensiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Juiste infusie van FITC-albumine in de halsslagader resultaten in de extravasation van de groene fluorescentie-tracer uit de bloedbaan in de parenchymawhen van de hersenen die de BBB is gecompromitteerd6. Onder fysiologische omstandigheden, distributie van geïnfundeerd fluorescerende albumine is beperkt tot de binnenkant van de bloedvaten van de hersenen en geen signaal in de omliggende gerelateerde gebied en/of hersenen parenchym is aantoonbaar (figuur 1A, microfoto op de boven). Omgekeerd, wanneer de BBB wordt gecompromitteerd neuro-pathologische omstandigheden, FITC-albumine toont een diffuus fluorescentie patroon langs gerelateerde ruimten en in de hersenen parenchym (figuur 1A, microfoto op de bodem). Samen met de vasculaire marker kleuring, wordt laminin, gebruikt om duidelijk lokaliseren site van FITC-albumine accumulatie (figuur 1A). Intensiteit van de grotere groene fluorescentie uitgestoten door FITC-albumine in gecompromitteerde BBB werd beoordeeld met behulp van een beeld processing software (Zie Tabel van materialen) en gerapporteerd als groene fluorescentie intensiteit (N = 3, 0.3112 vs 0.5765; ***, p = 0.0004, Ongepaarde T-test) (figuur 1B). Intensiteit van de FITC-albumine was genormaliseerd zoals hierboven gemeld.
Figuur 1: FITC-albumine extravasation als een marker van BBB schade. (A) representatieve fluorescentie microfoto van hersenen cryosecties waarin gedifferentieerde verdeling van groen fluorescent albumine onder beide fysiologische (boven) en pathologische condities (onder). Rode kleuring vertegenwoordigt de vasculaire markering laminin. Belichtingstijden: DAPI 20 ms, FITC 500 ms, Tx rood 60 ms. schaal bar = 100 µm (samenvoegen monografie). (B) deze grafiek toont de kwantificering van de groene fluorescentie uitgestoten door FITC-albumine, die wordt gerapporteerd als de intensiteit van de fluorescentie groen (zie stap 6.2), in zowel de fysiologische (gezonde BBB) als de pathologische condities (gecompromitteerde BBB). N = 3. Gegevens zijn vertegenwoordigd zoals bedoel ± SD, *** p = 0.0004 (ongepaarde T-test). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De techniek die we hier beschrijven is vooral handig voor het opsporen van BBB lekkage onder ziekten van de hersenen. BBB disfunctie is het verkrijgen van aandacht als een gemeenschappelijk kenmerk van diverse neurologische aandoeningen,4. Wij vroeger deze aanpak voor het beschrijven van de vervroegde derangement van BBB integriteit in een muismodel van een zeldzame neurodegeneratieve ziekte zoals HD6.
Deze methode neemt voordeel van de relatieve eenvoud en doeltreffendheid van de procedure, waarmee nauwkeurige en betrouwbare resultaten. Het vertegenwoordigt een zeer gevoelige, preklinische onderzoekhulpmiddel en is nuttig voor de snelheid en het biedt kwalitatief beoordeling van BBB verstoring door eenvoudige visualisatie van groene fluorescentie binnen verdeelde hersenweefsel directheid. Echter, wanneer gecombineerd met biochemische en moleculaire analyse, de techniek is succesvol in het verstrekken van kwantitatieve informatie over de structurele en functionele integriteit van vasculaire endothelial TJs en analyse van de correlatie van BBB vergunningen verstoring met hersenen homeostase.
Hoewel het niet het verstrekken van inlichtingen over de BBB ultrastructuur, kan het protocol beschreven hier resulteren in minder duur en tijd-veeleisende procedures in vergelijking met andere methoden zoals hoge resolutie elektronenmicroscopie16, 17. Bovendien, vanwege de gemakkelijke toepassing en reproduceerbaarheid, de procedure kunnen nuttig zijn voor het toezicht op de progressieve letsels van hersenen therapieën die preklinische modellen van neurodegeneratieve stoornis karakteriseren.
Een grote kracht van de beoordeling van de verstoring van de BBB door een fluorescentie gebaseerde benadering ligt in de mogelijkheden te onderzoeken van de rol van subtiele veranderingen in functie van de BBB gemeen en zeldzame neurologische stoornissen, en uiteindelijk tot direct testen in real time het effect van BBB-beïnvloeden drugs of endogene moleculen wanneer toegepast van het bloed of hersenen compartiment. Hoewel de procedure niet kan nog worden vertaald voor de mens, heeft het de potentie om aanwijzingen voor de ontwikkeling van nieuwe hersenen verklikstoffen worden gebruikt in de klinische praktijk in de toekomst geven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om bekend te maken
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door "Fondazione Neuromed" en gefinancierd door het Italiaanse ministerie van gezondheid "Ricerca Corrente" aan V.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
References
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
Tags
Neurowetenschappen kwestie 129 bloed - hersenbarrière (BBB) BBB permeabiliteit FITC-albumine neurodegeneratie intraveneuze injectie muismodelErratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
