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Summary
In dieser Studie stellen wir eine einfache und effiziente Verfahren zur Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke unter neurodegenerativen Erkrankungen. Um unser Ziel zu erreichen, wir infundiert hochmolekularen Fluorescein Herstellung gekennzeichnet (FITC)-Albumin in Maus Jugular Ader und die Leckage in der Anwesenheit von Fluoreszenz-Mikroskopie bewertet.
Abstract
Störung der Blut - Hirn-Schranke (BBB) Integrität ist ein gemeinsames Merkmal für verschiedene neurologische und Neurodegenerative Erkrankungen. Obwohl das Zusammenspiel gestört, BBB-Homöostase und die Pathogenese der Erkrankungen des Gehirns weiteren Untersuchungen benötigt, können die Entwicklung und Validierung eines zuverlässigen Verfahrens zum BBB Veränderungen genau zu erfassen entscheidend sein und ein nützliches Werkzeug für die potenziell Vorhersage Krankheit gezielt Fortschritt und Entwicklung von Therapiestrategien.
Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und effiziente Verfahren zur Bewertung BBB Leckage in einer neurodegenerativen Zustand wie das Auftreten in einem präklinischen Mausmodell der Huntington-Krankheit, in denen Mängel in der Durchlässigkeit der BBB altklug im eindeutig nachweisbar sind die Krankheit. Insbesondere die hochmolekularen Fluorescein Herstellung gekennzeichnet (FITC)-Albumin, das ist in der Lage, die BBB überqueren Sie nur, wenn letztere beeinträchtigt wird, ist akut in eine Maus Halsschlagader und deren Verteilung in den Bezirken Gefäß- oder parenchymatösen infundiert richtet sich dann nach Fluoreszenz-Mikroskopie.
Ansammlung von Grün fluoreszierend-Albumin in der Anwesenheit von fungiert als einen Index von aberranten BBB Permeabilität und beim quantitated mit Bild J-Processing-Software, wird berichtet, wie grüne Fluoreszenzintensität.
Introduction
Homöostase innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS) ist eine Voraussetzung für die richtige Kommunikation und Funktion der neuronalen Zellen. Das CNS-Parenchym ist fest von der Peripherie durch die endotheliale Blut - Hirn-Schranke (BBB), abgedichtet, stellt die Schnittstelle zwischen den peripheren Blutkreislauf und dem Gehirn dar und spielt eine Schlüsselrolle in der Übersprechen zwischen diese beiden Bezirke1 ,2. Die BBB ist eine komplexe und dynamischer dreidimensionale Struktur hauptsächlich bestehend aus spezialisierten Mikro-Schiff Endothelzellen (ECs) durch interzelluläre Knoten komplexe - tight Junctions (TJs) - miteinander verknüpft und umgeben von Perizyten, Neuron Endungen und Astrozyten Fuß Prozesse1,2.
Unter physiologischen Bedingungen die extrem geringe Durchlässigkeit der intakten BBB sorgt für die strenge Regelung des Transports von Nährstoffen und anderen Molekülen in und aus dem Gehirn und ZNS bietet einen einzigartigen Schutz vor Veränderungen in der Zusammensetzung des Blutes, die neuronalen Aktivität beeinflussen könnten und gegen Potenzial peripheren Beleidigungen1,2,3.
Störung des BBB Integrität und seine verbesserte Durchlässigkeit ist seit langem bekannt, bilden ein wesentliches Merkmal für viele neurologische und Neurodegenerative Erkrankungen4 einschließlich der Huntington-Krankheit (HD)5,6, jedoch , ob solch eine Funktionsstörung eine ursächliche Phänomen ist oder ein vermehrenden Ereignis im Verlauf der Erkrankung noch unklar ist. Das Timing der BBB Aufteilung bleibt auch schwer, zeigt jedoch Anzeichen von unserer Fraktion und anderen gestörten BBB Integrität dar kein Ende Ereignis in der Progression der Erkrankung, sondern eher ein erster Schritt6,7 , 8, die langfristige Auswirkungen haben kann.
Mit diesem Hintergrund ist es wichtig, altklug BBB Zusammenbruch der Neurodegeneration zu offenbaren, um Strategien nützlich, Krankheitsverlauf und Hirnschäden vorherzusagen und alternative und gezieltere Interventionen in der Lage, erfolgreich zu entwickeln Abschwächung der klinischen Folgen solch einer Unterbrechung. Zuverlässige Darstellung der BBB Beeinträchtigung ist daher von großer Bedeutung in der experimentellen Forschung und klinische Behandlung von Erkrankungen des Gehirns.
In diesem Beitrag beschreiben wir ein erfolgreiches und einfaches Verfahren für die Bewertung der BBB Permeabilität in einem HD-Maus-Modell mithilfe der hochmolekularen Fluorescein Herstellung gekennzeichnet-Albumin (FITC-Albumin). Extravasation von FITC-Albumin, die normalerweise die Schranke in das Gehirn Parenchym überqueren kann nicht gemessen wurde als Index der BBB Leckage. Diese Technik ist leicht anpassbar an Ratten und anderen pathologischen Zuständen zeichnet sich durch Cerebrovasculature Beeinträchtigung9,10.
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Protocol
alle Vorgänge an Tieren wurden genehmigt durch das IRCCS Neuromed Animal Care Review Board und " Istituto Superiore di Sanità " (Anzahl zu ermöglichen: 1163/2015-PR) und wurden nach den Vorgaben der EU-Richtlinie 2010 / 63/EU für Tierversuche.
1. Vorbereitung der FITC-Albumin-Lösung in Halsschlagader injiziert werden
Hinweis: alle Experimente wurden durchgeführt in manifest (11 - Wochen alten) HD R6/2-Mäuse und in Alter und Geschlecht abgestimmt Wildtyp (WT) Kontrolle Wurfgeschwistern.
- Auflösen FITC-Albumin Pulver (siehe Tabelle der Materialien) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 10 mg/ml.
Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, dies sollten werden frisch zubereitet für jede Kennzeichnung Reaktion.
2. Vorbereitung der Ausrüstung werden verwendet während der Operation
- legen Sie die zuvor autoklaviert chirurgische Instrumente (siehe Tabelle der Werkstoffe).
- Reinigen die chirurgischen Bank mit Alkohol (70 % Ethanol-Lösung). Vorbereitung der OP-Bereich (45 x 45 cm) mit einem chirurgischen sterile Einweg-Handtuch drapieren und richten Sie die operativen Stereomikroskop.
3. Chirurgische Verfahren für FITC-Albumin-Infusion in die Halsschlagader
- Maus Körpergewicht für Anästhesie aufnehmen.
- Anesthetize Maus mit einer intraperitonealen Injektion (IP) einer angemessenen Dosis von Ketamin (100 mg/kg) - Lösung (10 mg/kg) Xylazin.
- Monitor Tier Sedierung durch sanfte Zehe Prise zurückziehen Reflex, wie in Walantus Et al. 11 , 12.
- der narkotisierten Maus in Rückenlage aufgedeckt und die vier Beine und die Rute auf die chirurgische Werkbank mit Klebeband fixieren.
- Nach die Maus gesichert ist, sorgfältig die entsprechenden chirurgischen Marge am Hals mit einem elektrischen Rasierapparat Rasieren (siehe Tabelle der Materialien) und mit Povidon-Jod-Lösung und 70 % Ethanol desinfizieren.
- Die exponierte rasierte Oberfläche mit Wattestäbchen trocknen.
- Sanft die rasierte Haut hochziehen und machen einen 1,5 cm lange längs-Schnitt, mit Skalpell, in der Midclavicular Linie, beginnend in der Mitte auf dem Brustkorb und Erweiterung auf knapp unterhalb des Halses.
- Sorgfältig dehnen auseinander Bindegewebe mit der Pinzette unter mikroskopischer Beobachtung (5 X Vergrößerung), die äußere Halsschlagader aussetzen.
- Gewährleisten eine ausreichend Platz auf der rechten Seite und links von der Halsschlagader, die Einfügung der 30½ G Nadel für die Infusion der FITC-Albumin-Lösung zu erleichtern.
- Das Tier intravenös zu injizieren (Rechte Halsschlagader) langsam (über 3 min) mit 100 µL 10 mL/kg FITC-Albumin mit 30½ G Nadel.
- Nach 15 Minuten einschläfern die Maus durch Enthauptung, schnell entfernen das Gehirn aus dem Schädel als zuvor beschriebenen 13 und Tauchen Sie ihn für 15 min in mindestens 10 x das Volumen des Gehirns selbst vorgekühlt Isopentane.
- Bewegen der Isopentane Gehirn in ein vorgekühlt Rohr eingefroren und bis zur histologischen Schnitt in einem-80 ° C Gefrierschrank lagern.
4. Histologischen Schnitt des Gehirns infundiert mit FITC-Albumin
- Embed gefrorene Gehirn in optimale Arbeitstemperatur (OCT) zusammengesetzte (siehe Tabelle der Materialien) vor der Kryostat schneiden.
- Seriell das Gehirn in 20 µm dicke Schichten, mit einem Kryostat geschnitten (siehe Tabelle der Materialien), aus und klebe sie auf Glas-Objektträger.
- Führen die FITC-Albumin/Laminin Co-Färbung durch die Verwendung eines bestimmtes Anti-Laminin-Antikörper (siehe Tabelle der Materialien) wie oben beschrieben 6.
- Kurz, Abschnitte mit dem primären Antikörper Anti-Laminin (pAb 1: 1000) über Nacht inkubieren und fahren Sie mit entsprechenden Sekundärantikörpers konjugiert, Cy3.
- Deckglas gleitet mit Eindeckmittel mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) (Absorption Peak = 360 nm; Emission Peak = 460 nm (siehe Tabelle der Materialien).
- Die Rutsche über Nacht trocknen bei 4 ° C im Dunkeln verlassen.
- Beobachten die Fluoreszenz Färbung unter dem Fluoreszenzmikroskop (siehe Tabelle der Materialien) mit 20 X Vergrößerung mit beiden FITC ausgestattet (Absorption Peak = 495 nm; Emission Peak = 525 nm) und Cy3 Filter (Absorption Peak = 550 nm, Emission Peak = 570 nm).
- Um die Proben sofort nach der Färbung zu sehen, das Deckglas an den Ecken mit Nagellack zu sichern und prüfen sie unter dem Mikroskop wie oben (4.3.3).
5. Fluoreszenz-Mikroskop Einstellung und Übernahme von Farbbildern
- dem Fluoreszenzmikroskop wie folgt einrichten.
- Schalten die Fluoreszenz Lampe ca. 10 Minuten vor dem Gebrauch. Schalten Sie das Mikroskop, den angeschlossenen Computer und Digitalkamera. Die Bildanalyse-Software ausführen (siehe Tabelle der Werkstoffe).
- Das geeignete Ziel für optimales Signal Sammlung und räumlicher Auflösung, und wählen Sie geeignete Filter.
- Erwerb von Farbbildern
- Wählen Sie den Befehl auf die Bildanalyse-Software [live] (siehe Tabelle der Materialien) und die optimale Ausleuchtung-Parameter für jeden Filter einrichten.
- Wählen Sie den Befehl [Freeze] das Einkanal-Farbbild und die Maßstabsleiste hinzufügen (' bearbeiten > brennen Skala ')
- Speichern Sie jedes Bild in der ' .tiff ' Format.
- Kanäle zu einem einzigen Bild zu verschmelzen, durch die Auswahl ' Datei > Merge Kanal ' und speichern Sie es in der
- Tiff ' Format.
- Erwerben mindestens vier 24-Bit-Farbe Bilder (2200 µm X 3400 µm) pro Gehirn-Scheibe (6 Sektionen pro Folie).
6. Bewertung der FITC-Albumin Extravasation
- analysieren die Fluoreszenzintensität für jeden einzelnen Kanal mithilfe der frei verfügbare ImageJ 14 , 15.
- Normalisieren die totale Fluoreszenzsignal Intensität der FITC-Albumin durch die totale CY3 Laminin Fluoreszenz Intensität pro jedes Bild und berichten die extravasierten Albumin außerhalb der Gefäße als grün Fluoreszenzintensität.
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Representative Results
Korrekte Infusion von FITC-Albumin in die Halsschlagader-Ergebnisse in der Extravasation der grünen Fluoreszenz Tracer aus dem Blutkreislauf in das Gehirn-Parenchymawhen ist die BBB gefährdet6. Unter physiologischen Bedingungen, Verteilung der infundierten fluoreszierende Albumin beschränkt sich auf das Innere der Blutgefäße des Gehirns und kein Signal in die umliegenden perivaskuläre Bereich und/oder Gehirn Parenchym ist nachweisbar (Abb. 1A, Mikrographen auf der (oben). Umgekehrt, wenn die BBB unter Neuro-pathologischen Umständen gefährdet ist, zeigt FITC-Albumin eine diffuses Fluoreszenz-Muster entlang perivaskuläre Räume und in das Gehirn Parenchym (Abbildung 1A, Mikrographen auf der Unterseite). Gemeinsam mit dem vaskuläre Marker Färbung, wird Laminin, verwendet, um die Website der FITC-Albumin Akkumulation (Abbildung 1A) eindeutig zu lokalisieren. Erhöhten grünen Fluoreszenzintensität abgegebene FITC-Albumin in gefährdeten BBB wurde mithilfe einer Bildbearbeitungssoftware bewertet (siehe Tabelle der Materialien) und als grüne Fluoreszenzintensität gemeldet (N = 3; 0.3112 Vs 0.5765; ***, p = 0,0004, Ungepaarten T-Test) (Abbildung 1 b). FITC-Albumin Intensität normalisiert wurde, wie oben berichtet.
Abbildung 1: FITC-Albumin Extravasation als Marker der BBB-Schäden. (A) repräsentative Fluoreszenz Mikrographen des Gehirns Cryosections zeigt differenzierte Verteilung der grüne fluoreszierende Albumin unter beiden physiologischen (oben) und pathologischen Bedingungen (unten). Rote Färbung stellt die vaskuläre Marker Laminin. Belichtungszeiten: DAPI 20 ms, FITC 500 ms, Tx Rot 60 Ms. Skala bar = 100 µm (Merge Monographie). (B) dieses Diagramm zeigt die Quantifizierung der grünen Fluoreszenz emittierten FITC-Albumin, der als der grüne Fluoreszenzintensität ausgewiesen wird (siehe Punkt 6.2), physiologische (gesunde BBB) und pathologischen Zuständen (kompromittierten BBB). N = 3. Daten werden dargestellt als ± SD bedeuten *** p = 0.0004 (ungepaarten T-Test). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das Verfahren, die, das wir hier beschreiben, eignet sich in erster Linie zur Erkennung von BBB Leckage unter Erkrankungen des Gehirns. BBB-Dysfunktion gewinnt Aufmerksamkeit als ein gemeinsames Merkmal der vielfältigen neurologische Störungen4. Wir früher diesen Ansatz um die frühe Störung der BBB Integrität in einem Mausmodell der eine seltene Neurodegenerative Erkrankung wie HD6beschreiben.
Diese Methode nutzt die relative Einfachheit und Wirksamkeit des Verfahrens, die genaue und zuverlässige Ergebnisse liefert. Es repräsentiert ein hochsensibler präklinischen Forschungswerkzeug und eignet sich für die Geschwindigkeit und die Unmittelbarkeit, die er anbietet, bei der Beurteilung qualitativ BBB Störung durch einfache Visualisierung der grünen Fluoreszenz im geschnittenen Hirngewebe. In Kombination mit biochemischen und molekularbiologischen Analyse die Technik ist jedoch erfolgreich in der quantitative Informationen über die strukturelle und funktionelle Integrität der vaskulären endothelialen TJs und erlaubt die Analyse der Korrelation von BBB Störung mit Gehirn-Homöostase.
Obwohl es keine Informationen über die BBB Ultrastruktur bereitstellen kann, kann das hier beschriebene Protokoll weniger teuer und Zeit anspruchsvolle Verfahren im Vergleich zu anderen Methoden wie hochauflösende Elektronenmikroskopie16, führen 17. Darüber hinaus durch seine einfache Anwendung und Reproduzierbarkeit des Verfahrens kann nützlich sein, für die Überwachung der progressive Läsionen des Gehirns Gefäßsystem die Neurodegenerative Erkrankung präklinischen Modellen zu charakterisieren.
Eine große Stärke der Bewertung BBB Störung durch ein Fluoreszenz-basierter Ansatz liegt das Potenzial, die Rolle der subtile Veränderungen in der BBB-Funktion gemeinsam zu untersuchen und die seltene neurologische Erkrankungen und schließlich direkt in Echtzeit zu testen die Wirkung von BBB-beeinflussen Drogen oder endogene Moleküle aus dem Blut oder Gehirn Fach angewendet. Obwohl das Verfahren noch auf den Menschen übersetzt werden kann, hat es das Potenzial, Hinweise für die Entwicklung von neuen Gehirn Tracer in der klinischen Praxis in der Zukunft verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von "Fondazione Neuromed" unterstützt und gefördert durch das italienische Gesundheitsministerium "Ricerca Corrente", Valašské
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
References
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
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Ausgabe 129 Blut - Hirn-Schranke (BBB) Neurowissenschaften BBB Permeabilität FITC-Albumin Neurodegeneration intravenöse Injektion Maus-ModellErratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
