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Summary
इस अध्ययन में, हम neurodegenerative स्थितियों के तहत रक्त मस्तिष्क बाधा के विघटन के मूल्यांकन के लिए एक आसान और कुशल प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । हमारे उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए, हम उच्च आणविक वजन fluorescein isothiocyanate बला (FITC) संचार-माउस jugular नस में एल्ब्युमिन और पैरेन्काइमा माइक्रोस्कोपी द्वारा मस्तिष्क प्रतिदीप्ति में अपने रिसाव का मूल्यांकन किया ।
Abstract
रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) अखंडता के विघटन अलग स्नायविक और neurodegenerative रोगों के लिए एक आम सुविधा है । हालांकि परेशान BBB homeostasis और मस्तिष्क विकारों के रोगजनन के बीच पुनरावृत्ति आगे की जांच की जरूरत है, विकास और एक विश्वसनीय प्रक्रिया के सत्यापन के लिए सही BBB परिवर्तन का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है और एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व संभावित रोग प्रगति की भविष्यवाणी और लक्षित चिकित्सकीय रणनीतियों के विकास के लिए ।
यहाँ, हम एक neurodegenerative हालत में BBB रिसाव का मूल्यांकन करने के लिए एक आसान और कुशल प्रक्रिया वर्तमान हटिंगटन रोग के एक नैदानिक माउस मॉडल में होने वाली है, जिसमें BBB की पारगम्यता में दोषों स्पष्ट रूप से पता लगाने में precociously हैं रोग । विशेष रूप से, उच्च आणविक भार fluorescein isothiocyanate बला (FITC)-एल्ब्युमिन, जो BBB को केवल जब बाद में ख़राब कर रहा है पार करने में सक्षम है, तीव्रता से एक माउस jugular नस और संवहनी या parenchymal जिलों में इसके वितरण में संचार है तो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जाता है ।
ग्रीन फ्लोरोसेंट के संचय-मस्तिष्क पैरेन्काइमा कार्यों में एल्ब्युमिन ंयायपालिका BBB पारगम्यता के एक सूचकांक के रूप में और, जब छवि जंमू प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके quantitated, ग्रीन प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में सूचित किया है ।
Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के भीतर Homeostasis (सीएनएस) उचित संचार और न्यूरॉन कोशिकाओं के समारोह के लिए एक शर्त है. सीएनएस पैरेन्काइमा कसकर endothelial रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) है, जो परिधीय खून और मस्तिष्क के बीच इंटरफेस का प्रतिनिधित्व करता है और इन दो जिलों के बीच पार बात में एक निर्णायक भूमिका निभाता है द्वारा परिधि से बंद है1 ,2. BBB एक जटिल और गतिशील तीन आयामी संरचना मुख्य रूप से विशेष सूक्ष्म पोत endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) के माध्यम से एक दूसरे से जुड़े से बना है सेलुलर जंक्शन परिसरों तंग जंक्शनों (TJs)-और pericytes से घिरा हुआ, ंयूरॉन अंत और astrocyte पैर प्रक्रियाओं1,2.
शारीरिक स्थितियों के तहत, बरकरार BBB के अत्यंत कम पारगम्यता पोषक तत्वों और अन्य अणुओं के परिवहन के सख्त विनियमन मस्तिष्क के अंदर और बाहर सुनिश्चित करता है, और में होने वाले परिवर्तनों से एक अद्वितीय संरक्षण के साथ सीएनएस प्रदान रक्त है कि तंत्रिका गतिविधि और संभावित परिधीय अपमान के खिलाफ प्रभावित हो सकता है की संरचना1,2,3।
BBB अखंडता के विघटन और इसकी बढ़ी पारगम्यता लंबे समय से कई स्नायविक और neurodegenerative विकारों के लिए एक प्रमुख विशेषता का गठन करने के लिए जाना जाता है हटिंगटन रोग सहित4 (एचडी)5,6, तथापि , क्या इस तरह के एक रोग एक प्रेरणात्मक घटना या बीमारी के दौरान एक प्रचारक घटना है अभी भी अस्पष्ट है । BBB टूटने के समय भी मायावी रहता है, तथापि, हमारे समूह और दूसरों द्वारा उभरते सबूत इंगित करता है कि बाधित BBB अखंडता रोग प्रगति में एक देर घटना का प्रतिनिधित्व नहीं करता है, बल्कि एक प्रारंभिक चरण6,7 , 8, जो दीर्घकालिक परिणाम हो सकते हैं ।
इस के साथ मन में, यह neurodegeneration में BBB टूटने प्रकट precociously महत्वपूर्ण है ताकि रोग की प्रगति और मस्तिष्क क्षति की भविष्यवाणी के लिए उपयोगी रणनीतियों को विकसित करने के लिए और वैकल्पिक और अधिक लक्षित उपायों को सफलतापूर्वक विकसित करने में सक्षम ऐसे व्यवधान के नैदानिक परिणामों को कम करना. BBB हानि की विश्वसनीय इमेजिंग है, इसलिए, दोनों प्रयोगात्मक अनुसंधान और मस्तिष्क रोगों के नैदानिक प्रबंधन में प्रमुख महत्व का है ।
इस पत्र में, हम उच्च आणविक भार fluorescein isothiocyanate बला-एल्ब्युमिन (FITC-एल्ब्युमिन) का उपयोग करके एक HD माउस मॉडल में BBB पारगम्यता के मूल्यांकन के लिए एक सफल और सरल प्रक्रिया का वर्णन. Extravasation FITC-एल्ब्युमिन, जो आम तौर पर बाधा पार नहीं कर सकते, मस्तिष्क पैरेन्काइमा में BBB रिसाव के एक सूचकांक के रूप में मापा गया था । इस तकनीक को आसानी से चूहों के लिए अनुकूलनीय है और अंय रोग की स्थिति cerebrovasculature हानि9,10द्वारा विशेषता ।
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Protocol
- भंग FITC-एल्ब्युमिन पाउडर (देखें सामग्री की तालिका ) में फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में 10 मिलीग्राम/एमएल
नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, यह प्रत्येक लेबलिंग प्रतिक्रिया के लिए नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए ।
- पहले autoclaved शल्य चिकित्सा उपकरणों बाहर रखना ( सामग्री की मेज देखें) ।
- शराब (७०% इथेनॉल समाधान) के साथ सर्जिकल बेंच साफ । शल्य क्षेत्र (४५ cm x ४५ cm) एक शल्य बाँझ डिस्पोजेबल तौलिया कपड़े के साथ तैयार करें और ऑपरेटिंग stereomicroscope.
- में FITC-एल्ब्युमिन इन्फ्यूश़न के लिए सर्जिकल प्रक्रिया संज्ञाहरण के लिए माउस के शरीर के वजन रिकॉर्ड.
- Anesthetize माउस के साथ एक intraperitoneal इंजेक्शन (i. p) की एक उपयुक्त खुराक की Ketamine (१०० मिलीग्राम/xylazine (10 मिलीग्राम/समाधान.
- Walantus एट अल. में प्रदर्शन के रूप में कोमल पैर की अंगुली पिंच वापस लेने पलटा द्वारा मॉनिटर पशु बेहोशी < सुप वर्ग = "xref" > ११ , < सुप वर्ग = "xref" > १२ .
- एक आमने-सामने anesthetized की स्थिति में लापरवाह माउस प्लेस और चार पैर और सर्जिकल कार्यक्षेत्र पर पूंछ चिपकने वाला टेप के साथ ठीक ।
- के बाद माउस को सुरक्षित है, ध्यान से एक बिजली के रेजर के साथ गर्दन पर उचित शल्य चिकित्सा मार्जिन दाढ़ी (सामग्री के तालिका देखें) और यह povidone-आयोडीन समाधान और ७०% इथेनॉल के साथ संक्रमित ।
- कपास झाड़ू के साथ उजागर मुंडा सतह सूखी ।
- धीरे मुंडा त्वचा खींच और एक १.५ सेमी लंबे अनुदैर्ध्य चीरा बनाने के लिए, स्केलपेल द्वारा, midclavicular लाइन में छाती पर बीच में शुरू और सिर्फ गर्दन के नीचे करने के लिए विस्तार.
- ध्यान से सूक्ष्म अवलोकन के तहत संदंश के साथ संयोजी ऊतक के अलावा खिंचाव (5x इज़ाफ़ा) बाहरी jugular नस बेनकाब करने के लिए.
- सही पर पर्याप्त जगह सुनिश्चित करने और jugular नस के मिलन की सुविधा के लिए बायीं ओर 30 & #189; जी सुई के अर्क के लिए FITC-एल्ब्युमिन हल.
- जानवर नसों में सुई (सही jugular नस) धीरे (3 मिनट से अधिक) के साथ १०० & #181; L के 10 मिलीलीटर/FITC-एल्ब्युमिन का उपयोग कर 30 & #189; छ सुई.
- 15 मिनट के बाद, decapitation द्वारा माउस euthanize, तेजी से खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने के रूप में पहले से वर्णित < सुप वर्ग = "xref" > 13 , और इसे में 15 मिनट के लिए विसर्जित कम-से-पूर्व ठंडा isopentane के मस्तिष्क की मात्रा ।
- एक पूर्व ठंडा ट्यूब में isopentane जमे हुए मस्तिष्क चाल और यह एक में स्टोर-८० & #176; सी फ्रीजर जब तक ऊतकीय खोदी.
- इष्टतम काटने तापमान (OCT) यौगिक में जमे हुए मस्तिष्क एंबेड ( सामग्री की तालिका देखें) cryostat से पहले खोदी.
- प्रश्नपत्र में मस्तिष्क को काटते हैं 20 & #181; मी मोटी वर्गों, एक cryostat के साथ (सामग्री की तालिका देखें), और उंहें माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर माउंट ।
- प्रदर्शन FITC-एल्ब्युमिन/laminin सह एक विशिष्ट विरोधी का उपयोग करके दाग-laminin एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका देखें) पहले वर्णित के रूप में < सुप वर्ग = "xref" > ६ .
- संक्षेप में, रात में प्राथमिक एंटीबॉडी विरोधी laminin (pAb 1:1000) के साथ वर्गों गर्मी और एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त माध्यमिक संयुग्मित Cy3 के साथ आगे बढ़ना । बढ़ते मध्यम से युक्त
- Coverslip स्लाइड 4 & #39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (अवशोषण पीक = ३६० एनएम; उत्सर्जन पीक = ४६० एनएम ( सामग्री की तालिका देखें) ।
- को रात भर सूखने के लिए छोड़ दें 4 & #176; ग अंधेरे में ।
- एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत धुंधला प्रतिदीप्ति का पालन करें ( सामग्री की तालिका देखें) 20X आवर्धन पर दोनों FITC से सुसज्जित (अवशोषण पीक = ४९५ एनएम; उत्सर्जन पीक = ५२५ एनएम) और Cy3 फ़िल्टर (अवशोषण पीक = ५५० एनएम; उत्सर्जन पीक = ५७० एनएम) ।
- नमूने के तुरंत बाद दाग देखने के लिए, नेल पॉलिश का उपयोग कर कोनों पर coverslip सुरक्षित और उंहें ऊपर के रूप में माइक्रोस्कोप के तहत जांच (4.3.3) ।
- इस प्रकार के रूप में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की स्थापना की ।
- का उपयोग करने से पहले के बारे में 10 मिनट प्रतिदीप्ति लैंप चालू करें । माइक्रोस्कोप, कनेक्टेड कंप्यूटर, और डिजिटल कैमरा चालू करें । छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर भागो (सामग्री के तालिका देखें) ।
- इष्टतम संकेत संग्रह और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के लिए उपयुक्त उद्देश्य का उपयोग करें, और उपयुक्त फ़िल्टर का चयन करें ।
- रंग छवियों का अधिग्रहण
- छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर [लाइव] आदेश का चयन करें (सामग्री की तालिका देखें) और प्रत्येक फ़िल्टर के लिए इष्टतम रोशनी मापदंडों की स्थापना की ।
- का चयन करें [फ्रीज़] आदेश एकल चैनल रंगीन छवि लेने के लिए और स्केल बार जोड़ने के लिए (& #39; Edit & #62; बर्न स्केल & #39;)
- में प्रत्येक छवि सहेजें & #39;. tiff & #39; स्वरूप.
- को एकल छवि में मर्ज करें & #39; फ़ाइल & #62; मर्ज चैनल & #39; और इसे में सहेजें
- झगड़ा & #39; स्वरुप.
- ४ २४ बिट रंग चित्रों की एक ंयूनतम प्राप्त (२२०० & #181; m x ३४०० & #181; एम) प्रति मस्तिष्क टुकड़ा (स्लाइड प्रति 6 वर्गों).
- हर एक चैनल के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग कर मुक्त रूप से उपलब्ध ImageJ का विश्लेषण < सुप class = "xref" > 14 , < सुप class = "xref" > 15 . कुल CY3-Laminin प्रत्येक छवि के प्रति फ्लोरोसेंट तीव्रता और हरी extravasated तीव्रता के रूप में जहाजों के बाहर एल्ब्युमिन प्रतिदीप्ति रिपोर्ट द्वारा FITC-एल्ब्युमिन के कुल फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता को सामान्य
- .
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Representative Results
FITC के उचित अर्क-jugular नस में एल्ब्युमिन प्रतिदीप्ति parenchymawhen में खून से हरी BBB अनुरेखक के extravasation में मस्तिष्क में परिणाम है6समझौता किया है । शारीरिक स्थितियों के तहत, संचार फ्लोरोसेंट एल्ब्युमिन के वितरण मस्तिष्क रक्त वाहिकाओं के अंदर तक ही सीमित है और आसपास के perivascular क्षेत्र में कोई संकेत नहीं है और/या मस्तिष्क पैरेन्काइमा detectable है (चित्र 1a, पर माइक्रोग्राफ शीर्ष) । इसके विपरीत, जब BBB तंत्रिका रोग परिस्थितियों के तहत समझौता किया है, FITC-एल्ब्युमिन perivascular रिक्त स्थान के साथ एक फैलाना प्रतिदीप्ति पैटर्न से पता चलता है और मस्तिष्क पैरेन्काइमा में (चित्र 1a, माइक्रोग्राफ तल पर) । संवहनी मार्कर के साथ सह-दाग, laminin, FITC-एल्ब्युमिन संचय (चित्र 1a) की साइट को स्पष्ट रूप से स्थानीयकृत करने के लिए प्रयोग किया जाता है । समझौता BBB में FITC-एल्ब्युमिन द्वारा उत्सर्जित हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि हुई ( सामग्री की तालिकादेखें)) और ग्रीन प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में रिपोर्ट (N = 3; ०.३११२ बनाम ०.५७६५; * * * *, p = ०.०००४) का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था ख़राब टी-टेस्ट) (figure 1b). FITC-एल्ब्युमिन तीव्रता के रूप में ऊपर रिपोर्ट सामान्यीकृत था ।
चित्र 1: BBB क्षति के मार्कर के रूप में FITC-एल्ब्युमिन extravasation । (ए) के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति मस्तिष्क cryosections के माइक्रोग्राफ दोनों शारीरिक (ऊपर) और रोग की स्थिति (नीचे) के तहत हरी फ्लोरोसेंट एल्ब्युमिन के अंतर वितरण दिखा रहा है । लाल दाग संवहनी मार्कर laminin का प्रतिनिधित्व करता है । एक्सपोजर टाइंस: DAPI 20 एमएस, FITC ५०० एमएस, Tx लाल ६० एमएस स्केल बार = १०० µm (मोनोग्राफ विलय) । (B) यह ग्राफ़ FITC-एल्ब्युमिन द्वारा उत्सर्जित हरे प्रतिदीप्ति के ठहराव को प्रदर्शित करता है, जो कि हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता (चरण ६.२ देखें), दोनों में शारीरिक (स्वस्थ BBB) और रोग की स्थिति (समझौता BBB) के रूप में सूचित किया जाता है । N = 3. डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, * * * p = ०.०००४ (ख़राब टी परीक्षण) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
तकनीक का वर्णन हम यहां मस्तिष्क रोग की स्थिति के तहत BBB रिसाव का पता लगाने के लिए मुख्य रूप से उपयोगी है । BBB शिथिलता विविध neurologic विकारों के एक आम सुविधा के रूप में ध्यान प्राप्त कर रहा है4. हम पहले इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया HD6की तरह एक दुर्लभ neurodegenerative रोग के एक माउस मॉडल में BBB अखंडता की प्रारंभिक सीमा का वर्णन करने के लिए ।
इस विधि रिश्तेदार सादगी और प्रक्रिया है, जो सटीक और विश्वसनीय परिणाम प्रदान करता है की प्रभावशीलता का लाभ लेता है । यह एक अति संवेदनशील नैदानिक अनुसंधान उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है और गति और तुरंत्ता के लिए उपयोगी है यह गुणात्मक रूप से खंड मस्तिष्क ऊतक के भीतर हरी प्रतिदीप्ति के सरल दृश्य द्वारा BBB व्यवधान का आकलन करने में प्रदान करता है । हालांकि, जब जैव रासायनिक और आणविक विश्लेषण के साथ संयुक्त, तकनीक संवहनी endothelial TJs और परमिट BBB के सहसंबंध के विश्लेषण के संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने में सफल रहा है मस्तिष्क homeostasis के साथ व्यवधान ।
हालांकि यह BBB ultrastructure के बारे में कोई जानकारी प्रदान नहीं कर सकते, यहां वर्णित प्रोटोकॉल कम खर्चीला और समय में परिणाम उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी16के रूप में अंय तरीकों के साथ तुलना में की मांग कर सकते हैं, 17. इसके अलावा, अपने आसान आवेदन और reproducibility के कारण, प्रक्रिया मस्तिष्क vasculature जो neurodegenerative विकार पूर्व नैदानिक मॉडल की विशेषताएं के प्रगतिशील घावों की निगरानी के लिए उपयोगी हो सकती है ।
एक प्रतिदीप्ति आधारित दृष्टिकोण द्वारा BBB व्यवधान का आकलन करने की एक बड़ी ताकत आम और दुर्लभ स्नायविक विकारों में BBB समारोह में सूक्ष्म परिवर्तन की भूमिका की जांच करने की क्षमता में निहित है और अंत में सीधे वास्तविक समय में परीक्षण करने के लिए BBB-प्रभावित दवाओं या अंतर्जात अणुओं जब रक्त या मस्तिष्क के डिब्बे से लागू किया । हालांकि प्रक्रिया अभी तक मनुष्यों के लिए अनुवाद नहीं किया जा सकता है, यह क्षमता है नए मस्तिष्क अनुरेखकों के विकास के लिए संकेत प्रदान करने के लिए भविष्य में नैदानिक अभ्यास में इस्तेमाल किया जाएगा.
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Disclosures
लेखकों के हित का कोई टकराव नहीं है खुलासा
Acknowledgments
यह काम "Fondazione नेऊरोमेद" द्वारा समर्थित किया गया था और इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित "Ricerca Corrente" V.M. करने के लिए
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
#22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
Medical patch | Medicalis | 34788 | |
Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
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तंत्रिका विज्ञान १२९ अंक रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) BBB पारगम्यता FITC-एल्ब्युमिन neurodegeneration नसों में इंजेक्शन माउस मॉडलErratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017.
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An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione