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Summary
本研究では神経変性条件下で血液-脳関門の破壊を評価するための簡単で効率的な手順を提案する.我々 の目的を達成するために我々 は高分子量かにラベル (FITC) を注入-マウス頸静脈にアルブミン静脈および蛍光顕微鏡による脳実質にその漏洩を評価します。
Abstract
血液脳関門 (BBB) 整合性の破壊は、異なる神経と神経変性疾患の一般的な機能です。開発と BBB の変化を正確に検出する信頼性の高いプロシージャの検証が重要であるし、便利なツールを表す摂動の BBB の恒常性と脳疾患の病態との間の相互作用は、さらなる調査を必要とするが潜在的疾患を予測するためターゲットを絞った治療戦略を進行と開発。
ここでは、BBB の BBB 透過性の欠陥は明らかに早熟で検出可能なハンチントン病のマウスの前臨床モデルで発生するそのような変性条件で漏れを評価するための簡単で効率的な手順を提案します。病気。具体的には、高分子量かにラベル (FITC)-アルブミン、後者は障害時にのみ、BBB を交差することがあるがマウスの頸静脈と血管や実質地区におけるその分布に鋭く融合その後、蛍光顕微鏡によって決定されます。
脳実質の緑色蛍光アルブミンの蓄積異常 BBB 透過性の指標として機能し、J の画像処理ソフトウェアを使用して量的に表わされるとき緑の蛍光強度として報告されます。
Introduction
中枢神経系 (CNS) 内の恒常性は、適切なコミュニケーションと神経細胞の機能のための前提条件です。中枢神経系柔密によって封鎖される周辺から、内皮細胞血液脳関門 (BBB)、末梢血流と脳との間のインターフェイスを表し、これらの 2 つの地区の1 間のクロストークで極めて重要な役割を果たしています。 ,2。BBB は複雑な専門マイクロ血管内皮細胞) 細胞複合体 - タイトな接合 (TJs) - によって互いにリンク、囲まれて周を主体とする立体構造物の動的ニューロン終末とアストロ サイトの足プロセス1,2。
生理学的な条件の下でそのまま BBB の非常に低透磁率により、脳の栄養素および他の分子の輸送の厳しい規制とにより中枢神経系の変化からユニークな保護、潜在的な末梢神経活動に影響を与える可能性があります血液の組成は、1,2,3を侮辱します。
BBB の整合性および高められた透磁率の中断長い神経の多くの重要な機能を構成するため知られている、神経変性障害4ただしハンティントンの病気 (HD)5,6, を含む、かどうかこのような機能不全が原因の現象や病気の過程で繁殖イベントはまだ不明です。BBB 破壊のタイミングもとらえどころのないまま、しかし、中断の BBB の整合性が、後半イベント早期のステップ6ではなく、病気の進行で,7を表さないことを示します出現の私達のグループと他の証拠,8、長期的な影響を持っている可能性があります。
これを念頭において、早熟役に立つ病気の進行と脳損傷を予測し、正常に代替しよりターゲットを絞った介入できるを開発する戦略を開発するために神経変性の BBB の内訳を明らかにすることが重要です。このような混乱の臨床結果を軽減します。したがって、BBB 減損の信頼性の高い画像は、脳疾患の診療・研究の主要な重要なのです。
本稿では高分子量フルオレセイン イソチオ シアン酸ラベル-アルブミン (FITC-アルブミン) を使用して、HD マウス モデルの BBB 透過性の評価の成功と単純な手順をについて説明します。通常、脳実質にバリアを越えることはできません FITC-アルブミンの漏出を BBB 漏れの指標として測定しました。この手法は、ラットと cerebrovasculature 障害9,10によって特徴付けられる他の病理学の条件に容易に適応可能であります。
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Protocol
動物のすべてのプロシージャは IRCCS Neuromed 動物介護審査会によって、承認された " 会館 Istituto スペリオーレ ディ Sanità " (許可番号: 1163/2015-PR) され、2010 年の EU 指令のガイドラインに従って/63/EU 動物実験
。1 頸静脈に挿入される FITC-アルブミン溶液の調製
注: すべての実験が実施をマニフェスト (週齢 11) HD R6/2 マウス、時代、性別一致の野生型 (WT) コントロール。同腹子
。- ディゾルブ FITC-アルブミン パウダー (材料表 参照) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 10 mg/ml で
。 注: 最適な結果を得るには、このため準備されるべき新鮮な各ラベルの反応 。
2。手術中に使用する機器の準備
- 以前オートクレーブの手術器具 (材料の表 を参照) をレイアウトします 。
- はクリーン アルコール (70% エタノール溶液) で手術のベンチです。手術滅菌使い捨てタオル ドレープで外科領域 (45 cm × 45 cm) を準備し、営業の実体顕微鏡を設定します 。
3。頸静脈へ FITC-アルブミン注入術
- 麻酔マウスの体重を記録します 。
- 麻酔マウス腹腔内注射 (i.p) ケタミン (100 mg/kg) - キシラジン (10 mg/kg) ソリューションの適切な投与量と 。 穏やかなつま先ピンチによる
- モニター動物鎮静反射を撤回は、Walantus ら に示すよう 11, 12.
- フェイス アップ仰臥位で麻酔下のマウスを置き、4 本の脚と尾を手術ワークベンチに粘着テープで固定します 。
- 電気カミソリで首に適切な外科的マージンを慎重に剃るマウスを確保した後 (材料の表 を参照) し、ポビドン ヨード ソリューションと 70% エタノールで消毒します 。
- 綿棒で露出剃毛表面を乾燥します 。
- 優しく剃毛の皮膚を引き上げ、1.5 cm 長い縦切開を行う、メス、鎖骨の中央で線胸部上中間の開始と首の下だけを拡張する.
- 鉗子外頸静脈を公開する顕微鏡観察 (5 倍) の下で慎重に離れて結合組織を伸ばす 。
- 右側に、FITC-アルブミン液の注入用 30 G 針の挿入を容易にするために頸静脈の左側に十分なスペースを確保する 。
- 動物を静脈内注入 (右頸静脈) ゆっくり (3 分以上) 10 mL/kg FITC-アルブミンの 100 μ L に 30 G の針を使用しています 。
- 15 分後、斬首でマウスを安楽死させる急速に前述 13 として頭蓋骨から脳を取り除く、中古冷蔵イソペンタンの少なくとも 10 倍脳自体のボリュームで 15 分間浸します 。
- 中古冷蔵チューブに脳を冷凍イソペンタンを移動し、組織学的断面まで-80 ° C のフリーザーに保存します 。
4。組織切片の脳を流し込んで FITC-アルブミン
- 埋め込む最適な切削温度 (OCT) で脳を複合冷凍クライオスタットを区分する前に (材料の表 を参照してください).
- 直列クライオスタットで 20 μ m 厚いセクションに脳を切る (材料の表 を参照)、顕微鏡用スライド グラスの上にそれらをマウントと 。
- 特定を用いて FITC-アルブミン/ラミニン共同染色を行う抗ラミニン抗体前述 6 の方法 (材料の表を参照してください).
- 簡潔に、一次抗体の抗ラミニン (pAb 1: 1000) でセクションを一晩インキュベート、Cy3 標識適切な二次抗体を続行します 。
- Coverslip スライド 4 を含むメディアをマウントを '、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (吸収ピーク = 360 nm; 発光ピーク = 460 nm (材料の表 を参照してください).
- 暗闇の中で 4 ° C で一晩乾燥してスライドのまま 。
- 蛍光顕微鏡下で染色する蛍光を観察 (材料の表 を参照してください) 両方の FITC 装備 20 倍の倍率で (吸収ピーク = 495 nm; 発光ピーク = 525 nm) および Cy3 フィルター (吸収ピーク = 550 nm; 排出量ピーク = 570 nm)。
- 染色後すぐにサンプルを表示するのにはマニキュアを使用してコーナーで coverslip を確保し、(4.3.3) 上記として顕微鏡の下でそれらを検討します 。
5。蛍光顕微鏡を設定とカラー画像集録
- 蛍光顕微鏡を次のように設定します。
- 蛍光ランプをオンに使用する前に約 10 分。顕微鏡、接続されているコンピューターやデジタル カメラをオンにします。画像解析ソフトウェアを実行 (材料の表 を参照してください).
- 最適な信号収集および空間分解能の適切な目的を使用し、適切なフィルターを選択します 。
- カラー画像の取得
- 画像解析ソフトウェアの [live] コマンドを選択 (材料の表 を参照してください)、各フィルターの最適な照明のパラメーター設定 。
- 単一チャネルのカラー画像を取り出してスケールバーを追加 [凍結] コマンドを選択する (' 編集 > を燃やすスケール ')
- 内の各イメージを保存、' .tiff ' 形式 。
- を選択してチャンネルを単一のイメージにマージ ' ファイル > マージ チャネル ' の保存と、
- tiff ' 形式 。
- 脳スライス (スライドごと 6 セクション) ごと (2200 μ x 3400 μ m) を写真 4 の 24 ビット色の最小値を取得します 。
6。FITC-アルブミン漏出の評価
- 自由に利用できる ImageJ 14 , 15 を使用して各単一チャネルの蛍光強度を分析します 。
- 合計各画像ごとラミニン CY3 蛍光強度による FITC-アルブミンの全蛍光信号強度を正常化し、グリーンの蛍光強度として血管外管外アルブミンを報告します 。
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Representative Results
FITC-アルブミン血流から緑色の蛍光トレーサーの BBB は脳 parenchymawhen に血管外漏出に頸静脈結果の適切な注入は、6を妥協しました。生理学的な条件の下で注入蛍光アルブミンの分布は脳の血管の内側に制限と周囲の血管領域や脳実質内に信号が検出できなかった (図 1 a、顕微鏡写真で、トップ)。逆に、BBB 神経病理学的状況下で危険にさらされて FITC-アルブミンの血管周囲スペースに沿うそして脳実質 (図 1 a, 顕微鏡下に) びまん性蛍光パターンが表示されます。血管マーカー染色、ラミニン、はっきり FITC-アルブミン蓄積 (図 1 a) のサイトのローカライズに使用されます。侵害された BBB FITC-アルブミンによって放出される増加緑蛍光画像処理ソフトを使用して評価された (材料の表を参照してください)、緑の蛍光強度として報告 (N = 3; 0.3112 対 0.5765; * * *、p = 0.0004、対 T 検定になっていない) (図 1 b)。上記したように、FITC-アルブミン強度が正常化しました。
図 1: BBB 損傷のマーカーとして FITC-アルブミン漏出します。(A) 代表的な蛍光顕微鏡下で緑色蛍光アルブミンの差分の分布を示す脳の凍結切片の両方生理学的な (上) と病理学の条件 (下)。赤い染色血管マーカー ラミニンを表します。露出時間: DAPI 20 ms、FITC 500 ms、テキサス州赤 60 さんスケール バー = 100 μ m (マージ モノグラフ)。(B) グリーン蛍光強度として報告は FITC-アルブミンによって放射される蛍光グリーンの数量が表示されます (手順 6.2 を参照)、生理学的な (健康な BBB) の病理学の条件 (侵害された BBB)。N = 3。データは、平均 ± SD を表されます * * * p = 0.0004 (対になっていない T 検定)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
我々 はここで説明する手法は、主に脳疾患条件下で BBB の漏れを検出するため便利です。BBB の機能不全が多様な神経学的疾患4の共通の特徴として注目されています。我々 は以前 HD6のようなまれな神経変性疾患のマウスモデルで BBB 整合性の初期の異常を説明するのにこのアプローチを使用します。
このメソッドは、相対的な簡易性の利点と正確で信頼性の高い結果を提供するプロシージャの有効性を取ります。それは高感度プレクリニカル ・ リサーチ ツールを表す、スピードと BBB の中断を断面化された脳組織内の蛍光グリーンのシンプルな可視化による質的評価を提供しています即時性のため便利です。ただし、生化学および分子の分析と組み合わせると、テクニックの BBB の相関解析を許可が血管内皮 TJs の構造と機能の整合性についての定量的な情報を提供することに成功したと脳のホメオスタシスを中断。
高分解能電子顕微鏡による16,などの他の方法と比較して安価で時間要求手順 BBB 微細構造についての情報を提供することはできませんそれがここで説明されているプロトコルがあります。17します。 さらに、その簡単なアプリケーションと再現性のため、手順は、神経変性障害前臨床モデルを特徴づける進歩的な脳血管病変を監視するのに役立ちます。
蛍光ベースのアプローチによって BBB 破壊を評価するための偉大な強さある直接リアルタイムでテストして最終的に共通の BBB 機能の微妙な変化の役割を調査するための潜在性および稀な神経疾患の影響BBB-に影響を及ぼす薬物や内因性の分子血液や脳室から適用されます。プロシージャは人間にまだ変換できないが、将来的に臨床練習で使用する新しい脳のトレーサーの開発のための徴候を提供する可能性があります。
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Disclosures
著者がある利益相反を開示するには
Acknowledgments
この作品が"Fondazione Neuromed"でサポートされている、健康参加する「Ricerca グラーヴェ」イタリア省の資金
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
References
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Tags
神経科学、問題 129、血液脳関門 (BBB)、BBB 透過性、FITC-アルブミン、神経変性疾患、静脈内注射、マウス モデルErratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
