ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
I denne studien presenterer vi en enkel og effektiv fremgangsmåte for å vurdere avbrudd i blod - hjerne barrieren under neurodegenerative forhold. For å oppnå våre mål, vi tilført molekylvekt fluorescein isothiocyanate merket (FITC)-albumin i musen vena vene og vurdert lekkasje i hjernen parenchyma av fluorescens mikroskopi.
Abstract
Avbrudd av blod - hjerne barrieren (BBB) integritet er vanlig for ulike nevrologiske og nevrodegenerative sykdommer. Selv om samspillet mellom plaget BBB homeostase og patogenesen av hjernen lidelser må videre undersøkelser, kan utvikling og validering av en pålitelig prosedyre å nøyaktig oppdage BBB endringer være avgjørende og representerer et nyttig verktøy for potensielt forutsi sykdom målrettet progresjon og utvikle strategier.
Her presenterer vi en enkel og effektiv fremgangsmåte for å vurdere BBB lekkasje i nevrodegenerative betingelse som forekommer i en prekliniske musemodell Huntingtons sykdom, der feil i permeabilitet av BBB er klart synlig precociously i sykdommen. Spesielt den molekylvekt fluorescein isothiocyanate merket (FITC)-albumin, som er å krysse BBB bare når sistnevnte er svekket, er akutt infundert i en mus vena jugularis og distribusjon i distriktene vaskulær eller parenchymal deretter bestemmes fluorescens mikroskopi.
Akkumulering av grønne fluorescerende-albumin i hjernen parenchyma fungerer som en indeks av avvikende BBB permeabilitet og når quantitated ved hjelp av Image J bearbeiding programvare, rapporteres som Green fluorescens intensitet.
Introduction
Homeostase i sentralnervesystemet (CNS) er en forutsetning for riktig kommunikasjon og funksjonen til nevronale cellene. CNS parenchyma er tett forseglet fra periferien av den endothelial blod - hjerne barrieren (BBB), som representerer grensesnittet mellom eksterne blodet og hjernen og spiller en avgjørende rolle i kryss-snakk mellom disse to distriktene1 ,2. BBB er en kompleks og dynamisk tredimensjonal struktur bestående hovedsakelig av spesialiserte mikro-fartøy endotelceller (ECs) knyttet til hverandre gjennom intercellulære junctional komplekser - stramt veikryss (TJs) - og omgitt av pericytes, Nevron avslutninger og astrocytter foten prosesser1,2.
Under fysiologiske forhold, ekstremt lav permeabilitet av intakt BBB sikrer streng regulering av transport av næringsstoffer og andre molekyler inn og ut av hjernen, og gir en unik beskyttelse mot omveltningene i CNS den sammensetning av blod som kan påvirke nevrale aktivitet og potensial eksterne fornærmelser1,2,3.
Avbrudd av BBB integritet og sin økt permeabilitet har lenge vært kjent å utgjøre en viktig funksjon for mange nevrologiske og nevrodegenerative lidelser4 inkludert Huntingtons sykdom (HD)5,6, men , om slike en dysfunksjon er et fenomen som forårsaker eller en propagative hendelse i løpet av sykdommen er fortsatt uklart. Tidspunktet for BBB oversikt også forblir unnvikende, men nye bevis av vår gruppe og andre viser at forstyrret BBB integritet ikke representerer en sen hendelse i sykdomsprogresjon, men heller et tidlig trinn6,7 , 8, som kan ha langsiktige konsekvenser.
Med dette i tankene er det viktig å precociously avsløre BBB sammenbrudd i neurodegeneration for å utvikle strategier nyttig å forutsi sykdomsprogresjon og hjerneskade og utvikle alternative og mer målrettede tiltak kan lykkes dempe klinisk konsekvensene av slike avbrudd. Pålitelig imaging BBB verdifall er derfor av stor betydning både eksperimentell forskning og klinisk behandling av brain sykdommer.
I dette papir beskriver vi en vellykket og enkel prosedyre for vurdering av BBB permeabilitet i en HD musemodell ved hjelp av høy molekylvekt fluorescein isothiocyanate merket-albumin (FITC-albumin). Bloduttredelse av FITC-albumin, som normalt ikke krysse barrieren, i hjernen parenchyma ble målt som en indeks av BBB lekkasje. Denne teknikken er lett tilpasses rotter og andre pathological betingelser preget av cerebrovasculature verdifall9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle prosedyrer på dyr ble godkjent av IRCCS Neuromed Animal Care Review Board og av " Istituto Superiore di Sanità " (tillatelse nummer: 1163/2015-PR) og var i henhold til veiledning av EU direktiv 2010 63/EU for dyreforsøk.
1. forberedelse av FITC-albumin løsning skal injiseres i vena jugularis
Merk: alle eksperimentene ble gjennomført i manifest (11 - uke gamle) HD R6/2-mus og alder og kjønn-matchet vill-type (WT) kontroll littermates.
- Oppløsning FITC-albumin pulver (se Tabell for materiale) i fosfat bufret saltvann (PBS) på 10 mg/ml.
Merk: For optimale resultater, dette bør være forberedt frisk for hver merking reaksjon.
2. Klargjøring av utstyr til bli brukt under kirurgi
- legge ut tidligere autoklaveres Kirurgiske instrumenter (se Tabell av materialer).
- Rengjør kirurgisk benken med alkohol (70% etanol løsning). Forberede det kirurgiske området (45 cm x 45 cm) med en kirurgisk sterilt disponibel håndkle drapere og sette opp drift stereomicroscope.
3. Kirurgisk prosedyre for FITC-albumin infusjon i vena jugularis
- registrere musen kroppsvekt for anestesi.
- Anesthetize mus med en intraperitoneal injeksjon (IP) av en passende dose av ketamin (100 mg/kg) - xylazine (10 mg/kg) løsning.
- Monitor dyr sedasjon av mild tå knipe trekke refleks som vist i Walantus et al. 11 , 12.
- Plasser bedøvet musen i en opp supine posisjon og fikse fire bena og halen på kirurgisk workbench med teip.
- Når musen er sikret, nøye barbere riktig kirurgisk marg på halsen med en elektrisk barberhøvel (se Tabell for materiale) og Desinfiser det med povidon-jod løsning og 70% etanol.
- Tørke utsatt barbert overflaten med bomull vattpinner.
- Forsiktig trekke opp barbert huden og gjøre en 1,5 cm lange langsgående snitt, av skalpell, i midclavicular starter midt på thorax og utvide til å like nedenfor halsen.
- Forsiktig strekke apart bindevev med tang under mikroskopisk observasjon (5 X forstørrelse) å avsløre eksterne vena jugularis.
- Sikre et tilstrekkelig plass til høyre og venstre i vena jugularis å forenkle innsetting av 30½ G nålen for tilførsel av FITC-albumin løsningen.
- Injisere dyret intravenøst (høyre vena jugularis interna) sakte (over 3 min) med 100 µL av 10 mL/kg FITC-albumin ved hjelp 30½ G nålen.
- Etter 15 minutter, euthanize musen ved halshogging, raskt fjerne hjernen fra skallen som beskrevet tidligere 13 og dyppe den i 15 min i minst 10 x volumet av hjernen i seg selv av pre kjølt isopentane.
- Flytte isopentane frosset hjernen i en pre kjølt rør og lagre det i en-80 ° C fryser til histologiske snitting.
4. Histologiske snitting av hjernen tilført FITC-albumin
- Embed frosset hjernen i optimal kutte temperatur (OCT) sammensatte (se Tabell for materiale) før kryostaten snitting.
- Serielt skjær hjernen i 20 µm tykke snitt, med en kryostaten (se Tabell for materiale), og Monter dem på objektglass glass.
- Utføre den FITC-Albumin/laminin co-flekker ved hjelp av en bestemt anti-laminin antistoff (se tabell for materiale) som tidligere beskrevet 6.
- Kort, ruge seksjoner med den primære antistoff anti-laminin (pAb 1:1000) over natten og fortsette med passende sekundære antistoff konjugert til Cy3.
- Dekkglassvæske lysbilder med montering medium som inneholder 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (absorpsjon topp = 360 nm; utslipp topp = 460 nm (se Tabell av materialer).
- La lysbildet til tørr overnatting på 4 ° C i mørket.
- Observere fluorescens flekker under fluorescens mikroskop (se Tabell for materiale) på 20 X forstørrelse utstyrt med begge FITC (absorpsjon topp = 495 nm; utslipp topp = 525 nm) og Cy3 filtre (absorpsjon topp = 550 nm; utslipp topp = 570 nm).
- For å se eksempler umiddelbart etter farging, sikre dekkglassvæske i hjørnene bruker neglelakk og undersøke dem under mikroskopet som ovenfor (4.3.3).
5. Innstilling opp fluorescens mikroskop og oppkjøpet av fargebilder
- satt opp fluorescens mikroskopet slik.
- Sving på fluorescens lampen ca 10 minutter før bruk. Slå på mikroskopet, tilkoblet datamaskinen og digitalkameraet. Kjøre bildet analyseprogramvare (se Tabell av materialer).
- Riktige målet for optimal signal innsamling og romlig oppløsning og velger passende filtre.
- Oppkjøpet av fargebilder
- Velg kommandoen [live] på bildet analyseprogramvare (se Tabell for materiale) og angi parametrene optimal belysning for hvert filter.
- Velg [fryse] ta enkeltkanals farge bildet og legge til baren skala (' Rediger > brenne skala ')
- Lagrer hvert bilde i den ' .tiff ' format.
- Flette kanaler i et enkelt bilde ved å velge ' fil > flettingen kanal ' og lagre den i den
- tiff ' format.
- Hent minimum fire tjuefire bit farge bilder (2200 µm x 3400 µm) per hjernen stykke (6 deler per lysbilde).
6. Vurdering av FITC-albumin bloduttredelse
- analysere fluorescens intensiteten for hver enkelt kanal ved hjelp av fritt tilgjengelig ImageJ 14 , 15.
- Normalisere totale fluorescerende signalet intensiteten av FITC-albumin ved totalt CY3-Laminin fluorescerende intensiteten per hvert bilde og rapportere extravasated albumin utenfor fartøyene som Green fluorescens intensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Riktig tilførsel av FITC-albumin i vena jugularis resultatene i bloduttredelse av grønne fluorescens tracer fra blodet i hjernen parenchymawhen BBB er kompromittert6. Under fysiologiske forhold, distribusjon av infundert fluorescerende albumin er begrenset til innsiden av hjerne blodkar og ingen signal i det omkringliggende perivascular område og/eller hjernen parenchyma er synlig (figur 1A, micrographs på den topp). Motsatt, når BBB settes under Nevro-patologisk omstendigheter FITC-albumin viser et diffus fluorescens mønster langs perivascular områder og i hjernen parenchyma (figur 1A, micrographs på bunnen). Co flekker med vaskulær markøren, brukes laminin, til å lokalisere klart området av FITC-albumin opphopning (figur 1A). Økt grønne fluorescens intensitet slippes ut av FITC-albumin i kompromittert BBB ble vurdert ved hjelp av en bildebehandling (se Tabell for materiale) og rapportert som Green fluorescens intensitet (N = 3; 0.3112 vs 0.5765; ***, p = 0,0004, Unpaired T-test) (figur 1B). FITC-albumin intensitet var normalisert som rapportert ovenfor.
Figur 1: FITC-Albumin bloduttredelse som en markør av BBB skade. (A) representant fluorescens micrographs av hjernen cryosections viser differensial distribusjon av grønne fluorescerende albumin under både fysiologiske (øverst) og pathological betingelser (nederst). Røde flekker representerer vaskulær markør-laminin. Eksponeringstider: DAPI 20 ms og FITC 500 ms, Tx Red 60 ms. skala bar = 100 µm (flettingen monografi). (B) denne grafen viser kvantifisering av den grønne fluorescensen slippes ut av FITC-albumin, som er rapportert som Green fluorescens intensiteten (se trinn 6.2), både fysiologiske (sunn BBB) og pathological betingelser (kompromittert BBB). N = 3. Dataene er representert som betyr ± SD, *** p = 0,0004 (hender T-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikken vi beskriver her er spesielt nyttige for å oppdage BBB lekkasje under hjernen sykdom forhold. BBB dysfunksjon er å få oppmerksomhet som en vanlig funksjon i ulike nevrologiske lidelser4. Vi har tidligere brukt denne tilnærmingen for å beskrive den tidlige sinnsforvirring BBB integritet i en musemodell av en sjelden nevrodegenerative sykdommer som HD6.
Denne metoden tar nytte av den relative enkelheten og effektiviteten av prosedyren, som gir nøyaktige og pålitelige resultater. Det representerer en svært følsom prekliniske forskningsverktøy og er nyttige for hastigheten og umiddelbarhet tilbyr kvalitativt vurdere BBB avbrudd av enkel visualisering av grønne fluorescens innenfor valgte hjernevev. Men når kombinert med biokjemiske og molekylære analyse, teknikken er lykkes i å gi kvantitativ informasjon om strukturelle og funksjonelle integriteten av vaskulær endotelial TJs og tillater analyse av sammenhengen av BBB forstyrrelser i hjernen homeostase.
Selv om det ikke kan gi informasjon om BBB ultrastructure, kan protokollen beskrevet her resultere i mindre kostbart og tid-krevende prosedyrer med andre metoder som høy oppløsning elektronmikroskop16, 17. videre dens enkelt program og reproduserbarhet, prosedyren kan være nyttig for overvåking progressiv lesjoner av hjerne blodkar som kjennetegner nevrodegenerativ lidelse pre-klinisk modeller.
En stor styrke vurdere BBB avbrudd av en fluorescens tilnærming ligger i potensial til å undersøke hvilken rolle subtile endringer i BBB funksjonen felles og sjeldne nevrologiske lidelser og til slutt direkte teste i sanntid effekten av BBB-påvirke narkotika eller endogene molekyler når den brukes fra blod eller hjernen batterirommet. Selv om prosedyren ikke ennå oversettes til mennesker, har potensial til å gi indikasjoner for utvikling av nye hjernen tracers å bli brukt i klinisk praksis i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av "Fondazione Neuromed" og finansiert av italiensk helse "Ricerca Corrente" til V.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
References
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
Tags
Nevrovitenskap problemet 129 blod - hjerne barrieren (BBB) BBB permeabilitet FITC-albumin neurodegeneration intravenøs injeksjon musemodellErratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
