ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
В этом исследовании мы представляем простой и эффективной процедуры оценки нарушения blood - brain барьер нейродегенеративных условиях. Для достижения нашей цели, мы проникнуты высокомолекулярного флуоресцеин Изотиоцианаты маркировку (FITC)-альбумина в мыши яремной вены и оценку его утечки в паренхиме мозга микроскопии флуоресцирования.
Abstract
Нарушение целостности гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является общей особенностью для различных неврологических и нейродегенеративных заболеваний. Хотя взаимодействие возмущенных BBB гомеостаза и патогенез расстройств головного мозга требует дальнейшего расследования, разработки и проверки надежные процедуры точно обнаруживать изменения BBB может иметь решающее значение и представляют собой полезный инструмент для потенциально прогноза болезни прогрессирования и развития целевых терапевтических стратегий.
Здесь мы представляем простой и эффективной процедуры для оценки утечки BBB в состоянии нейродегенеративных подобное происходит в доклинических мыши модели болезни Гентингтона, в котором дефекты проницаемости BBB четко обнаруживаются благосклонностью в болезнь. В частности, высокой молекулярной массой флуоресцеин Изотиоцианаты маркировку (FITC)-альбумин, который способен пересечь BBB только тогда, когда последний нарушается, остро проникнуты в яремной мышь и ее распространение в районах сосудистой или Паренхиматозный Затем определяется микроскопии флуоресцирования.
Накопление Зеленый флуоресцентный-альбумина в паренхиме мозга функционирует как индекса проницаемости аберрантных BBB и, когда предел с помощью программного обеспечения для обработки изображений J, сообщается как зеленый интенсивности флуоресценции.
Introduction
Гомеостаз в пределах центральной нервной системы (ЦНС) является необходимым условием для надлежащей коммуникации и функции клеток-нейронов. Паренхима ЦНС плотно запечатан от периферии эндотелиальной гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который представляет собой интерфейс между периферической крови и мозг и играет ключевую роль в кросс разговор между этими двумя районами1 ,2. BBB – это комплекс и динамических трехмерной структуры в основном состоит из специализированных микро судно эндотелиальных клеток (ECs) связаны друг с другом через межклеточное соединительной комплексы - плотные соединения (сомони) - и окруженный pericytes, нейрон окончаний и экзоцитоз ног процессов1,2.
В физиологических условиях, крайне низкая проницаемость нетронутыми BBB обеспечивает строгое регулирование транспорта питательных веществ и других молекул в и из мозга и ЦНС с уникальной защитой от изменений, происходящих в состав крови, что может повлиять на нейронной активности и против потенциал периферийных оскорбляет1,2,3.
Нарушения целостности BBB и его повышение проницаемости давно известно, являются ключевым элементом для многих неврологических и нейродегенеративных расстройств4 включая болезни Гентингтона (HD)5,6, однако , является ли такая дисфункция причинные явления или распространение событий в ходе заболевания до сих пор неясно. Сроки BBB разбивка также остается недостижимой, однако, новые доказательства нашей группы и другие указывает, что нарушена целостность BBB не представляют поздно событий в развитие болезни, но довольно рано шаг6,7 , 8, который может иметь долгосрочные последствия.
Имея это в виду важно выявить благосклонностью BBB пробоя в нейродегенеративные для того, чтобы разработать стратегии, полезной для прогнозирования прогрессирования заболевания и повреждения головного мозга и успешно развивать альтернативные и более целенаправленных мероприятий, способных смягчение клинических последствий такого нарушения. Надежные изображений BBB обесценения является, таким образом, важное значение в экспериментальных исследований и клинического управления заболеваний головного мозга.
В этом документе мы описываем успешным и простой процедуры для оценки BBB проницаемости в мышиной модели HD с помощью высокой молекулярной массой флуоресцеин Изотиоцианаты маркировку альбумина (FITC-альбумина). Кровоподтек FITC-альбумина, который обычно не может пересекать барьер, в паренхиме мозга измерялась как индекс BBB утечки. Этот метод легко адаптируется, крысы и другие патологические состояния, характеризуется cerebrovasculature обесценения9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
все процедуры на животных были утверждены Правлением IRCCS Neuromed животное уход обзор и по " Istituto Superiore ди Sanita " (номер разрешения: 1163/2015-PR) и были в соответствии с руководящими принципами ЕС Директива 2010 / 63/ЕС для экспериментов животных.
1. Подготовка FITC-альбумина раствор для инъекций в яремной
Примечание: все эксперименты были управления осуществляется в манифеста (11 - неделя старый) HD R6/2 мышей и в возрасте и соответствием пола одичал тип (WT) Однопометники.
- Растворяют FITC-альбумин порошка (см. Таблицу материалы) в-фосфатный буфер (PBS) на 10 мг/мл.
Примечание: Для получения оптимальных результатов, это должно быть подготовлено свежие для каждой маркировки реакции.
2. Подготовка оборудования, чтобы быть использованы во время хирургии
- выложить ранее газобетона хирургических инструментов (см. Таблицу материалы).
- Чистой хирургической скамейке с алкоголем (70% этанола раствор). Подготовить хирургические области (45 x 45 см) с портьера хирургические стерильные Одноразовые полотенца и Настройка операционных стереомикроскопом.
3. Хирургическая процедура для вливания FITC-альбумина в яремной вены
- запись мыши веса тела для анестезии.
- Anesthetize мышь с внутрибрюшинной инъекции (i.p) соответствующей дозы кетамина (100 мг/кг) - решение Ксилазина (10 мг/кг).
- Монитор животных седации, нежный мыс щепотку снять рефлекс, как показано в Walantus et al. 11 , 12.
- место наркотизированных мышь в лежачем положении лицом вверх и исправить четыре ноги и хвост на хирургические workbench скотчем.
- После того, как мышь является защищенной, тщательно побриться надлежащих хирургических маржа на шею с электрической бритвой (см. Таблицу материалы) и лечить ее с повидон йод раствор и 70% этанол.
- Сухой поверхности подвергаются бритая с ватные тампоны.
- Осторожно потяните вверх бритой кожи и сделать 1,5 см длиной продольный разрез, на скальпель, в midclavicular линии начиная посередине на грудной клетки и чуть ниже шеи.
- Осторожно растянуть врозь соединительной ткани с щипцами микроскопические наблюдения (5 X увеличение) подвергать внешних яремной.
- Обеспечить наличие достаточного пространства справа и слева от яремной для облегчения вставки иглы 30½ G для инфузии FITC-альбумина раствор.
- Придать животное внутривенно (справа яремной) медленно (более 3 мин) с 100 мкл 10 мл/кг FITC-альбумина с помощью иглы 30½ Г.
- После 15 минут, усыпить мыши путем обезглавливания, быстро удалить мозга от черепа как описано 13 и погрузиться на 15 мин в по крайней мере 10 x размер самого мозга предварительно охлажденные изопентана.
- Перемещение изопентана заморожен мозг в предварительно охлажденные трубку и хранить его в холодильнике-80 ° C до гистологические секционирование.
4. Гистологические вырезание из мозга Infused с FITC-альбумина
- вставлять замороженные смеси мозга оптимального раскроя температуры (OCT) (см. Таблицу материалы) до их криостата резании.
- Серийно вырезать мозг 20 мкм толщиной разделов, с криостата (см. Таблицу материалы) и смонтировать их на стеклянных скольжениях микроскопа.
- Выполнять FITC-альбумин/Ламинин совместно окрашивание с помощью конкретного анти Ламинин антитела (см. таблицу материалы) как описано 6.
- Кратко, инкубировать секции с основного антитела анти Ламинин (pAb 1: 1000) за одну ночь и приступить к соответствующей вторичное антитело проспряганное с Cy3.
- Coverslip слайды с монтажа носитель, содержащий 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (пик поглощения = 360 Нм; пик выбросов = 460 Нм (см. Таблицу материалы).
- Оставить для высыхания на ночь при 4 ° C в темноте слайд.
- Наблюдать флуоресценции, окрашивание под флуоресцентным микроскопом (см. Таблицу материалов) при 20-кратном оснащены оба FITC (пик поглощения = 495 нм; пик выбросов = 525 Нм) и Cy3 фильтры (пик поглощения = 550 Нм; выбросов пик = 570 Нм).
- Для просмотра образцов сразу же после окрашивания, обеспечить coverslip на углах, используя лак и рассматривать их под микроскопом как выше (4.3.3).
5. Параметр вверх флуоресцентным микроскопом и приобретение цветные изображения
- настроить следующим флуоресцентным микроскопом.
- Включите люминесцентная лампа около 10 минут перед использованием. Включите Микроскоп, подключенного компьютера и цифровой фотоаппарат. Запустите программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалы).
- Использовать соответствующие цели для оптимального сигнала сбора и пространственного разрешения и выберите соответствующие фильтры.
- Приобретение цветные изображения
- выберите команду [live] на программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалы) и установите параметры оптимального освещения для каждого фильтра.
- Выберите команду [Стоп] принять изображения цвета один канал и добавить линейку шкалы (' редактировать > сжечь шкала ')
- Сохранить каждое изображение в ' .tiff ' формате.
- Объединение каналов в один образ, выбрав ' файл > канала слияния ' и сохраните его в
- tiff ' формате.
- Получить как минимум четырех 24-битный цвет картинки (2200 мкм x 3400 мкм) на срез мозга (6 секций на слайд).
6. Оценка FITC-альбумин кровоподтек
- Анализ интенсивности флуоресценции для каждое одного канала с помощью свободно доступных ImageJ 14 , 15.
- Нормализовать интенсивности всего флуоресцентные сигнала FITC-альбумина, общей интенсивности флуоресценции CY3-Ламинин за каждое изображение и доклад extravasated альбумина вне суда, как зеленый интенсивности флуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Надлежащего вливание FITC-альбумина в яремной результаты в кровоподтек зеленой флуоресценцией трассировщик из крови в мозг parenchymawhen, та BBB скомпрометированы6. В физиологических условиях, проникнуты флуоресцентные альбумина рассылается внутри кровеносных сосудов мозга и нет сигнала в окружающие области и/или мозга паренхиме периваскулярной обнаружению (рис. 1A, микроскопии на сверху). И наоборот когда BBB скомпрометирован нейро патологических условиях, FITC-альбумин показывает шаблон диффузных флуоресценции вдоль периваскулярные пространства и в паренхиме мозга (рис. 1A, микроскопии на дне). Совместно окрашивание с сосудистой маркер, Ламинин, используется четко локализовать сайт FITC-альбумин накопления (рис. 1A). Увеличение зеленого флуоресценции интенсивности излучаемого FITC-альбумина в скомпрометировано BBB оценивалась с использованием программного обеспечения для обработки изображения (см. Таблицу материалы) и интенсивности флуоресценции Грин (N = 3; 0.3112 против 0.5765; ***, p = 0.0004, Непарные T-тест) (рис. 1B). FITC-альбумин интенсивность нормализована, как сообщалось выше.
Рисунок 1: FITC-альбумин кровоподтек как маркер поражения BBB. (A) представитель флуоресценции микроскопии мозга cryosections показаны дифференцированного распределения Зеленый флуоресцентный альбумина под как физиологические (вверху) и патологические состояния (внизу). Красное окрашивание представляет Ламинин сосудистой маркер. Время экспозиции: DAPI 20 мс, FITC 500 мс, Tx красный 60 г-жа шкалы бар = 100 мкм (слияние монография). (B) этот график отображает количественная оценка зеленый флуоресценции, испускаемых FITC-альбумин, который сообщается как интенсивность флуоресценции Грин (см. шаг 6.2), в физиологических (здоровый BBB) и патологические состояния (нарушенной BBB). N = 3. Данные представлены как означает ± SD, *** p = 0.0004 (неспаренный T-тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Техника, которую мы опишем здесь главным образом полезен для обнаружения утечки BBB условиях болезнь мозга. BBB дисфункции завоевывает внимание как общей чертой различных неврологических расстройств4. Ранее мы использовали этот подход для описания ранних расстройство BBB целостности в мышиной модели редкие нейродегенеративные заболевания как HD6.
Этот метод принимает преимущество относительной простоты и эффективности процедуры, которая обеспечивает точные и надежные результаты. Он представляет собой инструмент высокочувствительный доклинические исследования и является полезным для скорости и непосредственность, которые она предлагает в качественно оценки BBB нарушения путем простой визуализации зеленый флуоресценции в рамках псевдоразреза мозговой ткани. Однако когда в сочетании с анализ биохимических и молекулярных, техника успеха в предоставлении количественной информации о структурной и функциональной целостности сосудистого эндотелия сомони и позволяет анализ соотношения BBB срыв с гомеостаза головного мозга.
Хотя он не может предоставить любую информацию о BBB Ультраструктура, протокол, описанные здесь может привести к менее дорогостоящим и требует времени процедур по сравнению с другими методами, например, высоким разрешением электронной микроскопии16 17. Кроме того, из-за его легко наносится и воспроизводимости, процедура может быть полезным для контроля за прогрессивной поражения мозга сосудистую, характеризующих нейродегенеративных расстройств доклинических моделей.
Великая сила оценки нарушения BBB, подход, основанный на флуоресценции лежит в потенциал для изучения роли тонкие изменения в функции BBB в общих и редкие неврологические расстройства и в конечном итоге непосредственно проверить в режиме реального времени эффект Препараты, влияющие на BBB или эндогенных молекул при применении из крови или мозг отсека. Хотя процедура еще не может быть преобразован к людям, он имеет потенциал для предоставления указаний для развития новых мозга Трейсеры для использования в клинической практике в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрывать
Acknowledgments
Эта работа была поддержана «Fondazione Neuromed» и финансируется министерством здравоохранения «Ricerca Corrente» для в.м. Италии
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
References
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
Tags
Нейробиологии выпуск 129 гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) BBB проницаемости FITC-альбумин нейродегенеративные внутривенные инъекции модель мышиErratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
