ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
I denna studie presenterar vi ett enkelt och effektivt förfarande för att utvärdera störningar av den blood - brain barriären under neurodegenerativa sjukdomar. För att uppnå vårt mål, vi infunderas hög molekylvikt fluorescein isotiocyanat märkt (FITC)-albumin in mus jugular ven och utvärderas dess läckage in i hjärnparenkymet av fluorescensmikroskopi.
Abstract
Störningar i blod - hjärnbarriären (BBB) integritet är en gemensam funktion för olika neurologiska och neurodegenerativa sjukdomar. Även om samspelet mellan perturbed BBB homeostas och patogenesen av hjärnsjukdomar behöver ytterligare utredning, kan utveckling och validering av ett tillförlitligt förfarande för att upptäcka BBB förändringar vara avgörande och representerar ett användbart verktyg för att kunna förutsäga sjukdom riktade progression och utveckla behandlingsstrategier.
Här presenterar vi ett enkelt och effektivt förfarande för att utvärdera BBB läckage i neurodegenerativa tillstånd som inträffar i en preklinisk musmodell av Huntingtons sjukdom, där brister i permeabiliteten i BBB är klart påvisbara precociously i sjukdomen. Specifikt, den höga molekylvikt fluorescein isotiocyanat märkt (FITC)-albumin, som kunna passera BBB endast när den senare är nedsatt, är akut infunderas in i en mus halsvenen och dess fördelning i stadsdelarna vaskulär eller parenkymal bestäms sedan av fluorescensmikroskopi.
Ansamling av grön fluorescerande-albumin i hjärnparenkymet fungerar som ett index av avvikande BBB permeabilitet och, när quantitated med hjälp av bild J bearbetning programvara, redovisas som Green fluorescensintensiteten.
Introduction
Homeostas inom det centrala nervsystemet (CNS) är en förutsättning för korrekt kommunikation och funktion av neuronala celler. CNS parenkymet är tätt tillsluten från periferin av den endothelial blodhjärnbarriären (BBB), som utgör gränssnittet mellan perifera blodomloppet och hjärnan och spelar en nyckelroll i överhörning mellan dessa två distrikt1 ,2. BBB är en komplex och dynamisk tredimensionell struktur huvudsakligen består av specialiserade mikro-fartyget endotelceller (ECs) kopplade till varandra genom intercellulära Junktional komplex - åtsittande föreningspunkter (TJs) - och omgiven av pericyter, neuron ändelser och Astrocyten foten processer1,2.
Under fysiologiska betingelser, extremt låg permeabilitet av intakt BBB säkerställer strikt reglering av transport av näringsämnen och andra molekyler in och ut ur hjärnan, och ger ett unikt skydd mot förändringar i CNS den sammansättningen av blod som kan påverka neural aktivitet och mot potentiella perifera förolämpningar1,2,3.
Störningar av BBB integritet och dess förbättrade permeabilitet har länge varit känt att utgöra en viktig funktion för många neurologiska och neurodegenerativa sjukdomar4 inklusive Huntingtons sjukdom (HD)5,6, men , om sådan en dysfunktion är ett orsakande fenomen eller en propagative händelse i sjukdomsförloppet är fortfarande oklart. Tidpunkten för BHB-nedbrytning förblir också svårfångade, men nya bevis av vår grupp och andra indikerar att störd BBB integritet inte utgör ett slutet evenemang i sjukdomsförloppet, men snarare ett tidigt steg6,7 , 8, som kan få långsiktiga konsekvenser.
Med detta i åtanke är det viktigt att avslöja precociously BHB-nedbrytning i neurodegeneration för att utveckla strategier som är användbart för att förutsäga sjukdomsprogress och hjärnskador och att utveckla alternativa och mer målinriktade insatser kan framgångsrikt lindra kliniska konsekvenserna av sådana avbrott. Pålitlig avbildning av BBB njurfunktion är därför av stor betydelse i både experimentell forskning och klinisk behandling av sjukdomar i hjärnan.
I den här artikeln beskriver vi en framgångsrik och enkel procedur för utvärdering av BBB permeabilitet i en musmodell för HD med hjälp av den höga molekylvikten fluorescein isotiocyanat märkt-albumin (FITC-albumin). Extravasering av FITC-albumin, som normalt inte kan passera barriären, in i hjärnparenkymet mättes som ett index av BBB läckage. Denna teknik är lätt anpassningsbar till råttor och andra sjukdomstillstånd som kännetecknas av cerebrovasculature nedskrivningar9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla förfaranden på djur godkändes av IRCCS Neuromed Animal Care i styrelsen och av " Istituto Superiore di Sanità " (tillståndsnummer: 1163/2015-PR) och var i enlighet med riktlinjerna för EU: S direktiv 2010 / 63/EU för djurförsök.
1. beredning av FITC-albumin lösning injiceras i halsvenen
Obs: alla experiment var buren i manifest (11 - vecka gammal) HD R6/2-möss och i ålder och kön-matchade vildtyp (WT) kontroll Kullsyskonen.
- Lös FITC-albumin pulver (se Tabell för material) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på 10 mg/ml.
Obs: För optimalt resultat, detta bör vara förberedda färska på varje märkning reaktion.
2. Iordningsställande av utrustning till vara används under kirurgi
- lägga ut de tidigare Ånghärdad kirurgiska instrument (se Tabell för material).
- Rengör kirurgiska bänken med alkohol (70% etanol lösning). Förbereda det kirurgiska området (45 x 45 cm) med en kirurgisk sterila disponibla handduk draperi och konfigurera operativa stereomikroskopet.
3. Kirurgiskt ingrepp för FITC-albumin Infusion i halsvenen
- spela in musens kroppsvikt för anestesi.
- Anesthetize mus med en intraperitoneal injektion (IP) med en lämplig dos av ketamin (100 mg/kg) - xylazin (10 mg/kg) lösning.
- Monitor djur sedering av mild tå nypa återkalla reflex visade i Walantus et al. 11 , 12.
- Placera sövda musen i ett uppåtvänt ryggläge och fixa fyra benen och svansen på kirurgiska arbetsbänken med självhäftande tejp.
- Efter musen är säkrade, omsorgsfullt rakar den lämplig kirurgisk marginalen på halsen med en rakapparat (se Tabell av material) och desinfektera den med povidonjod lösning och 70% etanol.
- Torka den exponerade raka ytan med bomullspinnar.
- Dra upp rakade huden försiktigt och gör en 1,5 cm långa längsgående snitt, av skalpell i midclavicular linjen börjar halvvägs på bröstkorgen och sträcker sig till strax under halsen.
- Försiktigt sträcka isär bindväv med pincett under mikroskopisk observation (5 X förstoring) att avslöja den yttre halsvenen.
- Säkerställa ett tillräckligt utrymme på höger och vänster på halsvenen att underlätta införandet av 30½ G nålen för infusion av FITC-albumin lösningen.
- Injicera djuret intravenöst (rätt halsvenen) långsamt (över 3 min) med 100 µL 10 mL/kg FITC-albumin med hjälp av 30½ G nålen.
- Efter 15 minuter, avliva musen genom halshuggning, snabbt bort hjärnan från skallen som tidigare beskrivits 13 och fördjupa det i 15 min i minst 10 x volymen av hjärnan själv av pre kylda isopentan.
- Flytta den isopentan fryst hjärnan i en pre kylda röret och lagra den i-80 ° C frys tills histologiska snittning.
4. Histologiska snitt av hjärnan infunderas med FITC-albumin
- Embed fryst hjärnan i optimal skärtemperatur (ULT) förening (se Tabell för material) före kryostaten snittning.
- Seriellt skär hjärnan i 20 µm tjocka sektioner, med en kryostat (se Tabell för material), och montera dem på glas objektglas.
- Utföra FITC-Albumin/laminin Co färgningen med hjälp av en särskild anti-laminin antikropp (se tabell för material) som tidigare beskrivs 6.
- Kort, inkubera sektioner med den primär antikropp anti-laminin (pAb 1: 1000) över natten och fortsätt med lämpliga sekundär antikropp konjugerat till Cy3.
- Täckglas glider med monteringsmedium som innehåller 4 ', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) (absorption topp = 360 nm, emission topp = 460 nm (se Tabell för material).
- Lämnar bilden att torka över natten vid 4 ° C i mörker.
- Observera fluorescensen färgning i fluorescens Mikroskop (se Tabell för material) på 20 X förstoring med båda FITC (absorption topp = 495 nm, emission peak = 525 nm) och Cy3 filter (absorption topp = 550 nm, emission topp = 570 nm).
- Visa proverna omedelbart efter färgningen, säkra täckglaset i hörnen med hjälp av lacket och undersöka dem i Mikroskop som ovan (4.3.3).
5. Inställningen upp the fluorescens Mikroskop och förvärvet av färgbilder
- Ställ mikroskopet fluorescens enligt följande.
- Slå på lampan fluorescens ca 10 minuter före användning. Slå på mikroskopet, den anslutna datorn och digitalkameran. Kör bild analys programvara (se Tabell för material).
- Använda lämpliga mål för optimal signalöverföring insamling och rumslig upplösning och Välj lämpliga filter.
- Förvärv av färgbilder
- Välj kommandot [levande] på bild analys programvara (se Tabell av material) och ställa in optimal belysning parametrar för varje filter.
- Välj kommandot [freeze] att ta den enda kanal färg bilden och lägga skalstapeln (' redigera > bränna skala ')
- Spara varje bild i den ' .tiff ' format.
- Koppla kanaler till en enda bild genom att välja ' fil > Merge kanal ' och spara den i den
- tiff ' format.
- Skaffa minst fyra twenty-fyra bitarsfärg bilder (2200 µm x 3400 µm) per hjärnan slice (6 avsnitt per bild).
6. Bedömning av FITC-albumin extravasering
- analysera fluorescensintensiteten för varje enskild kanal med hjälp av den fritt tillgängliga ImageJ 14 , 15.
- Normalisera totala fluorescerande signal intensiteten av den FITC-albumin av totala CY3-Laminin fluorescerande intensiteten per varje bild och rapportera den extravasering albumin utanför kärlen som Green fluorescensintensiteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ordentlig infusion av FITC-albumin i halsvenen resultaten i extravaseringen av grön fluorescens spårämne från blodet in i hjärnan parenchymawhen BBB är komprometterat6. Under fysiologiska betingelser, fördelningen av infunderas fluorescerande albumin är begränsad till insidan av hjärnans blodkärl och ingen signal i omgivande perivaskulär område och/eller hjärnan parenkymet är detekterbar (figur 1A, micrographs på den överst). Omvänt, när BBB äventyras under neuro-patologiska förhållanden, FITC-albumin visar en diffus fluorescens mönster längs perivaskulär utrymmen och i hjärnparenkymet (figur 1A, micrographs på botten). Co färgning med vaskulär markören, används laminin, för att tydligt lokalisera sida av FITC-albumin ackumulering (figur 1A). Ökad grön fluorescensintensiteten som avges av FITC-albumin i komprometterad BBB bedömdes med hjälp av ett bildbehandlingsprogram (se Tabell av material) och redovisas som Green fluorescensintensiteten (N = 3; 0.3112 vs 0.5765; ***, p = 0,0004, Oparade T-test) (figur 1B). FITC-albumin intensitet var normaliserade som anges ovan.
Figur 1: FITC-Albumin extravasation som markör av BBB skador. (A) representativa fluorescens micrographs av hjärnan kryosnitt visar differentierad fördelning av grön fluorescerande albumin under både fysiologiska (överst) och sjukdomstillstånd (nederst). Röd färgning representerar den vaskulära markör laminin. Exponeringstid: DAPI 20 ms, FITC 500 ms, Tx röd 60 ms. skala bar = 100 µm (sammanfoga monografi). (B) denna graf visar kvantifiering av den gröna fluorescensen som avges av FITC-albumin, som redovisas som Green fluorescensintensiteten (se steg 6,2), i både fysiologiska (friska BBB) och sjukdomstillstånd (komprometterad BBB). N = 3. Data representeras som genomsnitt ± SD, *** p = 0,0004 (oparat T-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den teknik som vi beskriver här är främst användbart för att upptäcka BBB läckage under hjärnan sjukdomstillstånd. BBB dysfunktion är att få uppmärksamhet som gemensamt för olika neurologiska problem4. Vi har tidigare använt denna metod för att beskriva den tidiga störning av BBB integritet i en musmodell av en sällsynt neurodegenerativ sjukdom som HD6.
Denna metod tar fördel av den relativa enkelheten och effektiviteten i förfarandet, som ger noggranna och pålitliga resultat. Det representerar ett mycket känsliga preklinisk forskningsverktyg och är användbar för hastighet och omedelbarhet som det erbjuder i kvalitativt bedöma BBB störningar genom enkel visualisering av grön fluorescens inom sektionerad hjärnvävnad. Men när de kombineras med biokemiska och molekylära analys, tekniken är framgångsrik i att tillhandahålla kvantitativa uppgifter om strukturella och funktionella integritet av vaskulär endotelial TJs och tillåter analys av korrelationen av BBB störningar med hjärnan homeostas.
Även om det inte ger någon information om den BBB ultrastruktur, kan det protokoll som beskrivs här resultera i mindre dyra och tid-krävande förfaranden i jämförelse med andra metoder såsom högupplöst elektronmikroskopi16, 17. Dessutom på grund av dess lätt tillämpning och reproducerbarhet, förfarandet kan vara användbara för att övervaka de progressiva lesioner i hjärnan kärlsystemet som kännetecknar neurodegenerativ sjukdom prekliniska modeller.
En stor styrka att bedöma BBB störningar av en fluorescens-baserade strategi ligger i potential att undersöka betydelsen av subtila förändringar i BBB funktion gemensamt och sällsynta neurologiska och så småningom att direkt testa i realtid effekten av BBB-påverka droger eller endogena molekyler när tillämpas från blod eller hjärnan facket. Även om förfarandet inte kan ännu översättas till människor, har det potential att ge indikationer för utvecklingen av nya hjärnan spårämnen som ska användas i klinisk praxis framöver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ”Fondazione Neuromed” och finansieras av det italienska hälsoministeriet ”Ricerca Corrente” till V.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
References
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
Tags
Neurovetenskap frågan 129 blod - hjärnbarriären (BBB) BBB permeabilitet FITC-albumin neurodegeneration intravenös injektion musmodellErratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
