Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

أسلوب ثقافة بديلة للحفاظ على هيبوميثيليشن الجينية للخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 وفيتامين (ج)

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/56391
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

وصفت لنا بالتفصيل البروتوكولين على أساس المادة الكيميائية لاستزراع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس. ويستخدم هذا الأسلوب الجديد التآزري آليات تعزيز أكسدة تيت بوساطة (بفيتامين ج) وقمع حيثياته توليف 5-ميثيلسيتوسيني (حسب PD0325901) للحفاظ على الحمض النووي هيبوميثيليشن وبلوريبوتينسي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس.

Abstract

الخلايا الجذعية الجنينية (ES) لديها القدرة على التفريق بين أي من الطبقات الجرثومية الثلاث (الأنسجة أو ميسوديرم أو الأديم الظاهر)، ويمكن أن تولد الكثير من الأنساب للطب التجديدي. وفاق خلية الثقافة في المختبر منذ أمد بعيد موضوع مخاوف على نطاق واسع. تقليديا، يتم الاحتفاظ بالماوس دإط الخلايا في مصل الدم وسرطان الدم من العوامل المثبطة (LIF)-التي تحتوي على المتوسط. بيد تحت ظروف المصل/ليف، الخلايا إظهار عدم التجانس في التشكل والتشكيل الجانبي لتعبير الجينات المتعلقة بلوريبوتينسي، وهي في معظمها في دولة يتواجد. وعلاوة على ذلك، مثقف دإط الخلايا معرض هايبرميثيليشن العالمي، ولكن السذاجة دإط الخلايا من كتلة الخلايا الداخلية (ICM) والخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) في حالة من هيبوميثيليشن العالمية. الدولة هيبوميثيلاتيد ICM وبجكس يرتبط ارتباطاً وثيقا بما بلوريبوتينسي. لتحسين أساليب الثقافة الخلية الماوس دإط، وضعنا مؤخرا طريقة جديدة على أساس استخدام مجتمعة بشكل انتقائي من المركبين جزيء صغير للحفاظ على الدولة هيبوميثيلاتيد و pluripotent في الحمض النووي. هنا، نقدم هذا العلاج المشارك من فيتامين ج (Vc)، ويمكن محو PD0325901 حوالي 90 في المائة من 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) في 5 أيام في الماوس دإط الخلايا. المحتوى الذي تم إنشاؤه 5mC يماثل في بجكس. آليا إلى التحقيق يظهر أن PD0325901 أعلى-وينظم التعبير Prdm14 لقمع Dnmt3b (دي نوفو الحمض النووي ميثيلترانسفيراسي) و Dnmt3l (مساعد Dnmt3b)، بخفض التوليف 5mC دي نوفو . Vc يسهل تحويل 5mC إلى 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) تحفزها أساسا Tet1 و Tet2، التي تشير إلى تورط ديميثيليشنز الحمض النووي السلبي والإيجابي على حد سواء. وعلاوة على ذلك، تظهر الماوس دإط الخلايا تحت ظروف Vc/PD0325901، مورفولوجيا متجانسة والدولة pluripotent. جماعياً، نقترح الرواية والأسلوب الثقافة الكيميائية-التآزر لتحقيق هيبوميثيليشن الحمض النووي والحفاظ على بلوريبوتينسي في خلايا الفأر ES. طريقة كيميائية تعتمد على جزيء صغير ويتغلب على أوجه القصور الرئيسية في الثقافة المصل، ويحمل وعدا بتوليد خلايا ES متجانسة لمزيد من التطبيقات السريرية، والأبحاث.

Introduction

دإط الخلايا نشأت من ICM من الكيسة1. في حالة بلوريبوتينسي الخلايا ويمكن أن تشكل جميع الأنساب الجسدية و خلايا germline2. إنشاء خلايا ES يوفر الفرصة للتحقيق في تطوير العمليات في المختبر ويمكن أن تولد خلايا ذات الأهمية الطبية للطب التجديدي استناداً على بلوريبوتينسي3.

إنشاء فريقين يحملني خطوط الخلايا الماوس وفاق في عام 1981 وعندما كانت استزراع الخلايا المشتقة من الأجنة الماوس المبكر في مصل الدم البقري الجنين (FBS)-تتضمن المتوسطة مع الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs) كتغذية طبقة1،4 . تم إبطال ميتوتيكالي ميفس وكانت تزرع مسبقاً في الأطباق قبل استزراع خلايا ES. تقديم الدعم لمرفق خلية الماوس ES ميفس وإنتاج عوامل النمو لتعزيز نشر وقمع التمايز5، بينما يقدم FBS العوامل التغذوية الأساسية والهرمونات لتكاثر الخلايا. بينت الدراسات اللاحقة أن ليف تنتجها الخلايا المغذية سيتوكين رئيسي للذاتي تجديد وصيانة بلوريبوتينسي في الماوس دإط الخلايا، وإضافة ليف في المتوسط يمكن أن تكون بديلاً لتغذية الخلايا6. في الوقت الراهن، الاكتفاء الماوس دإط الخلايا في المتوسط FBS/ليف على مغذيات لا يزال الأسلوب القياسي اعتمده العديد من الباحثين. ومع ذلك، تنشأ بعض المشاكل مع هذا النهج الثقافة الكلاسيكية. أولاً، تغذية الخلايا تفرز عوامل الزائدة وغير المنضبط وقد يسبب التلوث المسببة للمرض7. لتجنب هذا التدخل، وطلاء سطح الأطباق مع الجيلاتين وإضافة ليف في المحتوية على مصل المتوسطة أساليب بديلة للحفاظ على الماوس دإط الخلايا دون تغذية طبقة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، يحمل الماوس دإط الخلايا نمت تحت ظروف المصل/ليف المورفولوجية عدم التجانس في السكان خلية وحتى في مستوى التعبير من العوامل المتصلة بلوريبوتينسي8. تشير الدراسات الأخيرة إلى أن عوامل النسخ الأساسية المتصلة بلوريبوتينسي (بما في ذلك SOX2 ونانج OCT4) يمكن الحفاظ على ظروف المصل/ليف، بلوريبوتينسي عن طريق الآنف و WNT الإشارات؛ ومع ذلك، خصوصا، أنها أيضا تنشيط إشارة عامل النمو (صندوق الأجيال القادمة) تنتجها الخلايا الليفية لتحريك التمايز8. بسبب العمل المزدوج المتناقض لعوامل النسخ الأساسية، تقديم الماوس دإط الخلايا المستزرعة في المصل التغايرية، تتألف من السكان للتبادل اثنين، واحد مماثلة لمؤسسة أي سي أم وأخرى تشبه الدولة epiblast معبي8. وعلاوة على ذلك، الماوس دإط الخلايا في مصل الدم يحمل غالباً ما هايبرميثيليشن العالمي9، بينما ICM وبجكس في حالة هيبوميثيلاتيد عالمية، التي ترتبط ارتباطاً وثيقا بما9،بلوريبوتينسي10.

وهناك طلب كبير لتطوير أساليب جديدة لاستزراع خلايا الفأر ES. وقد أقيمت عدة بروتوكولات تحسن منذ عام 200311 ولكن لا تزال هناك بعض القيود وأوجه القصور7. منذ عام 2008 بالجمع بين استخدام اثنين كيناز جزيء صغير مثبطات، PD0325901 (مثبط للبروتين المنشط mitogen كيناز (MAPK)/ينظم إشارة خارج الخلية كيناز (إيرك) (مجاهدي خلق)) و CHIR99021 (مثبطات سينثاز الجليكوجين كيناز 3 (GSK3))، في ن2ب27 المتوسطة مع الآنف ودون المصل إلى فتح آفاق جديدة للماوس تثقيف دإط الخلايا12. هذه الوسيلة المعرفة الجديدة تتميز باستعمال مثبطات اثنين (2i). دإط الماوس الخلايا المستزرعة في المتوسط 2 طاء/ليف أكثر تجانساً في الخلية السكان والتعبير عن العوامل بلوريبوتينسي. وبالإضافة إلى ذلك، أن الماوس 2 طاء/ليف-مثقف دإط الخلايا يحمل هيبوميثيليشن الحمض النووي على الصعيد العالمي، وهو أقرب إلى الخلايا مثل ICM9،13. ومع ذلك فقد الثقافة 2 طاء عيوبها. PD0325901 CHIR99021 غير قابلة للذوبان في الماء، وعموما يتم حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])-على أساس حل الأسهم لإضافتها في الثقافة المتوسطة. وقد أظهرت الدراسات أن طويل الأجل ويمكن أن يؤدي التعرض لجرعة منخفضة من الخلايا إلى [دمس] إلى سيتوتوكسيسيتي14.

هنا، يمكننا استخدام المركبين جزيء صغير ووضع أسلوب ثقافة جديدة للماوس دإط الخلايا. الأسلوب الثقافة رواية يجمع بين المانع الرأسمالي ومجاهدي خلق PD0325901 النهوض هيبوميثيليشن الحمض النووي بسرعة وفعالية على مستوى مماثل من PGC، اسمه كبروتوكول تثقيف Vc/PD0325901. معرض التجانس في مورفولوجيا الخلايا ES الماوس في Vc/PD0325901--أضيفت المتوسطة المحتوية على مصل وهي مستمرة في حالة الأرض. بالمقارنة مع الثقافة 2 طاء، الماوس دإط الخلايا المزروعة تحت ظروف Vc/PD0325901 يحمل أسرع حركية demethylation الحمض النووي ويمكن أن تصل إلى مستوى هيبوميثيليشن مماثلة لتلك التي PGC. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام مثبط واحد (PD0325901) يقلل كمية المدخلات [دمس] في المتوسط بالمقارنة مع تلك المستخدمة في 2i (PD0325901/CHIR99021)، ويقلل من الضرر للخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-الأعمال التحضيرية

  1. تعد الحل من 1.0 مم PD0325901 (مثبط لمجاهدى خلق) ومم 3.0 CHIR99021 (مثبط GSK3).
    1. تزن 2 مغ PD0325901 وإضافة مل 4.15 من [دمس] في قنينة زجاج العنبر.
    2. تزن 2 مغ CHIR99021 وإضافة مل 1.43 من [دمس] في قنينة زجاج العنبر.
    3. إعادة تشكيل التالية، تخزين مختبرين (50 ميليلتر/أنبوب في أنابيب PCR ميليلتر 200) في-20 درجة مئوية، ومحمية من الضوء. إزالة أنبوب يحتوي على المخزون المجمد من الثلاجة وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
  2. وزن ز 0.0176 من الاستثمار الرأسمالي في 1 مل أنبوب الطرد المركزي وإعادة تشكيل ذلك مع 1 مل الماء المعقم لتركيز 100 ملم قبل استخدامها نهائي.
  3. إلغاء تنشيط FBS: احتضان 500 مل FBS في حمام مائي في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. إعداد 600 مل الوسيلة الأساسية لاستزراع خلايا الفأر ES.
    1. استخدام زجاجة من دميم/ارتفاع الجلوكوز المتوسطة (500 مل) وإزالة 40 مل.
    2. الملحق 460 مل من دميم/ارتفاع الجلوكوز المتوسطة بنسبة 20% إبطال FBS (120 مل)، 1,000 ليف يو/مليلتر (60 ميليلتر من 107 U/mL حل الأسهم)، 0.1 ملم غير الأحماض الأمينية الأساسية (نيا) (6 مل من محلول الأسهم 10 ملم)، بيروفات صوديوم 1 ملم (6 مل من محلول الأسهم 100 ملم) ، 2 مم L-الجلوتامين (6 مل من محلول الأسهم 200 ملم)، 0.1 مم β-mercaptoethanol (600 ميليلتر من حل الأسهم 100 ملم)، والبنسلين 33 وحدة دولية/مل و 33 ميكروغرام/مل ستربتوميسين (2 مل من البنسلين-ستربتوميسين مختلطة الحل (البنسلين 10000 وحدة دولية/مل و 10,000 ميكروغرام/مل ستربتوميسين)) . تعريف الوسيلة الأساسية كالمتوسطة المصل.
    3. "الماصة؛" 50 ميليلتر من الأسهم حل PD0325901 (1.0 مم) والرأسمالي (100 ملم)، على التوالي، إلى 50 مل الوسط المصل (التركيز النهائي: 1.0 ميكرومتر PD0325901 و 100 ميكرومتر الرأسمالي)، وتعريف المتوسطة كالمتوسطة Vc/PD0325901.
      ملاحظة: إعداد Vc/PD0325901 الطازجة المتوسطة قبل الاستخدام بسبب عدم الاستقرار في الاستثمار الرأسمالي.
    4. استخدام ماصة، نقل 50 ميليلتر من الأسهم حل PD0325901 (1.0 مم) و CHIR99021 (3.0 ملم)، على التوالي، إلى 50 مل الوسط المصل (التركيز النهائي: مكم PD0325901 1.0 و CHIR99021 3.0 ميكرومتر)، وتعريف المتوسطة متوسطة 2 طاء.
  5. إعداد أطباق الجيلاتين المغلفة.
    1. إعداد الحل الجيلاتين 0.1%: حل 0.3 غرام جيلاتين إلى 300 مل من الماء عالي النقاوة في زجاجة كاشف زجاج مع غطاء وتعقيمها في اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لتخزين 20 دقيقة الحل العقيمة في درجة حرارة الغرفة.
    2. احتضان الأطباق ثقافة الخلية (قطرها 6 سم) مع 2 مل محلول الجيلاتين 0.1% لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وثم نضح الجيلاتين. الأطباق في الهواء الجاف واستخدامها ضمن ح 12.
  6. إعداد 10 مل خلية الماوس ES تجميد المتوسطة في أنبوب الطرد مركزي 15 مل: 90% FBS (9 مل) و [دمس] 10% (1 مل). استخدام المتوسط خلال يوم واحد.
  7. إعداد حاوية تجميد: إضافة كحول الأيزوبروبيل 100% لخط تعبئة الحاوية التجميد، وتجاهل كحول الأيزوبروبيل القديمة. إضافة كحول الأيزوبروبيل الجديد مباشرة بعد كل استخدام الخامس.
  8. جعل المخزن المؤقت الهضم الأنزيمي: تتركز تزن ز 1.2114 مسحوق تريس في 100 مل الماء عالي النقاوة لإعداد 100 مم حل تريس وإضافة حل HCl (حوالي 12 م) إلى الحل تريس لضبط درجة الحموضة إلى 7.6 (حوالي 0.6 مل من محلول HCl مركزة).
  9. إعداد 50 مل من إذاعة إيمونوبريسيبيتيشن الإنزيم المخزن المؤقت (المعهد الملكي العازلة): 20 مم تريس، درجة الحموضة 7.4، 1 مم مجكل2، 150 مم كلوريد الصوديوم، الجلسرين 20%، 0.5% NP40، يدتا ملم 1، 1 مم عطا. الملحق مع 1 مم DTT، 1 X مثبط البروتياز كوكتيل و 1 مم بمسف قبل الاستخدام. حالما تتم إضافة بمسف، استخدام المخزن المؤقت خلال 30 دقيقة.

2-تنمو خلايا ES الماوس على الأطباق المغلفة بالجيلاتين

  1. الماوس قبل الحارة دإط الخلايا (نوع البرية، سفيف 129) الثقافة المتوسطة، التربسين، والحل الفوسفات مخزنة (PBS) في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
  2. مرور الخلايا. نضح المتوسطة تماما من صحن وماصة 2 مل من برنامج تلفزيوني للاطباق شطف الخلايا.
    1. إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة وغسل الخلايا مرة أخرى مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. إزالة برنامج تلفزيوني وأضف 0.3 مل التربسين-يدتا (0.25%) لكل طبق.
    3. تغطية الطبق كله مع التربسين سرعة وقم بإزالته فورا.
    4. وضع الطبق في حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لفصل الخلايا من الطبق. تأخذ بها الأطباق من الحاضنة وإضافة 2 مل من المصل قبل حرارة متوسطة إنهاء عمل التربسين.
    5. ننأى مستعمرات الخلايا في تعليق خلية واحدة من ريسوسبيندينج مع ماصة (نصيحة ماصة 5 مل) 10 مرات.
  3. نقل 150 ميليلتر من 2 مل الحل خلية (خلايا حوالي 190,000 عن طريق العد مع هيموسيتوميتير) إلى طبق المغلفة بالجيلاتين جديد، وتكمل مع 3 مل من تقدم طازجة Vc/PD0325901 المتوسطة الواحدة وطبق الثقافة 6 سم. ثقافة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2.
  4. كل 24 ساعة في حين تفرخ، إزالة المتوسطة الثقافة القديمة وإضافة 3 مل من الطازجة Vc/PD0325901-متوسطة في الطبق الثقافة بسبب عدم استقرار كونفلوينسي Vc-تتوقع 70-80% بعد 2-3 أيام.
  5. بعد أن وصلت إلى كونفلوينسي 70-80%، مرور الخلايا وتواصل الثقافة لهم كما هو موضح في الخطوات 2.2-2.4.

3-تجميد وإذابة خلايا ES الماوس

  1. تجميد الماوس دإط الخلايا.
    1. فصل الخلايا من الأطباق مع التربسين خطوة بعد 2.2.
    2. نقل الخلايا إلى أنبوب بلاستيكي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 800 × ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
    3. تفريغ المادة طافية برفق في كوب وريسوسبيند بيليه الخلية مع 1 مل من طازجة متوسطة التجميد. إعداد تجميد متوسطة 30 دقيقة قبل هذه الخطوة للتأكد من درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
    4. نقل الخلايا في تجميد المتوسطة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.8 مل مع ماصة 1 مل ووضع أنبوب ميكروسينتريفوجي في حاوية تجميد. إضافة كحول الأيزوبروبيل إلى خط تعبئة الحاوية التجميد ويبقيه في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
    5. ترك في حاويات تجميد بين عشية وضحاها في ثلاجة-80 درجة مئوية.
    6. نقل أنابيب ميكروسينتريفوجي إلى حاوية نيتروجين سائل لمدة تصل إلى 2-3 سنوات.
      ملاحظة: التي عدم إبقاء الخلايا في الأجلين المتوسط والتجميد لفترة طويلة الوقت وسرعة نقل الخلايا إلى ثلاجة-80 درجة مئوية بسبب السمية [دمس].
  2. ذوبان الجليد الماوس دإط الخلايا.
    1. قبل دافئ 50 مل من المصل المتوسطة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. أخرج قنينة تحتوي على خلية من الحاوية النتروجين السائل وتزج القنينة توج في حمام مائي 37 درجة مئوية. اهتز بسرعة في حمام الماء لإذابة الجليد. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل مع ماصة 1 مل. إضافة 2 مل من المصل قبل حرارة الثقافة المتوسطة في الأنبوب تمييع المتوسطة التجميد والطرد المركزي ثم ز 800 x ودرجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
    3. إزالة المادة طافية ولطف ريسوسبيند الكريات الخلية مع 3 مل من الطازجة المتوسطة Vc/PD0325901 استخدام ماصة 5 مل.
    4. نقل الخلايا من أنبوب 15 مل إلى طبق المغلفة بالجيلاتين والثقافة الخلايا الخاصة بحاء 24 ثقافة الخلايا مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 2.

4-استخراج البروتين الكلي من خلايا

  1. شطف الخلايا التي تم جمعها مع 1 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي ثم ز 800 x ودرجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
  2. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية دقة مع المخزن المؤقت ريبا تكملها مع DTT ومثبط البروتياز كوكتيل بمسف بيبيتينج برفق. حجم المخزن المؤقت للمعهد الملكي هو حوالي 5 س أن الخلية بيليه.
    ملاحظة: القيام باستثارة الخلية على الجليد.
  3. إبقاء الخلايا في المخزن المؤقت للمعهد الملكي لمدة 30 دقيقة على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وتخزين مختبرين في-80 درجة مئوية.
  5. تحديد تركيز البروتين مع مجموعة مقايسة بروتين برادفورد.

5-استخراج الحمض النووي من الخلايا وهضم الحمض النووي إلى نوكليوزيد واحد استخدام الإنزيمات

  1. جمع الخلايا مع التربسين كما هو موضح في الخطوات 3.1.1 و 3.1.2.
  2. القيام باستخراج الحمض النووي مع مجموعة تنقية الحمض النووي جينومي اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  3. تخزين الحمض النووي المستخرج في أنابيب الطرد المركزي 1 مل. إضافة 100 ميليلتر من الماء عالي النقاوة في أنبوب الطرد المركزي، ويحل الحمض النووي من بيبيتينج حوالي 15 مرة. تحديد التركيز وتقييم نوعية الحمض النووي بقياس امتصاص في 260 شمال البحر الأبيض المتوسط، و شمال البحر الأبيض المتوسط 28015. تركيز الحمض النووي حوالي 500 نانوغرام/ميليلتر.
  4. خلاصة 5 ميكروغرام من الحمض النووي في نظام حل 50 ميليلتر: إضافة 5 ميليلتر من 100 مم حل تريس-HCl، ودرجة الحموضة 7.6 (التركيز النهائي: 10 ملم)، 2 يو العجل الفوسفاتيز المعوية، 1 يو الدناز الأول، 0.005 يو ثعبان فوسفوديستريس السم الأول، و 5 ميكروغرام من الحمض النووي (حساب حجم المضافة وفقا قنينة تركيز الحمض النووي أحمر، ~ 10 ميليلتر) إلى أنبوب الطرد المركزي وزيادة حجم الحل إلى 50 ميليلتر ماء عالي النقاوة. احتضان هذا الخليط في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. الطرد المركزي الحل الحمض النووي هضمها 1,000 ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة لجمع الحل إلى الجزء السفلي من الأنابيب.
  5. نقل الحل الحمض النووي هضمها من أنابيب الطرد المركزي في أنابيب الترشيح الترا (وزن جزيء استقطاع: كاتشين 3) وأجهزة الطرد المركزي في 13,000 g و 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة الإنزيمات الهضم.
  6. إعداد العينات لتحليل 5mC و 5hmC.
    1. لتحليل 5hmC: ميليلتر بيبيت 36 حل تصفية لأجهزة الطرد مركزي جديدة أنبوب (1 مل) وإضافة 4 ميليلتر من 5 '-(hydroxymethyl-d3)-2-ديوكسيسيتيديني ([د3]-5hmC) بتركيز نهائي 3 نانومتر.
    2. لتحليل 5mC: إضافة 196 ميليلتر الماء عالي النقاوة في أنبوب الطرد مركزي جديدة وبيبيت 4 ميليلتر لتصفية حل للأنبوبة (تخفيف 50-fold)، بسبب كثافة عالية من 5mC في الحمض النووي. نقل ميليلتر 36 الحل المخفف لأنبوب الطرد مركزي جديدة وإضافة 4 ميليلتر من (5 '-(methyl-d3)-2-ديوكسيسيتيديني ([د3]-5mC) مع تركيز النهائي من 50 نانومتر. استخدام [د3]-5hmC و [د3]-5mC كمعيار الداخلية لمعايرة 5hmC و 5mC، على التوالي.
  7. نقل الحل عينة لأنابيب قياس وتخزينها في 4 درجات مئوية. تحليل 5mC و 5hmC مع الرباعي ثلاثية اللوني السائل فائقة الأداء الكتلي مع رصد رد فعل متعددة (أوهبلك-MS/MS (MRM)) كما هو موضح في تقرير سابق15.

6-تحليل 5mC و 5hmC باستخدام أوهبلك-MS/MS15

  1. إعداد معلمات مختلفة لتحليل 5mC و 5hmC باستخدام برنامج أوهبلك--مرض التصلب العصبي المتعدد.
    1. إنشاء أسلوب جديد. افتح البرنامج وانقر فوق "ملف | جديد | أسلوب ". معرض مربع الرسالة من "محرر أسلوب" محتوى "هل تريد حفظ التغييرات للأسلوب الحالي"، وانقر فوق "لا".
    2. بناء المعلمات لأخذ العينات. انقر فوق "العينات | الإعداد | حقن ". حدد "حقن القياسية" وإدخال "5 ميليلتر في حقن وحدة التخزين".
    3. بناء بارامترات المضخة في أوهبلك.
      1. انقر فوق "BinPump2 | الإعداد "لبناء معالم المضخة. إعداد "تدفق" في "0.25 مل/دقيقة" و "وقف الوقت" في "15 دقيقة".
      2. قم بإعداد "المذيب ب 5%" و "حدود الضغط" في "ماكس 600 بار".
      3. انقر فوق "BinPump2 | الجدول الزمني "لبناء إيسوكراتيك معلمات شطف لتحليل 5mC. انقر فوق "إلحاق" لإضافة صف. إدخال "0.00" في "وقت" و "5.0" في "ب %". انقر فوق "إلحاق" مرة أخرى لإضافة صف جديد. إدخال "15.00" في "وقت" و "5.0" في "ب %".
      4. انقر فوق "BinPump2 | الجدول الزمني "لبناء المعلمات شطف التدرج لتحليل 5hmC. انقر فوق "إلحاق إضافة صف. إدخال 0.00 في الوقت و 5.0 "ب %". انقر فوق "إلحاق" مرة أخرى لإضافة صف جديد. إدخال "3.00" في "وقت" و "5.0" في "ب %". انقر فوق "إلحاق" لآخر 6 مرات لإضافة الصفوف 6. إدخال "3.01" في "وقت" و "15.0" "% ب"، "6.00" في "وقت" و "15.0" "% ب"، "6.01" في "وقت" و "100" في "ب %"، "10.00" في "وقت" و "100.0" "% ب"، "10.01" في "وقت" و "5.0" في "ب %"، "15.00" في "وقت" و "5.0" في "ب %" في تسلسل.
        ملاحظة: إجراء تحليل 5mC و 5hmC على حدة نظراً للظروف فصل مختلف من أوهبلك.
    4. بناء المعلمات من درجة حرارة المقصورة العمود (TCC) في أوهبلك.
      انقر فوق "TCC | الإعداد | درجة الحرارة (يسار) "وإدخال" 30 درجة مئوية ".
    5. إنشاء معلمات ققق-MS/MS.
      1. انقر فوق "MS ققق | إيقاف الوقت | لا حدود/كمضخة "،" مصدر أيون | أي إس أي "،" تصفية وقت | العرض الأقصى: 0.07 دقيقة ". قم بإعداد "وقت شرائح: وقت البدء: 0"؛ "تفحص نوع: الآلية"؛ "القيمة Div: لمرض التصلب العصبي المتعدد"؛ "دلتا EMV (+): 200" و "دلتا EMV (-): 0".
      2. بناء المعلمات لرصد التحولات 5mC، د3-5mC، العاصمة، 5hmC، ودال-3-5hmC
        1. انقر فوق "MS ققق | اكتساب | مسح الشرائح: يسكن: "90"؛ "فراجمينتور: 90"؛ "الطاقة الاصطدام: 5"؛ "الخلية الجهد المسرع: 4" و "الأقطاب: إيجابية".
        2. إدخال "5mC" في مجمع "الاسم"، "242" على السلائف "أيون"، "126" في "أيون المنتج" لتحليل 5mC. انقر فوق الزر الأيمن وحدد "إضافة صف" لإضافة صف جديد. إدخال "د3-5mC" في مجمع "الاسم"، "245" على السلائف "أيون"، "129" في "أيون المنتج" لمد3-تحليل 5mC.
        3. الملحق آخر ثلاثة صفوف باستخدام نفس الأسلوب. إدخال "دي سي" في مجمع "الاسم"، "228" على السلائف "أيون"، "112" في "أيون المنتج" لتحليل dC. إدخال "5hmC" في مجمع "الاسم"، "258" على السلائف "أيون"، "142" في "أيون المنتج" لتحليل 5hmC. مدخل د3-5hmC في "اسم مركب"، "261" على السلائف "أيون"، "145" في "أيون المنتج" لمد3-تحليل 5hmC.
      3. بناء معلمات مصدر الغاز. انقر فوق "MS ققق | مصدر | المصدر المعلمات: Temp الغاز: 300 درجة مئوية "؛ "تدفق الغاز: 11 لتر في الدقيقة"؛ "البخاخات: 15 رطل/بوصة مربعة"؛ "إيجابية-الشعرية: 3500 الخامس".
      4. حفظ الأسلوب المقترح. انقر فوق "MS ققق | أداة | حفظ الأسلوب ك ". حدد مساراً للطريقة المقترحة من "الدليل"، وإعطاء اسم للأسلوب عن طريق إدخال المحتوى في "أسلوب"، على سبيل المثال: تحليل 5mC و 5hmC.
  2. الفصل أوهبلك وتحليل MS/MS مونونوكليوسيديس
    1. التحضير لمرحلة الجوال ل 5mC والسيتوزين (ج) التحليل: تشكل المرحلة المتنقلة من الحل أ وب الحل ج: 500 مل من الماء عالي النقاوة مع 500 ميليلتر من حمض الفورميك (التركيز النهائي: 0.1%)، والحل ب: 500 مل من الميثانول 100%. مزيج الحل A و B في نمط (الخامس: الخامس) كمرحلة المتنقلة الوت 5mC وجيم (تعيين في الخطوة 6.1.3.3). تعيين معدل التدفق في 0.25 مل/دقيقة (تعيين في الخطوة 6.1.3.1).
    2. التحضير لمرحلة الجوال بالمذيبات A و B لتحليل 5hmC. المذيبات 2.0 مم NH4HCO3 محلول مائي (pH 9.0) (500 مل)، وهو مذيب ب 100 ٪ الميثانول (500 مل). 5hmC منفصلة شطف تدرج أمثل: 0-3 دقيقة، ب 5.0 في المائة و 95 في المائة (الخامس: الخامس)؛ 3-6 دقيقة، 15.0% ب و 85% A؛ 6-10 دقيقة، 100% ب؛ 10-15 دقيقة، 5.0% ب و 95% A (تعيين في الخطوة 6.1.3.4). تعيين معدل التدفق في 0.25 مل/دقيقة (تعيين في الخطوة 6.1.3.1).
  3. استخدام اليكتروسبراي MS/MS مع وضع إليه الرصد والإبلاغ (تعيين في الخطوة 6.1.5.1) لتحليل شطف من العمود وتعتمد طريقة أيون إيجابية (تعيين في الخطوة 6.1.5.2.1).
    1. رصد التحولات: 5mC, 242→126 m/z (الطاقة الاصطدام، ف 5)؛ [د3]-5mC، 245→129 m/z (ف 5)؛ العاصمة، 228→112 m/z (ف 5)؛ 5hmC، 258→142 m/z (ف 5)؛ [د3]-5hmC، 261→145 m/z (ف 5) (مجموعة في الخطوة 6.1.5.2.2).
    2. تعيين الفولتية الشعرية وجزء في +3,500 الخامس (تعيين في الخطوة 6.1.5.3) و 90 الخامس (تعيين في الخطوة 6.1.5.2.1)، على التوالي.
    3. تعيين حجم الحقن في 5 ميليلتر وتحليل كل عينة 3 مرات (تعيين في الخطوة 6.1.2). استخدام المنحنيات القياسية المطابق لتقييم مقدار 5mC و 5hmC.
      1. إنشاء المنحنى القياسي من 5mC: نقل 1 – 50 نانومتر (1، 5، 10، 20، 50 نانومتر، وتركيز النهائي) أنابيب الحل القياسي من 5mC إلى جهاز الطرد المركزي وإضافة 50 نانومتر [د3]-5mC للأنابيب. الملحق الحجم الإجمالي إلى 50 ميليلتر. إجراء تحليل 5mC القياسية اتباع التعليمات للحصول على نموذج 5mC (الخطوة 6).
      2. بناء المنحنى القياسي من 5hmC: نقل 1 – 20 نانومتر (1، 2، 5، 10، 20 نانومتر، وتركيز النهائي) الحل القياسي من 5hmC الطرد المركزي أنابيب وإضافة 3 نانومتر [د3]-5hmC للأنابيب. الملحق الحجم الإجمالي إلى 50 ميليلتر. إجراء تحليل 5hmC القياسية اتباع التعليمات للحصول على نموذج 5hmC (الخطوة 6).

7-تحليل الدلالة الإحصائية

  1. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام البرنامج.
    1. افتح البرنامج وحدد "العمود" في "جدول جديد والرسم البياني". تعيين المعلمات على النحو التالي: "نموذج بيانات | ابدأ باستخدام جدول بيانات فارغ "؛ "اختر وضع الرسم بياني، أولى"؛ "الرسوم البيانية replicates أو أشرطة الخطأ | ارسم | يعني مع وزارة شؤون المرأة ".
    2. انقر فوق "إنشاء" لإدخال replicates ثلاثة من مجموعة المراقبة والرأسمالي/PD0325901-تعامل في السطر "ألف" و "باء"، على التوالي. حدد ستة بيانات وانقر فوق "تحليل" في "تحليل".
    3. حدد "اختباراتt (واختبارات nonparametric)" في "العمود تحليلات" وانقر فوق "موافق" لإدخال الواجهة التالية.
    4. تعيين المعلمات على النحو التالي: "اختر اختبار | اسم الاختبار | اختبار مزاوج تي ؛ خيارات | 2-الذيل "؛ "فواصل الثقة: 95%"؛ "الأرقام المعنوية | وتظهر الأرقام المعنوية 4 ". انقر فوق "موافق" للحصول على قيمة p بين معاملة السيطرة والرأسمالي/PD0325901.
  2. تقييم دلالة إحصائية بين عنصر التحكم والمجموعات التجريبية التي توظف للطالب ذو الذيل اثنين ومزاوج تي-اختبار16.
    ملاحظة: ف < 0.05 يدل الفرق تمتلك دلالة إحصائية. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vc/PD0325901 فعل تآزر المحو العالمية للماوس دإط الخلايا. خلايا ES الماوس في مصل الدم يحمل هايبرميثيليشن الحمض النووي، بينما pluripotent الخلايا ICM وبجكس إظهار انتفاء مثلايشن الحمض النووي العالمي والدولة هيبوميثيلاتيد يرتبط ارتباطاً وثيقا بما9،بلوريبوتينسي10.

سابقا، نحن وآخرون تبين أن اتفاقية فيينا قد تعزز تيت بوساطة 5mC ديميثيليشن15،17. وفي الوقت نفسه، وجد أيضا 2 طاء تمنع توليف نوفو دي 5mC. في سياق هذه النتائج، اقترحنا زيادة التآزر التلاعب بالماوس دإط الخلايا معا باستخدام Vc و 2 طاء. وبعد تحليل أوهبلك-MS/MS، وجدنا أن الرأسمالي و 2 طاء تستكمل في الأجلين المتوسط والمحتوية على مصل جذريا تقليل محتوى 5mC من 3.2 إلى 0.33 الواحدة 100 ج (~ 90% 5mC خسارة) يوم 11 في الماوس دإط الخلايا (الشكل 1A). وفي المقابل، الرأسمالي أو 2 طاء-العلاج وحدها فقط تسبب المحو 58% بمستوى ثابت في الحد 5mC أو 61% 1.4% على مستوى 5mC 1.3%.

متوسطة 2 طاء تتألف من مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 ومثبطات GSK3β CHIR99021. المقبل، ونحن التحقيق المكون الذي يدفع الخسارة العالمية في 5mC أثناء فترة العلاج المشترك للاستثمار الرأسمالي و 2 طاء. مثيرة للاهتمام، Vc/PD0325901 تسبب انخفاض أسرع في مستويات مثلايشن الحمض النووي من Vc/2 طاء. Vc/PD0325901 حققت مستويات مطردة 5mC (~0.33% 5mC) بعد 5 أيام، بينما Vc/2 طاء التوصل إلى مستوى مماثل في يوم 11. وفي المقابل، قمعت بالملحق CHIR99021 جزئيا demethylation تشغيل Vc الحمض النووي (الشكل 1A). هذه البيانات تشير بوضوح أن PD0325901 في 2 طاء يسهم في هيبوميثيليشن العالمي للحمض النووي في خلايا الفأر دإط، بينما يمنع CHIR99021 من 2 طاء جزئيا محو 5mC. ولذلك، يمكننا التكهن أن demethylation DNA أسرع الناجمة عن الاستثمار الرأسمالي/PD0325901 بالنسبة للرأسمالي/2 طاء يمكن أن يعزى إلى تثبيط جزئي من CHIR99021 في ديميثيليشن.

افترضنا أن محو العالمية من 5mC في الماوس دإط الخلايا الناجمة عن الاستثمار الرأسمالي/PD0325901 قد تكون جزئيا ذات الصلة لتعزيز DNA demethylation. ومن ثم، قمنا بفحص المنتجات أكسدة الجينوم من 5mC. وأفيد أن 5mC يمكن تحويلها إلى 5hmC باكسدة حفازة تيت ديوكسيجيناسيس الأسرية، التي تعتمد على الحديد (II) و 2-أوكسوجلوتاراتي،من1819. قد تضعف 5hmC المجينية الحمض النووي النسخ المتماثل20. وعلاوة على ذلك، يمكن كذلك تتأكسد 5hmC قبل ديوكسيجيناسيس تيت لإنتاج 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5-كاربوكسيلسيتوسيني (5caC)، وكفاءة اقتطعت يمكن أن الثايمين DNA glycosylase (لجنة) لاسترداد السيتوزين أونميثيلاتيد، مما يدل الحمض النووي نشطة ديميثيليشن،من2122.

تمشيا مع العمل السابق15، المعاملة المحتوية على الرأسمالي (الاستثمار الرأسمالي، Vc/2 طاء، Vc/PD0325901، والرأسمالي/CHIR99021) زيادة هائلة تردد 5hmC (5hmC/106 ج) بعد يوم واحد، وبعد ذلك 5hmC المستويات انخفضت تدريجيا (الشكل 1B) نظراً الحد تدريجيا في الركيزة 5mC. جدير بالذكر أن Vc/PD0325901 والرأسمالي/2 طاء أظهرت حركية أسرع من فقدان 5hmC بالمقارنة مع الاستثمار الرأسمالي والاستثمار الرأسمالي/CHIR99021 نظراً لانخفاض أسرع من 5mC. وباﻹضافة إلى ذلك، لاحظنا أيضا أن Vc-العلاج في اليوم 1، حفز توليد أكثر من 5hmC بالمقارنة مع Vc/CHIR99021، مشيراً إلى أن CHIR99021 جزئيا إعاقة الإنتاج الناجمة عن الاستثمار الرأسمالي من 5hmC، وأعاقت DNA demethylation. فقدان 5hmC في المعاملة 2 طاء ينبغي أن يعزى إلى انخفاض الركازة 5mC. أخذت معا، أظهرت هذه النتائج أن نشاط demethylation DNA Vc--تعزيز أسهم جزئيا إلى تآزر هيبوميثيليشن في المعاملة المشارك Vc/PD0325901 والرأسمالي/2 طاء.

كلا حبيبي et al. 23 ومين فون et al. وأفادت 24 أيضا أن الماوس دإط الخلايا تحت ظروف 2 طاء وأظهرت الحمض النووي العالمي بلوريبوتينسي هيبوميثيليشن وساذج. مستويات 5mC أظهرت تنخفض تدريجيا والوصول إلى حالة مستقرة (~ 1% 5mC) في 12 – 14 يوما بعد العودة من المصل إلى 2 طاء. في النظام الرأسمالي/PD0325901، والثقافة demethylation DNA أسرع بسبب معاملة المشارك ووصلت إلى مستوى مستقر (0.33% 5mC) بعد تكميل Vc/PD0325901 في المصل المتوسطة لمدة 5 أيام، بسبب تأثير تآزري Vc/PD0325901. وكان مستوى ميثليته بلغت (0.33% 5mC) برونوونسدلي أقل من ذلك في ظل الظروف 2 طاء عنها حبيبي et al. ومين فون et al.، بينما كانت 5hmC مستويات أعلى بسبب تشجيع توليد الاستثمار الرأسمالي.

PD0325901 ارتقى التعبير Prdm14 لقمع Dnmt3b و Dnmt3l، ولكن لا Dnmt3a25. للتحقيق في عمل PD0325901 في حمل فقدان 5mC، تم بحث سلسلة من البروتين 5mC المتصلة التعبير، بما في ذلك الصيانة (Dnmt1) و حيثياته (Dnmt3a و Dnmt3b) ميثيلترانسفيراسيس الحمض النووي وعلى مساعد (Uhrf1 و Dnmt3l) و لائحة البروتين (Prdm14) 8،،من926. وبعد تحليل لطخة غربية، تم رفع Prdm14 برونوونسدلي في PD0325901، بما في ذلك الثقافة (الشكل 2). على النقيض من ذلك، أظهرت Dnmt3b وبه مساعد Dnmt3l أسفل كبيرة-تنظيم التعبير البروتين في PD0325901، بما في ذلك العلاج (الشكل 2). العلاج CHIR99021 أثر طفيف أو أظهرت لا على مستوى Prdm14، و Dnmt3b، و Dnmt3l. التعبير عن Dnmt3awas ولم يتغير والسبب غير واضح. وباﻹضافة إلى ذلك، methyltransferase الحمض النووي الصيانة Dnmt1 وبه عامل استهداف Uhrf1 أظهرت أيضا لا تغيير، وقد لا تظهر البيانات.

أشارت الدراسات الأخيرة إلى أن Prdm14 يمكن تجنيد بوليكومب القمعية المعقدة 2 (PRC2) لبعض مروجي الجينات لقمع التعبير عنها، مثل دي نوفو ميثيلترانسفيراسيس الحمض النووي (Dnmt3a و Dnmt3b) ومساعد على (Dnmt3l)، ويساهم في الحفاظ على هيبوميثيليشن تحت ظروف 2 طاء8،27. لدينا بيانات كشفت أن PD0325901 ارتقى مستوى التعبير Prdm14 لمنع Dnmt3b و Dnmt3l وخفض التوليف 5mC الجينوم حيثياته إليه.

لاستكشاف صيانة الماوس دإط الخلايا تحت ظروف Vc/PD0325901 بلوريبوتينسي، تم فحص مستويات التعبير مرناً لعدة عوامل مرتبطة بلوريبوتينسي الأساسية، وهذه العوامل قد تأكدت من تلعب دوراً حيويا في بلوريبوتينسي28. تحليل PCR في الوقت الحقيقي العثور على أن Oct4، SOX2، وأسرب، و Sall4 وأظهرت مستويات التعبير موحدة من خلال 5 أيام علاج مع Vc/PD0325901 وعلى النقيض من ثقافة المصل (الشكل 3A). نانج و Tcf3 زيادة 1.3-fold و 1.6-fold، على التوالي. على النقيض من ذلك، Klf4 أظهرت 42% لأسفل-التنظيم و Rex1 فقط انخفض بنسبة 12%. هذه النتائج تشير إلى أن معاملة المشارك في Vc/PD0325901 الناجمة عن التعديلات المتنوعة في التعبير عن العوامل بلوريبوتينسي؛ ومع ذلك، Oct4 و SOX2، معظم العوامل الأساسية، والاحتفاظ بمستويات ثابتة تقريبا للتعبير.

بعد ذلك، أجرى تحليل الفوسفاتيز قلوي (AP) لتقييم ما إذا كانت خلايا الفأر ES في حالة غير متمايزة أو متمايزة. وتم الحصول على صور خلايا (الشكل 3 و 3 ج) من كاميرا متصلة مجهر مقلوب مع التضخيم إذ بواسطة عدسة الهدف. بعد زراعة مستمرة لمدة 26 يوما في Vc/PD0325901--أضيفت المتوسطة المصل، أظهرت الخلايا الماوس ES مورفولوجيا متجانسة. وعلاوة على ذلك، كانت الملون الأسود الأرجواني تقريبا كافة الخلايا وأظهرت حالة شبيهة بالكرة دون ثمرة (الشكل 3)، إظهار حالة غير متمايزة. على النقيض من ذلك، تحت ظروف المصل، وكانت جزء من الخلايا الماوس وفاق في يوم 26 الأسود الأرجواني بعد تلطيخ وكان دولة مثل الكرة في التشكل، بينما الآخرين عرض لون فاتح مع الانتشار تتسم بخطوط بيضاء بيضاوي متقطع (الشكل 3 (ب))؛ وهذا أشارت إلى أن الخلايا المستزرعة المصل الماوس دا غير متجانسة في التشكل، وفي حالة pluripotent، وما يتسق مع التقارير السابقة13. وأيد البيانات جماعياً، أن PD0325901 في تركيبة مع الرأسمالي يمكن إدامة مورفولوجيا ممتازة وحالة غير متمايزة في خلايا ES الماوس.

Figure 1
رقم 1: Vc/PD0325901 فعل تآزر المحو العالمي للجينوم 5mCin الماوس دإط الخلايا. التردد 5mC (A) (5mC/C) والوقت التردد (5hmC/C) 5hmC (ب)-تعتمد تغيير أثناء علاج يوم 26 من ملحق المستمر مع الرأسمالي أو 2 طاء، Vc/2 طاء، Vc/PD0325901 أو Vc/CHIR99021 في المحتوية على مصل المتوسطة. يظهر شريط خطأ الانحراف المعياري (SD) من التحليلات المتكررة ثلاثة من السيتوزين "c:" السيدة/أوهبلك--مرض التصلب العصبي المتعدد. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al. 25- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تغيير تعبير البروتين ميثيلترانسفيراسيس Prdm14 والحمض النووي (Dnmt3a و Dnmt3b و Dnmt3l). النطاقات المعروضة (من اليسار إلى اليمين) تم الحصول على من خلال يوم 5-علاج ثقافة المصل (المراقبة) والرأسمالي، PD0325901، CHIR99021، 2 طاء، Vc/PD0325901، Vc/CHIR99021 والرأسمالي/2 طاء، على التوالي. كان التعبير عن 14 بردم أعلى-وينظم و Dnmt3b و Dnmt3l وانخفض بعد PD0325901، بما في ذلك الثقافة. Dnmt3a أظهرت أي تغيير. وكان تعيين β-tubulin كمرجع داخلي. الاشتراكات: المراقبة؛ PD: PD0325901؛ CH: CHIR99021. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al. 25- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: Vc/PD0325901-فعل التغيير في التعبير مرناً pluripotent الجينات ونشاط الفوسفاتيز القلوية. (أ) مرناً تم تغيير مستوى الجينات pluripotent الجزئي من خلال علاج يوم 5 من Vc/PD0325901 بالنسبة إلى ظروف المصل (التحكم). ومثلت البيانات يعني ± التنمية المستدامة. وتم تقييم الدلالة الإحصائية وف < 0.05 معتدا به إحصائيا. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < تمثيل 0.001 و ns غير هامة. PD: PD0325901. خلايا ES الماوس في مصل الدم لمدة 26 يوما (ب) عرضت ثمرة جزئية تميزت خطوط بيضاوية متقطعة بيضاء، بينما المتوسطة المصل Vc/PD0325901--إضافة مورفولوجيا كبيرا ودولة غير متمايز (ج). هذه الصور تم الحصول عليها من مجهر مقلوب متصلة مع كاميرا في الميدان مشرق. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al. 25-مقياس أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وفي هذا العمل، أثبتنا طريقة جديدة للجمع بين الرأسمالي و PD0325901 للحفاظ على خلايا الفأر ES في حالة غير متمايزة وهيبوميثيلاتيد، الذي تم التوصل إليه قبل إجراء تعاوني لتعزيز demethylation DNA بالاستثمار الرأسمالي، وقمع حيثياته الحمض النووي مثلايشن التي PD0325901. وعلاوة على ذلك، أظهرت الماوس دإط الخلايا مورفولوجيا كبيرة تحت النظام الرأسمالي/PD0325901 الثقافة.

للحفاظ على أفضل حالة الماوس دإط الخلايا في النظام الرأسمالي/PD0325901 الثقافة، هناك بعض الخطوات الحاسمة. أولاً، تحتاج إلى دفعات FBS يتم فرزهم للعثور على والأسهم دفعات أفضل؛ أيضا، يتم استبدال متكررة من المصل يضر بتكاثر الخلايا والحفاظ على بلوريبوتينسي. ثانيا، تجنب أكثر من الخلايا بيبيتينج خلال الناي مستعمرات الخلايا إلى تعليق خلية واحدة فقط في مرحلة مرور الخلية. ثالثا، للتخفيف من الأثر السلبي التربسين أثناء زراعة الخلية، يجب إزالة التربسين فورا بعد أنه يغطي الخلايا في الأطباق أثناء باساجينج الخلية. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي استبدال المتوسطة الثقافة الرأسمالي/PD0325901 يوميا بسبب عدم الاستقرار في الاستثمار الرأسمالي.

بالمقارنة مع الثقافة الكلاسيكية المصل، وإظهار الماوس دإط الخلايا تحت ظروف Vc/PD0325901 عدد سكان أكثر تجانساً في خلية (الشكل 3، ج) ودولة هيبوميثيلاتيد، الذي يشبه ICM و PGC. وبالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع الثقافة المتقدمة مؤخرا 2 طاء، لدينا أسلوب يمكن أن ندرك هيبوميثيليشن مع حركية أسرع، واستخدام مثبط واحد (PD0325901) يقلل من الكمية [دمس]، وبالتالي تقليل الضرر الذي لحق بخلايا الإدخال. بيد بسبب إضافة FBS في نظامنا الثقافة، قد تسبب تصرفات المتناقض المزدوج FBS تمايز الخلية أثناء ثقافة طويلة الأجل. وعموما، هذا النظام الثقافة رواية مناسبة لصيانة وتوسيع في نطاق واسع من الماوس دإط الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

المؤلفون بالكشف عن لا تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

وأيده هذا العمل الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (21435008 و 21327006 إلى الأب)، وبرنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDB14030200 إلى الأب).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 136، فيتامين ج، PD0325901، الماوس الجذعية الجنينية خلايا الحمض النووي هيبوميثيليشن، Prdm14، بلوريبوتينسي
أسلوب ثقافة بديلة للحفاظ على هيبوميثيليشن الجينية للخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 وفيتامين (ج)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, C., Lai, W., Wang, H. An… More

Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter