Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En alternativ kultur-metod för att bibehålla genomisk hypometylering av mus embryonala stamceller med MEK-hämmare PD0325901 och Vitamin C

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/56391
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

Vi beskrivs i detalj två kemisk-baserat protokoll för odling mus embryonala stamceller. Denna nya metod använder tredjeparts samverkande mekanismer för att främja Tet-medierad oxidation (av C-vitamin) och undertrycka de novo syntesen av 5-metylcytosin (av PD0325901) för att upprätthålla DNA hypometylering och pluripotency mus embryonala stamceller.

Abstract

Embryonala stamceller (ES) har potential att differentieras till någon av de tre groddar skikt (endoderm, mesoderm och ektoderm) och kan generera många härstamningar för regenerativ medicin. ES cell kultur in vitro- har länge varit föremål för omfattande oro. Klassiskt, mus ES celler upprätthålls i serum och leukemi hämmande faktor (LIF)-innehållande medium. Dock villkor som serum/LIF, celler Visa heterogenitet i morfologi och uttryck profilen för pluripotens-relaterade gener, och är oftast i ett metastabilt tillstånd. Dessutom odlade ES-celler uppvisar globala hypermethylation, men naiv ES-celler av inre cellmassan (ICM) och primordiala könsceller (PGCs) är i ett tillstånd av globala hypometylering. Tillståndet hypometylering av ICM och PGCs är nära förknippad med deras pluripotency. För att förbättra mus ES cell kultur metoder, har vi nyligen utvecklat en ny metod baserad på selektivt kombinerade utilizationen av två småmolekylär föreningar att DNA hypometylering och pluripotenta tillståndet. Här presenterar vi som samtidig behandling av C-vitamin (Vc) och PD0325901 kan ta bort ca 90% av 5-metylcytosin (5mC) på 5 dagar på mus ES-celler. Genererade 5mC innehållet är jämförbar med den hos PGCs. Den mekanistiska utredningen visar att PD0325901 upp-reglerar Prdm14 uttryck för att undertrycka Dnmt3b (de novo DNA methyltransferase) och Dnmt3l (kofaktor av Dnmt3b), genom att minska de novo 5mC syntes. VC underlättar konvertering av 5mC till 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) katalyseras huvudsakligen av Tet1 och Tet2, som anger medverkan av både passiva och aktiva DNA demetylering. Mus ES-celler visar dessutom på Vc/PD0325901 villkor, homogen morfologi och pluripotenta stat. Sammantaget föreslår vi en roman och kemiska-synergy kultur metod för att uppnå DNA hypometylering och underhåll av pluripotency i mus ES-celler. Metoden småmolekylär kemikalie-beroende övervinner de stora bristerna i serum kultur och håller löftet att generera homogen ES-celler för ytterligare kliniska tillämpningar och forskningar.

Introduction

ES-celler har sitt ursprung från ICM en blastocyst1. Cellerna i en pluripotency tillstånd och kan bilda alla somatiska härstamningar och könsceller celler2. Inrättandet av ES-celler ger möjlighet att undersöka utvecklingen bearbetar in vitro- och kan generera celler av medicinsk relevans för regenerativ medicin baserat på deras pluripotency3.

Två grupper seminally etablerades mus ES cellinjer 1981 och när celler från det tidiga embryot mus odlades i fostrets bovint serum (FBS)-innehållande medium med mus embryonala fibroblaster (MEFs) som mataren lager1,4 . MEFs var inaktiverat mitotiskt och odlades redan i rätter före odling ES-celler. MEFs ger stöd för mus ES cell fastsättning och producera tillväxtfaktorer för att främja förökning och förtränga den differentiering5, medan FBS erbjuder väsentliga trofiska faktorer och hormoner för cellproliferation. Efterföljande studier indikerade att LIF produceras av mataren celler var den viktigaste cytokin för självförnyelse och underhåll av pluripotency i mus ES-celler, och tillägg av LIF till medium kan ersätta för feeder celler6. För närvarande är sustainment av mus ES-celler i FBS/LIF medium på matare fortfarande den standardmetod som antagits av många forskare. Dock uppstå vissa problem med detta klassisk kultur synsätt. För det första feeder celler utsöndrar överflödigt och okontrollerad faktorer och kan orsaka patogena kontaminering7. Att undvika denna störning, beläggning ytan av rätter med gelatin och tillägg av LIF i serum-innehållande medium finns alternativa metoder för att upprätthålla mus ES celler utan feeder-lager celler. Dessutom uppvisar mus ES-celler som odlas under serum/LIF förhållanden morfologiska heterogenitet i cellpopulationer och även i uttrycket nivån på pluripotency-relaterade faktorer8. Nyligen genomförda studier tyder på att villkor som serum/LIF, de pluripotency-relaterade core transkriptionsfaktorer (inklusive SOX2, Nanog och OCT4) kan upprätthålla pluripotency genom LIF och WNT signalering; men framför allt, aktivera de också en fibroblast tillväxtfaktor (FGF) signal att utlösa differentiering8. På grund av ambivalent dubbla verkan av de core transkriptionsfaktorerna presentera mus ES-celler odlade i serum heterogenitet, bestående av två utbytbara populationer, ett liknande ICM och en annan som liknar den primade epiblast state8. Dessutom uppvisar mus ES celler i serum ofta globala hypermethylation9, ICM och PGCs är i en global hypometylering tillstånd, vilket är nära förbunden med deras pluripotency9,10.

Det finns en betydande efterfrågan att utveckla nya metoder för odling mus ES-celler. Flera förbättrade protokoll har fastställts sedan 200311 men det fortsätter att vara vissa begränsningar och brister7. Sedan 2008 har den kombinera utilizationen av två småmolekylär kinashämmare, PD0325901 (en hämmare av de mitogen-aktiverat proteinkinas (MAPK) / extracellulär signal-reglerade kinase (ERK) (MEK)) och CHIR99021 (en hämmare av glykogen syntetas Kinas 3 (GSK3)), i N2B27 medium med LIF och utan serum har öppnat nya perspektiv för odling mus ES cells12. Detta nya definierade medium kännetecknas av användning av två hämmare (2i). Mus ES-celler odlade i 2i/LIF medium är mer homogena i cellpopulationer och uttryck för pluripotens faktorer. 2i/LIF-odlade mus ES celler uppvisar dessutom DNA hypometylering globalt, vilket är närmare till ICM-liknande celler9,13på. Även så, har 2i kultur sina nackdelar. PD0325901 och CHIR99021 är olösligt i vatten och allmänt löses i dimetyl sulfoxid (DMSO)-baserat stamlösning för att lägga till dem i odlingsmedium. Studier har visat att långsiktiga och låg dos exponering av celler för DMSO kan leda till cytotoxicitet14.

Här, vi utnyttjade två småmolekylär föreningar och utvecklat en ny kultur metod av mus ES-celler. Den nya kultur-metoden kombinerar Vc och MEK-hämmare PD0325901 för att främja DNA hypometylering snabbt och till en jämförbar PGC, benämn effektivt så Vc/PD0325901 culturing protokollet. Mus ES-celler i Vc/PD0325901-lagt serum-innehållande medium uppvisar homogenitet i morfologi och upprätthålls i en grundtillståndet. Jämfört med 2i kultur, mus ES-celler odlade Vc/PD0325901 villkor uppvisar snabbare kinetik av DNA demetylering och kan nå hypometylering nivå jämförbar med PGC. Dessutom, användning av en enda hämmare (PD0325901) minskar den ingående mängden DMSO till medium i jämförelse med som används i 2i (PD0325901/CHIR99021) och minskar skador på celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. förberedelser

  1. Förbereda en lösning av 1,0 mM PD0325901 (MEK-hämmare) och 3,0 mM CHIR99021 (GSK3 hämmare).
    1. Väger 2 mg PD0325901 och lägga till 4,15 mL av DMSO i en bärnstensfärgad glasflaska.
    2. Väger 2 mg CHIR99021 och lägga till 1,43 mL av DMSO i en bärnstensfärgad glasflaska.
    3. Följande beredning, lagra alikvoter (50 µL/rör i 200 µL PCR-rören) vid-20 ° C och skyddas från ljus. Ta bort en tub som innehåller det fryst lagret från en frys och Tina i rumstemperatur före användning.
  2. Väga 0,0176 g Vc i 1 mL av ett centrifugrör och Beredes det med 1 mL sterilt vatten till en slutlig koncentration på 100 mM före användning.
  3. Inaktivera FBS: Inkubera 500 mL FBS i ett vattenbad vid 56 ° C i 30 min.
  4. Förbereda 600 mL Bassubstrat för odling mus ES-celler.
    1. Använd en flaska DMEM/hög glukos medium (500 mL) och ta bort 40 mL.
    2. Tillägg 460 mL DMEM/hög glukos medium med 20% inaktiverat FBS (120 mL), 1 000 U/mL LIF (60 µL av 107 U/mL stamlösning), 0,1 mM icke-essentiella aminosyror (NEAA) (6 mL stamlösning av 10 mM), 1 mM natrium pyruvat (6 mL 100 mM stamlösning) , 2 mM L-glutamin (6 mL 200 mM stamlösning), 0,1 mM β-merkaptoetanol (600 µL av 100 mM stamlösning), och 33 IE/mL penicillin och 33 µg/mL streptomycin (2 mL av penicillin-streptomycin blandad lösning (10 000 IE/mL penicillin och 10 000 µg/mL streptomycin)) . Definiera bassubstratet som serum medium.
    3. Överför med pipett 50 μl av stamlösning av PD0325901 (1,0 mM) och Vc (100 mM), respektive i 50 mL serum medium (slutlig koncentration: 1,0 µM PD0325901 och 100 µM Vc), och definiera mediet som Vc/PD0325901 medium.
      Obs: Förbereda Vc/PD0325901 medelstora färska före användning på grund av instabiliteten i Vc.
    4. Med pipett över 50 µL av stamlösning av PD0325901 (1,0 mM) och CHIR99021 (3,0 mM), respektive i 50 mL serum medium (slutlig koncentration: PD0325901 1,0 µM och CHIR99021 3,0 µM), och definiera mediet som 2i medium.
  5. Förbered rätterna som gelatin-belagd.
    1. Förbereda 0,1% gelatin lösningen: Lös 0.3 g gelatin i 300 mL ultrarent vatten i en reagens glasflaska med en mössa och sterilisera i autoklav vid 121 ° C i 20 min. Store den steril lösningen vid rumstemperatur.
    2. Inkubera cell kultur rätter (6 cm diameter) med 2 mL 0,1% gelatin i 15 min i rumstemperatur och sug sedan upp gelatinet. Torka rätterna i luften och använder dem inom 12 h.
  6. Förbereda 10 mL mus ES cell frysning medium i en 15 mL centrifugrör: 90% FBS (9 mL) och 10% DMSO (1 mL). Använd mediet inom 1 dag.
  7. Förbereda en frysning behållare: lägga till 100% isopropylalkohol maxstrecket behållaren frysning och kassera den gamla isopropylalkohol. Lägga till nya isopropylalkohol direkt efter var femte användning.
  8. Gör enzymatisk nedbrytning bufferten: väga 1.2114 g Tris pulver i 100 mL ultrarent vatten att förbereda 100 mM Tris lösning och tillsätt koncentrerad HCl-lösning (ca 12 M) i Tris lösning för justering av pH 7,6 (ca 0,6 mL koncentrerad HCl-lösning).
  9. Förbereda 50 mL analysbuffert för radio immunoprecipitation (RIPA buffert): 20 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 20% glycerol, 0,5% NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. Komplettera med 1 mM DTT, 1 X proteashämmare cocktail och 1 mM PMSF före användning. När PMSF läggs, använda bufferten inom 30 min.

2. växa mus ES-celler på Gelatin-belagd rätter

  1. Pre varma mus ES celler (vildtyp, 129 SvEv) kultur medium, trypsin och fosfatbuffrad lösning (PBS) i vattenbad vid 37 ° C.
  2. Passagen cellerna. Aspirera på medellång helt från skålen och pipett 2 mL PBS rätter att skölj cellerna.
    1. Ta bort PBS med en pipett och tvätta cellerna igen med 2 mL PBS.
    2. Ta bort PBS och lägga till 0,3 mL av trypsin-EDTA (0,25%) i varje maträtt.
    3. Täcka hela skålen med trypsin snabbt och sedan ta bort det omedelbart.
    4. Placera skålen i en inkubator vid 37 ° C i 1 min att lossa cellerna från skålen. Ta ut rätterna från inkubatorn och tillsätt 2 mL av pre värmde serum medium att avsluta åtgärden av trypsin.
    5. Separera cell kolonierna till en enda cellsuspension av omblandning med en pipett (5 mL pipettspetsen) 10 gånger.
  3. Över 150 µL av 2 mL cell lösning (cirka 190 000 celler genom att räkna med en hemocytometer) in i en ny maträtt som gelatin-belagda och komplettera med 3 mL av nygjorda Vc/PD0325901 medium per 6 cm kultur maträtt. Odla cellerna i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
  4. Varje 24 h medan ruvning, ta bort det gamla odlingsmediet och tillsätt 3 mL för färska Vc/PD0325901-medium i kultur skålen på grund av instabiliteten i Vc. förvänta 70 – 80% konfluens efter 2 – 3 dagar.
  5. Efter att nå 70-80% konfluens, passage cellerna och fortsätta att kultur dem som beskrivs i steg 2.2 – 2.4.

3. frysa och Tina mus ES-celler

  1. Frysa mus ES-celler.
    1. Lossa cellerna från rätter med trypsin genom att följa steg 2.2.
    2. Överföra cellerna i en 15 mL plaströr och centrifugera vid 800 x g och rumstemperatur under 3 minuter.
    3. Dumpa supernatanten försiktigt i en bägare och resuspendera cellpelleten med 1 mL nygjorda frysning medium. Förbereda den frysning medium 30 min innan detta steg att se till att det är rumstemperatur före användning.
    4. Överföra cellerna i frysning medium till en 1,8 mL mikrocentrifug rör med 1 mL pipett och placera mikrocentrifug röret i en frysning behållare. Lägga till isopropylalkohol maxstrecket behållaren frysning och förvara det i rumstemperatur innan du använder.
    5. Lämna frysning behållarna över natten i-80 ° C frys.
    6. Överföra mikrocentrifugrör till en behållare för flytande kväve i upp till 2 – 3 år.
      Obs: Gör inte hålla celler i frysning medium för en lång tid och snabbt överföra cellerna till-80 ° C frys på grund av toxiciteten av DMSO.
  2. Tina mus ES-celler.
    1. Pre varm 50 mL serum medium i 37 ° C vattenbad.
    2. Ta ut en cell som innehåller injektionsflaskan från behållaren med flytande kväve och fördjupa utjämnade injektionsflaskan i 37 ° C vattenbad. Skaka den snabbt i vattenbadet Tina. Överföra cellerna i en 15 mL rör med 1 mL pipett. Tillsätt 2 mL av pre värmde serum odlingsmedium i röret till späd frysning mediet och sedan Centrifugera vid 800 x g och rumstemperatur i 3 min.
    3. Avlägsna supernatanten och återsuspendera försiktigt cell pellets med 3 mL av färska Vc/PD0325901 medium med 5 mL pipett.
    4. Överföra cellerna från 15 mL röret till en gelatin-belagd maträtt och odla cellerna för 24 h. kultur cellerna igen enligt beskrivningen i steg 2.

4. extrahera totalt Protein från celler

  1. Skölj de insamlade cellerna med 1 mL PBS och sedan Centrifugera vid 800 x g och rumstemperatur i 3 min.
  2. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten noggrant med RIPA bufferten kompletteras med DTT, proteashämmare cocktail och PMSF genom att försiktigt med. Volymen av RIPA bufferten är ca 5 x som cellens pellet.
    Obs: Genomföra cell resuspension på is.
  3. Hålla cellerna i RIPA bufferten för 30 min på is och centrifugera vid 13 000 x g och 4 ° C i 5 min.
  4. Överför supernatanten till en ny tub och lagra alikvoter vid-80 ° C.
  5. Bestämma koncentrationen av protein med en Bradford protein assay kit.

5. extrahera DNA från celler och Digest DNA till en enda nukleosid med enzymer

  1. Samla in cellerna med trypsin som beskrivs i steg 3.1.1 och 3.1.2.
  2. Utföra den DNA-extraktionen med en genomisk DNA rening kit följa tillverkarens instruktioner.
  3. Lagra den extraherat DNA i 1 mL centrifugrör. Tillsätt 100 µL av ultrarent vatten i centrifugröret och upplösa DNA vid pipettering cirka 15 gånger. Bestämma koncentrationen och utvärdera kvaliteten av DNA genom mätning av absorbansen vid 260 nm och 280 nm15. Den DNA-koncentrationen är ca 500 ng/µL.
  4. Digest 5 µg av DNA i en 50 µL lösning system: Tillsätt 5 µL 100 mM Tris-HCl-lösning, pH 7,6 (slutlig koncentration: 10 mM), 2 U kalv intestinal fosfatas, 1 U DNAS I, 0,005 U snake venom fosfodiesteras jag och 5 µg av DNA (beräkna den extra volymen enligt kolva röd DNA-koncentration, ~ 10 µL) in i ett centrifugrör och öka volymen av lösning till 50 µL med ultrarent vatten. Inkubera vid 37 ° C blandningen över natten. Centrifugera smält DNA lösningen på 1000 g och rumstemperatur i 1 min att samla in lösningen till botten av rören.
  5. Överför smält DNA lösningen från Centrifugera rören till ultra-filtrering rör (en molekyl vikt cutoff: 3 kDa) och centrifugera vid 13.000 g och 4 ° C i 30 min ta bort matsmältning enzymer.
  6. Bereda proverna för 5mC och 5hmC analys.
    1. För 5hmC analys: Pipettera 36 µL filterlösning till en ny centrifug tube (1 mL) och tillsätt 4 µL 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5hmC) med den slutliga koncentrationen av 3 nM.
    2. För 5mC analys: Tillsätt 196 µL ultrarent vatten i en ny centrifugrör och Pipettera 4 µL av filterlösning till röret (50-faldig utspädning), på grund av den höga tätheten av 5mC i genomisk DNA. Överföra 36 µL av den utspädda lösningen till ett nytt centrifugrör och tillsätt 4 µL (5'-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5mC) med en slutlig koncentration på 50 nM. Använd [D3]-5hmC och [D3]-5mC som intern standard att kalibrera 5hmC och 5mC, respektive.
  7. Överföra provlösningen till mäta rören och förvaras vid 4 ° C. Analysera 5mC och 5hmC med extremt högpresterande liquid chromatography-trippel quadrupole masspektrometri med flera-reaktionsövervakning (UHPLC-MS/MS (MRM)) som beskrivs i en tidigare rapport15.

6. analysera 5mC och 5hmC använder UHPLC-MS/MS15

  1. Ställa in olika parametrar för att analysera 5mC och 5hmC med programvaran UHPLC-MS.
    1. Upprätta en ny metod. Öppna programmet och klicka på ”fil | Nya | Metoden ”. Uppvisar meddelanderutan av ”Method Editor” med innehåll ”vill du spara ändringarna för den nuvarande metoden” och klicka på ”Nej”.
    2. Bygga parametrarna för provtagaren. Klicka på ”Sampler | Setup | Injektion ”. Välja ”Standard injektion” och mata in ”5 µL vid injektionsvolym”.
    3. Bygga parametrarna för pumpen i UHPLC.
      1. Klicka på ”BinPump2 | Setup ”för att bygga parametrarna för pumpen. Ställa in ”flöde” vid ”0,25 mL/min” och ”stopptid” på ”15 min”.
      2. Ställ in ”lösningsmedel B på 5%” och ”pressa gränser” på ”Max 600 bar”.
      3. Klicka på ”BinPump2 | Tidtabell ”att bygga Isokratisk eluering parametrar för 5mC analys. Klicka på ”Lägg till” för att lägga till en rad. Mata in ”0.00” på ”tid” och ”5,0” vid ”B %”. Klicka på ”Lägg till” en gång till för att lägga till en ny rad. Mata in ”15.00” på ”tid” och ”5,0” vid ”B %”.
      4. Klicka på ”BinPump2 | Tidtabell ”att bygga parametrarna lutning eluering för 5hmC analys. Klicka på ”Append för att lägga till en rad. Ingång 0,00 på tid och 5.0 ”B %”. Klicka på ”Lägg till” en gång till för att lägga till en ny rad. Mata in ”3.00” på ”tid” och ”5,0” vid ”B %”. Klicka på ”Lägg till” för en annan 6 gånger för att lägga till 6 rader. Mata in ”3.01” på ”Time” och ”15,0” vid ”B %”, ”6,00” på ”Time” och ”15,0” vid ”B %”, ”6.01” på ”Time” och ”100” på ”B %”, ”10.00” på ”Time” och ”100,0” vid ”B %”, ”10,01” på ”Time” och ”5,0” vid ”B %”, ”15.00” på ”tid” och ”5,0” vid ”B %” i sekvens.
        Obs: Utföra analys av 5mC och 5hmC individuellt på grund av olika separationsbetingeiserna av UHPLC.
    4. Bygga parametrarna för temperaturen i kolumnen facket (TCC) i UHPLC.
      Klicka på ”TCC | Setup | temperatur (vänster) ”och ange” 30 ° C ”.
    5. Fastställa parametrarna för QQQ-MS/MS.
      1. Klicka på ”MS QQQ | Stoppa tiden | Ingen gräns/som pump ””, Ion källa | ESI ””, tid filtrering | Toppens bredd: 0,07 min ”. Ställ in ”tid segment: starttid: 0”; ”Skanningstyp: MRM”; ”Div värde: till MS”; ”Delta EMV (+): 200” och ”Delta EMV (-): 0”.
      2. Bygga parametrarna för övervakning övergångar av 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC och D3-5hmC
        1. Klicka på ”MS QQQ | Förvärv | Scan segment: Dwell: 90 ”; ”Fragmentor: 90”; ”Kollision energi: 5”; ”Cell Accelerator spänning: 4” och ”polaritet: positiv”.
        2. Mata in ”5mC” på ”sammansatta namn”, ”242” på ”föregångare Ion”, ”126” på ”produkt Ion” för 5mC analys. Klicka på knappen till höger och välj ”Lägg till rad” att lägga till en ny rad. Ingång ”D3-5mC” på ”sammansatta namn”, ”245” på ”föregångare Ion”, ”129” på ”produkt Ion” för D3-5mC analys.
        3. Komplettera en annan tre rader med samma läge. Ingång ”dC” på ”sammansatta namn”, ”228” på ”föregångare Ion”, ”112” på ”produkt Ion” för dC analys. Mata in ”5hmC” på ”sammansatta namn”, ”258” på ”föregångare Ion”, ”142” på ”produkt Ion” för 5hmC analys. Ingång D3-5hmC på sammansatta namn, ”261” på ”föregångare Ion”, ”145” på ”produkt Ion” för D3-5hmC analys.
      3. Bygga parametrarna för källan gas. Klicka på ”MS QQQ | Källa | Källa parametrar: gastemp: 300 ° C ”; ”Gas flöde: 11 L/min”; ”Nebulisatorn: 15 psi”; ”Positivt-kapillär: 3500 V”.
      4. Spara den föreslagna metoden. Klicka på ”MS QQQ | Instrument | Spara metod som ”. Välj en väg för den föreslagna metoden av ”katalogen” och ge ett namn för metoden genom att ange innehållet i ”metod”, till exempel: 5mC och 5hmC analys.
  2. UHPLC separation och MS/MS-analys av mononucleosides
    1. Förbereda den mobila fasen för 5mC och cytosin (C) analys: bilda den mobila fasen av lösning A och B. lösning A: 500 mL ultrarent vatten med 500 µL av myrsyra (slutlig koncentration: 0,1%), och lösning B: 500 mL 100% metanol. Blanda lösningen A och B på 95:5 (v: v) som den mobila fasen att eluera 5mC och C (anges i steg 6.1.3.3). Ställa in flödet på 0,25 mL/min (anges i steg 6.1.3.1).
    2. Förbereda den mobila fasen av lösningsmedel A och B för 5hmC analys. Lösningsmedel är 2,0 mM NH4HCO3 aqueous lösning (pH 9,0) (500 mL), och lösningsmedel B är 100% metanol (500 mL). Separat 5hmC genom en optimerad toning eluering: 0-3 min, 5.0% B och 95% A (v: v); 3-6 min, 15,0% B och 85% A; 6-10 min, 100% B; 10-15 min, 5.0% B och 95% ett (set i steg 6.1.3.4). Ställa in flödet på 0,25 mL/min (anges i steg 6.1.3.1).
  3. Utnyttja elektrospray MS/MS med MRM-läge (anges i steg 6.1.5.1) för att analysera elueringen från kolumnen och anta den positiva jonen läge (anges i steg 6.1.5.2.1).
    1. Övervaka övergångar: 5mC, m/z 242→126 (kollision energi, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV); dC, m/z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (set i steg 6.1.5.2.2).
    2. Kapillär och fragment spänningar på +3,500 V (anges i steg 6.1.5.3) och 90 V (i steg 6.1.5.2.1), respektive.
    3. Injektionsvolymen på 5 µL och analysera varje prov 3 gånger (anges i steg 6.1.2). Anställa de motsvarande standard kurvorna att utvärdera mängden 5mC och 5hmC.
      1. Upprätta standardkurvan för 5mC: överföra 1 – 50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, slutlig koncentration) standardlösning av 5mC i centrifug rör och tillsätt 50 nM [D3]-5mC rör. Tillägg den totala volymen till 50 µL. utföra analysen av standard 5mC följa instruktionerna för det 5mC provet (steg 6).
      2. Bygga standardkurvan för 5hmC: överföra 1 – 20 nM (1, 2, 5, 10, 20 nM, slutlig koncentration) standardlösning av 5hmC att Centrifugera rören och Lägg till 3 nM [D3]-5hmC till rören. Tillägg den totala volymen till 50 µL. utföra analysen av standard 5hmC följa instruktionerna för det 5hmC provet (steg 6).

7. analysera den statistisk signifikansen

  1. Utföra den statistiska analysen med hjälp av programvara.
    1. Öppna programmet och välj ”kolumn” i ”ny tabell & graf”. Ställa in parametrar som följer ”: exempeldata | Börja med en tom tabell ”; ”Välj en graf-det första läget”; ”Graphing replikat eller felstaplar | Rita | Menar med SEM ”.
    2. Klicka på ”skapa” för att mata in de tre replikat av kontroll och Vc/PD0325901-behandlade gruppen i raden ”A” och ”B”, respektive. Välj de sex data och klicka på ”analysera” i ”analysen”.
    3. Välj ”t tester (och icke-parametriska tester)” i ”kolumn analyser” och klicka ”OK” för att ange nästa gränssnittet.
    4. Ställa in parametrar som följer ”: Välj test | Test namn | Oparat t -test; Alternativ | Tvåsidiga ”; ”Konfidensintervall: 95%”; ”Signifikanta siffror | Visa 4 signifikanta siffror ”. Klicka på ”OK” för att förvärva p värde mellan kontroll och Vc/PD0325901 behandling.
  2. Utvärdera den statistisk signifikansen mellan kontrollen och de experimentella grupper som sysselsätter den tvåsidiga och oparade Students t-test16.
    Obs: p < 0,05 betecknar skillnaden som har statistisk signifikans. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

VC/PD0325901 inducerad synergistiskt globala radering av mus ES-celler. Mus ES-celler i serum uppvisar DNA hypermethylation, medan pluripotenta ICM celler och PGCs visar globala radering av DNA-metylering och hypometylering staten är nära förknippad med deras pluripotency9,10.

Tidigare har hittade vi och andra att Vc kan förstärka Tet-medierad 5mC demetylering15,17. Under tiden, 2i konstaterades också för att hämma de novo syntesen av 5mC. I samband med dessa fynd föreslog vi ytterligare synergistisk manipulering av mus ES-celler använder Vc och 2i tillsammans. Efter analysen av UHPLC-MS/MS fann vi att Vc och 2i kompletteras i serum-innehållande medium kan dramatiskt minska 5mC innehållet från 3,2 till 0,33 per 100 C (~ 90% 5mC förlust) av dag 11 i mus ES celler (figur 1A). Däremot orsakat Vc eller enbart 2i-behandling endast 58% radering med stadig nivå på 1,4% 5mC eller 61% minskning i nivå med 1,3% 5mC.

2i medlet består av MEK hämmare PD0325901 och GSK3β-hämmare CHIR99021. Nästa, vi undersöker vilken komponent inducerar den globala förlusten av 5mC under samtidig behandling av Vc och 2i. Vc/PD0325901 intressant, och orsakade en snabbare nedgång i nivåer av DNA metylering än Vc/2i. VC/PD0325901 uppnådde steady 5mC nivåer (~0.33% 5mC) efter 5 dagar, medan Vc/2i nått en jämförbar nivå på dag 11. Tillägg av CHIR99021 undertryckt däremot delvis Vc-utlöst DNA demetylering (figur 1A). Dessa data tyder klart på att PD0325901 i 2i bidrar till den globala hypometylering av genomisk DNA i mus ES-celler, medan CHIR99021 av 2i delvis hämmar raderingen av 5mC. Därför spekulera vi att den snabbare DNA demetylering induceras av Vc/PD0325901 i förhållande till Vc/2i kan hänföras till partiell hämning av CHIR99021 på demetylering.

Vi hade en hypotes att den globala raderingen av 5mC i mus ES-celler som induceras av Vc/PD0325901 kan vara delvis relevant att förstärkningen av DNA demetylering. Därför undersökte vi genomisk oxidationsprodukter av 5mC. Det har rapporterats att 5mC kan konverteras till 5hmC genom katalytisk oxidation av Tet familj dioxygenases, som är beroende av Fe (II) och 2-oxoglutarate18,19. Genomisk 5hmC kan spädas med DNA-replikering20. Dessutom 5hmC ytterligare kan oxideras av Tet dioxygenases att producera 5-formylcytosine (5fC) och 5-carboxylcytosine (5caC), som kan vara effektivt censurerade av tymin DNA glykosylas (TDG) för att återställa unmethylated cytosin, vilket indikerar en aktiv DNA demetylering21,22.

I linje med tidigare arbete15, Vc-innehållande behandling (Vc, Vc/2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021) ökat dramatiskt 5hmC frekvens (5hmC/106 C) efter 1 dag, och därefter 5hmC nivåer minskat gradvis (figur 1B) beror på den gradvis minskning av 5mC substrat. Särskilt, visade Vc/PD0325901 och Vc/2i snabbare kinetik av 5hmC förlust jämfört med Vc och Vc/CHIR99021 på grund av den snabbare minskningen av 5mC. Dessutom observerade vi också att Vc-behandling på dag 1, stimuleras mer generation av 5hmC jämfört med Vc/CHIR99021, som anger att CHIR99021 delvis undertryckta Vc-inducerad produktionen av 5hmC och hämmade DNA demetylering. 5hmC förlust i 2i behandling bör hänföras till minskningen av 5mC substrat. Sammantaget visade resultaten att Vc-förbättrade DNA demetylering verksamhet delvis bidragit till den synergistiskt hypometylering samtidig behandling av Vc/PD0325901 och Vc/2i.

Båda Hermansson m.fl. 23 och von Meyenn o.a. 24 rapporterade också att musen ES-celler 2i villkor visade global DNA hypometylering och naiv pluripotency. 5mC nivåer visade minska gradvis och når steady-state (~ 1% 5mC) 12 – 14 dagar efter återgången från serum till 2i. I Vc/PD0325901 kultur systemet, samtidig behandling orsakade snabbare DNA demetylering och nått en stabil nivå (0,33% 5mC) efter tillskott av Vc/PD0325901 i serum medium för 5 dagar, på grund av den synergistiska effekten av Vc/PD0325901. Den nådda metylerade nivån (0,33% 5mC) var pronouncedly lägre än 2i villkor som Hoffman et al. rapporterat och von Meyenn et al., medan 5hmC nivåerna var högre på grund av den främja generationen av Vc.

PD0325901 förhöjd Prdm14 uttryck för att förtränga Dnmt3b och Dnmt3l, men inte Dnmt3a25. För att undersöka effekten av PD0325901 för att framkalla 5mC förlust, en serie av 5mC-relaterade proteinuttryck undersöktes, inklusive underhåll (Dnmt1) och de novo (Dnmt3a, och Dnmt3b) DNA-metyltransferaser och sin kofaktor (Uhrf1 och Dnmt3l) och förordning protein (Prdm14) 8,9,26. Efter Western blot analys upphöjdes pronouncedly Prdm14 i PD0325901-inklusive kultur (figur 2). Däremot visade Dnmt3b och dess kofaktor Dnmt3l betydande down-förordning av proteinuttryck i PD0325901-inklusive behandling (figur 2). CHIR99021 behandling visade ingen eller liten effekt på nivån av Prdm14, Dnmt3b och Dnmt3l. Uttrycket av Dnmt3awas förändrades inte och orsaken är oklar. Dessutom det underhåll DNA methyltransferase Dnmt1 och dess inriktning faktor Uhrf1 också visade ingen förändring och data visades inte.

Nyligen genomförda studier har visat att Prdm14 kan rekrytera polycomb repressiva complex 2 (PRC2) till vissa gene initiativtagare att förtrycka deras uttryck, såsom de novo DNA-metyltransferaser (Dnmt3a och Dnmt3b) och sin kofaktor (Dnmt3l), och bidrar till att upprätthålla hypometylering enligt 2i villkor8,27. Våra data visade att PD0325901 förhöjda nivån uttryck av Prdm14 hämma Dnmt3b och Dnmt3l och minskat de novo genomisk 5mC syntes av mekanismen.

Om du vill utforska pluripotency underhåll av mus ES celler Vc/PD0325901 villkor, mRNA-uttrycksnivåerna för flera core pluripotency-länkade faktorer undersöktes, och dessa faktorer har bekräftats för att spela avgörande roller i pluripotency28. Realtids PCR-analys fann att Oct4, SOX2, Esrrb och Sall4 visade enhetligt uttryck nivåer genom 5 dagars behandling med Vc/PD0325901 i motsats till serum kultur (figur 3A). Nanog och Tcf3 ökade 1,3 gånger och 1,6 gånger, respektive. Däremot Klf4 visade 42% down-förordning och Rex1 endast minskade med cirka 12%. Dessa resultat tyder på att samtidig behandling med Vc/PD0325901 inducerad olika förändringar i uttryck för pluripotens faktorer; dock höll Oct4 och SOX2, de flesta faktorer som kärna, nästan konstant nivåer av uttryck.

Nästa, ett alkaliskt fosfatas (AP)-test utfördes för att bedöma om musen ES celler var i en odifferentierad eller differentierade tillstånd. Foton av celler (figur 3B och 3 C) erhölls från en kamera ansluten till en inverterade Mikroskop med 10-faldig amplifiering av en objektiv. Efter kontinuerlig odling på 26 dagar i Vc/PD0325901-lagt serum medium visade mus ES-celler homogen morfologi. Dessutom nästan alla celler var målat lila-svart och ställde ut en boll-liknande tillstånd utan utväxt (figur 3 c), visar en odifferentierad stat. Villkor som serum, var däremot en del av mus ES-celler på dag 26 lila-svart efter färgning och hade en boll-liknande tillstånd i morfologi, medan andra presenteras ljus färg med outspreading märkta med vita streckade oval linjer (figur 3B); Detta visade att serum-odlade mus ES cellerna heterogena i morfologi och en pluripotenta stat, vilket överensstämmer med tidigare rapporter13. Data stöds kollektivt, att PD0325901 i kombination med Vc kan upprätthålla utmärkt morfologi och en odifferentierad stat i mus ES-celler.

Figure 1
Figur 1: Vc/PD0325901 inducerad synergistiskt globala radering av genomisk 5mCin mus ES celler. (A) 5mC frekvens (5mC/C) och (B) 5hmC frekvens (5hmC/C) tid-beroende förändring under en 26-dagars behandling av en kontinuerlig tillägg med Vc, 2i, Vc/2i, Vc/PD0325901 eller Vc/CHIR99021 i serum-innehållande medium. Felstapel visar standardavvikelsen (SD) från tre upprepade analyser av UHPLC-MS/MS. C: cytosin. Denna siffra har ändrats från Li et al. 25. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Protein uttryck förändring av Prdm14 och DNA-metyltransferaser (Dnmt3a, Dnmt3b och Dnmt3l). De presenteras banden (från vänster till höger) erhölls genom en 5 dagars-behandling av serum kultur (kontroll), Vc, PD0325901, CHIR99021, 2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021 och Vc/2i, respektive. Uttrycket av Prdm 14 var uppreglerat och Dnmt3b och Dnmt3l minskade efter PD0325901-inklusive kultur. Dnmt3a uppvisade ingen förändring. Β-tubulin angavs som interna referensen. CON: Kontroll; PD: PD0325901; CH: CHIR99021. Denna siffra har ändrats från Li et al. 25. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Vc/PD0325901-inducerad ändring i mRNA-uttryck av pluripotenta gener och i aktiviteten av alkalisk fosfatas. (A) mRNA nivå av partiell pluripotenta gener har ändrats genom en 5 dagars behandling av Vc/PD0325901 i förhållande till serum villkor (kontroll). Data var representerade som menar ± SD. Den statistiska signifikansen utvärderades och p < 0,05 var statistiskt signifikant. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 och ns representerade obetydlig. PD: PD0325901. Mus ES-celler i serum för 26 dagar (B) uppvisade delvis utväxt markerad med vita streckade oval linjer, medan Vc/PD0325901-lagt serum medium underhålls bra morfologi och en odifferentierad stat (C). Dessa bilder har förvärvats från en inverterade mikroskopet ansluten med en kamera i fältet ljusa. Denna siffra har ändrats från Li et al. 25. skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I arbetet visat vi en ny metod för att kombinera Vc och PD0325901 för att upprätthålla mus ES celler på en odifferentierad och hypometylering stat, som uppnåddes genom en samverkande åtgärder för att främja DNA demetylering av Vc och undertrycka de novo DNA metylering av PD0325901. Dessutom visade mus ES-celler fantastiska morfologi under systemets Vc/PD0325901 kultur.

För att bättre upprätthålla tillståndet av mus ES-celler i Vc/PD0325901 kultur systemet, finns det några viktiga steg. För det första, FBS partier behöver vara pre-screening att hitta och lagerför de bästa satserna; frekvent byte av serum är också skadar cellproliferation och underhåll av pluripotenta. För det andra, undvika över pipettering celler under den separera av cell kolonierna till en enda cellsuspension i cell passage scenen. För det tredje, för att dämpa de negativa effekterna av trypsin under cell odlingen, trypsin bör avlägsnas omedelbart efter det täcker cellerna i rätterna under cell passaging. Dessutom bör Vc/PD0325901 odlingsmediet bytas dagligen på grund av instabiliteten i Vc.

I jämförelse med den klassiska serum kulturen visar mus ES-celler Vc/PD0325901 villkor en mer homogen cell befolkningen (figur 3B, C) och en hypometylering stat, som liknar ICM och PGC. Dessutom jämfört med den nyligen utvecklade 2i kulturen, vår metod kan förverkliga hypometylering med snabbare kinetik, och utnyttjandet av en enda hämmare (PD0325901) minskar ingående mängden DMSO, vilket minskar skador på celler. Dock på grund av tillägg av FBS i vår kultur system, kan FBS ambivalent dubbla agerande orsaka celldifferentiering under långtidsodling. Sammantaget är denna roman kultur-systemet lämpligt för underhåll och utbyggnad i stor skala av mus ES-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna avslöja inga potentiella intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete fick stöd av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (21435008 och 21327006 att H.W.) och prioriterade strategiska forskningsprogrammet i kinesiska Academy of Sciences (XDB14030200 att H.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).

Tags

Biokemi fråga 136 Vitamin C PD0325901 mus embryonala stamceller DNA hypometylering Prdm14 pluripotens
En alternativ kultur-metod för att bibehålla genomisk hypometylering av mus embryonala stamceller med MEK-hämmare PD0325901 och Vitamin C
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, C., Lai, W., Wang, H. An… More

Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter