Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En alternativ kultur metode til at opretholde genomisk Hypomethylation af mus embryonale stamceller ved hjælp af MEK hæmmer PD0325901 og C-Vitamin

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/56391
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

Vi beskrev i detaljer to kemiske-baserede protokoller for dyrkning mus embryonale stamceller. Denne nye metode udnytter synergistisk mekanismer til at fremme Tet-medierede oxidation (af C-vitamin) og undertrykke de novo syntesen af 5-methylcytosine (af PD0325901) for at opretholde DNA hypomethylation og pluripotency mus embryonale stamceller.

Abstract

Embryonale stamceller (ES) har potentiale til at differentiere i nogen af de tre Kim lag (endoderm, mesoderm eller ectoderm), og kan generere mange lineages for regenerativ medicin. ES celle kultur i vitro har længe været genstand for udbredt bekymring. Klassisk, mus ES celler bevares i serum og leukæmi hæmmende faktor (LIF)-indeholdende medium. Dog under serum/LIF betingelser, celler Vis heterogenitet i morfologi og profilen udtryk pluripotency-relaterede gener, og er for det meste i en metastabile tilstand. Desuden kulturperler ES-celler udstille globale hypermethylation, men naiv ES cellerne i den indre cellemasse (ICM) og primordiale kønsceller (PGCs) er i en tilstand af globale hypomethylation. Tilstanden hypomethylated af ICM og PGCs er tæt forbundet med deres pluripotency. For at forbedre mus ES celle kultur metoder, har vi for nylig udviklet en ny metode baseret på selektivt kombineret udnyttelse af to små-molekyle forbindelser til at opretholde den DNA hypomethylated og pluripotente tilstand. Her præsenterer vi at fælles behandling af C-vitamin (Vc) og PD0325901 kan slette omkring 90% af 5-methylcytosine (5mC) på 5 dage i mus ES-celler. Genererede 5mC indhold kan sammenlignes i PGCer. Den mekanistiske undersøgelse viser, at PD0325901 op-regulerer Prdm14 udtryk for at undertrykke Dnmt3b (de novo DNA methyltransferase) og Dnmt3l (cofaktor for Dnmt3b), ved at reducere de novo 5mC syntese. VC letter konvertering af 5mC til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) katalyseret hovedsagelig af Tet1 og Tet2, der angiver inddragelse af både passive og aktive DNA demethylations. Desuden under Vc/PD0325901 betingelser Vis mus ES celler homogene morfologi og pluripotente stat. Kollektivt, foreslår vi en roman og kemisk-synergy kultur metode til at opnå DNA hypomethylation og vedligeholdelse af pluripotency i mus ES celler. Små-molekyle kemisk-dependent metode overvinder serum kultur og holder løfte om at generere homogene ES-celler for yderligere kliniske applikationer og forsker store mangler.

Introduction

ES-celler stammede fra ICM af en blastocyst1. Cellerne er i tilstanden pluripotency og kan danne alle somatiske lineages og kønscelleoverførsel celler2. Oprettelsen af ES-celler giver mulighed for at undersøge udviklingen processer in vitro- og kan generere celler af medicinsk relevans for regenerativ medicin baseret på deres pluripotency3.

To grupper Ecrd etablerede cellelinier mus ES i 1981 og når celler, der stammer fra den tidlige mus Foster var kulturperler i føtal bovint serum (FBS)-indeholdende medium med musen embryonale fibroblaster (MEFs) som feeder lag1,4 . MEFs var inaktiveret mitotically og blev præ dyrket i retter inden dyrkning af ES-celler. MEFs yder støtte til musen ES celle attachment og producere vækstfaktorer for at fremme udbredelse og undertrykke differentiering5, mens FBS tilbyder væsentlige trofiske faktorer og hormoner for celledelingen. Efterfølgende undersøgelser viste, at LIF produceret af feeder celler var den centrale cytokin til selvfornyelse og vedligeholdelse af pluripotency i mus ES-celler og tilsætning af LIF i medium kunne erstatte feeder celler6. I øjeblikket, er opretholdelse af musen ES-celler i FBS/LIF medium på foderautomater stadig standard metode vedtaget af mange forskere. Imidlertid opstår nogle problemer med denne klassiske kultur tilgang. For det første feeder celler udskiller overskydende og ukontrolleret faktorer og kan forårsage sygdomsfremkaldende forurening7. At undgå denne indblanding, belægning overfladen af retter med gelatine og tilsætning af LIF i serum, der indeholder mediet er alternative metoder til at opretholde mus ES celler uden feeder-lag celler. Derudover udviser mus ES celler dyrkes serum/LIF betingelser morfologiske heterogenitet i cellepopulationer og endda i niveauet udtryk pluripotency-relaterede faktorer8. Nylige undersøgelser tyder på, at serum/LIF betingelser pluripotency-relaterede core transskriptionsfaktorer (herunder SOX2, Nanog og OCT4) kan opretholde pluripotency gennem LIF og WNT signalering; dog især aktivere de også en fibroblast vækstfaktor (FGF) signal til at udløse differentiering8. På grund af den ambivalent dual action af transkriptionsfaktorer core præsentere mus ES celler dyrkes i serum heterogenitet, bestående af to udskiftelige populationer, en lignende til ICM og en anden der ligner PRIMES epiblast stat8. Derudover mus ES celler i serum udviser ofte en global hypermethylation9, ICM og PGCs er i en global hypomethylated stat, som er tæt forbundet med deres pluripotency9,10.

Der er en betydelig efterspørgsel til at udvikle nye metoder til dyrkning mus ES celler. Flere forbedrede protokoller har været etableret siden 200311 men der fortsat er visse begrænsninger og mangler7. Siden 2008, den kombinerede udnyttelse af to små-molekyle kinase hæmmere, PD0325901 (hæmmer af mitogen-aktiveret protein kinase (MAPK) / ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK) (MEK)) og CHIR99021 (hæmmer af glykogen syntase kinase 3 (GSK3)), i N2B27 medium med LIF og uden serum har åbnet nye perspektiver for dyrkningsbaserede mus ES-celler12. Denne nye definerede medium er karakteriseret ved brugen af to hæmmere (2i). Musen ES celler dyrkes i 2i/LIF medium er mere homogen cellepopulationer og udtryk pluripotency faktorer. 2i/LIF-kulturperler mus ES celler udviser desuden DNA hypomethylation globalt, som er tættere på ICM-lignende celler9,13. Selv så, har 2i kultur sine ulemper. PD0325901 og CHIR99021 er uopløseligt i vand, og generelt er opløst i dimethylsulfoxid (DMSO)-baserede stock løsning for at tilføje dem i dyrkningsmediet. Undersøgelser har vist, at langvarig og lavdosis udsættelse af celler for DMSO kan føre til cytotoksicitet14.

Her, vi udnyttede to små-molekyle forbindelser og udviklet en ny kultur metode af musen ES celler. Roman kultur metoden kombinerer Vc og MEK hæmmer PD0325901 for at fremme DNA hypomethylation hurtigt og til en sammenlignelig PGC, benævnt effektivt nemlig Vc/PD0325901 dyrkningsbaserede protokol. Musen ES-celler i Vc/PD0325901-tilføjet serum-holdige medium udstille homogenitet i morfologi og er påført i en grundtilstand. I forhold til 2i kultur, mus ES celler kulturperler Vc/PD0325901 betingelser udviser hurtigere kinetik af DNA demetylering og kan nå det hypomethylation niveau sammenlignes med PGC. Desuden brug af en enkelt hæmmer (PD0325901) nedsætter input mængden af DMSO i medium i forhold til, bruges i 2i (PD0325901/CHIR99021) og reducerer skader på celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. præparater

  1. Forberede en opløsning af 1.0 mM PD0325901 (MEK hæmmer) og 3,0 mM CHIR99021 (GSK3-hæmmer).
    1. 2 mg af PD0325901 afvejes og tilføje 4,15 mL af DMSO i en rav hætteglasset.
    2. 2 mg af CHIR99021 afvejes og tilføje 1,43 mL af DMSO i en rav hætteglasset.
    3. Følgende rekonstitution, gemme delprøver (50 µL/rør i 200 µL PCR rør) ved-20 ° C og beskyttet mod lys. Fjerne et rør, der indeholder den frosne lager fra en fryser og tø ved stuetemperatur før anvendelse.
  2. 0.0176 g af Vc i 1 mL af et centrifugeglas og rekonstruere det med 1 mL sterilt vand til en endelig koncentration på 100 mM før brug.
  3. Inaktivere FBS: Inkuber 500 mL FBS i vandbad på 56 ° C i 30 min.
  4. Forberede 600 mL af grundlæggende medium til dyrkning mus ES celler.
    1. Bruge en flaske DMEM/høj glukose middel (500 mL) og fjerne 40 mL.
    2. Supplement 460 mL af DMEM/høj glukose middel med 20% inaktiveret FBS (120 mL), 1.000 U/mL LIF (60 µL af 107 U/mL stamopløsning), 0.1 mM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA) (6 mL af 10 mM stamopløsning), 1 mM natrium pyruvat (6 mL af 100 mM stamopløsning) , 2 mM L-glutamin (6 mL af 200 mM stamopløsning), 0.1 mM β-mercaptoethanol (600 µL af 100 mM stamopløsning), og 33 IU/mL penicillin og 33 µg/mL streptomycin (2 mL af penicillin-streptomycin blandet løsning (10.000 IU/mL penicillin og 10.000 µg/mL streptomycin)) . Definere den grundlæggende medie som serum medium.
    3. Tilsæt 50 µL af stamopløsningen af PD0325901 (1.0 mM) og Vc (100 mM), henholdsvis i 50 mL serum medium (endelig koncentration: 1,0 µM PD0325901 og 100 µM Vc), og definere mediet som Vc/PD0325901 medium.
      Bemærk: Forberede Vc/PD0325901 medium frisk før brug på grund af ustabilitet i Vc.
    4. Ved hjælp af en pipette overføres 50 µL af stamopløsningen af PD0325901 (1.0 mM) og CHIR99021 (3,0 mM), henholdsvis i 50 mL serum medium (endelig koncentration: PD0325901 1,0 µM og CHIR99021 3,0 µM), og definere mediet som 2i medium.
  5. Forberede de gelatine-belagt retter.
    1. Forberede 0,1% gelatine løsning: 0,3 g gelatine opløses i 300 mL i ultrarent vand i et glas reagensflaske med en hætte og steriliseres i en autoklave ved 121 ° C til 20 min. butik den steril opløsning ved stuetemperatur.
    2. Inkuber celle kultur retter (6 cm diameter) med 2 mL af 0,1% gelatine løsning i 15 min. ved stuetemperatur og derefter Aspirér gelatine. Tør retter i luften og bruge dem i 12 timer.
  6. Forberede 10 mL af musen ES celle frysning medium i en 15 mL centrifugeglas: 90% FBS (9 mL) og 10% DMSO (1 mL). Bruge mellemlang inden for 1 døgn.
  7. Forberede en indefrysning container: tilføje 100% isopropylalkohol til linjen fyld i objektbeholderen frysning, og kassér den gamle isopropylalkohol. Tilføje nye isopropylalkohol direkte efter hver femte brug.
  8. Gøre den enzymatiske fordøjelse buffer: vejer 1.2114 g af Tris pulver i 100 mL i ultrarent vand til at forberede 100 mM Tris løsning og tilføje koncentreret HCl løsning (ca. 12 M) i Tris løsning til at justere pH-værdien til 7,6 (ca. 0,6 mL koncentreret HCl-opløsning).
  9. Forberede 50 mL af radio immunoprecipitation analysebuffer (RIPA buffer): 20 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 20% glycerol, 0,5% NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. Supplere med 1 mM DTT, 1 X protease hæmmer cocktail og 1 mM PMSF før brug. Når PMSF er tilføjet, skal du bruge buffer inden for 30 min.

2. vokse mus ES-celler på gelatine-belagt retter

  1. Pre varm mus ES celler (vildtype, 129 SvEv) kultur medium, trypsin og fosfatbufferet løsning (PBS) i vandbad ved 37 ° C.
  2. Passage af celler. Opsug mellemlang helt fra parabol og afpipetteres 2 mL PBS retter at skylle cellerne.
    1. Fjern PBS med en pipette, og cellerne vaskes igen med 2 mL PBS.
    2. Fjerne PBS og tilsættes 0,3 mL trypsin-EDTA (0,25%) til hver tallerken.
    3. Dæk hele fadet med trypsin hurtigt og derefter fjerne det straks.
    4. Sæt fadet i en inkubator ved 37 ° C i 1 min Adskil celler fra fadet. Tegne retter fra rugemaskinen, og der tilsættes 2 mL pre varmede serum medium til at ophæve virkningen af trypsin.
    5. Adskille celle kolonier i en enkelt cellesuspension af resuspending med en pipette (5 mL pipette tip) 10 gange.
  3. Overføre 150 µL af 2 mL af celle (omkring 190.000 celler ved at tælle med en hemocytometer) til en ny gelatine-belagte fad, og supplere med 3 mL af frisklavet Vc/PD0325901 medium pr. 6 cm kultur parabol. Kultur cellerne i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2.
  4. Hver 24 timer mens inkubere, fjerne den gamle næringssubstrat og Tilføj 3 mL frisk Vc/PD0325901-medium i kultur skålen på grund af ustabilitet i Vc. Forvent 70 – 80% confluency efter 2-3 dage.
  5. Efter at nå 70-80% confluency, passage cellerne og fortsætte til kultur dem som beskrevet i trin 2.2-2.4.

3. fryse og tø mus ES-celler

  1. Fryse mus ES celler.
    1. Frigør cellerne fra retter med trypsin ved følge trin 2.2.
    2. Overføre cellerne i en 15 mL plastik rør og centrifugeres ved 800 x g og stuetemperatur i 3 min.
    3. Dumpe supernatanten forsigtigt i et bægerglas og resuspenderes celle med 1 mL frisklavet indefrysning medium. Forberede den indefrysning medium 30 min før dette skridt til at sikre, at det er stuetemperatur før anvendelse.
    4. Overfør celler i frysning medium til et 1,8 mL microcentrifuge rør med 1 mL pipette og microcentrifuge røret anbringes i en indefrysning beholder. Tilføje isopropylalkohol til linjen fyld i objektbeholderen frysning og opbevare det ved stuetemperatur før brug.
    5. Lad frysning containerne natten over i en-80 ° C fryser.
    6. Overføre microcentrifuge rør til en flydende kvælstof beholder i op til 2-3 år.
      Bemærk: Ikke holde celler i indefrysning mellemlang til lang tid og hurtigt overføre cellerne til en-80 ° C fryser på grund af toksicitet af DMSO.
  2. Tø mus ES celler.
    1. Pre varm 50 mL serum medium i et 37 ° C vandbad.
    2. Tag en celle, der indeholder hætteglas fra objektbeholderen flydende kvælstof og fordybe udjævnede hætteglasset i et 37 ° C vandbad. Ryst den hurtigt i vandbad til at tø. Overføre cellerne ind i en 15 mL rør med 1 mL pipette. Der tilsættes 2 mL af pre varmede serum næringssubstratet ind i røret til fortyndes indefrysning mellemlang og derefter centrifugeres ved 800 x g og stuetemperatur i 3 min.
    3. Fjern supernatanten og forsigtigt resuspend celle pellets med 3 mL frisk Vc/PD0325901 medium ved hjælp af 5 mL pipette.
    4. Overføre cellerne fra 15 mL tube til en gelatine-belagte fad og kultur celler for 24 h. kultur cellerne igen som beskrevet i trin 2.

4. Uddrag Total Protein fra celler

  1. Skyl de indsamlede celler med 1 mL PBS og derefter centrifugeres ved 800 x g og stuetemperatur i 3 min.
  2. Opsug supernatanten og resuspenderes celle grundigt med RIPA buffer suppleret med DTT, protease hæmmer cocktail og PMSF af pipettering forsigtigt. Mængden af RIPA buffer er ca. 5 x, at af cellen pellet.
    Bemærk: Udføre celle ophvirvling på is.
  3. Holde cellerne i RIPA buffer i 30 min på is og centrifugeres ved 13.000 x g og 4 ° C i 5 min.
  4. Overføre supernatanten til en ny tube og gemme alikvoter ved-80 ° C.
  5. Bestemme koncentrationen af protein med en Bradford protein assay kit.

5. Uddrag DNA af celler og fordøje DNA i en enkelt Nucleoside ved hjælp af enzymer

  1. Indsamle cellerne med trypsin, som beskrevet i trin 3.1.1 og 3.1.2.
  2. Udføre DNA-ekstraktion med en genomisk DNA rensning kit efter fabrikantens anvisninger.
  3. Gemme den udpakkede DNA i 1 mL centrifugeglas. Tilsæt 100 µL ultrarent vand i centrifugeglasset, og opløse DNA af pipettering ca 15 gange. Bestemme koncentrationen og evaluere kvaliteten af DNA ved måling af absorbans ved 260 nm og 280 nm15. DNA-koncentrationen er omkring 500 ng/µL.
  4. Digest 5 µg af DNA i en 50 µL løsning system: Tilsæt 5 µL af 100 mM Tris-HCl løsning, pH 7,6 (endelig koncentration: 10 mM), 2 U kalv intestinal fosfatase, 1 U DNase jeg, 0.005 U snake venom phosphodiesterase jeg, og 5 µg af DNA (Beregn den ekstra volumen efter measu rød DNA koncentration, ~ 10 µL) i et centrifugeglas og øge mængden af løsning til 50 µL med ultrarent vand. Inkuber blanding ved 37 ° C natten over. Der centrifugeres fordøjet DNA løsningen på 1.000 g og stuetemperatur i 1 minut til at indsamle løsningen til bunden af rør.
  5. Oploesningen fordøjet DNA fra centrifugeglas til ultra-filtrering rør (et molekyle vægt cutoff: 3 kDa), og der centrifugeres på 13.000 g og 4 ° C i 30 min til at fjerne fordøjelse-enzymer.
  6. Forberede prøverne til 5mC og 5hmC analyse.
    1. For 5hmC analyse: afpipetteres 36 µL af filter løsning til en ny centrifuge tube (1 mL) og tilføje 4 µL af 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5hmC) med den endelige koncentration af 3 nM.
    2. For 5mC analyse: tilføje 196 µL ultrarent vand i en nye centrifugerør og afpipetteres 4 µL af filter løsning til tube (50-fold fortynding), på grund af den høje tæthed af 5mC i genomisk DNA. Overføre 36 µL af de fortyndede opløsning til en nye centrifugerør og tilføje 4 µL (5'-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5mC) med den endelige koncentration af 50 nM. Brug [D3]-5hmC og [D3]-5mC som intern standard at kalibrere 5hmC og 5mC, henholdsvis.
  7. Overføre prøveopløsningen måling rør og opbevares ved 4 ° C. Analysere 5mC og 5hmC med ultra-high-performance liquid chromatography-triple Quadrupol massespektrometri med flere-reaktion overvågning (UHPLC-MS/MS (MRM)) som beskrevet i en tidligere betænkning15.

6. analysere 5mC og 5hmC ved hjælp af UHPLC-MS/MS15

  1. Angiv forskellige parametre til at analysere 5mC og 5hmC ved hjælp af UHPLC-MS software.
    1. Etablere en ny metode. Åbn softwaren og klik på "fil | Nye | Metode". Udstille meddelelsesboksen af "Metodeeditor" med indhold "Vil du gemme ændringer i den aktuelle metode" og klik "Nej".
    2. Bygge parametrene for sampler. Klik på "Sampler | Setup | Injektion". Vælg "Standard injektion" og input "5 µL på Injektionsvolumen".
    3. Bygge parametrene for pumpen i UHPLC.
      1. Klik på "BinPump2 | Setup"for at opbygge parametrene af pumpen. Oprette "Flow" på "0,25 mL/min" og "Stop tiden" "15 min.".
      2. Oprette "Opløsningsmiddel B på 5%" og "Pres grænser" på "Maks 600 bar".
      3. Klik på "BinPump2 | Tidsplan"til at bygge isocratic eluering parametre for 5mC analyse. Klik på "Tilføj" for at tilføje en række. Input "0,00" på "Time" og "5.0" "B %". Klik på "Tilføj" igen for at føje en ny række. Input "15,00" på "Time" og "5.0" "B %".
      4. Klik på "BinPump2 | Tidsplan"at bygge gradient eluering parametre for 5hmC analyse. Klik på "Tilføj for at tilføje en række. Input 0,00 på tid og 5.0 "B %". Klik på "Tilføj" igen for at føje en ny række. Input "3,00" på "Time" og "5.0" "B %". Klik på "Tilføj" for en anden 6 gange for at tilføje 6 rækker. Input "3,01" på "Time" og "15,0" "B %", "6,00" på "Time" og "15,0" "B %", "6.01" på "Time" og "100" "B %", "10.00" på "Time" og "100,0" "B %", "10.01" på "Time" og "5.0" "B %", "15,00" på "Time" og "5.0" "B %" i rækkefølge.
        Bemærk: Udføre analyse af 5mC og 5hmC individuelt på grund af de forskellige adskillelse betingelser af UHPLC.
    4. Bygge parametrene for temperatur kolonne rum (TCC) i UHPLC.
      Klik på "TCC | Setup | temperatur (venstre) "og input"30 ° C".
    5. Fastsætte parametrene for Souschef-MS/MS.
      1. Klik på "MS Souschef | Stop tid | Ingen grænse/som pumpe"," Ion kilde | ESI"," tid filtrering | Topbredden: 0,07 min ". Oprette "tid segmenter: starttidspunkt: 0"; "Skan Type: MRM"; "Div værdi: at MS"; "Delta EMV (+): 200" og "Delta EMV (-): 0".
      2. Bygge parametrene for overvågning overgange af 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC og D3-5hmC
        1. Klik på "MS Souschef | Køb | Skan segmenter: bo: 90"; "Fragmentor: 90"; "Kollisionen energi: 5"; "Celle Accelerator spænding: 4" og "polaritet: positiv".
        2. Input "5mC" på "Sammensatte navn", "242" på "Forløber Ion", "126" på "Produkt Ion" for 5mC analyse. Klik på den højre knap og vælg "Tilføj række" til at føje en ny række. Input "D3-5mC" på "Sammensatte navn", "245" på "Forløber Ion", "129" på "Produkt Ion" for D3-5mC analyse.
        3. Supplere en anden tre rækker ved hjælp af den samme tilstand. Input "dC" på "Sammensatte navn", "228" på "Forløber Ion", "112" på "Produkt Ion" for dC analyse. Input "5hmC" på "Sammensatte navn", "258" på "Forløber Ion", "142" på "Produkt Ion" for 5hmC analyse. Indgang D3-5hmC på sammensatte navn, "261" på "Forløber Ion", "145" på "Produkt Ion" for D3-5hmC analyse.
      3. Bygge parametrene for gas kilden. Klik på "MS Souschef | Kilde | Kilde parametre: Gas Temp: 300 ° C "; "Gas Flow: 11 L/min"; "Forstøver: 15 psi"; "Positivt-kapillær: 3500 V".
      4. Gem den foreslåede metode. Klik på "MS Souschef | Instrument | Gemme metode som". Vælg en vej for den foreslåede metode af "Directory" og give et navn til metoden ved at indtaste indhold i "Metoden", for eksempel: 5mC og 5hmC analyse.
  2. UHPLC adskillelse og MS/MS analyse af mononucleosides
    1. Forberede den mobile fase for 5mC og cytosin (C) analyse: danner den mobile fase af opløsning A og B. løsning A: 500 mL i ultrarent vand med 500 µL af myresyre (endelig koncentration: 0,1%), og løsningen B: 500 mL 100% methanol. Bland løsning A og B på 95:5 (v: v) som den mobile fase at eluere 5mC og C (angivet i trin 6.1.3.3). Indstille strømningshastighed på 0,25 mL/min. (angivet i trin 6.1.3.1).
    2. Forberede den mobile fase af opløsningsmiddel A og B for 5hmC analyse. Opløsningsmiddel A er 2,0 mM NH4HCO3 vandig opløsning (pH 9,0) (500 mL), og opløsningsmiddel B er 100% methanol (500 mL). Separat 5hmC af en optimeret gradient eluering: 0-3 min, 5.0% B og 95% A (v: v); 3-6 min, 15,0% B og 85% A; 6-10 min, 100% B; 10-15 min, 5.0% B og 95% A (angivet i trin 6.1.3.4). Indstille strømningshastighed på 0,25 mL/min. (angivet i trin 6.1.3.1).
  3. Udnytte electrospray MS/MS med MRM tilstand (angivet i trin 6.1.5.1) for at analysere eluering fra kolonnen og vedtage den positive ion mode (angivet i trin 6.1.5.2.1).
    1. Overvåge overgangene: 5mC, m/z 242→126 (kollisionen energi, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV); dC, m/z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (sæt i trin 6.1.5.2.2).
    2. Angivet kapillær og fragment spændinger på +3,500 V (angivet i trin 6.1.5.3) og 90 V (angivet i trin 6.1.5.2.1), henholdsvis.
    3. Angiv Injektionsvolumen på 5 µL og analysere hver prøve 3 gange (angivet i trin 6.1.2). Ansætte de tilsvarende standard kurver til at vurdere mængden af 5mC og 5hmC.
      1. Etablere standard kurven for 5mC: overføre 1 – 50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, endelige koncentration) standard opløsning af 5mC i centrifuge rør og tilføje 50 nM [D3]-5mC-rør. Supplere den samlede volumen til 50 µL. udføre analyse af standard 5mC følge vejledningen for at 5mC prøven (trin 6).
      2. Opbygge 5hmC standardkurven: overføre 1-20 nM (1, 2, 5, 10, 20 nM, endelige koncentration) standardopløsning af 5hmC centrifugeres rør og tilføje 3 nM [D3]-5hmC til rør. Supplere den samlede volumen til 50 µL. udføre analyse af standard 5hmC følge vejledningen for at 5hmC prøven (trin 6).

7. analysere den statistiske signifikans

  1. Udføre de statistiske analyser ved hjælp af software.
    1. Åbn softwaren, og vælg "Kolonne" i "ny tabel & graf". Indstille parametre som følger: "demodata | Start med en tom datatabel"; "Vælg en graf-den første tilstand"; "Graftegning replikater eller fejllinjer | Plot | Mener med SEM".
    2. Klik på "Opret" for at input de tre replikater af kontrol og Vc/PD0325901-behandlede gruppe i linjen "A" og "B", henholdsvis. Vælg seks data og klikke på "Analyze" i "Analyse".
    3. Vælg"t test (og ikke-parametrisk test)" i "Kolonne analyser" og klik "OK" for at indtaste den næste grænseflade.
    4. Indstille parametre som følger: "Vælg test | Test navn | Uparret t -test. Indstillingerne | To-sidet"; "Konfidensintervaller: 95%"; "Betydende cifre | Vis 4 betydende cifre". Klik på "OK" for at erhverve p -værdi mellem kontrol og Vc/PD0325901 behandling.
  2. Evaluere den statistiske signifikans mellem kontrol og de eksperimentelle grupper beskæftiger to-sidet og uparret Student's t-test16.
    Bemærk: p < 0,05 angiver forskellen besidder Statistisk signifikans. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

VC/PD0325901 induceret synergistisk globale sletning af musen ES-celler. Musen ES-celler i serum udviser DNA hypermethylation, mens pluripotente ICM celler og PGCs vise global sletning af DNA methylering og hypomethylated staten er tæt forbundet med deres pluripotency9,10.

Tidligere, vi og andre konstateret, at Vc kan forbedre Tet-medieret 5mC demetylering15,17. I mellemtiden, 2i blev også fundet for at hæmme de novo syntesen af 5mC. I forbindelse med disse resultater foreslog vi yderligere synergistiske manipulation af musen ES-celler ved hjælp af Vc og 2i sammen. Efter analyse af UHPLC-MS/MS fandt vi, at Vc og 2i suppleret i serum, der indeholder mediet kan dramatisk reducere 5mC indhold fra 3,2 til 0,33 per 100 C (~ 90% 5mC tab) af dag 11 i mus ES celler (figur 1A). Derimod forårsaget Vc eller 2i-behandling alene kun 58% sletning med den konstant niveau på 1,4% 5mC eller 61% reduktion på niveauet af 1,3% 5mC.

2i medium er sammensat af MEK hæmmer PD0325901 og GSK3β hæmmer CHIR99021. Næste, vi undersøge hvilke komponent inducerer den globale tab af 5mC under fælles behandling af Vc og 2i. Interessant, forårsaget Vc/PD0325901 et hurtigere fald i niveauet af DNA methylering end Vc/2i. VC/PD0325901 opnåede stabil 5mC niveauer (~0.33% 5mC) efter 5 dage, mens Vc/2i nås et sammenligneligt niveau på dag 11. Derimod undertrykt supplement af CHIR99021 dels Vc-udløst DNA demetylering (figur 1A). Disse data tyder klart på, at PD0325901 i 2i bidrager til den globale hypomethylation af genomisk DNA i mus ES celler, mens CHIR99021 af 2i delvist hæmmer sletning af 5mC. Derfor, vi spekulere at den hurtigere DNA demetylering induceret af Vc/PD0325901 i forhold til Vc/2i kan tilskrives den delvis hæmning af CHIR99021 på demetylering.

Vi antager, at den globale sletning af 5mC i mus ES celler induceret af Vc/PD0325901 kan være delvist relevant til en forbedring af DNA demetylering. Derfor undersøgte vi genomisk oxidation produkter af 5mC. Det er blevet rapporteret, at 5mC kan blive konverteret til 5hmC ved katalytisk oxidation af Tet familie dioxygenases, som er afhængige af Fe (II) og 2-oxoglutarate18,19. Genomisk 5hmC kan fortyndes ved DNA replikation20. Derudover 5hmC kan yderligere oxideres af Tet dioxygenases at producere 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC), som kan være effektivt skåret ud af thymin DNA glycosylase (TDG) at inddrive unmethylated cytosin, der angiver en aktiv DNA demetylering21,22.

I overensstemmelse med tidligere arbejdet15, Vc-holdige behandling (Vc, Vc/2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021) steget dramatisk 5hmC frekvens (5hmC/106 C) efter 1 dag, og derefter 5hmC niveauer faldt gradvist (figur 1B) skyldes den gradvis reduktion i 5mC substrat. Navnlig, viste Vc/PD0325901 og Vc/2i hurtigere kinetik af 5hmC tab i forhold til Vc og Vc/CHIR99021 på grund af den hurtigere reduktion af 5mC. Desuden bemærkede vi også, at Vc-behandling på dag 1, stimuleret mere generation af 5hmC sammenlignet med Vc/CHIR99021, der angiver, CHIR99021 dels undertrykt Vc-induceret produktion af 5hmC og hæmmet DNA demetylering. 5hmC tab i 2i behandling bør tilskrives faldet i 5mC substrat. Taget sammen, disse resultater viste, at Vc-forbedret DNA demetylering aktivitet dels bidraget til den synergistisk hypomethylation Co behandling af Vc/PD0325901 og Vc/2i.

Begge Henriksen et al. 23 og von Meyenn et al. 24 rapporterede også, at musen ES celler 2i betingelser viste globale DNA hypomethylation og naive pluripotency. 5mC niveauer viste falde gradvis og nåede et steady state (~ 1% 5mC) på 12-14 dage efter tilbagevenden fra serum til 2i. I Vc/PD0325901 kultur system, den kombinerede behandling forårsaget hurtigere DNA demetylering og nået et stabilt niveau (0,33% 5mC) efter tilskud af Vc/PD0325901 i serum medium for 5 dage, på grund af de synergiske virkninger af Vc/PD0325901. Den nåede methylerede niveau (0,33% 5mC) var pronouncedly lavere end 2i betingelser rapporteret af Henriksen et al. og von Meyenn et al., mens 5hmC niveauer blev højere på grund af de promoverede generation af Vc.

PD0325901 forhøjet Prdm14 udtryk for at undertrykke Dnmt3b og Dnmt3l, men ikke Dnmt3a25. For at undersøge virkningen af PD0325901 i overtalelse 5mC tab, en serie af 5mC-relaterede proteiner udtryk blev undersøgt, herunder vedligeholdelse (Dnmt1) og de novo (Dnmt3a og Dnmt3b) DNA methyltransferases og deres cofaktor (Uhrf1 og Dnmt3l) og forordning protein (Prdm14) 8,9,26. Efter vestlige skamplet analyse, blev Prdm14 pronouncedly forhøjet i PD0325901-herunder kultur (figur 2). Derimod viste Dnmt3b og dets cofaktor Dnmt3l betydelige ned-regulering af protein udtryk i PD0325901-herunder behandling (figur 2). CHIR99021 behandling viste ingen eller lille effekt på niveauet af Prdm14, Dnmt3b og Dnmt3l. Udtryk for Dnmt3awas ændre ikke, og årsagen er uklar. Derudover vedligeholdelse DNA methyltransferase Dnmt1 og dens målretning faktor Uhrf1 også viste ingen ændring og dataene blev ikke vist.

Nylige undersøgelser har vist, at Prdm14 kan rekruttere polycomb repressive komplekse 2 (PRC2) til nogle gen projektledere til at undertrykke deres udtryk, som de novo DNA methyltransferases (Dnmt3a og Dnmt3b) og deres cofaktor (Dnmt3l), og bidrager til opretholde hypomethylation under 2i betingelser8,27. Vores data viste, at PD0325901 forhøjede udtryk niveauet af Prdm14 at hæmme Dnmt3b og Dnmt3l og reduceret de novo genomisk 5mC syntese af mekanismen.

For at udforske pluripotency vedligeholdelse af musen ES celler under Vc/PD0325901 betingelser, mRNA udtryk niveauer af flere core pluripotency-linked faktorer blev undersøgt, og disse faktorer er blevet bekræftet til at spille en afgørende rolle i pluripotency28. Real-time PCR analyse fandt, at Oct4, SOX2, Esrrb og Sall4 viste ensartet udtryk niveauer gennem 5 dage efter behandling med Vc/PD0325901 i modsætning til serum kultur (figur 3A). Nanog og Tcf3, øget 1.3-fold og 1.6-fold, henholdsvis. Derimod Klf4 viste 42% ned-regulering og Rex1 kun faldt med omkring 12%. Disse resultater tyder på, at Vc/PD0325901 Co behandling induceret forskellige ændringer i udtryk pluripotency faktorer; men Oct4 og SOX2, de mest centrale faktorer, holdt næsten konstant niveauer af udtryk.

Næste, en alkalisk fosfatase (AP) analyse blev udført for at vurdere, om musen ES celler var i en udifferentieret eller differentieret tilstand. Billeder af celler (figur 3B og 3 C) blev indhentet fra et kamera tilsluttet en inverteret mikroskop med 10-fold forstærkning af en mål linse. Efter kontinuerlig dyrkning af 26 dage i Vc/PD0325901-tilføjet serum medium, mus ES-celler viste homogene morfologi. Desuden, næsten alle celler blev farves lilla-sort og udstillet en bold-lignende tilstand uden udvækst (fig. 3 c), viser en udifferentieret stat. Derimod på serum betingelser, en del af musen ES-celler på dag 26 blev lilla-sort efter farvning og havde en bold-lignende tilstand i morfologi, mens andre præsenteret lys farve med outspreading præget af hvide stiplede oval linjer (figur 3B); Dette antydede, at serum-kulturperler mus ES-celler heterogene i morfologi og i pluripotente, som er i overensstemmelse med tidligere rapporter13. Kollektivt, understøttes dataene, der, at PD0325901 i kombination med Vc kan opretholde fremragende morfologi og en udifferentieret stat i mus ES-celler.

Figure 1
Figur 1: Vc/PD0325901 synergistisk induceret globale sletning af genomisk 5mCin mus ES celler. (A) 5mC frekvens (5mC/C) og (B) 5hmC frekvens (5hmC/C) tid-afhængige ændring under en 26-dages behandling af en kontinuerlig supplement med Vc, 2i, Vc/2i, Vc/PD0325901 eller Vc/CHIR99021 i serum-holdige medium. Fejllinje viser standardafvigelse (SD) fra tre gentagne analyser af UHPLC-MS/MS. C: cytosin. Dette tal er blevet ændret fra Li et al. 25. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Protein udtryk ændring af Prdm14 og DNA methyltransferases (Dnmt3a, Dnmt3b og Dnmt3l). De præsenterede bands (fra venstre til højre) blev opnået gennem en 5 dages-behandling af serum kultur (kontrol), Vc, PD0325901, CHIR99021, 2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021 og Vc/2i, henholdsvis. Udtryk for Prdm 14 var op-regulerede og Dnmt3b og Dnmt3l faldt efter PD0325901-herunder kultur. Dnmt3a udstillet ingen ændring. Β-tubulin blev sat som intern reference. Con: Kontrol; PD: PD0325901; CH: CHIR99021. Dette tal er blevet ændret fra Li et al. 25. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Vc/PD0325901-induceret ændring i mRNA udtryk for pluripotente gener og i aktiviteten af basisk fosfatase. (A) mRNA niveau af delvis pluripotente gener blev ændret gennem en 5 dages behandling af Vc/PD0325901 i forhold til serum betingelser (kontrol). Data blev repræsenteret som betyder ± SD. Den statistiske signifikans blev evalueret og p < 0,05 var statistisk signifikant. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 og ns repræsenterede ikke-væsentlig. PD: PD0325901. Musen ES-celler i serum i 26 dage (B) udstillet delvis udvækst kendetegnet ved hvide stiplede oval linjer, mens Vc/PD0325901-tilføjet serum medium vedligeholdes stor morfologi og en udifferentieret stat (C). Disse billeder blev erhvervet fra en inverteret mikroskop forbundet med et kamera i den lyse felt. Dette tal er blevet ændret fra Li et al. 25. skala barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I arbejdet viste vi en roman metode kombinerer Vc og PD0325901 for at opretholde mus ES celler på en udifferentierede og hypomethylated tilstand, som blev opnået ved en synergistiske virkning af at fremme DNA demetylering af Vc og undertrykke de novo DNA methylering af PD0325901. Derudover mus ES celler viste stor morfologi under Vc/PD0325901 kultur system.

For at opretholde bedre tilstand af musen ES celler i Vc/PD0325901 kultur system, er der nogle afgørende skridt. For det første, FBS partier skal være præ-screenet til at finde og lagerføre de bedste partier; hyppig udskiftning af serum er også skadelig celleproliferation og for opretholdelsen af pluripotency. For det andet, undgå over pipettering celler under fællesinstansen for celle kolonier til en enkelt cellesuspension i celle passage Stadium. For det tredje, for at dæmpe den negative virkning af trypsin under celle dyrkning, trypsin bør være fjernet umiddelbart efter, at det dækker cellerne i retterne under celle passaging. Derudover skal Vc/PD0325901 næringssubstratet erstattes dagligt på grund af ustabilitet i Vc.

I forhold til den klassiske serum kultur viser mus ES-celler under Vc/PD0325901 betingelser en mere homogen celle population (figur 3B, C) og en hypomethylated tilstand, som ligner ICM og PGC. Derudover sammenlignet med den nyligt udviklede 2i kultur, vores metode kan realisere hypomethylation med hurtigere kinetik, og udnyttelsen af en enkelt hæmmer (PD0325901) reducerer input mængden af DMSO, dermed reducere skader på cellerne. Men som følge af tilsætning af FBS i vores kultur system, FBS ambivalent dual handlinger kan forårsage Celledifferentiering under langtidskulturer. Samlet set er denne roman kultur system velegnet til vedligeholdelse og udvidelse i stor skala af musen ES-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne afslører ingen potentielle interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (21435008 og 21327006 til H.W.), og den strategiske prioritet Research Program af den kinesiske Academy of Sciences (XDB14030200 til H.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).

Tags

Biokemi sag 136 C-Vitamin PD0325901 mus embryonale stamceller-celler DNA hypomethylation Prdm14 pluripotency
En alternativ kultur metode til at opretholde genomisk Hypomethylation af mus embryonale stamceller ved hjælp af MEK hæmmer PD0325901 og C-Vitamin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, C., Lai, W., Wang, H. An… More

Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter