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Biochemistry

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/56391
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.

Abstract

배아 줄기 (ES) 세포 (endoderm, mesoderm, 또는 ectoderm), 3 개의 세균 층의 구분을 하 고 재생 의학에 대 한 많은 계보를 생성할 수 있습니다. ES 세포 문화에서 체 외에 는 오랫동안 광범위 한 관심사의 주제. 마우스 ES 세포 혈 청 및 백혈병 금지 요인 (LIF)에서 유지 관리 하는 고전적인,-포함 하는 매체. 그러나, 혈 청/LIF 조건 하에서 세포 형태학 및 pluripotency 관련 유전자의 식 프로 파일에서이 표시 하 고 준 상태에서 주로. 또한, 교양된 ES 세포 전시 글로벌 hypermethylation 하지만 순진한 ES 세포는 안 세포 질량 (ICM) 및 원시 생식 세포 (PGCs)의 글로벌 hypomethylation의 상태에 있습니다. ICM과 PGCs의 hypomethylated 상태 그들의 pluripotency와 밀접 하 게 연결 됩니다. 마우스 ES 세포 문화 방법 개선, 최근 DNA hypomethylated 만능 상태를 유지 하기 위해 두 개의 작은 분자 화합물의 선택적으로 결합 된 사용률을 기반 하는 새로운 방법을 개발 했습니다. 여기, 우리는 비타민 C (Vc)의 공동 치료를 제시 하 고 PD0325901 마우스 ES 세포에서 5 일에 5-methylcytosine (5mC)의 약 90%를 지울 수 있습니다. 생성 된 5mC 콘텐츠는 PGCs에 비교. 기계 조사 보여준다는 PD0325901 최대-조절 억제 Dnmt3b Prdm14 식 (de novo DNA methyltransferase) 및 Dnmt3l (Dnmt3b의 공동 인자), 드 노 보 5mC 합성을 감소 시켜. Vc는 모두 수동 및 활성 DNA demethylations의 참여를 나타내는 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) Tet1 및 Tet2에 의해 주로 촉매 변환 용이. 또한, Vc/PD0325901 조건에서 마우스 ES 세포 균질 형태학 및 만능 상태를 표시합니다. 샨 다, 우리 소설과 화학 시너지 문화 DNA hypomethylation 및 마우스 ES 세포의 pluripotency의 유지 보수를 달성 하기 위한 방법을 제안 합니다. 작은 분자 화학 종속 메서드 혈 청 문화, 그리고 균질 ES 세포 연구에 대 한 추가 임상 응용 프로그램 생성을 보유 약속의 주요 단점을 극복 했다.

Introduction

ES 세포 blastocyst1의 ICM에서 기인 된다. 셀은 pluripotency 상태에 있고 모든 계보 체세포와 생식 세포2형성할 수 있다. ES 세포의 설립 기회 개발 조사를 생체 외에서 처리 하 고 그들의 pluripotency3에 기반 하는 재생 의학에 대 한 의료 관련의 세포를 생성할 수 있습니다 제공 합니다.

두 그룹은 seminally 1981 년에 마우스 ES 세포 라인을 설립 하 고 소 태아 혈 청 (FBS)에 셀 초기 마우스 배아에서 파생 했다 경작 하는 때-급지대 레이어1,4로 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)와 매체를 포함 하 . MEFs mitotically 비활성화 했다 고 미리 이전에 ES 세포를 배양 접시에 성장 했다. MEFs는 마우스 ES 셀 첨부 파일에 대 한 지원을 제공 하 고 전파를 홍보 하 여 필수적인 영양 요소와 세포 증식에 대 한 호르몬을 제공 하는 FBS 차별화5억 누르다 성장 인자를 생산. 후속 연구 LIF 피더 세포에 의해 생성 했다 자기 갱신 및 마우스 ES 세포의 pluripotency의 유지 보수에 대 한 주요 cytokine 매체에 LIF의 추가 피더 세포6에 대 한 대체할 수 있는 표시. 현재, 지류에 FBS/LIF 매체에 마우스 ES 세포의 주 아직도 많은 연구자에 의해 채택 된 표준 방법입니다. 그러나,이 고아 한 문화 접근 몇 가지 문제가 발생합니다. 첫째, 피더 세포 분 비 과잉 통제 요인 및 병원 성 오염7을 발생할 수 있습니다. 혈 청에 포함 된 젤라틴과 요리 표면 및 LIF의 추가 코팅이 간섭을 유발 하지 않도록 매체 급지대 계층 셀 없이 마우스 ES 세포를 유지 하기 위한 대체 방법이 있습니다. 또한, 혈 청/LIF 조건 하에서 성장 하는 마우스 ES 세포 형태학이 세포 인구 및 pluripotency 관련 요인8식 수준 에서도 전시. 최근 연구 제안 조건 하에서 혈 청/LIF, (를 포함 하 여, Nanog, OCT4, SOX2) pluripotency 관련 핵심 전사 인자 LIF 및 WNT 신호; 통해 pluripotency 유지할 수 있습니다. 그러나, 특히, 그들은 또한 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF) 신호 차별화8트리거를 활성화 합니다. 핵 녹음 방송 요인의 상반 된 이중 작용으로 인해 마우스 ES 세포 혈 청에서 교양된 ICM을 닮은 끝났다 epiblast 상태8다른 유사한 두 개의 상호 인구의 구성 된이 현재. 또한, 마우스 ES 세포 혈 청에 자주 전시 글로벌 hypermethylation9, ICM과 PGCs 그들의 pluripotency9,10와 밀접 하 게 연결 되는 글로벌 hypomethylated 상태에 있는 반면.

마우스 ES 세포 배양을 위한 새로운 방법을 개발 하는 상당한 수요가 있다. 여러 가지 향상 된 프로토콜 200311 이후 설립 되었습니다 하지만 몇 가지 제한 사항 및 단점7계속. 2008 년 이후, 두 개의 작은 분자 kinase 억제제, PD0325901의 결합된 이용 (물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (MAPK)의 억제 물 extracellular 신호 통제 / 키 니 아 제 (ERK) (MEK)) 및 CHIR99021 (글 리 코겐 synthase의 억제제를 키 니 아 제 3 (GSK3)), 자란 마우스 ES 세포12대 한 N2B27 에 매체 LIF와 혈 청 하지 않고 새로운 관점 오픈 했습니다. 이 새로운 정의 된 매체 2 억제제 (2i)의 사용에 의해 특징입니다. 2i/LIF 매체에 경작 마우스 ES 세포는 세포 인구 및 pluripotency 요인의 표현에 더 균질. 또한, 2i/LIF 교양 마우스 ES 세포 전시 DNA hypomethylation 세계적으로 ICM 같은 셀9,13에 가깝다. 그럼에도 불구 하 고, 2i 문화는 그것의 단점이 있습니다. PD0325901 및 CHIR99021는 물에 용 해 일반적으로 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 해산-문화 매체에 그들을 추가 하려면 재고 솔루션을 기반으로. 연구는 그 장기 그리고 DMSO에 셀의 낮은 복용량 노출 세포 독성14이어질 수 있습니다.

우리 두 작은 분자 화합물을 활용 하는 여기, 마우스 ES 세포의 새로운 문화 방법을 개발 하 고. 새로운 문화 메서드 빠르게 DNA hypomethylation 홍보 Vc와 MEK 억제제 PD0325901를 결합 하 고 효과적으로 PGC의 유사한 수준에 임명 된 Vc/PD0325901 자란 프로토콜. Vc/PD0325901 추가 혈 청에 포함 된 매체에 마우스 ES 세포 형태학에 동질성을 전시 하 고 접지 상태에서 지속. 2i 문화에 비해, Vc/PD0325901 조건 하에서 경작 하는 마우스 ES 세포 DNA demethylation의 빠른 활동을 전시 하 고 PGC의 비교 hypomethylation 수준에 도달할 수 있습니다. 또한, 단일 억제제 (PD0325901)를 사용 하 여 2에서 사용에 비해 중간에 DMSO의 입력된 금액 감소 (PD0325901/CHIR99021) 셀에 피해를 감소 시킨다.

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Protocol

1입니다. 준비

  1. 1.0 m m PD0325901의 솔루션 (MEK 억제제)와 3.0 m m CHIR99021 준비 (GSK3 억제제).
    1. PD0325901의 2 밀리 그램의 무게 고 호박색 유리 유리병에 DMSO의 4.15 mL를 추가 합니다.
    2. CHIR99021의 2 밀리 그램의 무게 고 호박색 유리 유리병에 DMSO의 1.43 mL를 추가 합니다.
    3. 다음 재구성,-20 ° C에서 aliquots (200 µ L PCR 튜브에 50 µ L/튜브)를 저장 하 고 빛 으로부터 보호. 냉장고를 사용 하기 전에 실내 온도에 녹여 냉동된 주식을 포함 하는 튜브를 제거 합니다.
  2. 원심 분리기 튜브의 1 mL에 Vc의 0.0176 g의 무게와 사용 하기 전에 100 m m의 최종 농도에 살 균 물의 1 mL와 함께 그것을 다시 구성 하기.
  3. FBS 비활성화: 500ml FBS의 30 분 동안 56 ° C에서 물 욕조에 품 어.
  4. 마우스 ES 세포 배양에 대 한 기본적인 매체의 600 mL를 준비 합니다.
    1. DMEM/높은 포도 당 매체 (500 mL)의 병을 사용 하 고 40 mL를 제거 합니다.
    2. DMEM/높은 포도 당 보통 20%의 보충 460 mL 비활성화 FBS (120 mL), 1000 U/mL LIF (107 U/mL 재고 솔루션의 60 µ L), 0.1 m m 비 본질적인 아미노산 (NEAA) (10 m m 재고 솔루션의 6 mL), 1 m m 나트륨 pyruvate (100 m m 재고 솔루션의 6 mL) 2 mM L-글루타민 (200 m m 재고 솔루션의 6 mL), 0.1 m m β-mercaptoethanol (100 m m 재고 솔루션의 600 µ L), 및 33 IU/mL 페니실린과 33 µ g/mL 스 (페니실린 스 솔루션 (10000 IU/mL 페니실린 및 10000 µ g/mL 스) 혼합의 2 개 mL) . 혈 청 매체 기본 매체를 정의 합니다.
    3. 플라스틱 PD0325901의 재고 솔루션의 50 µ L (1.0 m m) 및 Vc (100 m m), 혈 청 매체의 50 mL에 각각, (최종 농도: 1.0 µ M PD0325901 100 µ m Vc), Vc/PD0325901 매체 매체를 정의 하 고.
      참고: Vc의 불안정으로 인해 사용 하기 전에 Vc/PD0325901 중간 신선한을 준비 합니다.
    4. 피 펫을 사용 하 여 전송 PD0325901의 재고 솔루션의 50 µ L (1.0 m m) 및 CHIR99021 (3.0 m m), 혈 청 매체의 50 mL에 각각, (최종 농도: PD0325901 1.0 µ M 및 CHIR99021 3.0 µ M), 2i 매체로 매체를 정의 하 고.
  5. 젤라틴 코팅 요리를 준비 합니다.
    1. 0.1% 젤라틴 용액을 준비: 모자와 함께 유리 시 약 병에 초순의 300 mL에 젤라틴의 0.3 g을 분해 하 고 실내 온도에서 살 균 솔루션 20 분 저장소에 대 한 121 ° C에서 압력솥에 소독.
    2. 실 온에서 15 분 0.1% 젤라틴 용액 2 mL로 세포 문화 요리 (6cm 직경) incubate 고 젤라틴을 발음. 건조 한 공기에서 요리 하 고 그들을 사용 하 여 12 h 이내.
  6. 마우스 ES 세포 동결 15ml 원심 관에 매체의 10 mL를 준비: 90 %FBS (9 mL) 및 10 %DMSO (1 mL). 매체를 사용 하 여 1 일 이내.
  7. 냉동 컨테이너를 준비: 냉동 컨테이너의 급지를 100% 이소프로필 알코올을 추가 하 고 오래 된 이소프로필 알코올을 삭제. 모든 5 사용 후 직접 새로운 이소프로필 알코올을 추가 합니다.
  8. 효소 소화 버퍼 만들기: 무게 1.2114 g 100 mM Tris 솔루션을 준비 하 여 추가 초순의 100 mL로 트리 파우더의 pH 7.6 (집중된 HCl 솔루션의 약 0.6 mL)를 조정 하 트리 스 솔루션으로 HCl 솔루션 (약 12 M)를 집중.
  9. 라디오 immunoprecipitation 분석 결과 버퍼 (RIPA 버퍼) 50 mL를 준비: 20 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 150 m m NaCl, 20% 글리세롤, 0.5 %NP40, 1 mM EDTA, 1mm EGTA. 1mm DTT, 프로 테아 제 억제 물 칵테일, X 1과 1 m m와 보충 PMSF 사용 하기 전에. PMSF는 추가 되 면 30 분 이내 버퍼를 사용 합니다.

2. 젤라틴 코팅 요리에 마우스 ES 세포 성장

  1. 미리 따뜻한 마우스 ES 세포 (야생 타입, 129 SvEv) 문화 매체, 트립 신, 고 37 ° c.에 물 목욕에서 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS)
  2. 셀 통로 셀 린스를 요리 접시와 피 펫 2 mL PBS의에서 완전히 중간 발음
    1. 피 펫으로 PBS를 제거 하 고 2 mL의 PBS로 세포 세척.
    2. PBS를 제거 하 고 각 요리에 트립 신-EDTA (0.25%)의 0.3 mL를 추가 합니다.
    3. 트립 신으로 전체 요리를 신속 하 게 커버 하 고 즉시 제거.
    4. 접시에서 세포를 분리 하려면 1 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 넣어. 인큐베이터에서 요리를 꺼내와 trypsin의 작업 종료를 미리 데워 진된 혈 청 매체의 2 개 mL를 추가.
    5. 10 번 피 펫 (5 mL 피 펫 팁)와 resuspending에 의해 단일 셀 서 스 펜 션으로 셀 식민지를 분리.
  3. 새로운 젤라틴 코팅 접시에 셀 솔루션 (약 190000 세포는 hemocytometer를 계산 하 여)의 2 개 mL의 150 µ L를 전송 및 3 mL 6 cm 문화 접시 당 갓 만든된 Vc/PD0325901 매체의 보충. 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 세포 문화.
  4. 잠복기, 하는 동안 모든 24 시간 오래 된 문화 매체를 제거 하 고 2-3 일 후에 Vc 기대 70-80 %confluency 불안정으로 인해 문화 접시에 신선한 Vc/PD0325901-매체의 3 개 mL를 추가.
  5. 도달 후 70-80 %confluency, 세포를 통과 하 고 2.2-2.4 단계에 설명 된 대로 그들의 문화를 계속 합니다.

3. 고정 및 마우스 ES 세포를 녹여

  1. 마우스 ES 세포를 고정 합니다.
    1. 다음 단계 2.2 trypsin으로 요리에서 셀 분리 합니다.
    2. 15 mL 플라스틱 튜브와 3 분 800 x g 및 실 온에서 원심 분리기로 셀을 전송 합니다.
    3. 비 커에는 상쾌한 부드럽게 덤프 하 고 resuspend 셀 펠 릿의 1 mL와 함께 갓 어 중간 했다. 사용 하기 전에 실내 온도 인지 확인 하려면이 단계 전에 동결 중 30 분을 준비 합니다.
    4. 전송 매체 1 mL 피 펫 1.8 mL microcentrifuge 튜브에 세포 고 microcentrifuge 튜브 냉동 컨테이너 합니다. 냉동 컨테이너의 급지에 이소프로필 알코올을 추가 하 고 사용 하기 전에 실내 온도에 그것을 유지.
    5. -80 ° C 냉동 실에 냉동 컨테이너를 하룻밤 둡니다.
    6. 최대 2-3 년 동안 액체 질소 용기 microcentrifuge 튜브를 전송.
      참고: 오래 어 중간 하지 계속 셀 시간 고 셀 DMSO의 독성 때문에-80 ° C 냉동 고에 신속 하 게 전송.
  2. 마우스 ES 세포 녹여
    1. 전 37 ° C 물 욕조에 혈 청 매체의 50 mL 따뜻한.
    2. 액체 질소 용기에서 포함 하는 셀 유리병 밖으로가 고 출장된 유리병 37 ° C 물 욕조에 담가. 빨리 해 동 물 목욕에 흔들. 1 mL 피 펫 15 mL 튜브에 세포를 전송 합니다. 냉동 매체를 희석 하 여 다음 800 x g 및 3 분 동안 실 온에서 원심 관에 미리 데워 진된 혈 청 문화 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.
    3. 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 5 mL 피 펫을 사용 하 여 신선한 Vc/PD0325901 매체의 3 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend.
    4. 젤라틴 코팅 접시에 15 mL 튜브에서 셀을 전송 하 고 문화 24 h. 문화에 대 한 셀 2 단계에에서 설명 된 대로 다시 셀.

4. 셀에서 총 단백질 추출

  1. 1 mL의 PBS로 수집 된 세포를 헹 구 고 800 x g 및 3 분 동안 실 온에서 원심.
  2. 상쾌한 발음 하 고 철저 하 게 부드럽게 pipetting DTT, 칵테일, protease 억제제와 PMSF 보완 RIPA 버퍼 셀 펠 릿을 resuspend. RIPA 버퍼의 볼륨은 약 5 x 셀의 작은.
    참고: 셀 물의 resuspension 얼음에 실시 합니다.
  3. RIPA 버퍼 얼음과 원심 분리기에서 13000 x g와 4 ° C 5 분 동안에 30 분에 셀을 계속.
  4. 새로운 튜브는 상쾌한 전송 및 저장할-80 ° c.에 aliquots
  5. Bradford 단백질 분석 실험 키트와 함께 단백질의 농도 결정 합니다.

5. 효소를 사용 하 여 단일 Nucleoside에 다이제스트 DNA를 세포 DNA 추출

  1. 단계 3.1.1 3.1.2에에서 설명 된 대로 trypsin으로 세포를 수집 합니다.
  2. DNA 추출 genomic DNA 정제 키트를 제조업체의 지침에 따라 수행 합니다.
  3. 1 mL 원심 분리기 튜브에서 추출 된 DNA를 저장 합니다. 원심 분리기 튜브에 초순의 100 µ L을 추가 하 고 약 15 배를 pipetting으로 DNA를 분해. 농도 결정 하 고 260에서 흡 광도의 측정에 의해 DNA의 품질 평가 nm 및 280 nm15. DNA 농도 약 500 ng / µ L.
  4. 50 µ L 솔루션 시스템에 DNA의 다이제스트 5 µ g: 100 mM Tris HCl 솔루션, pH 7.6의 5 µ L 추가 (최종 농도: 10 m m), 2 U 송아지 장 인산 가수분해 효소, 1 U DNase I, 0.005 U 뱀 독이 포스, 그리고 DNA의 5 µ g (는 measu에 따라 추가 볼륨을 계산 레드 DNA 농도, ~ 10 µ L) 원심 분리기 튜브 및 증가 초순 물으로 50 µ L 솔루션의 볼륨. 37 ° C에 혼합물을 밤새 품 어. 1000 g 및 튜브의 하단에는 솔루션을 수집 하는 1 분 동안 실 온에서 소화 DNA 솔루션 원심
  5. 원심 분리기 튜브에서 울트라 여과 튜브로 소화 DNA 솔루션을 전송 (분자량 컷오프: 3 kDa) 및 13000 g와 소화 효소를 제거 하려면 30 분 동안 4 ° C 원심 분리기.
  6. 5mC와 5hmC 분석에 대 한 샘플을 준비 합니다.
    1. 5hmC 분석: 피펫으로 36 µ L의 새로운 분리기를 필터 솔루션 (1 mL) 튜브 및 추가 4 µ L의 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5hmC) 3의 최종 농도 가진 nM.
    2. 5mC 분석: 5mC genomic DNA에서의 높은 밀도 인해 튜브 (50-fold 희석), 196 새로운 분리기 관으로 초순의 µ L를 피펫으로 4 µ L 필터 솔루션의 추가. 36 µ L 희석된 솔루션의 새로운 원심 분리기 튜브 전송과 4 µ L의 추가 (5'-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5mC) 50의 최종 농도 가진 nM. [D3]를 사용 하 여-5hmC [D3]-5mC 교정 5hmC 및 5mC, 각각에 내부 표준으로.
  7. 측정 튜브 샘플 솔루션 전송 및 4 ° c.에 저장 5mC 및 5hmC 다중 반응 모니터링 (UHPLC-MS/MS (MRM)) 이전 보고서15에 설명 된 대로 초 고성능 액체 착 색 인쇄기-트리플 4 극 자 질량 분석으로 분석 합니다.

6. 분석 5mC와 5hmC UHPLC-MS/MS15 를 사용 하 여

  1. 5mC와 5hmC를 분석 하기 위한 다양 한 매개 변수를 설정 UHPLC MS 소프트웨어를 사용 하 여.
    1. 새로운 메서드를 설정 합니다. 소프트웨어를 오픈 하 고 클릭 합니다 "파일 | 새로운 | 방법 "입니다. 전시 콘텐츠 "기가" 메시지 상자 "할 저장 하려는 현재 메서드에 대 한 변경" "아니오"를 클릭 합니다.
    2. 샘플러의 매개 변수를 구축 합니다. 클릭 "샘플러 | 설치 | 주입 "입니다. "표준 주입"를 선택 하 고 "주입 볼륨에서 5 µ L" 입력.
    3. UHPLC에서 펌프의 매개 변수를 구축 합니다.
      1. 클릭 "BinPump2 | 설치 "펌프의 매개 변수를 만들려고. "15 분"에서 "0.25 mL/min" 및 "중지 시간"에서 "흐름"을 설정 합니다.
      2. "5% 용 매 B" 설정 "최대 600 바"에서 "제한 압력"와.
      3. 클릭 "BinPump2 | 시간표 "차입 5mC 분석에 대 한 매개 변수는 isocratic를 구축 하 행을 추가 "추가"를 클릭 합니다. "시간"과 "B %"에서 "5.0"에서 "0.00" 입력. 한 번 더 새 행을 추가 하려면 "추가"를 클릭 합니다. "시간"과 "B %"에서 "5.0"에서 "15.00" 입력.
      4. 클릭 "BinPump2 | 시간표 "5hmC 분석에 대 한 그라데이션 차입 매개 변수를 구축 클릭 "행을 추가 하려면 추가. 시간 및 "B %" 5.0에서 0.00을 입력 합니다. 한 번 더 새 행을 추가 하려면 "추가"를 클릭 합니다. "시간"과 "B %"에서 "5.0"에서 "3.00" 입력. 6 행을 추가 하려면 다른 6 번에 대 한 "추가"를 클릭 합니다. 시퀀스에서 "시간"과 "B %"에서 "5.0"에서 "3.01" "시간"과 "15.0"에서 "B %", "시간"에서 "6.00"와 "B %"에서 "15.0", "6.01" "시간" 및 "100"에 "B %", "10.00" "시간"과 "100.0"에서 "B %", "시간"에서 "10.01"과 "B %"에서 "5.0", "15.00"를 입력 합니다.
        참고: 5mC와 UHPLC의 다른 분리 조건 때문에 개별적으로 5hmC의 분석을 수행 합니다.
    4. UHPLC에서 열 구획 (TCC)의 온도 매개 변수를 구축 합니다.
      클릭 "TCC | 설치 | 온도 (왼쪽) "" 30 ° C "를 입력 하 고.
    5. QQQ-MS/MS의 매개 변수를 설정 합니다.
      1. 클릭 "MS QQQ | 중지 시간 | 아니 제한/로 펌프"," 이온 소스 | ESI"," 시간 필터링 | 최대 폭: 0.07 분 ". 설정 "세그먼트 시간: 시작 시간: 0"; "스캔 유형: MRM"; "Div 값: Ms"; "델타 EMV (+): 200"와 "델타 EMV (-): 0".
      2. 5mC, D3의 전환 모니터링 매개 변수를 구축-5mC, dC, 5hmC, 및 D3-5hmC
        1. 클릭 "MS QQQ | 수집 | 세그먼트 검사: 연연: 90"; "Fragmentor: 90"; "충돌 에너지: 5"; "가속기 전압 셀: 4"와 "극성: 긍정적인".
        2. "복합 이름", "전조 이온", 5mC 분석을 위해 "제품 이온"에서 "126"에서 "242"에서 "5mC"를 입력 합니다. 오른쪽 버튼을 클릭 하 고 "행 추가" 새 행을 추가 하려면. 입력 "D3-5mC" "복합 이름", "전조 이온", D3에 대 한 "제품 이온"에서 "129"에 "245"에서-5mC 분석.
        3. 다른 동일한 모드를 사용 하 여 세 행을 보충 한다. "복합 이름", "전조 이온", dC 분석을 위해 "제품 이온"에서 "112"에서 "228"에서 "dC"를 입력 합니다. "복합 이름", "전조 이온", 5hmC 분석을 위해 "제품 이온"에서 "142"에서 "258"에서 "5hmC"를 입력 합니다. 입력 D3-5hmC 화합물 이름, "선구자 이온", D3에 대 한 "제품 이온"에서 "145"에서 "261"에서-5hmC 분석.
      3. 가스 소스 매개 변수를 구축 합니다. 클릭 "MS QQQ | 소스 | 매개 변수 소스: 가스 온도: 300 ℃ "; "가스 흐름: 11 L/분"; "분무기: 15 psi"; "긍정적인 모 세관: 3500 V".
      4. 제안된 된 방법을 저장 합니다. 클릭 "MS QQQ | 악기 | 저장 방법 ". "디렉토리"에 의해 제안된 된 방법에 대 한 경로 선택 하 고 입력 "방법"의 내용을 예 하 여 메서드에 대 한 이름을: 5mC와 5hmC 분석.
  2. UHPLC 분리 및 mononucleosides의 MS/MS 분석
    1. 준비 모바일 단계 5mC와 시 토 신 (C) 분석: 솔루션의 모바일 단계와 포 름 산의 500 µ L로 초순의 B. 솔루션 a: 500 mL (최종 농도: 0.1%), 그리고 100% 메탄올 솔루션 b: 500 mL. 모바일 단계 elute 5mC와 C (단계 6.1.3.3에서에서 설정)로 95:5 (v:)에 해결책 A와 B를 혼합. 0.25 mL/min (단계 6.1.3.1에서에서 설정)에 흐름 속도 설정 합니다.
    2. 5hmC 분석에 대 한 용 매 A와 B에 의해 모바일 단계를 준비 합니다. 용 매 A는 2.0 m m NH4HCO3 용액 (pH 9.0) (500 mL), 그리고 용 매 B 100% 메탄올 (500 mL). 최적화 된 그라데이션 차입에 의해 별도 5hmC: 0-3 분, 5.0% 및 95% (v: v); A 3-6 분, 15.0% 및 85% 6-10 분, 100 %B; 10-15 분, 5.0% 및 95 %A (단계 6.1.3.4에서에서 설정). 0.25 mL/min (단계 6.1.3.1에서에서 설정)에 흐름 속도 설정 합니다.
  3. 분석 하는 열에서 차입 고 긍정적인 이온 모드 (단계 6.1.5.2.1에서에서 설정)을 채택 MRM 모드 (단계 6.1.5.1에서에서 설정) 분무 MS/MS를 이용 한다.
    1. 전환 모니터링: 5mC, m/z 242→126 (충돌 에너지, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV); dC, m/z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (단계 6.1.5.2.2에서에서 설정).
    2. +3,500 V (단계 6.1.5.3에서에서 설정)에 모 세관 및 조각 전압을 설정 하 고 90 (설정 단계 6.1.5.2.1에서에서), 각각.
    3. 5 µ L에서 주입 볼륨을 설정 하 고 분석 하는 각 샘플 3 번 (6.1.2 단계에서 설정). 5mC와 5hmC의 양을 평가 하 해당 표준 곡선을 사용 합니다.
      1. 5mC의 표준 곡선 설정: 전송 1-50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, 최종 농도) 원심 분리기로 5mC의 표준 솔루션 튜브 및 추가 50 nM [D3]-튜브 5mC. 보충 50 µ L. 총 볼륨 5mC 샘플 (6 단계)에 대 한 지침에 따라 표준 5mC의 분석을 수행 합니다.
      2. 5hmC의 표준 곡선을 작성: 1-20 nM를 전송 (1, 2, 5, 10, 20 nM, 최종 농도) 원심 관 3을 추가 하는 5hmC의 표준 솔루션 nM [D3]-튜브를 5hmC. 보충 50 µ L. 총 볼륨 5hmC 샘플 (6 단계)에 대 한 지침에 따라 표준 5hmC의 분석을 수행 합니다.

7. 통계적 의미 분석

  1. 소프트웨어를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다.
    1. 소프트웨어를 열고 "새 테이블 및 그래프"에서 "열"을 선택 합니다. 다음과 같이 매개 변수를 설정: "데이터를 견본 | 빈 데이터 테이블로 시작"; "그래프의 첫 번째 모드를 선택 하십시오"; "복제 또는 오차 막대 그래프 | 플롯 | SEM으로 의미 ".
    2. 클릭 "만들기"를 각각 "A"와 "B" 라인 제어 및 Vc/PD0325901-대우 그룹의 3 개의 복제를 입력 합니다. 6 데이터를 선택 하 고 "분석"에서 "분석"을 클릭 합니다.
    3. "열 분석"에서"t (시험과 비패라메트릭 테스트)"를 선택 하 고 "확인"을 입력 하는 다음 인터페이스를 클릭 합니다.
    4. 다음과 같이 매개 변수를 설정: "선택 테스트 | 테스트 이름 | 짝이 없는 t 테스트; 옵션 | 양측 "; "자신감을 간격: 95%"; "유효 자릿수 | 4 유효 자릿수 표시 ". 제어 및 Vc/PD0325901 치료 사이의 p 값을 얻으려면 "확인"을 클릭 합니다.
  2. 컨트롤 및 양측 고 짝이 없는 학생의 t채용 실험 그룹 간의 통계적 의미를 평가-16테스트.
    참고: p < 0.05 통계적 의미를 보유 하는 차이 나타냅니다. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001.

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Representative Results

Vc/PD0325901 synergistically 마우스 ES 세포의 글로벌 삭제를 유도 한다. 혈 청에 마우스 ES 세포 pluripotent ICM 세포와 PGCs DNA 메 틸 화의 글로벌 삭제 표시 하 고 hypomethylated 상태가 그들의 pluripotency9,10에 밀접 하 게 연관 DNA hypermethylation 전시.

이전에 우리와 다른 Vc Tet 중재 5mC demethylation15,17를 향상 시킬 수 있습니다 발견. 한편, 2i 5mC 드 노 보 합성을 억제 하는 것도 발견 되었습니다. 이 발견의 맥락에서 우리는 더 함께 Vc와 2i를 사용 하 여 마우스 ES 세포의 시너지 조작 제안. UHPLC-MS/MS 분석 후 우리 Vc와 2i 혈 청에 포함 된 매체에 보충 수 크게 줄일 것 5mC 콘텐츠 3.2에서 100 C (~ 90 %5mC 손실) 당 0.33 하루 11 마우스 ES 세포 (그림 1A)에서 발견. 반면, Vc 또는 2i-치료를 혼자만 발생 58% 삭제 1.3 %5mC의 수준에서 1.4 %5mC 또는 61% 감소에서 꾸준한 수준.

2i 매체 MEK 억제제 PD0325901 및 GSK3β 억제제 CHIR99021 구성 됩니다. 다음, 우리는 Vc와 2i의 공동 처리 하는 동안 5mC의 글로벌 손실을 유도 하는 구성 요소를 조사 합니다. 재미 있는, Vc/PD0325901 Vc/2i 보다 DNA 메 틸 화 수준의 빠른 감소를 발생 합니다. Vc/PD0325901 Vc/2i 일 11에 대 등 한 수준에 도달 하는 동안, 5 일 후 꾸준한 5mC 수준 (~0.33% 5mC)를 달성. 대조적으로, CHIR99021의 보충 Vc 트리거 DNA demethylation을 (그림 1A) 부분적으로 표시 되지 않습니다. 이러한 데이터 명확 하 게 CHIR99021 2i의 부분적으로 억제 5mC 삭제 하는 동안 2에서 PD0325901 마우스 ES 세포에서 게놈 DNA의 글로벌 hypomethylation에 기여 하는 것이 좋습니다. 따라서, 우리는 Vc/2i 상대적인 Vc/PD0325901에 의해 유도 된 빠른 DNA demethylation demethylation에 CHIR99021의 부분적인 억제에 표시 될 수 있습니다 추측 하고있다.

우리 가설 글로벌 삭제 5mC Vc/PD0325901에 의해 유도 된 마우스 ES 세포에서의 DNA demethylation의 향상에 부분적으로 관련 될 수 있습니다. 따라서, 우리는 5mC의 게놈 산화 제품을 검사합니다. 그것은 그 5mC 변환할 수 5hmC Fe (II) 및 2 oxoglutarate18,19에 Tet 가족 dioxygenases의 촉매 산화에 의해 보고 되었습니다. 게놈 5hmC DNA 복제20희석 될 수 있습니다. 또한, 5hmC 수 수 추가 산화 Tet dioxygenases 5-formylcytosine (5 fC)를 생산 하 여 5-carboxylcytosine (5caC), 수 수 thymine DNA glycosylase (TDG) unmethylated 시 토 신을 복구 하 여 excised 효율적으로,이 활성 DNA를 나타내는 및 demethylation21,22.

이전 작업15, 라인 Vc 포함 된 처리 (Vc, Vc/2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021) 극적으로 증가 했다 5hmC 주파수 (5hmC/106 C) 후 1 일, 그리고 그 후 5hmC 수준을 점차적으로 감소 (그림 1B)에 5mC 기판에 점차적으로 감소입니다. 특히, Vc/PD0325901 및 Vc/2i 5mC의 빠른 감소 때문에 비해 Vc 및 Vc/CHIR99021 5hmC 손실의 빠른 활동을 보여주었다. 또한, 우리는 또한 하루 1, Vc-치료 5hmC Vc/CHIR99021, CHIR99021 부분적으로 5hmC의 Vc 유도 생산 억제 및 DNA demethylation 저해를 나타내는 비교의 더 많은 세대 자극 관찰. 2i 치료에서 5hmC 손실 5mC 기판의 감소에 기인 합니다. 함께 찍은, 이러한 결과 나타났다 Vc 향상 된 DNA demethylation 활동에 일부 기여는 Vc/PD0325901 및 Vc/2i의 공동 치료에 synergistically hypomethylation.

두 하비비 외. 23 그리고 폰 Meyenn 외. 24 는 또한 마우스 ES 세포 2i 조건 하에서 글로벌 DNA hypomethylation와 순진한 pluripotency 보였다 보고 했다. 5mC 수준을 보여주었다 점차적으로 감소 하 고 2i 혈 청에서 복귀 후 12-14 일에 정상 상태 (~ 1 %5mC)를 도달 했다. Vc/PD0325901 문화 시스템에서 공동 치료 빠른 DNA demethylation를 발생 하 고 안정적인 수준 (0.33 %5mC) Vc/PD0325901의 시너지 효과 인해 5 일 동안 혈 청 매체에 Vc/PD0325901의 보충 후에 도달. Methylated 레벨 (0.33 %5mC)에 도달된 했다 뚜렷하게 하비비 외. 보고 2i 조건 보다 낮은 그리고 폰 Meyenn 그 외 여러분, 5hmC 수준 때문에 Vc의 승격된 세대 더 높은 동안.

PD0325901 상승 Prdm14 식 Dnmt3b 및 Dnmt3l, 하지만 하지 Dnmt3a25억 누르다. 유도 하는 5mC 손실에 PD0325901의 행동을 조사, 5mC 관련 단백질 식의 시리즈 시험 되었다, 유지 관리 (Dnmt1)와 드 노 보 (, Dnmt3a 및 Dnmt3b)를 포함 하 여 DNA methyltransferases 및 그들의 공동 인자 (Uhrf1 및 Dnmt3l) 및 조절 단백질 (Prdm14) 8,,926. 서쪽 오 점 분석 후 Prdm14 뚜렷하게 PD0325901을 포함 하 여 문화 (그림 2)에서 상승 했다. 반면, Dnmt3b 및 그것의 공동 인자 Dnmt3l PD0325901을 포함 하 여 치료 (그림 2)에서 단백질 발현의 상당한 다운 규정을 보여주었다. CHIR99021 처리 Prdm14, Dnmt3b, 및 Dnmt3l의 수준에 보였다 아니 또는 약간의 효과. Dnmt3awas의 표현을 변경 하지 않은 그리고 원인이 명확 하지 않습니다. 또한, 유지 보수 DNA methyltransferase Dnmt1 및 그것의 대상 요소 Uhrf1 또한 아무 변경 그리고 데이터 표시 하지 했다.

최근 연구는 지적 Prdm14 de novo DNA methyltransferases (Dnmt3a와 Dnmt3b) 등 그들의 공동 인자 (Dnmt3l), 그들의 식을 억 누르기 위해 일부 유전자 발기인에 polycomb 억압 적인 복잡 한 2 (PRC2)를 모집 할 수 있는에 기여 2i 조건8,27아래 hypomethylation 유지. 우리의 데이터 PD0325901 Dnmt3b 및 Dnmt3l를 억제 하기 위해 Prdm14의 식 수준 높은 드 노 보 게놈 5mC 합성 메커니즘에 의해 감소 밝혔다.

Vc/PD0325901 조건에서 마우스 ES 세포의 pluripotency 유지 보수를 탐험, 여러 코어 pluripotency에 연결 된 요소의 mRNA 식 수준을 조사 했다, 그리고 이러한 요소 pluripotency28에 중요 한 역할을 확인 되었다. 실시간 PCR 분석 발견 Oct4, SOX2, Esrrb, 및 Sall4 Vc/PD0325901 혈 청 문화 (그림 3A)과 달리 치료의 5 일을 통해 균일 한 식 수준을 보여주었다. Nanog와 Tcf3 1.3-fold 증가 하면, 각각. 대조적으로, Klf4 42% 다운 레 귤 레이 션 그리고 Rex1만 약 12% 감소 했습니다. 이러한 결과 Vc/PD0325901 공동 치료 유도 pluripotency 요인;의 표현에서 다양 한 변경 제안 그러나, Oct4, SOX2, 가장 핵심 요인 식의 거의 일정 한 수준을 유지.

다음으로, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 분석 결과 마우스 ES 세포는 undifferentiated 또는 차별화 된 상태에 있던 여부를 평가 하기 위해 수행 되었다. 사진 (그림 3B 와 3c) 셀의 사진 확대와는 거꾸로 한 현미경 대물 렌즈에 의해 연결 하는 카메라에서 얻은 했다. Vc/PD0325901 추가 혈 청 매체에서 26 일의 연속 재배 후 마우스 ES 세포 균질 형태학을 보여주었다. 또한, 거의 모든 셀 보라색-검은 얼룩이 했다 하 고는 미 분화 상태를 보여주는 파생물 (그림 3C) 없이 공 같은 상태를 전시. 대조적으로, 조건 하에서 혈 청, 하루 26에서 마우스 ES 세포의 일부 보라색-블랙은 후 얼룩이 지 고 형태에 공 모양의 상태 다른 outspreading 백색 타원형 파선 (그림 3B);에 의해 표시와 밝은 색상을 제시 했다 이 혈 청 교양 마우스 ES 세포 형태학 및 이전 보고서13일치 만능 상태에서 이기종 했다 나타냅니다. 공동으로, 데이터 지원 Vc와 조합에서 PD0325901 우수한 형태 및 마우스 ES 세포에서 미 분화 상태를 유지할 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: Vc/PD0325901 synergistically 게놈 5mCin 마우스 ES 세포의 글로벌 삭제 유도. (A) 5mC 주파수 (5mC/C) 및 (B) 5hmC 주파수 (5hmC/C) 시간-종속 변경 포함 하는 혈 청에서 Vc, 2i, Vc/2i, Vc/PD0325901, 또는 Vc/CHIR99021 연속 보충의 26 일간의 치료 중 매체. 오차 막대는 UHPLC-MS/양 c: 시 토 신에 의해 3 개의 반복된 분석에서 표준 편차 (SD)를 보여 줍니다. 이 그림 리 외 에서 수정 되었습니다. 25. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: Prdm14 및 DNA methyltransferases (Dnmt3a와 Dnmt3b, Dnmt3l)의 단백질 식 변경. (왼쪽에서 오른쪽) 제시 밴드 얻은 했다를 통해 5 일 치료 혈 청 문화 (제어), Vc, PD0325901, CHIR99021, 2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021 및 Vc/2i, 각각. Prdm 14의 표현 했다 위로 및 Dnmt3b 및 Dnmt3l PD0325901을 포함 하 여 문화 후 감소. Dnmt3a 전시 변화. Β-tubulin는 내부 기준 전압으로 설정 했다. 단점: 제어; PD: PD0325901; CH: CHIR99021. 이 그림 리 외 에서 수정 되었습니다. 25. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 변경 Vc/PD0325901-유도 된 pluripotent 유전자의 mRNA 표정 및 알칼리 성 인산 가수분해 효소의 활동에. (A) mRNA 부분 만능 유전자의 수준 혈 청 조건 (제어)을 기준으로 Vc/PD0325901의 5 일 치료를 통해 변경 되었습니다. 데이터는 ± sd. 의미를 표현 했다 통계적 의미는 평가 및 p < 0.05를 통계적으로 중요 했다. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, 및 ns 아닌 상당한 표현. PD: PD0325901. 26 일 (B)에 대 한 혈 청에서 마우스 ES 세포 전시 부분 파생물 Vc/PD0325901 추가 혈 청 매체 큰 형태 및 미 분화 상태 (C)를 유지 하는 동안 백색 타원형 파선에 의해 표시. 이러한 이미지는 밝은 분야에 카메라와는 거꾸로 한 현미경에서 인수 했다. 이 그림 리 외 에서 수정 되었습니다. 25. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

작품, 우리 시연 Vc 및 PD0325901 vc DNA demethylation를 홍보 하 고 de novo DNA 억제 시너지 행동에 의해 달성 되었다는 undifferentiated 및 hypomethylated 상태에서 마우스 ES 세포를 유지 하기 위해 결합 하는 새로운 방법 메 틸 PD0325901입니다. 또한, 마우스 ES 세포 Vc/PD0325901 문화 시스템 아래 큰 형태를 보였다.

더 나은 마우스 ES 세포의 상태는 Vc/PD0325901 문화 시스템에서을 하려면 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, FBS 배치 해야 미리 발견 하 고 최고의 일괄; 재고 스크린 또한, 혈 청의 잦은 교체는 해로운 세포 증식 및 pluripotency의 유지 보수. 둘째, pipetting 셀에 셀 통로 단계에서 단일 세포 현 탁 액을 셀 식민지의 해리 하는 동안 하지 마십시오. 셋째, 세포 배양 중 trypsin의 부정적인 영향을 감소 하는 트립 신 제거 되어야 한다 셀 뿌리고 동안 요리에 셀을 처리 하는 그것 후에 즉시. 또한, Vc/PD0325901 문화 매체는 Vc의 불안정으로 인해 매일 대체 되어야 한다.

클래식 혈 청 문화에 비해 Vc/PD0325901 조건에서 마우스 ES 세포 더 균질 세포 인구 (그림 3B, C) 및 ICM 및 PGC는 hypomethylated 상태 표시. 또한, 최근에 개발한 2i 문화에 비해, 우리의 방법은 더 빠른 속도와 hypomethylation 실현할 수 하 고 단일 억제제 (PD0325901)의 활용 DMSO, 따라서 감소 하는 세포에 손상을 줄여 입력. 그러나, 때문에 우리의 문화 시스템에서 FBS의 추가, FBS의 상반 된 듀얼 작업 장기 문화 중 세포 분화를 발생할 수 있습니다. 전반적으로,이 새로운 문화 시스템은 마우스 ES 세포의 큰 규모의 유지 보수 및 확장에 적합 합니다.

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Disclosures

저자는 잠재적인 충돌의 관심을 공개.

Acknowledgments

이 작품은 국가 자연 과학 재단의 중국 (21435008 및 호우를 21327006), 그리고 과학의 중국 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 (호우에 XDB14030200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

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생화학 문제 136 비타민 C PD0325901 마우스 배아 줄기 세포 DNA hypomethylation Prdm14 pluripotency
MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법
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Li, C., Lai, W., Wang, H. An… More

Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

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