Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/56391
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

אנחנו מתוארות בפרוטרוט שני פרוטוקולים המבוססות על חומרים כימיים עבור culturing בתאי גזע עובריים בעכבר. שיטה חדשה מנצל מנגנונים סינרגטי של קידום חמצון בתיווך טט (על-ידי ויטמין C) ומדכא דה נובו סינתזה של 5-methylcytosine (על-ידי PD0325901) כדי לשמור על ה-DNA hypomethylation pluripotency של תאי גזע עובריים בעכבר.

Abstract

תאי גזע עובריים (ES) יש את היכולת להבדיל בין לכל אחת משלוש שכבות הנבט (האנדודרם, והמזודרם או האאקטודרם), ניתן להפיק שושלות רבות עבור רפואה רגנרטיבית. ES תא תרבות במבחנה כבר זמן רב בנושא חששות נרחבת. באופן קלאסי, העכבר ES תאים נשמרים בסרום ו לוקמיה מעכבות פקטור (LIF)-המכיל בינוני. עם זאת, בתנאים סרום/LIF, תאים להראות הטרוגניות מורפולוגיה, לפרופיל ביטוי של גנים הקשורים pluripotency, בעיקר במצב והשלמת. יתר על כן, בתרבית תאים ES התערוכה הכללית hypermethylation, אך נאיבי ES תאים של התא הפנימי מסה (ICM), בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) במצב של hypomethylation העולמית. מדינת hypomethylated ICM, PGCs קשורה קשר הדוק pluripotency שלהם. כדי לשפר את העכבר ES תא תרבות שיטות, לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה המבוססת על ניצול סלקטיבי משולב של שתי תרכובות מולקולה קטנה כדי לשמור על המדינה hypomethylated ו pluripotent הדנ א. כאן, אנו מציגים את הטיפול שיתוף של ויטמין C (Vc), PD0325901 יכול למחוק כ 90% 5-methylcytosine (5mC) ב 5 ימים העכבר ES תאים. התוכן שנוצר 5mC דומה לזו של PGCs. החקירה מכניסטית מראה כי PD0325901 up-מווסת את הביטוי Prdm14 לדכא את Dnmt3b (de novo דנ א methyltransferase), Dnmt3l (קופקטור של Dnmt3b), על-ידי הפחתת סינתזה 5mC de novo . Vc מקלה את ההמרה של 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בעיקר על ידי Tet1, Tet2, המציין את מעורבותם של demethylations ה-DNA פסיביים ואקטיביים. יתר על כן, בתנאים Vc/PD0325901, העכבר ES תאים מראים pluripotent המדינה ומורפולוגיה הומוגנית. באופן קולקטיבי, אנו מציעים הרומן ושיטת כימית-סינרגיה תרבות להשגת DNA hypomethylation ותחזוקה של pluripotency העכבר ES תאים. השיטה תלויי-כימית מולקולה קטנה מתגבר את החסרונות העיקריים של התרבות סרום, מביאות הבטחה לייצר הומוגניות תאים ES עבור יישומים קליניים נוספים מחקרים.

Introduction

ES תאים שמקורם את ICM של הבלסטוציסט1. התאים נמצאים במצב pluripotency והוא יכול ליצור כל שושלות הסומטית, תאים germline2. הקמת תאים ES מספק ההזדמנות לחקור את ההתפתחות תהליכי במבחנה ניתן להפיק תאים של הרלוונטיות רפואי עבור רפואה רגנרטיבית בהתבסס על שלהם pluripotency3.

שתי קבוצות seminally נוסדה הקווים תא העכבר ES בשנת 1981, כאשר תאים שמקורם העובר העכבר בתחילת היו תרבותי בנסיוב שור עוברית (FBS)-המכיל בינוני עם העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) מזין שכבה1,4 . MEFs היו לא פעיל mitotically, גדלו מראש במנות לפני culturing תאים ES. MEFs מספקים תמיכה עבור העכבר ES תא מצורף ומפיקים גורמי גדילה כדי לקדם את הפצת ותרסן את הבידול5, בעוד FBS מציעה גורמים עם מחלות חיוניות והורמונים עבור התפשטות תאים. מחקרים מאוחרים יותר ציין כי LIF המיוצר על ידי תאי מזין היה ציטוקין מפתח התחדשות עצמית ותחזוקה של pluripotency העכבר ES תאים, התוספת של LIF לתוך האמצעי יכול תחליף מזין תאים6. כיום, התפרסות של העכבר ES התאים FBS/LIF בינוני-מזיני הוא עדיין השיטה הרגילה שאומצה על ידי חוקרים רבים. עם זאת, כמה בעיות עולות מתוך תפיסה זו התרבות הקלאסית. ראשית, מזין התאים מפרישים גורמי עודף בלתי מבוקרת, עלול לגרום זיהום פתוגניים7. כדי למנוע הפרעה זו, ציפוי המשטח של מנות עם ג'לטין ותוספת של LIF בסרום המכיל בינוני הן שיטות אלטרנטיביות לשמירה על העכבר ES תאים ללא תאים בשכבה מזין. בנוסף, העכבר ES התאים גדלו בתנאים סרום/LIF התערוכה מורפולוגי הטרוגניות אוכלוסיית תאים, אפילו ברמת הביטוי של גורמים הקשורים pluripotency8. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי בתנאים סרום/LIF, גורמי שעתוק הקשורות pluripotency הליבה (כולל SOX2, Nanog ו- OCT4) יכול לקיים את pluripotency דרך LIF ונ ט איתות; עם זאת, ראוי לציין, הם גם מפעילים אות פיברובלסט גורם הגדילה (FGF) כדי לעורר בידול8. עקב פעולה כפולה אמביוולנטי גורמי שעתוק הליבה, העכבר ES תאים בתרבית בנסיוב מציגים הטרוגניות, בהיקף של שתי האוכלוסיות להחלפה, אחד דומה ICM ועוד הדומה המדינה כאשר הבחינה epiblast8. יתר על כן, העכבר ES תאים בנסיוב לעתים קרובות להפגין hypermethylation העולמי9, בעוד ICM ו- PGCs הם במצב hypomethylated הכללית, אשר קשורה קשר הדוק שלהם9,pluripotency10.

יש ביקוש רב לפתח שיטות חדשות culturing העכבר ES תאים. מספר פרוטוקולים משופרת הוקמו מאז 200311 אבל שם ממשיך להיות כמה מגבלות, חסרונות7. מאז 2008, ניצול בשילוב של שני מעכבי קינאז מולקולה קטנה, PD0325901 (החומר המדכא של חלבון mitogen מופעל (MAPK) / חוץ-תאית-אות-מוסדר קינאז (טיפשה) (MEK)), CHIR99021 (המדכא של גליקוגן סינתאז קינאז 3 (GSK3)), N2ב'27 בינוני עם LIF ובלי סרום פתחה אופקים חדשים עבור culturing העכבר ES תאים12. בינוני מוגדר החדש מאופיין על ידי שימוש שני מעכבי (2i). העכבר ES התאים תרבותי במדיום 2i/LIF הם הומוגנית אוכלוסיות התאים ואת הביטוי של גורמים pluripotency. בנוסף, העכבר 2i/LIF-תרבותי ' ES תאים התערוכה DNA hypomethylation ברחבי העולם, אשר קרובה יותר תאים דמויי ICM9,13. למרות זאת, תרבות 2i יש החסרונות. PD0325901, CHIR99021 אינם מסיסים במים, בדרך כלל הם מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-מבוסס מניות פתרון כדי להוסיף אותם תרבות בינוני. מחקרים הראו כי לטווח ארוך, חשיפה במינון נמוך של תאים דימתיל סולפוקסיד יכול להוביל cytotoxicity14.

כאן, אנחנו מנוצל שתי תרכובות מולקולה קטנה פיתחה שיטה תרבות חדשה של העכבר ES תאים. שיטת תרבות הרומן משלב Vc מעכב MEK PD0325901 כדי לקדם את ה-DNA hypomethylation במהירות, ביעילות לרמה המקבילה של PGC, בשם פרוטוקול culturing Vc/PD0325901. העכבר ES התאים Vc/PD0325901-נוסף בינוני המכילים סרום התערוכה עניי מורפולוגיה, מתקיימים במצב הקרקע. בהשוואה ל- 2i תרבות, העכבר ES התאים תרבותי בתנאים Vc/PD0325901 שהפגינו קינטיקה מהירה יותר של ה-DNA demethylation, יכול להגיע לרמה hypomethylation לזו של PGC. בנוסף, השימוש מעכב יחיד (PD0325901) מפחית את כמות דימתיל סולפוקסיד. קלט לתוך בינוני בהשוואה בשימוש 2i (PD0325901/CHIR99021) ומפחית את הנזק לתאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תכשירים

  1. היכונו פתרון של 1.0 מ מ PD0325901 (מעכב MEK) ו- 3.0 מ מ CHIR99021 (מעכב GSK3).
    1. שוקל 2 מ ג של PD0325901 ולהוסיף 4.15 מיליליטר דימתיל סולפוקסיד ב בקבוקון זכוכית ענבר.
    2. שוקל 2 מ ג של CHIR99021 ולהוסיף 1.43 מיליליטר דימתיל סולפוקסיד ב בקבוקון זכוכית ענבר.
    3. שיחזור הבאים, לאחסן aliquots (50 µL/צינור ב 200 µL המבחנות) ב-20 ° C, מוגן מפני אור. הסר את שפופרת המכילה את המניה קפואים במקפיא, להפשיר בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  2. שוקל 0.0176 גר' Vc לתוך 1 מ"ל של שפופרת צנטרפוגה, לשקם אותו עם 1 מ"ל מים סטריליים ריכוז סופי של 100 מ מ לפני השימוש.
  3. הפוך ללא פעיל FBS: דגירה 500 מ"ל של FBS באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. היכונו culturing העכבר ES תאים 600 מ של מדיום בסיסי.
    1. השתמש בקבוק של DMEM/גבוהה גלוקוז בינוני (500 mL) והסר 40 מ.
    2. תוספת 460 מ של DMEM/גבוהה בינונית גלוקוז עם 20% לא פעיל FBS (120 מ ל), 1,000 LIF U/mL (60 µL של פתרון מניות U/mL7 10), מ מ 0.1 שאינם חיוניים חומצות אמינו (NEAA) (6 מ"ל של פתרון מניות 10 מ מ), 1 מ מ נתרן פירובט (6 מ"ל של פתרון מניות 100 מ מ) , 2 מ מגלוטמין (6 מ"ל של פתרון מניות 200 מ"מ), מ מ 0.1 β-mercaptoethanol (600 µL של פתרון מניות 100 מ מ), ואת 33 IU/mL פניצילין µg/mL 33 סטרפטומיצין (2 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין מעורב פתרון (פניצילין 10,000 IU/mL ו- 10,000 סטרפטומיצין µg/mL)) . להגדיר את המדיום בסיסיים כמו סרום בינוני.
    3. פיפטה 50 µL של פתרון מניות של PD0325901 (1.0 מ מ) ו- Vc (100 מ מ), בהתאמה, לתוך 50 מ של המדיום סרום (הריכוז הסופי: מיקרומטר 1.0 PD0325901 ו 100 מיקרומטר Vc), ולהגדיר את המדיום כמו Vc/PD0325901 בינונית.
      הערה: להכין Vc/PD0325901 הטרייה בינונית לפני השימוש עקב חוסר היציבות של Vc.
    4. באמצעות פיפטה של, להעביר 50 µL של פתרון מניות של PD0325901 (1.0 מ מ), CHIR99021 (3.0 מ מ), בהתאמה, לתוך 50 מ של המדיום סרום (הריכוז הסופי: מיקרומטר PD0325901 1.0 ו- CHIR99021 3.0 מיקרומטר), ולהגדיר את המדיום כמו 2i בינוני.
  5. להכין את הכלים מצופים ג'לטין.
    1. להכין את הפתרון ג'לטין 0.1%: להמיס 0.3 גרם ג'לטין לתוך 300 מ ל מים הנדסה גנטית בתוך בקבוק ריאגנט זכוכית עם כובע ולחטא ב החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס מינימלית 20 לחנות את פתרון סטרילי בטמפרטורת החדר.
    2. דגירה המנות התרבות התא (קוטר 6 ס"מ) עם 2 מ של 0.1% פתרון ג'לטין למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ואז האחות הג'לטין. יבש את הכלים אוויר ולהשתמש בהם בתוך 12 שעות.
  6. הכינו 10 מ"ל של העכבר ES תא הקפאה במדיום שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל: 90% FBS (9 מ ל) ו- 10% דימתיל סולפוקסיד (1 מ"ל). השתמש המדיום בתוך יום אחד.
  7. להכין מיכל ההקפאה: להוסיף 100% אלכוהול איזופרופיל לקו המילוי של המיכל מקפיא, ולמחוק את האלכוהול איזופרופיל הישן. להוסיף אלכוהול איזופרופיל חדש ישירות לאחר כל שימוש החמישי.
  8. להפוך את המאגר עיכול אנזימטי: שוקלים 1.2114 גר' אבקה טריס לתוך 100 מ של מים הנדסה גנטית כדי להכין 100 מ מ פתרון טריס ולהוסיף מרוכז פתרון HCl (כ- 12 מ') בתוך תמיסת טריס כדי להתאים את ה-pH ל 7.6 (בערך 0.6 מ"ל של תמיסה HCl מרוכזת).
  9. הכנת 50 מ של רדיו immunoprecipitation assay מאגר (מאגר ריפה): 20 מ מ טריס, pH 7.4, 1 מ MgCl2, 150 מ מ NaCl, 20% גליצרול, 0.5% NP40, 1 מ מ EDTA, 1 מ"מ EGTA. תוספת עם 1 מ DTT, 1 X מעכב פרוטאז קוקטיילים ו- 1 מ מ PMSF לפני השימוש. פעם נוספת את PMSF, להשתמש המאגר תוך 30 דקות.

2. לגדול העכבר ES תאים על מנות מצופים ג'לטין

  1. חם מראש העכבר ES תאים (סוג הפרוע, 129 SvEv) תרבות בינוני טריפסין, פתרון פוספט buffered (PBS) באמבט מים בטמפרטורה 37 º c
  2. המעבר את התאים. האחות המדיום לחלוטין מן המנה פיפטה 2 מ של PBS לשטוף הכלים לשטוף את התאים.
    1. להסיר את PBS עם פיפטה ולשטוף את התאים שוב עם 2 מ"ל ל- PBS.
    2. הסר את PBS ולהוסיף mL 0.3 של טריפסין-EDTA (0.25%) כל מנה.
    3. מכסים את כל טריפסין במהירות ולאחר מכן הסר אותו באופן מיידי.
    4. הכניסו את המנה אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה לנתק את התאים מתוך קערה. להוציא את הכלים מן החממה ולהוסיף 2 מ של סרום מראש ומחוממת בינוני כדי לסיים את הפעולה של טריפסין.
    5. מביצועם המושבות תא להשעיה תא בודד על-ידי resuspending עם פיפטה (tip פיפטה 5 מ"ל) 10 פעמים.
  3. להעביר µL 150 של 2 מ של הפתרון הסלולרי (כ- 190,000 תאים על ידי ספירת עם hemocytometer) לתוך תבשיל חדש מצופים ג'לטין, להשלים עם 3 מ"ל של מדיום Vc/PD0325901 טריים לכל מאכל תרבות 6 ס מ. התרבות התאים חממה 37 ° C עם 5% CO2.
  4. כל 24 שעות ביממה תוך המקננת, להסיר את המדיום התרבות הישנה ולהוסיף 3 מ"ל של טרי Vc/PD0325901-בינוניים לתוך המנה תרבות עקב חוסר היציבות של Vc. מצפה 70 – 80% confluency לאחר 2-3 ימים.
  5. כשמגיעים 70-80% confluency, המעבר את התאים ולהמשיך תרבות אותן כמתואר בצעדים 2.2-2.4.

3. הקפאה והפשרה העכבר ES תאים

  1. להקפיא העכבר ES תאים.
    1. ניתוק התאים מתוך מבחר המאכלים עם טריפסין צעד בעקבות 2.2.
    2. העבר את התאים לתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל צנטריפוגה-800 x g ובטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
    3. זורק את תגובת שיקוע בעדינות לתוך גביע, resuspend בגדר תא עם 1 מ"ל של טריות בינוני מקפיא. הכינו את המקפיא בינוני 30 דקות לפני שלב זה על מנת להבטיח כי זה בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    4. העברת תאי הקפאה בינוניים עד צינור microcentrifuge מ ל 1.8 עם פיפטה 1 מ"ל ולמקם את הצינור microcentrifuge לתוך מיכל ההקפאה. להוסיף אלכוהול איזופרופיל לקו המילוי של המיכל מקפיא ולשמור אותו בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    5. להשאיר את מיכלי הקפאה בן לילה במקפיא-80 ° C.
    6. העברת הצינורות microcentrifuge מיכל חנקן נוזלי עד 2-3 שנים.
      הערה: לא לשמור תאים המדיום קפוא במשך הרבה זמן, מהר להעביר את התאים מקפיא-80 ° C בשל הרעילות של דימתיל סולפוקסיד.
  2. הפשרת העכבר ES תאים.
    1. לחמם 50 מ של סרום בינוני באמבט מים 37 º C.
    2. להוציא בקבוקון המכיל תאים מהגורם המכיל חנקן נוזלי, לטבול את המבחנה רצ'ט באמבט מים 37 º C. לנער את זה במהירות באמבט מים להפשיר. העבר את התאים לתוך צינור 15 מ"ל עם פיפטה 1 מ"ל. להוסיף 2 מ של סרום מראש ומחוממת תרבות בינוני לתוך צינור כדי לדלל את המדיום קופא, ואז צנטריפוגה-g 800 x ובטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
    3. הסר את תגובת שיקוע, בעדינות resuspend כדורי תא עם 3 מ"ל של מדיום Vc/PD0325901 טריים באמצעות פיפטה 5 מ.
    4. להעביר את התאים מהצינור 15 מ"ל מאכל מצופה ג'לטין, התרבות התאים עבור ה 24 התרבות התאים שוב כפי שמתואר בשלב 2.

4. לחלץ את החלבון הכולל של תאים

  1. לשטוף את התאים שנאספו מ ל 1 ל- PBS, ואז צנטריפוגה-g 800 x ובטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
  2. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ביסודיות באמצעות מאגר ריפה בתוספת עם DTT, מעכבי פרוטאז קוקטייל PMSF pipetting בעדינות. אמצעי האחסון ריפה המאגר נמצא כ 5 x זה של התא גלולה.
    הערה: לבצע את resuspension תא על קרח.
  3. שמור את התאים במאגר ריפה במשך 30 דקות על קרח, צנטריפוגה ב 13,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  4. להעביר את תגובת שיקוע צינור ולאחסן aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
  5. לקבוע את הריכוז של החלבון עם ערכת וזמינותו של חלבון ברדפורד.

5. לחלץ את הדנ א מן התאים תקציר DNA לתוך נוקלאוטיד יחיד באמצעות אנזימים

  1. לאסוף את התאים עם טריפסין כפי שתואר בשלבים 3.1.1 ו- 3.1.2.
  2. לבצע את החילוץ DNA עם ערכת טיהור DNA גנומי ההוראות של היצרן.
  3. אחסן את ה-DNA שחולץ צינורות 1-mL צנטריפוגה. להוסיף 100 µL של הנדסה גנטית מים לתוך הצינור צנטריפוגה, לפזר את ה-DNA על-ידי pipetting כ 15 פעמים. לקבוע את הריכוז ולהעריך את איכות ה-DNA על ידי מדידת ספיגת ב-260 nm ו- 280 ננומטר15. ריכוז הדנ א הוא כ-500 ng/µL.
  4. µG 5 תקציר של ה-DNA במערכת פתרון 50 µL: להוסיף µL 5 מ"מ טריס-HCl פתרון, pH 7.6 (הריכוז הסופי: 10 מ מ), 2 U עגל פוספטאז במעי, 1 U DNase אני, 0.005 U נחש ארס phosphodiesterase, 5 µg של ה-DNA (לחשב את עוצמת הקול שנוספו על-פי measu ריכוז ה-DNA אדום, µL ~ 10) לתוך צנטריפוגה צינור להגביר עוצמת הקול של פתרון µL 50 עם מים הנדסה גנטית. דגירה התערובת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. Centrifuge הפתרון DNA מעוכל-1000 g ובטמפרטורת החדר במשך 1 דקה לאסוף את הפתרון לחלק התחתון של צינורות.
  5. להעביר את פתרון ה-DNA מעוכל מן הצינורות צנטריפוגה לתוך צינורות אולטרה-סינון (משקל מולקולה הקיצוץ: 3 kDa), צנטריפוגה-13,000 g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להסיר את אנזימי עיכול.
  6. להכין את הדגימות 5mC וניתוח 5hmC.
    1. לניתוח 5hmC: pipet 36 µL מסנן לפתרון צנטריפוגה חדש צינור (1 מ"ל) ולהוסיף 4 µL של 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5hmC) עם הריכוז הסופי של 3 ננומטר.
    2. לניתוח 5mC: להוסיף 196 µL של הנדסה גנטית מים לתוך שפופרת צנטרפוגה חדש pipet 4 µL של פתרון סינון הצינור (דילול 50-fold), עקב צפיפות גבוהה של 5mC ב- DNA גנומי. להעביר µL 36 של הפתרון מדולל שפופרת צנטרפוגה חדש ולהוסיף 4 µL של (5'-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5mC) עם הריכוז הסופי של 50 ננומטר. שימוש [D3]-5hmC [D3]-5mC כמו תקן פנימי לכיול 5hmC ו- 5mC, בהתאמה.
  7. להעביר את הפתרון מדגם צינורות מדידה ולאחסן ב 4 º C. לנתח את 5mC ואת 5hmC עם ביצועים מעולים במיוחד נוזלי כרומטוגרפיה-טריפל פאול ספקטרומטר מסה עם מרובה-תגובה ניטור (UHPLC-MS/MS (MRM)) כפי שמתואר הדוח הקודם15.

6. לנתח 5mC ואת 5hmC באמצעות UHPLC-MS/MS15

  1. כוונן פרמטרים שונים עבור ניתוח 5mC ו- 5hmC שימוש בתוכנת UHPLC-MS.
    1. להקים שיטה חדשה. פתח את התוכנה ולחץ על "קובץ | חדש | שיטת". התערוכה תיבת ההודעה של "שיטת עורך" עם התוכן "האם ברצונך לשמור את השינויים עבור השיטה הנוכחית" ולחץ על "לא".
    2. לבנות את הפרמטרים של דוגם. לחץ על "דוגם | ההתקנה | הזרקת". בחרו "הזרקת רגיל", קלט "5 µL בווליום הזרקת".
    3. לבנות את הפרמטרים של המשאבה ב- UHPLC.
      1. לחץ על "BinPump2 | הגדרת"לבנות את הפרמטרים של המשאבה. הגדר "זורם" "0.25 mL/min" ו- "לעצור את הזמן" ב- "15 דקות".
      2. הגדרת "ממיס B ב-5%" ולחץ "גבולות"-"מקס 600 בר".
      3. לחץ על "BinPump2 | לוח זמנים"כדי לבנות איזוקראטית • תנאי פרמטרים עבור ניתוח 5mC. לחץ על 'הוספה' כדי להוסיף שורה. קלט "0.00" ב "זמן" ו- "5.0" ב "B %". לחץ על "הוספה" פעם נוספת כדי להוסיף שורה חדשה. קלט "15.00" ב "זמן" ו- "5.0" ב "B %".
      4. לחץ על "BinPump2 | לוח זמנים"לבנות את הפרמטרים • תנאי מעבר לניתוח 5hmC. לחץ על "הוספה כדי להוסיף שורה. קלט 0.00-זמן ו- 5.0-"B %". לחץ על "הוספה" פעם נוספת כדי להוסיף שורה חדשה. קלט "3.00" ב "זמן" ו- "5.0" ב "B %". לחץ על "הוספה" עבור עוד 6 פעמים להוסיף שורות 6. קלט "3.01" ב "הזמן" ו "15.0" ב- "B %", "6.00"-"הזמן" ו- "15.0" ב- "B %", "6.01" ב "זמן" ו- "100" ב- "B %", "10.00" ב "זמן" ואת "100.0" ב- "B %", "10.01"-"הזמן" ו- "5.0" ב- "B %", "15.00" ב "זמן" ו- "5.0" ב- "B %" ברצף.
        הערה: לבצע הניתוח של 5mC ו- 5hmC בנפרד בשל תנאי ההפרדה שונה UHPLC.
    4. לבנות את הפרמטרים של הטמפרטורה של תא עמודה (TCC) ב- UHPLC.
      לחץ על "TCC | ההתקנה | טמפרטורה (משמאל) "קלט"30 ° C".
    5. להקים את הפרמטרים של דני מוליארצוק-MS/MS.
      1. לחץ על "דני מוליארצוק MS | לעצור את הזמן | לא הגבלת/כמו משאבה"," מקור יון | ESI"," זמן סינון | שיא רוחב: 0.07 דקות ". הגדרת "זמן מקטעים: שעת התחלה: 0"; "סוג סריקה: MRM"; "ערך Div: ל MS"; "דלתא EMV (+): 200" ו- "דלתא EMV (-): 0".
      2. לבנות את הפרמטרים של ניטור המעברים של 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC ו- D3-5hmC
        1. לחץ על "דני מוליארצוק MS | רכישה | לסרוק קטעים: לשכון:-90 אינץ '; "Fragmentor: 90"; "אנרגיית התנגשות: 5"; "תא מאיץ מתח: 4" ו- "קוטביות: חיובי".
        2. קלט "5mC"-מתחם "שם", "242" ב "קודמן יון", "126" ב- "מוצר יון" לניתוח 5mC. לחץ על הלחצן הימני ובחר באפשרות "הוסף שורה" כדי להוסיף שורה חדשה. קלט "D3-5mC"-מתחם "שם", "245" ב "קודמן יון", "129" ב- "מוצר יון" D3-ניתוח 5mC.
        3. תוספת אחרת שלוש שורות באמצעות של אותו מצב. קלט "dC"-מתחם "שם", "228" ב "קודמן יון", "112" ב- "מוצר יון" לניתוח dC. קלט "5hmC"-מתחם "שם", "258" ב "קודמן יון", "142" ב- "מוצר יון" לניתוח 5hmC. קלט D3-5hmC-מתחם שם, "261" ב "קודמן יון", "145" ב- "מוצר יון" D3-ניתוח 5hmC.
      3. לבנות את הפרמטרים של מקור גז. לחץ על "דני מוליארצוק MS | מקור | מקור פרמטרים: גז Temp: 300 ° C "; "גז זרימה: 11 L/min"; "מפוחים: 15 psi"; "חיובי-נימי: 3500 V".
      4. לשמור את השיטה המוצעת. לחץ על "דני מוליארצוק MS | מכשיר | שמור שיטה כמו". בחר נתיב עבור השיטה המוצעת על ידי "מדריך" ותן שם עבור פעולת השירות על-ידי הזנת התוכן "שיטה", לדוגמה: 5mC וניתוח 5hmC.
  2. UHPLC ההפרדה וניתוח MS/MS של mononucleosides
    1. הכן השלב ניידים עבור 5mC ו ציטוזין (C) ניתוח: יוצרים שלב ניידים של פתרון A ו- B. פתרון א': 500 מ ל מים הנדסה גנטית עם 500 µL חומצה פורמית (הריכוז הסופי: 0.1%), ואת פתרון ב': 500 מ ל 100% מתנול. לערבב פתרון A ו- B 95:5 (v: v) כמו השלב נייד כדי elute 5mC ו- C (מוגדרת בשלב 6.1.3.3). לקבוע את קצב הזרימה 0.25 mL/min (מוגדרת בשלב 6.1.3.1).
    2. הכן השלב ניידים על ידי ממס A ו- B לניתוח 5hmC. הממס הוא 2.0 מ מ NH4HCO3 תמיסה מימית (pH 9.0) (500 mL), והוא ממיס B 100% מתנול (500 mL). 5hmC נפרדות על-ידי • הדרגתיות אופטימיזציה תנאי: 0-3 דקות, 5.0% B ל- 95% (v: v); 3-6 דקות, 15.0% B ו- 85% A; 6-10 דקות, 100% ב'; 10-15 דקות, 5.0% B ל- 95% A (מוגדרת בשלב 6.1.3.4). לקבוע את קצב הזרימה 0.25 mL/min (מוגדרת בשלב 6.1.3.1).
  3. לנצל ספקטרומטריית electrospray MS/MS עם מצב MRM (מוגדרת בשלב 6.1.5.1) כדי לנתח את • תנאי מהעמודה ולאמץ את מצב יון חיובי (מוגדרת בשלב 6.1.5.2.1).
    1. לפקח על המעברים: 5mC, 242→126 מ/z (אנרגיית התנגשות, 5 eV); [D3]-5mC, 245→129 מ/z (5 eV); dC, מ/z 228→112 (5 eV); 5hmC, 258→142 מ/z (5 eV); [D3]-5hmC, 261→145 מ/z (5 eV) (מוגדרת בשלב 6.1.5.2.2).
    2. להגדיר את המתחים נים, פרגמנט +3,500 V (מוגדרת בשלב 6.1.5.3) ולהגדיר 90 וולט (בשלב 6.1.5.2.1), בהתאמה.
    3. לקבוע את עוצמת הקול של הזרקת 5 µL ולנתח כל מדגם 3 פעמים (מוגדרת בשלב 6.1.2). מעסיקים את עקומות סטנדרטי המתאים כדי להעריך את כמות 5mC ו- 5hmC.
      1. להקים את עקומת סטנדרטית של 5mC: העברת 1 – 50 ננומטר (1, 5, 10, 20, 50 ננומטר, הריכוז הסופי) תמיסה סטנדרטית של 5mC לתוך צנטריפוגה צינורות ולהוסיף 50 ננומטר [D3]-5mC על הצינורות. תוספת לנפח הכללי ל- µL 50. לבצע הניתוח של 5mC תקן ביצוע ההוראות עבור הדגימה 5mC (שלב 6).
      2. לבנות את עקומת סטנדרטית של 5hmC: העברת 1 – 20 ננומטר (1, 2, 5, 10, 20 ננומטר, הריכוז הסופי) תמיסה סטנדרטית של 5hmC צנטריפוגה צינורות ולהוסיף 3 ננומטר [D3]-5hmC על הצינורות. תוספת לנפח הכללי ל- µL 50. לבצע הניתוח של 5hmC תקן ביצוע ההוראות עבור הדגימה 5hmC (שלב 6).

7. לנתח את מובהקות סטטיסטית

  1. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה.
    1. לפתוח את התוכנה ובחר "טור" "טבלה חדשה & גרף". הגדר את פרמטרי כדלקמן: "דגום נתונים | התחל עם טבלת נתונים ריק"; "בחר מצב קודם את גרף"; "יצירת גרפים משכפל או קווי שגיאה | מגרש | מתכוון עם SEM."
    2. לחץ על "צור" קלט את שלושת משכפל בקבוצת הבקרה וטיפל Vc/PD0325901 בשורה "A" ו- "B", בהתאמה. בחר את הנתונים שש ' ולחץ על 'נתח' בניתוח"" '.
    3. בחר "בדיקותt (וגם בדיקות nonparametric)" ב- "טור ניתוחים" ולחץ "אישור" כדי להזין את הממשק הבא.
    4. הגדר את פרמטרי כדלקמן: "בחר מבחן | שם הבדיקה | מבחן אינטראקצית t ; אפשרויות | דו-זנבית"; "מרווחי ביטחון: 95%"; "ספרות משמעותיות | הצג 4 ספרות משמעותיות". לחץ על "אישור" כדי לרכוש את ערך p בין הטיפול ובקרה Vc/PD0325901.
  2. להעריך את משמעות סטטיסטית בין הפקד הקבוצות ניסיוני העסקת הסטודנט דו-זנבי, אינטראקצית t-מבחן16.
    הערה: p < 0.05 מציין את ההבדל בעלי מובהקות סטטיסטית. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vc/PD0325901 המושרה בסינרגיה מחיקה הכללית של העכבר ES התאים. העכבר ES התאים בנסיוב התערוכה DNA hypermethylation, ואילו תאים pluripotent ICM PGCs מראים מחיקה הכללית של מתילציה DNA המדינה hypomethylated קשורה קשר הדוק עם שלהם9,pluripotency10.

בעבר, אנחנו ואחרים מצאו כי Vc עשוי לשפר את בתיווך ט 5mC demethylation15,17. בינתיים, 2i נמצאה גם כדי לעכב דה נובו הסינתזה של 5mC. בהקשר של ממצאים אלה, אנחנו עוד הציע מניפולציה סינרגטי של העכבר ES התאים באמצעות Vc ו- 2i ביחד. אחרי הניתוח של UHPLC-MS/MS, מצאנו כי Vc ו- 2i שיושלם בתוך המדיום המכיל סרום יכולים להפחית באופן דרמטי את התוכן 5mC 3.2 כדי 0.33 לכל 100 C (~ 90% 5mC הפסד) ביום 11 העכבר ES תאים (איור 1 א'). לעומת זאת, Vc או 2i-טיפול לבד רק גרמה 58% מחיקה עם רמת יציבות ב- 1.4% 5mC או 61% ירידה ברמה של 1.3% 5mC.

המדיום 2i מורכב MEK מעכב PD0325901 והמעכב GSK3β CHIR99021. בשלב הבא, אנו לחקור איזה רכיב המניע אובדן הכללית של 5mC במהלך הטיפול שיתוף של Vc ו- 2i. מעניין, Vc/PD0325901 נגרמת ירידה מהירה ברמות של מתילציה DNA מאשר Vc/2i. Vc/PD0325901 מושגת רמות יציבות 5mC (~0.33% 5mC) לאחר 5 ימים, בעוד Vc/2i לרמה המקבילה ביום 11. לעומת זאת, תוספת של CHIR99021 דיכאו חלקית demethylation DNA המופעלות Vc (איור 1 א'). נתונים אלו מראים בבירור כי PD0325901 ב 2i תורמת hypomethylation העולמי של ה-DNA גנומי העכבר ES תאים, בעוד CHIR99021 של 2i מעכב חלקית המחיקה של 5mC. לכן, אנו משערים כי demethylation DNA מהר יותר שנגזרות Vc/PD0325901 ביחס Vc/2i לייחס עיכוב חלקי של CHIR99021 על demethylation.

אנחנו שיערו כי מחיקה הכללית של 5mC העכבר ES תאים שנגזרות Vc/PD0325901 עשויה להיות חלקית הקשורה השיפור של דנ א demethylation. לפיכך, נבחנו חמצון גנומית המוצרים של 5mC. דווח שניתן להמיר את 5mC 5hmC על ידי חמצון הקטליטי של dioxygenases משפחה ט, אשר אינן תלויות Fe (II) ו- 2-oxoglutarate18,19. 5hmC גנומית עשוי להיות מדולל על-ידי שכפול ה-DNA20. יתר על כן, 5hmC יכול להיות עוד יותר תחמוצת על-ידי ט dioxygenases לייצר 5-formylcytosine (5fC) 5-carboxylcytosine (5caC), אשר אפשר להוציא ביעילות על ידי תימין דנ א glycosylase (TDG) לשחזר ציטוזין unmethylated, מצביע על DNA פעילה 21,demethylation22.

בקנה אחד עם העבודה הקודמת15, טיפול המכילות הון סיכון (Vc, Vc/2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021) הגבירה 5hmC תדר (5hmC/106 C) לאחר יום 1, ולאחר מכן 5hmC רמות ירדה בהדרגה (איור 1B) בשל צמצום בהדרגה 5mC המצע. ראוי לציין, Vc/PD0325901 ו- Vc/2i הראה מהר יותר קינטיקה של אובדן 5hmC בהשוואה Vc ו- Vc/CHIR99021 בשל ההפחתה מהירה יותר של 5mC. בנוסף, הבחנו גם כי ביום 1, Vc-טיפול מגורה עוד דור של 5hmC לעומת Vc/CHIR99021, המציין כי CHIR99021 חלקית לדכא את ייצור Vc-induced 5hmC, עכבות דנ א demethylation. 5hmC אובדן בטיפול 2i שיש לייחס הירידה של המצע 5mC. יחדיו, התוצאות הראו כי פעילות demethylation DNA משופרת Vc חלקית תרמו בסינרגיה hypomethylation טיפול משותף של Vc/PD0325901 ו- Vc/2i.

שניהם חביבי. et al. . 23 ופון Meyenn et al. 24 דיווחו גם כי העכבר ES התאים בתנאים 2i הראו pluripotency hypomethylation ותמימה DNA הכללית. רמות 5mC הראו ירידה בהדרגה והגיע למצב יציב (~ 1% 5mC) ב 12-14 ימים לאחר לדוגמות של סרום 2i. במערכת התרבות Vc/PD0325901, הטיפול שיתוף גרם demethylation DNA מהר יותר וניתן להגיע אל רמה יציבה (0.33% 5mC) לאחר תוספת של Vc/PD0325901 סרום בינוני במשך 5 ימים, עקב אפקט סינרגיסטי של Vc/PD0325901. רמת מפוגל הגיעו (0.33% 5mC) היה pronouncedly נמוך מזה בתנאים 2i שדווחו על-ידי חביבי. et al. Meyenn פון. et al., בעוד 5hmC הרמות היו גבוהות בשל הדור בדרגה של Vc.

PD0325901 גבוהות Prdm14 ביטוי להדחיק Dnmt3b, Dnmt3l, אבל לא Dnmt3a25. כדי לבדוק את הפעולה של PD0325901 ב גרימת הפסד 5mC, נבחנה סדרה של ביטוי חלבונים הקשורים 5mC, כולל תחזוקה (Dnmt1) ו- דה נובו (Dnmt3a, ו Dnmt3b) ה-DNA methyltransferases, שלהם קופקטור (Uhrf1 ו- Dnmt3l), תקנה חלבון (Prdm14) 8,9,26. אחרי ניתוח תספיג, Prdm14 הועלה pronouncedly PD0325901-כולל התרבות (איור 2). לעומת זאת, Dnmt3b וקופקטור שלה Dnmt3l הראו ניכר למטה-ויסות ביטוי חלבון PD0325901-כולל טיפול (איור 2). טיפול CHIR99021 או קלה לא הראה אפקט ברמה של Prdm14, Dnmt3b ו- Dnmt3l. הביטוי של Dnmt3awas לא השתנה, הסיבה אינה ברורה. בנוסף, את תחזוקת ה-DNA methyltransferase Dnmt1 ו שלה גורם מיקוד Uhrf1 גם הראה אין שינוי, הנתונים לא הוצגו.

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי Prdm14 יכול לגייס polycomb דכאניים מורכבים 2 (PRC2) עד כמה היזמים ג'ין להדחיק את הביטוי שלהם, כגון methyltransferases אן דה נובו (Dnmt3a ו- Dnmt3b) וקופקטור שלהם (Dnmt3l), ותורמת שמירה על hypomethylation תחת 2i תנאים8,27. הנתונים שלנו גילה כי PD0325901 גבוהות רמת הביטוי של Prdm14 כדי לעכב Dnmt3b ו- Dnmt3l, מופחת דה נובו 5mC גנומית סינתזה על-ידי המנגנון.

כדי לחקור את pluripotency תחזוקה של העכבר ES תאים בתנאים Vc/PD0325901, נבחנו mRNA רמות ביטוי של מספר גורמים מקושרים pluripotency הליבה, גורמים אלה אושרו לשחק תפקיד חיוני pluripotency28. ניתוח ה-PCR בזמן אמת מצאו כי Oct4, SOX2, Esrrb ו- Sall4 הראו רמות הביטוי אחיד דרך 5 ימי טיפול עם Vc/PD0325901 בניגוד לתרבות סרום (איור 3 א). Nanog ו- Tcf3 גדל 1.3-fold, 1.6-fold, בהתאמה. לעומת זאת, Klf4 הראה 42% למטה-תקנה, Rex1 רק ירד בכ-12%. תוצאות אלו מראים כי טיפול ושיתוף Vc/PD0325901 המושרה מגוון שינויים בביטוי של גורמים pluripotency; עם זאת, Oct4, SOX2, רוב גורמי הליבה, שמר רמות כמעט קבוע של הביטוי.

בשלב הבא, וזמינותו phosphatase אלקליין (AP) בוצע כדי להעריך אם העכבר ES התאים היו במצב בלתי מובחן או הבדיל. תמונות של תאים (איור 3B ו- 3 C) התקבלו ממצלמה מחובר במיקרוסקופ הפוך עם הגברה 10-fold על-ידי המטרה של העדשה. לאחר טיפוח רציפה של 26 ימים ב- Vc/PD0325901-להוסיף סרום בינוני, העכבר ES התאים הראו מורפולוגיה הומוגנית. יתר על כן, כמעט כל התאים היו מוכתמים סגול שחור, הציג מדינה הכדורית ללא תוצר (איור 3C), מציג מצב וייעודים. לעומת זאת, בתנאים סרום, היו חלק התאים העכבר ES ביום 26 סגול שחור אחרי צביעת והיה מדינה הכדורית מורפולוגיה, בעוד אחרים מוצג בצבע בהיר outspreading מסומן על ידי קווים לבנים מקווקו סגלגל (איור 3B); זה יצוין כי התאים תרבותי סרום העכבר ES היו הטרוגניות מורפולוגיה, במצב pluripotent, אשר עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים13. באופן קולקטיבי, הנתונים תמיכה PD0325901 בשילוב עם Vc ניתן לקיים מצב וייעודים העכבר ES התאים ומורפולוגיה מעולה.

Figure 1
איור 1: Vc/PD0325901 בסינרגיה המושרה מחיקה הכללית של 5mCin גנומית העכבר ES תאים. (א) 5mC תדר (5mC/C) וזמן תדר (5hmC/C) 5hmC (B)-שינוי התלויים במהלך טיפול בן 26 יום של תוסף רציפה עם Vc, 2i, Vc/2i, Vc/PD0325901 או Vc/CHIR99021, סרום המכיל בינוני. קו שגיאה מציג סטיית התקן (SD) שלושה ניתוחים חוזרים ונשנים על ידי ציטוזין c: UHPLC-MS/גברת. איור זה שונה מ- Li. et al. 25. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: שינוי בביטוי חלבונים methyltransferases Prdm14 ו- DNA (Dnmt3a, Dnmt3b ו- Dnmt3l). הלהקות הציג (משמאל לימין) התקבלו באמצעות טיפול יום 5 של תרבות סרום (בקרה), Vc, PD0325901, CHIR99021, 2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021 ו- Vc/2i, בהתאמה. הביטוי של Prdm 14 היה מוסדר למעלה, Dnmt3b ו- Dnmt3l ירד לאחר PD0325901-כולל התרבות. Dnmt3a הציג ללא שינוי. Β-טובולין הוגדר בתור הפניה פנימית. קון: שליטה; המשטרה: PD0325901; CH: CHIR99021. איור זה שונה מ- Li. et al. 25. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: Vc/PD0325901-induced שינוי בביטוי ה-mRNA של גנים pluripotent, בפעילות של phosphatase אלקליין. (א) ה-mRNA ברמה של גנים pluripotent חלקית השתנה דרך טיפול יום 5 של Vc/PD0325901 יחסית זה בתנאים סרום (בקרה). הנתונים היו מיוצגים אומר ± SD. מובהקות סטטיסטית הוערך ו- p < 0.05 היה משמעותי מבחינה סטטיסטית. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 ו ns ייצג שאינם משמעותיים. המשטרה: PD0325901. העכבר ES התאים בנסיוב 26 ימים (B) הציג תוצר חלקי מסומנים באמצעות קווים מקווקווים סגלגל לבן, בעוד Vc/PD0325901-להוסיף סרום בינוני נשמרות נהדר ומורפולוגיה מצב וייעודים (C). תמונות אלה נרכשו מ במיקרוסקופ הפוכה מחובר עם מצלמה בשדה בהיר. איור זה שונה מ- Li. et al. 25. גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבודה, הפגנו שיטה של שילוב Vc, PD0325901 כדי לקיים את העכבר ES תאים על מצב מובחן ו hypomethylated, אשר הושגה על ידי פעולה סינרגטי של קידום DNA demethylation מאת Vc ודיכוי דה נובו דנ א מתילציה על-ידי PD0325901. יתר על כן, העכבר ES התאים הראו מורפולוגיה נהדר תחת מערכת התרבות Vc/PD0325901.

לקיים יותר של המדינה של העכבר ES תאים במערכת התרבות Vc/PD0325901, ישנם כמה צעדים קריטיים. ראשית, אצוות FBS צריך להיות ממוסך מראש כדי למצוא במלאי את הטוב באצוות. כמו כן, החלפה בתדירות גבוהה של סרום מזיקה התפשטות תאים ועל קיום pluripotency. שנית, להימנע pipetting תאים במהלך בריא של המושבות תא ל השעיה תא בודד בשלב המעבר התא. שלישית, כדי לרכך השפעה שלילית של טריפסין במהלך הטיפוח תא, את טריפסין יש להסיר מיד לאחר זה מכסה התאים הכלים במהלך תא passaging. בנוסף, המדיום תרבות Vc/PD0325901 יש להחליף מדי יום עקב חוסר היציבות של Vc.

לעומת התרבות סרום קלאסי, העכבר ES התאים בתנאים Vc/PD0325901 מראים אוכלוסיה תא הומוגנית (איור 3B, C) מדינה hypomethylated, הדומה ICM, PGC. בנוסף, בהשוואה עם התרבות 2i שפותח לאחרונה, השיטה שלנו יכול לממש את hypomethylation עם קינטיקה מהיר, הניצול של מעכב יחיד (PD0325901) מפחיתה את כמות הקלט דימתיל סולפוקסיד, ובכך להקטין את הנזק לתאים. עם זאת, בשל התוספת של FBS במערכת התרבות שלנו, הפעולות כפול אמביוולנטי של FBS עלול לגרום תאית התמיינות במהלך תרבות לטווח ארוך. באופן כללי, מערכת זו תרבות הרומן הוא מתאים תחזוקה, הרחבה בקנה מידה גדול של העכבר ES תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לחשוף אין פוטנציאל ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (21435008 ו- 21327006 ל ה. ו), התוכנית האסטרטגית של מחקר עדיפות של האקדמיה הסינית למדעים (XDB14030200 ל ה. ו).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).

Tags

ביוכימיה גיליון 136 ויטמין C PD0325901 העכבר גזע עובריים תאי דנ א hypomethylation Prdm14 pluripotency
שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, C., Lai, W., Wang, H. An… More

Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter