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Biochemistry

Un metodo di cultura alternativa per mantenere l'ipometilazione genomica delle cellule staminali embrionali del Mouse utilizzando PD0325901 inibitore MEK e vitamina C

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/56391
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

Abbiamo descritto in dettaglio due protocolli basati su sostanze chimiche per la coltura di cellule staminali embrionali di topo. Questo nuovo metodo utilizza meccanismi sinergici di promuovere ossidazione Tet-mediata (da vitamina C) e reprimendo la sintesi de novo di 5-metilcitosina (da PD0325901) per mantenere l'ipometilazione del DNA e la pluripotenza delle cellule staminali embrionali di topo.

Abstract

Cellule staminali embrionali (ES) hanno la capacità di differenziarsi in uno qualsiasi dei tre strati germinali (ectoderma, mesoderma o endoderma) e possono generare molti lignaggi per la medicina rigenerativa. ES cella cultura in vitro è stata a lungo oggetto di diffuse preoccupazioni. Classicamente, le cellule di topo ES sono mantenute in fattore inibitorio di leucemia e del siero (LIF)-che contiene il media. Tuttavia, in condizioni di siero/LIF, cellule mostrano eterogeneità nella morfologia e il profilo di espressione di geni correlati alla pluripotenza e sono per lo più in uno stato metastabile. Inoltre, cellule ES coltivate presentano ipermetilazione globale, ma ingenuo ES le cellule della massa cellulare interna (ICM) e cellule germinali primordiali (PGC) sono in uno stato di hypomethylation globale. Lo stato di ipometilato di ICM e PGC è associato molto attentamente con loro pluripotenza. Per migliorare i metodi di coltura cellulare di topo ES, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo metodo basato sull'utilizzazione selettivamente combinata di due composti di piccole molecole per mantenere lo stato di DNA ipometilato e pluripotenti. Qui, vi presentiamo che il co-trattamento di vitamina C (Vc) e PD0325901 può cancellare circa il 90% di 5-metilcitosina (5mC) a 5 giorni in cellule di topo ES. Il contenuto generato 5mC è paragonabile a quella di PGC. L'indagine meccanicistica dimostra che PD0325901 in su-regola l'espressione di Prdm14 per sopprimere Dnmt3b (de novo del DNA metiltransferasi) e Dnmt3l (il cofattore di Dnmt3b), riducendo la sintesi de novo del 5mC. VC facilita la conversione di 5mC a 5-idrossimetilcitosina (5hmC) catalizzata principalmente da Tet1 e Tet2, indicante la partecipazione di demethylations di DNA sia passive che attive. Inoltre, in condizioni di Vc/PD0325901, cellule di topo ES mostrano morfologia omogenea e stato pluripotent. Collettivamente, vi proponiamo un nuovo e metodo di cultura chimica-sinergia per il raggiungimento ipometilazione del DNA e mantenimento della pluripotenza in cellule di topo ES. Il metodo chimico-dipendente della piccolo-molecola sormonta le imperfezioni più importanti della cultura del siero e detiene promessa per generare cellule ES omogenee per ulteriori applicazioni cliniche e ricerche.

Introduction

Le cellule ES sono originate da ICM di una blastocisti1. Le cellule sono in uno stato di pluripotenza e possono formare tutti i lignaggi somatici e germinale celle2. Istituzione di cellule ES fornisce la possibilità di indagare lo sviluppo processi in vitro e in grado di generare cellule di rilevanza medica per la medicina rigenerativa basata sul loro pluripotenza3.

Due gruppi intaccata stabilito le linee di cellule di topo ES nel 1981 e quando le cellule derivate dal primo embrione di topo sono state coltivate in siero bovino fetale (FBS)-che contiene il media con fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) come l'alimentatore livello1,4 . MEFs sono state inattivate mitoticamente e pre-sono stati coltivati in piatti prima della coltura delle cellule ES. MEFs forniscono il supporto per il collegamento delle cellule di topo ES e produrre fattori di crescita per promuovere la propagazione e reprimere la differenziazione5, mentre FBS offre essenziali fattori trofici e ormoni per proliferazione delle cellule. Studi successivi indicava che LIF prodotto da cellule di alimentatore la citochina chiave per auto-rinnovamento e mantenimento della pluripotenza in cellule di topo ES, e l'aggiunta di LIF nel mezzo potrebbe sostituire alimentatore celle6. Attualmente, il sostentamento delle cellule di ES del topo nel mezzo di FBS/LIF sugli alimentatori è ancora il metodo standard adottato da molti ricercatori. Tuttavia, alcuni problemi con questo approccio di cultura classica. In primo luogo, le cellule di alimentatore secernono fattori in eccesso e incontrollati e possono causare contaminazione patogena7. Per evitare questa interferenza, rivestimento della superficie dei piatti con gelatina e l'aggiunta di LIF in contenenti siero medio sono metodi alternativi per il mantenimento di cellule di topo ES senza cellule strato dell'alimentatore. Inoltre, cellule di topo ES coltivate in condizioni di siero/LIF esibiscono eterogeneità morfologica in popolazioni cellulari e anche a livello di espressione di fattori correlati al pluripotenza8. Gli studi recenti suggeriscono che in condizioni di siero/LIF, i fattori di trascrizione di nucleo di pluripotenza-correlati (tra cui SOX2, Nanog e OCT4) possono sostenere la pluripotenza attraverso LIF e WNT segnalazione; Tuttavia, in particolare, si attiva anche un segnale del fattore di crescita (FGF) del fibroblasto per attivare differenziazione8. Dovuto la duplice azione ambivalente dei fattori di trascrizione di nucleo, cellule di topo ES coltivate in siero attualmente eterogeneità, che consiste di due popolazioni intercambiabili, uno simile a ICM e un altro che assomiglia l'epiblasto innescato statale8. Inoltre, cellule di topo ES in siero esibiscono spesso globale ipermetilazione9, considerando che ICM e PGC sono in uno stato di ipometilato globale, che è strettamente collegato con la loro pluripotenza9,10.

C'è una forte domanda di sviluppare nuovi metodi per la coltura di cellule di topo ES. Diversi protocolli di miglioramento sono state istituite dal 200311 ma continua ad esserci alcune limitazioni e carenze7. Dal 2008, l'utilizzo combinato di due inibitori della chinasi della piccolo-molecola, PD0325901 (l'inibitore della chinasi di proteina mitogene-attivata (MAPK) / extracellulare-segnale-regolata della chinasi (ERK) (MEK)) e CHIR99021 (l'inibitore della glicogeno sintasi chinasi 3 (GSK3)), N2B27 medium con LIF e senza siero ha aperto nuove prospettive per coltura mouse ES cellule12. Questo nuovo medium definito è caratterizzato dall'uso di due inibitori (2i). Cellule di topo ES coltivate in medium 2i/LIF sono più omogenee in popolazioni di cellule e l'espressione dei fattori di pluripotenza. Inoltre, cellule 2i/LIF-coltivati del topo ES esibiscono ipometilazione del DNA a livello globale, che è più vicino a ICM-come le cellule9,13. Anche così, 2i cultura ha i suoi svantaggi. PD0325901 e CHIR99021 sono insolubili in acqua e generalmente sono dissolti in dimetilsolfossido (DMSO)-basato soluzione di riserva per aggiungerli nel terreno di coltura. Studi hanno dimostrato che a lungo termine e della basso-dose esposizione delle cellule a DMSO può portare a citotossicità14.

Qui, abbiamo utilizzato due composti di piccole molecole e sviluppato un nuovo metodo di coltura delle cellule di topo ES. Il metodo di cultura romanzo combina Vc e MEK inibitore PD0325901 per promuovere l'ipometilazione del DNA rapidamente e in modo efficace ad un livello paragonabile di PGC, denominato come il protocollo di coltura Vc/PD0325901. Cellule di topo ES in Vc/PD0325901-aggiunto medium contenente siero esibiscono omogeneità nella morfologia e sono sostenute in uno stato di terra. Rispetto alla cultura 2i, mouse ES cellule coltivate in condizioni di Vc/PD0325901 mostrano più veloce cinetica di demetilazione del DNA e possono raggiungere il livello di hypomethylation paragonabile a quella di PGC. Inoltre, l'uso di un inibitore singolo (PD0325901) diminuisce la quantità di input di DMSO in mezzo rispetto a quella utilizzata in 2i (PD0325901/CHIR99021) e riduce il danno alle cellule.

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Protocol

1. preparati

  1. Preparare una soluzione di 1,0 mM PD0325901 (inibitore di MEK) e 3,0 mM CHIR99021 (inibitore di GSK3).
    1. Pesare 2 mg di PD0325901 e aggiungere 4,15 mL di DMSO in un flacone di vetro ambrato.
    2. Pesare 2 mg di CHIR99021 e aggiungere 1,43 mL di DMSO in un flacone di vetro ambrato.
    3. Seguente la ricostituzione, conservare le aliquote (50 µ l/tubo in provette per PCR 200 µ l) a-20 ° C e al riparo dalla luce. Rimuovere una provetta contenente il brodo congelato da un e scongelare a temperatura ambiente prima dell'uso.
  2. Pesare 0,0176 g di Vc in 1 mL di una provetta da centrifuga e si ricostituire con 1 mL di acqua sterile ad una concentrazione finale del Priore di 100 mM da utilizzare.
  3. Inattivare FBS: incubare 500ml di FBS in un bagno di acqua a 56 ° C per 30 min.
  4. Preparare 600 mL di terreno base per la coltura di cellule di topo ES.
    1. Utilizzare una bottiglia di mezzo di DMEM/alto glucosio (500 mL) e rimuovere 40 mL.
    2. Supplemento 460 mL di medium del glucosio DMEM/alta con 20% inattivato FBS (120 mL), 1.000 LIF U/mL (60 µ l di soluzione stock di 107 U/mL), 0.1 mM non essenziali aminoacidi (NEAA) (6 mL della soluzione madre 10 mM), piruvato di sodio 1 mM (6 mL di soluzione di riserva di 100 mM) , 2 mM L-Glutammina (6 mL della soluzione madre 200 mM), 0,1 mM β-mercaptoetanolo (600 µ l di soluzione di riserva di 100 mM) e 33 IU/mL di penicillina e 33 µ g/mL di streptomicina (2 mL di soluzione (10.000 UI/mL di penicillina e 10.000 µ g/mL di streptomicina) mista penicillina-streptomicina) . Definire il terreno base come mezzo di siero.
    3. Pipettare 50 µ l di soluzione madre di PD0325901 (1.0 mM) e Vc (100 mM), rispettivamente, in 50 mL di terreno del siero (concentrazione finale: 1,0 µM PD0325901 e 100 µM Vc) e definire il mezzo come mezzo di Vc/PD0325901.
      Nota: Preparare il Vc/PD0325901 medio fresco prima dell'uso a causa dell'instabilità del Vc.
    4. Utilizzando una pipetta, trasferire 50 µ l di soluzione madre di PD0325901 (1.0 mM) e CHIR99021 (3,0 mM), rispettivamente, in 50 mL di terreno del siero (concentrazione finale: PD0325901 1.0 µM e CHIR99021 3.0 µM) e definire il mezzo come mezzo di 2i.
  5. Preparare i piatti rivestite con gelatina.
    1. Preparare la soluzione di gelatina 0,1%: sciogliere 0,3 g di gelatina in 300 mL di acqua distillata in una bottiglia di reagente di vetro con un tappo e sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 20 min. Store la soluzione sterile a temperatura ambiente.
    2. Incubare le piastre di coltura delle cellule (6 cm di diametro) con 2 mL di soluzione di gelatina di 0,1% per 15 min a temperatura ambiente e poi aspirare la gelatina. Asciugare i piatti in aria e utilizzarli all'interno di 12 h.
  6. Preparare 10 mL di mezzo in una provetta da centrifuga da 15 mL di congelamento delle cellule di topo ES: 90% FBS (9 mL) e 10% DMSO (1 mL). Utilizzare il mezzo entro 1 giorno.
  7. Preparare un contenitore di congelamento: aggiungere 100% alcool isopropilico per la linea di riempimento del contenitore congelamento e scartare il vecchio alcol isopropilico. Aggiungere nuovo alcool isopropilico direttamente dopo ogni cinque utilizzi.
  8. Rendere il buffer di digestione enzimatica: pesare 1,2114 g di polvere di Tris in 100 mL di acqua ultrapura per preparare 100 mM Tris soluzione e aggiungere concentrato di soluzione di HCl (circa 12 M) nella soluzione Tris per aggiustare il pH a 7,6 (circa 0,6 mL di soluzione di HCl concentrato).
  9. Preparare 50 mL di tampone (buffer di RIPA) del saggio di immunoprecipitazione radio: 20 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, glicerolo 20%, 0,5% NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. Completare con 1 millimetro DTT, 1 X cocktail di inibitore della proteasi e 1 mM prima del PMSF uso. Una volta aggiunto il PMSF, utilizzare il buffer entro 30 min.

2. crescere cellule di topo ES su piatti rivestite con gelatina

  1. Cellule di topo pre-calda ES (wild type, SvEv 129) cultura media, tripsina e soluzione tamponato fosfato (PBS) in un bagno di acqua a 37 ° C.
  2. Le cellule del passaggio. Aspirare il mezzo completamente dal piatto e pipettare 2 mL di PBS per i piatti da lavare le cellule.
    1. Rimuovere il PBS con una pipetta e lavare le cellule nuovo con 2 mL di PBS.
    2. Rimuovere il PBS e aggiungere 0,3 mL di tripsina-EDTA (0,25%) ad ogni piatto.
    3. Coprire l'intera pietanza con la tripsina rapidamente e quindi rimuoverlo immediatamente.
    4. Mettete la teglia in un incubatore a 37 ° C per 1 min staccare le cellule dal piatto. Prendere i piatti dall'incubatrice e aggiungere 2 mL di terreno di siero pre-riscaldato a terminare l'azione della tripsina.
    5. Dissociare le colonie di cellule in sospensione singola cella mediante risospendere con una pipetta (punta della pipetta 5ml) 10 volte.
  3. Trasferire 150 µ l di 2 mL della soluzione di cella (circa 190.000 cellule contando con un emocitometro) in un piatto nuovo rivestite con gelatina e completare con 3 mL di appena fatte Vc/PD0325901 medio per ogni piatto di cultura di 6 cm. Coltura le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
  4. Ogni 24 h durante l'incubazione, rimuovere il vecchio mezzo di cultura e aggiungere 3 mL di Vc/PD0325901-mezzo fresco nella piastra di coltura a causa dell'instabilità del confluency di Vc. Expect 70 – 80% dopo 2 – 3 giorni.
  5. Dopo aver raggiunto il confluency di 70-80%, le cellule del passaggio e continuare alla cultura come descritto nella procedura 2.2-2.4.

3. congelare e scongelare cellule di topo ES

  1. Congelare le cellule di topo ES.
    1. Staccare le cellule dai piatti con tripsina eseguendo il passaggio 2.2.
    2. Trasferire le cellule in un tubo di plastica da 15 mL e centrifugare a 800 x g e a temperatura ambiente per 3 min.
    3. Dump delicatamente il surnatante in un becher e risospendere il pellet cellulare con 1 mL di preparate sul congelamento medio. Preparare il congelamento medio 30 min prima di questo passaggio per assicurarsi che sia a temperatura ambiente prima dell'uso.
    4. Trasferire le cellule nel mezzo di un tubo del microcentrifuge 1,8 mL con una pipetta da 1 mL di congelamento e posizionare il tubo del microcentrifuge in un contenitore di congelamento. Aggiungere alcol isopropilico per la linea di riempimento del contenitore congelamento e tenerlo a temperatura ambiente prima dell'uso.
    5. Lasciare i contenitori congelamento durante la notte in un congelatore a-80 ° C.
    6. Trasferire la microcentrifuga in un contenitore di azoto liquido per fino a 2 – 3 anni.
      Nota: Non tenere le cellule nel mezzo di congelamento per un lungo tempo e trasferire rapidamente le cellule per un congelatore-80 ° C a causa della tossicità di DMSO.
  2. Scongelare le cellule di topo ES.
    1. Pre-riscaldare 50 mL di mezzo di siero in bagnomaria a 37 ° C.
    2. Prendete una fiala contenente delle cellule dal contenitore di azoto liquido e immergere il flaconcino innevato in bagnomaria a 37 ° C. Agitare velocemente nel bagno d'acqua di disgelo. Trasferire le cellule in una provetta da 15 mL con una pipetta da 1 mL. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura del siero pre-riscaldato nel tubo per diluire il medium di congelamento e poi Centrifugare a 800 x g e a temperatura ambiente per 3 min.
    3. Rimuovere il supernatante e Risospendere delicatamente i pellet cellulare con 3 mL di terreno di Vc/PD0325901 nuovo utilizzando una pipetta da 5 mL.
    4. Trasferire le cellule dal tubo da 15 mL per un piatto di gelatina-rivestito e coltura delle cellule per 24 h. cultura le celle come descritto nel passaggio 2.

4. Estrarre proteine totali da cellule

  1. Sciacquare le cellule prelevate con 1 mL di PBS e poi Centrifugare a 800 x g e a temperatura ambiente per 3 min.
  2. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare accuratamente con RIPA buffer completati con DTT, inibitore della proteasi cocktail e PMSF pipettando delicatamente. Il volume di tampone RIPA è circa 5 volte quello della cellula a pellet.
    Nota: Eseguire la risospensione delle cellule sul ghiaccio.
  3. Tenere le cellule in RIPA buffer per 30 min in ghiaccio e centrifugare a 13.000 x g e a 4 ° C per 5 min.
  4. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e conservare le aliquote a-80 ° C.
  5. Determinare la concentrazione della proteina con un kit di analisi della proteina di Bradford.

5. Estrarre il DNA dalle cellule e del DNA Digest in un singolo Nucleoside usando gli enzimi

  1. Raccogliere le cellule con tripsina come descritto ai punti 3.1.1 e 3.1.2.
  2. Eseguire l'estrazione di DNA con un kit di purificazione del DNA genomico seguendo le istruzioni del produttore.
  3. Conservare il DNA estratto in provette per centrifuga 1 mL. Aggiungere 100 µ l di acqua ultrapura nella provetta da centrifuga e sciogliere il DNA pipettando circa 15 volte. Determinare la concentrazione e valutare la qualità del DNA tramite la misura dell'assorbanza a 260 nm e 280 nm15. La concentrazione di DNA è circa 500 ng / µ l.
  4. Digest 5 µ g di DNA in un sistema di 50 µ l della soluzione: aggiungere 5 µ l di 100 mM Tris-HCl soluzione a pH 7,6 (concentrazione finale: 10 mM), 2 della fosfatasi intestinale del vitello U, 1 U dnasi I, 0,005 U serpente veleno fosfodiesterasi io e 5 µ g di DNA (calcolare il volume aggiunto secondo le misurazioni concentrazione di DNA rossa, ~ 10 µ l) in una provetta da centrifuga e aumentare il volume della soluzione a 50 µ l con acqua ultrapura. Incubare la miscela a 37 ° C durante la notte. Centrifughi la soluzione di DNA digerita a 1.000 g e a temperatura ambiente per 1 min raccogliere la soluzione il fondo delle provette.
  5. Trasferire la soluzione di DNA digerita dai tubi della centrifuga in tubi di ultra-filtrazione (un peso di molecola di taglio: 3 kDa) e centrifugare a 13.000 g e 4 ° C per 30 min rimuovere gli enzimi di digestione.
  6. Preparare i campioni per analisi 5mC e 5hmC.
    1. Per l'analisi di 5hmC: dispensare 36 µ l di soluzione di filtro per una nuova centrifuga tubo (1 mL) e 4 µ l di-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine 5' ([D3]-5hmC) con la concentrazione finale di 3 nM.
    2. Per l'analisi di 5mC: aggiungere 196 µ l di acqua ultrapura in una nuova provetta da centrifuga e dispensare 4 µ l di soluzione di filtro sul tubo (50 volte diluizione), dovuto l'alta densità di 5mC in DNA genomic. Trasferire 36 µ l della soluzione diluita in una nuova provetta da centrifuga e 4 µ l di (-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine 5' ([D3]-5mC) con la concentrazione finale di 50 nM. Uso [D3]-5hmC e [D3]-5mC come standard interno per calibrare 5hmC e 5mC, rispettivamente.
  7. Trasferire la soluzione campione in provette e conservare a 4 ° C. Analizzare 5mC e 5hmC con spettrometria di massa ultra-high-performance liquido cromatografia-triplo quadrupolo con multiplo-reazione monitoraggio (UHPLC-MS/MS (MRM)) come descritto in un precedente rapporto15.

6. analizzare 5mC e 5hmC usando UHPLC-MS/MS15

  1. Impostare vari parametri per analizzare 5mC e 5hmC utilizzando il software di UHPLC-MS.
    1. Stabilire un nuovo metodo. Aprire il software e fare clic su "File | Nuovo | Metodo". Esporre la finestra di messaggio "Method Editor" con il contenuto "Si desidera salvare le modifiche per il metodo corrente" e fare clic su "No".
    2. Costruire i parametri del campionatore. Fare clic su "Sampler | Installazione | Iniezione". Selezionare "Standard iniezione" e inserire "5 µ l a volume di iniezione".
    3. Costruire i parametri della pompa in UHPLC.
      1. Fare clic su "BinPump2 | Setup"per costruire i parametri della pompa. Impostare "Flusso" a "0,25 mL/min" e "Fermare il tempo" a "15 minuti".
      2. Impostare "Solvente B al 5%" e "Limiti di pressione" a "Max 600 bar".
      3. Fare clic su "BinPump2 | Calendario"per costruire il isocratic parametri di eluizione per analisi 5mC. Fare clic su "Aggiungi" per aggiungere una riga. Input "0.00" a "Time" e "5.0" a "B %". Fare clic su "Aggiungi" una volta di più per aggiungere una nuova riga. Input "15.00" a "Time" e "5.0" a "B %".
      4. Fare clic su "BinPump2 | Calendario"per costruire i parametri di eluizione di pendenza per l'analisi di 5hmC. Fare clic su "Append per aggiungere una riga. Input di 0.00 a tempo e 5.0 "B %". Fare clic su "Aggiungi" una volta di più per aggiungere una nuova riga. Input "3.00" a "Time" e "5.0" a "B %". Fare clic su "Aggiungi" per un altro 6 volte aggiungere 6 righe. Input "3.01" al "Tempo" e "15,0" a "B %", "6.00" al "Tempo" e "15,0" a "B %", "6.01" al "Tempo" e "100" al "B %", "10.00" al "Tempo" e "100,0" a "B %", "10.01" al "Tempo" e "5.0" a "B %", "15.00" a "Time" e "5.0" a "B %" in sequenza.
        Nota: Eseguire l'analisi di 5mC e 5hmC singolarmente a causa delle condizioni di separazione diversa di UHPLC.
    4. Costruire i parametri della temperatura del vano colonna (TCC) in UHPLC.
      Fare clic su "TCC | Installazione | temperatura (a sinistra) "e"30 ° C"in ingresso.
    5. Stabilire i parametri di QQQ-MS/MS.
      1. Fare clic su "MS QQQ | Fermare il tempo | No limite/come pompa"," sorgente di ioni | ESI"," tempo di filtraggio | Larghezza del picco: 0,07 min ". Impostare "segmenti di tempo: ora di inizio: 0"; "Tipo di scansione: MRM"; "Valore Div: ms"; "Delta EMV (+): 200" e "Delta EMV (-): 0".
      2. Costruire i parametri di monitoraggio le transizioni di 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC e D3-5hmC
        1. Fare clic su "MS QQQ | Acquisizione | Segmenti di scansione: abitare: 90"; "Fragmentor: 90"; "Energia di collisione: 5"; "Acceleratore tensione di cella: 4" e "polarità: positivo".
        2. Input "5mC" a "Compound nome", "242" alle "Precursore Ion", "126" al "Prodotto Ion" per l'analisi di 5mC. Cliccare col tasto destro e selezionare "Add row" per aggiungere una nuova riga. Ingresso "D3-5mC" alle "Compound nome", "245" alle "Precursore Ion", "129" al "Prodotto Ion" per D3-5mC analisi.
        3. Un altro supplemento tre righe utilizzando la stessa modalità. Ingresso "dC" a "Compound nome", "228" alle "Precursore Ion", "112" al "Prodotto Ion" per l'analisi di dC. Input "5hmC" a "Compound nome", "258" alle "Precursore Ion", "142" al "Prodotto Ion" per l'analisi di 5hmC. Ingresso D3-5hmC a nome Compound, "261" alle "Precursore Ion", "145" al "Prodotto Ion" per D3-analisi di 5hmC.
      3. Costruire i parametri della sorgente del gas. Fare clic su "MS QQQ | Fonte | Parametri di origine: Gas Temp: 300 ° C "; "Flusso del gas: 11 L/min"; "Nebulizzatore: 15 psi"; "Positivo-capillare: 3500 V".
      4. Salvare il metodo proposto. Fare clic su "MS QQQ | Strumento | Metodo come Save". Selezionare un percorso per il metodo proposto da "Directory" e dare un nome per il metodo inserendo il contenuto nel "Metodo", ad esempio: analisi 5mC e 5hmC.
  2. Separazione UHPLC e analisi di MS/MS di mononucleosides
    1. Preparare la fase mobile per 5mC e citosina (C) analisi: formare la fase mobile di soluzione A e B. soluzione a: 500 mL di acqua ultrapura con 500 µ l di acido formico (concentrazione finale: 0,1%) e la soluzione b: 500 mL di metanolo al 100%. Mescolare la soluzione A e B alle 95: 5 (v: v) come fase mobile per eluire 5mC e C (impostato nel passaggio 6.1.3.3). Impostare la portata a 0,25 mL/min (impostato nel passaggio 6.1.3.1).
    2. Preparare la fase mobile di solvente A e B per l'analisi di 5hmC. A solvente è 2,0 mM NH4HCO3 acquoso soluzione (pH 9.0) (500 mL), ed è solvente B al 100% di metanolo (500 mL). 5hmC separata da un'eluizione di pendenza ottimizzata: 0-3 min, 95% e 5,0% B una (v: v); 3-6 min, 15,0% B e 85% A; 6-10 min, 100% B; 10-15 min, 5,0% B e 95% A (impostato nel passaggio 6.1.3.4). Impostare la portata a 0,25 mL/min (impostato nel passaggio 6.1.3.1).
  3. Utilizzare electrospray MS/MS con modalità di gestione record di messaggistica (impostata nel passaggio 6.1.5.1) per analizzare l'eluizione dalla colonna e adottare la modalità ioni positivi (impostata nel passaggio 6.1.5.2.1).
    1. Monitorare le transizioni: 5mC, m/z 242→126 (energia di collisione, 5 eV); [D3]-5mC, 245→129 m/z (5 eV); dC, 228→112 m/z (5 eV); 5hmC, 258→142 m/z (5 eV); [D3]-5hmC, 261→145 m/z (5 eV) (impostato nel passaggio 6.1.5.2.2).
    2. Impostare le tensioni capillare e frammento a +3,500 V (impostato nel passaggio 6.1.5.3) e 90 V (impostato nel passaggio 6.1.5.2.1), rispettivamente.
    3. Impostare il volume di iniezione a 5 µ l e analizzare ciascun campione 3 volte (impostati nel passaggio 6.1.2). Impiegare le corrispondenti curve standard per valutare la quantità di 5mC e 5hmC.
      1. Tracciare la curva standard della 5mC: trasferire 1 – 50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, concentrazione finale) soluzione standard di 5mC nella centrifuga tubi e aggiungere 50 nM [D3]-5mC ai tubi. Supplemento il volume totale da 50 µ l. eseguire l'analisi di standard 5mC seguendo le istruzioni per il campione di 5mC (passo 6).
      2. Costruire la curva standard di 5hmC: trasferire 1 – 20 nM (1, 2, 5, 10, 20 nM, concentrazione finale) soluzione standard di 5hmC per provette da centrifuga e aggiungere 3 nM [D3]-5hmC ai tubi. Supplemento il volume totale da 50 µ l. eseguire l'analisi di standard 5hmC seguendo le istruzioni per l'esempio di 5hmC (passaggio 6).

7. analizzare la significatività statistica

  1. Eseguire l'analisi statistica utilizzando il software.
    1. Aprire il software e selezionare "Colonna" in "nuova tabella e grafico". Impostare i parametri come segue: "dati di esempio | Inizio con una tabella dati vuota"; "Scegliere un grafico, la prima modalità"; "Graphing replicati o barre di errore | Trama | Dire con SEM".
    2. Clicca su "Crea" per inserire i tre replicati del gruppo Vc/PD0325901-trattati e di controllo nella riga "A" e "B", rispettivamente. Selezionare i dati di sei e fare clic su "Analyze" in "Analisi".
    3. Selezionare"t test (e i test non parametrici)" in "Analisi di colonna" e fare clic su "OK" per accedere all'interfaccia successiva.
    4. Impostare i parametri come segue: "Scegli prova | Nome del test | Test di spaiato t ; Opzioni | Due code"; "Intervalli di confidenza: 95%"; "Cifre significative | Visualizza 4 cifre significative". Fare clic su "OK" per acquisire il valore di p tra il trattamento di controllo e Vc/PD0325901.
  2. Valutare la significatività statistica tra il controllo e i gruppi sperimentali che impiegano due code e spaiata dello studente t-16di prova.
    Nota: p < 0,05 denota la differenza che possiede la significatività statistica. * p < 0,05, * * p < 0.01, * * * p < 0,001.

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Representative Results

VC/PD0325901 indotto sinergicamente la cancellazione globale delle cellule di topo ES. Cellule di topo ES in siero esibiscono ipermetilazione del DNA, mentre le cellule pluripotenti ICM e PGC mostrano la cancellazione globale di metilazione del DNA e lo stato di ipometilato è associato molto attentamente con loro pluripotenza9,10.

In precedenza, noi ed altri trovato che Vc può migliorare Tet-mediata 5mC demetilazione15,17. Nel frattempo, 2i inoltre è stato trovato per inibire la sintesi de novo di 5mC. Nel contesto di questi risultati, abbiamo proposto ulteriormente la manipolazione sinergica delle cellule di ES del mouse utilizzando Vc e 2i insieme. Dopo l'analisi di UHPLC-MS/MS, abbiamo trovato che Vc e 2i completati nel medium contenente siero può ridurre drasticamente il contenuto di 5mC da 3,2 a 0,33 a 100 C (~ 90% 5mC perdita) di giorno 11 in cellule di topo ES (Figura 1A). Al contrario, Vc o 2i-trattamento da solo solo ha causato la cancellazione 58% con il livello costante a 1,4% 5mC o 61% riduzione al livello del 1,3% 5mC.

Il mezzo di 2i è composto di inibitore di MEK PD0325901 e inibitore di GSK3β CHIR99021. Successivamente, indaghiamo quale componente induce la perdita globale di 5mC durante il co-trattamento di Vc e 2i. Interessante, Vc/PD0325901 ha causato un declino più veloce nei livelli di metilazione del DNA di Vc/2i. VC/PD0325901 raggiunto livelli 5mC costante (~0.33% 5mC) dopo 5 giorni, mentre Vc/2i hanno raggiunto un livello paragonabile al giorno 11. Al contrario, il supplemento di CHIR99021 parzialmente ha soppresso la demetilazione del DNA Vc-innescato (Figura 1A). Questi dati suggeriscono chiaramente che PD0325901 a 2i contribuisce per il hypomethylation globale del DNA genomico in cellule di topo ES, mentre CHIR99021 di 2i inibisce parzialmente la cancellatura di 5mC. Di conseguenza, speculiamo che il più veloce demetilazione del DNA indotto da Vc/PD0325901 rispetto al Vc/2i può essere attribuita all'inibizione parziale di CHIR99021 su demetilazione.

Abbiamo supposto che la cancellazione globale di 5mC in cellule di topo ES indotta da Vc/PD0325901 può essere parzialmente pertinente per la valorizzazione di demetilazione del DNA. Quindi, abbiamo esaminato i prodotti di ossidazione genomica di 5mC. È stato segnalato che 5mC può essere convertito in 5hmC dall'ossidazione catalitica di famiglia diossigenasi Tet, che dipendono da Fe (II) e 2-ossoglutarato18,19. 5hmC genomico può essere diluito da DNA replica20. Inoltre, 5hmC può essere ulteriormente ossidata di diossigenasi Tet per produrre 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxylcytosine (5caC), che può essere asportato in modo efficiente di timina del DNA glicosilasi (TDG) per recuperare non metilato citosina, che indica un DNA attivo demetilazione21,22.

In linea con il precedente lavoro15, trattamento contenente Vc (Vc, Vc/2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021) drammaticamente aumentata frequenza di 5hmC (5hmC/106 C) dopo 1 giorno e, successivamente, 5hmC livelli sono diminuito gradualmente (Figura 1B) a causa della progressiva riduzione del substrato 5mC. In particolare, Vc/PD0325901 e Vc/2i hanno mostrato più veloce cinetica di 5hmC perdita rispetto al Vc e Vc/CHIR99021 a causa della riduzione più veloce di 5mC. Inoltre, abbiamo anche osservato che al giorno 1, Vc-trattamento ha stimolato la generazione di più di 5hmC rispetto a Vc/CHIR99021, che indica che CHIR99021 parzialmente ha soppresso la produzione indotta da Vc di 5hmC e ha inibito la demetilazione del DNA. perdita di 5hmC nel trattamento di 2i dovrebbe essere attribuito alla diminuzione del substrato 5mC. Presi insieme, questi risultati hanno dimostrato che attività di demetilazione Vc-aumentata del DNA ha contribuito parzialmente al hypomethylation sinergicamente in co-trattamento di Vc/PD0325901 e Vc/2i.

Entrambi di Habibi et al. 23 e von Meyenn et al. 24 ha anche riferito che cellule di topo ES 2i condizioni ha mostrato globale del DNA hypomethylation e ingenuo pluripotenza. livelli di 5mc ha mostrati diminuiscono gradualmente e raggiunto uno stato stazionario (~ 1% 5mC) a 12 – 14 giorni dopo il ritorno dal siero a 2i. Nel sistema cultura Vc/PD0325901, il co-trattamento causato demetilazione del DNA più veloce e ha raggiunto un livello stabile (0,33% 5mC) dopo il completamento del Vc/PD0325901 nel mezzo di siero per 5 giorni, a causa dell'effetto sinergico di Vc/PD0325901. Il livello raggiunto metilato (0,33% 5mC) era pronouncedly inferiore a quello in condizioni di 2i segnalate da Habibi et al. e von Meyenn et al., mentre i livelli di 5hmC erano più elevati a causa della generazione promossa di Vc.

PD0325901 elevata espressione di Prdm14 per reprimere Dnmt3b e Dnmt3l, ma non Dnmt3a25. Per studiare l'azione di PD0325901 nell'indurre perdita di 5mC, è stata esaminata una serie di espressione della proteina 5mC-correlate, compresa la manutenzione (Dnmt1) e de novo (Dnmt3a e Dnmt3b) methyltransferases del DNA e loro cofattore (Uhrf1 e Dnmt3l) e regolamento della proteina (Prdm14) 8,9,26. Dopo l'analisi Western blot, Prdm14 pronouncedly è stato elevato in PD0325901, tra cui cultura (Figura 2). Al contrario, Dnmt3b e suo cofattore Dnmt3l hanno mostrato notevole giù-regolamento dell'espressione della proteina in PD0325901, tra cui trattamento (Figura 2). CHIR99021 trattamento non ha mostrato o lieve effetto sul livello di Prdm14, Dnmt3b e Dnmt3l. L'espressione di Dnmt3awas non è cambiato e la causa è chiara. Inoltre, la manutenzione del DNA metiltransferasi Dnmt1 ed il relativo fattore di targeting Uhrf1 anche non hanno mostrato alterazione e i dati non sono stati indicati.

Recenti studi hanno indicato che Prdm14 può reclutare polycomb repressive complex 2 (PRC2) di alcuni promotori di geni di reprimere la loro espressione, ad esempio de novo del DNA metiltransferasi (Dnmt3a e Dnmt3b) e loro cofattore (Dnmt3l) e contribuisce alla mantenere il hypomethylation sotto 2i condizioni8,27. I nostri dati hanno rivelato che PD0325901 elevato il livello di espressione di Prdm14 per inibire Dnmt3b e Dnmt3l e ridotta sintesi di genomica 5mC de novo dal meccanismo.

Per esplorare il mantenimento della pluripotenza delle cellule di topo ES in Vc/PD0325901 condizioni, sono stati esaminati i livelli di espressione di mRNA di parecchi fattori di pluripotenza-collegata di core, e questi fattori sono stati confermati per svolgono un ruolo fondamentale nel pluripotenza28. Analisi in tempo reale di PCR ha trovato che Oct4, SOX2, Esrrb e Sall4 hanno mostrato i livelli di espressione uniforme attraverso 5 giorni di trattamento con Vc/PD0325901 in contrasto con la cultura del siero (Figura 3A). Nanog e Tcf3 aumentato 1,3 e 1.6-fold, rispettivamente. Al contrario, Klf4 ha mostrato 42% giù-regolamento e Rex1 solo sono diminuite di circa il 12%. Questi risultati indicano che il co-trattamento Vc/PD0325901 indotto diverse alterazioni nell'espressione dei fattori di pluripotenza; Tuttavia, Oct4 e SOX2, il maggior parte dei fattori fondamentali, mantenuto quasi costanti livelli di espressione.

Successivamente, un'analisi della fosfatasi alcalina (AP) è stata effettuata per valutare se cellule di topo ES erano in uno stato indifferenziato o differenziato. Foto di cellule (Figura 3B e 3C) sono stati ottenuti da una fotocamera collegata a un microscopio invertito con amplificazione di 10 volte da una lente obiettiva. Dopo la coltivazione continua di 26 giorni in Vc/PD0325901-aggiunto medio del siero, le cellule di topo ES ha mostrato la morfologia omogenea. Inoltre, quasi tutte le cellule erano macchiate viola-nero e ha esibito un sfera-come stato senza conseguenza (Figura 3), mostrando uno stato indifferenziato. Al contrario, in condizioni di siero, una parte delle cellule del mouse ES al giorno 26 erano viola-nero dopo la macchiatura e aveva uno stato di sfera-come nella morfologia, mentre altri hanno presentato il colore chiaro con divulgazione contrassegnati da linee bianche in ovale tratteggiate (Figura 3B); Ciò ha indicato che le cellule coltivate in siero del mouse ES erano eterogenee nella morfologia e in uno stato di pluripotent, che è coerenza con precedenti rapporti13. Collettivamente, i dati supportati che PD0325901 in combinazione con Vc può sostenere morfologia eccellente e uno stato indifferenziato nelle cellule ES del mouse.

Figure 1
Figura 1: Vc/PD0325901 indotto sinergico globale cancellatura delle cellule di topo ES genomico 5mCin. (A) 5mC frequenza (5mC/C) e (B) 5hmC frequenza (5hmC/C) tempo-dipendente cambia durante un trattamento di 26 giorni di integratore continuo con Vc, 2i, Vc/2i, Vc/PD0325901 o Vc/CHIR99021 nel liquido contenente siero medio. Barra di errore Mostra la deviazione standard (SD) da tre analisi ripetute di citosina c: UHPLC-MS/MS.. Questa figura è stata modificata da Li et al. 25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: L'alterazione di espressione della proteina di Prdm14 e DNA metiltransferasi (Dnmt3a, Dnmt3b e Dnmt3l). Le bande presentate (da sinistra a destra) sono state ottenute attraverso un trattamento di 5 giorni di cultura del siero (controllo), Vc, PD0325901, CHIR99021, 2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021 e Vc/2i, rispettivamente. L'espressione di Prdm 14 era up-regolato e Dnmt3b e Dnmt3l è diminuito dopo PD0325901, tra cui cultura. Dnmt3a non ha esibito cambiamento. Β-tubulina è stato impostato come il riferimento interno. Svantaggi: Controllo; PD: PD0325901; CH: CHIR99021. Questa figura è stata modificata da Li et al. 25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Vc/PD0325901-indotta alterazione nell'espressione di mRNA di geni pluripotenti e nell'attività della fosfatasi alcalina. (A) il mRNA livello dei geni pluripotenti parziale è stato modificato attraverso un trattamento di 5 giorni di Vc/PD0325901 rispetto a quello in condizioni di siero (controllo). I dati sono stati rappresentati come media ± SD La significatività statistica è stata valutata e p < 0,05 era statisticamente significativa. * p < 0,05, * * p < 0.01, * * * p < 0,001 e ns rappresentati non significativo. PD: PD0325901. Cellule di topo ES in siero per 26 giorni (B) ha esibito parziale escrescenza segnato da linee tratteggiate ovale bianche mentre Vc/PD0325901-aggiunto siero medio mantenuto grande morfologia e uno stato indifferenziato (C). Queste immagini sono state acquisite da un microscopio invertito collegato con una macchina fotografica nel campo luminoso. Questa figura è stata modificata da Li et al. 25. scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Nel lavoro, abbiamo dimostrato un metodo novello di combinando Vc e PD0325901 per sostenere le cellule di topo ES a uno stato indifferenziato e ipometilato, che è stato raggiunto da un'azione sinergica di promuovere la demetilazione del DNA di Vc e soppressione de novo del DNA metilazione di PD0325901. Inoltre, cellule di topo ES ha mostrato grande morfologia sotto il sistema di coltura Vc/PD0325901.

Per meglio sostenere lo stato di cellule di topo ES nel sistema Vc/PD0325901 cultura, ci sono alcuni passaggi critici. In primo luogo, FBS batch devono essere attentamente selezionati per trovare e stock migliori lotti; Inoltre, frequente sostituzione del siero è dannoso per la proliferazione delle cellule e per il mantenimento della pluripotenza. In secondo luogo, evitare sopra cellule di pipettaggio durante la dissociazione delle colonie delle cellule ad una sospensione di singola cellula in fase di passaggio delle cellule. In terzo luogo, per attenuare l'effetto negativo della tripsina durante la coltivazione delle cellule, la tripsina deve essere rimosso immediatamente dopo che esso copre le cellule nei piatti durante il passaggio delle cellule. Inoltre, il terreno di coltura di Vc/PD0325901 dovrebbero essere sostituito ogni giorno a causa dell'instabilità del Vc.

In confronto con la cultura classica del siero, cellule di topo ES in Vc/PD0325901 condizioni mostrano una popolazione più omogenea delle cellule (Figura 3B, C) e uno stato di ipometilato, che assomiglia a ICM e PGC. Inoltre, rispetto alla cultura 2i sviluppata di recente, il nostro metodo in grado di realizzare il hypomethylation con la cinetica più veloce, e l'utilizzo di un singolo inibitore (PD0325901) riduce la quantità di input di DMSO, diminuendo così il danno alle cellule. Tuttavia, grazie all'aggiunta di FBS nel nostro sistema di cultura, le azioni di duale ambivalente FB possono causare la differenziazione delle cellule durante la coltura a lungo termine. Nel complesso, questo sistema di coltura romanzo è adatto per la manutenzione e l'espansione in larga scala di cellule di topo ES.

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Disclosures

Gli autori non divulgare nessun potenziali conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da National Foundation Natural Science of China (21435008 e 21327006 di H.W.) e il programma di ricerca di priorità strategica dell'Accademia cinese delle scienze (XDB14030200 di H.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

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Le cellule staminali embrionali di biochimica problema 136 vitamina C PD0325901 mouse ipometilazione del DNA Prdm14 pluripotenza
Un metodo di cultura alternativa per mantenere l'ipometilazione genomica delle cellule staminali embrionali del Mouse utilizzando PD0325901 inibitore MEK e vitamina C
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Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

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