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Biochemistry

Un método de cultura alternativa para mantener la hipometilación genómica de células madre embrionarias del ratón usando MEK inhibidor PD0325901 y vitamina C

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/56391
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

Describimos en detalle dos protocolos basados en químicos para el cultivo de células madre embrionarias de ratón. Este nuevo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidación mediada por Tet (vitamina C) y reprimiendo la síntesis de novo de la 5-METILCITOSINA (por PD0325901) para mantener el hypomethylation de la DNA y pluripotencia de células madre embrionarias de ratón.

Abstract

Las células madre embrionarias (ES) tienen el potencial de diferenciarse en cualquiera de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo o ectodermo) y pueden generar muchos linajes para la medicina regenerativa. ES la célula cultura en vitro ha sido objeto de preocupación generalizada. Clásicamente, se mantienen las células de ratón ES en factor inhibitorio del suero y la leucemia (LIF)-que contiene el medio. Sin embargo, bajo condiciones de suero/LIF, las células muestran heterogeneidad en la morfología y el perfil de expresión de genes relacionados con la pluripotencia y sobre todo en un estado metaestable. Por otra parte, las células cultivadas ES exhiben hipermetilación global, pero ingenuo ES las células de la masa celular interna (ICM) y células de germen primordiales (PGCs) son en un estado de hipometilación global. El estado de hypomethylated de ICM y PGCs está estrechamente relacionado con su pluripotencia. Para mejorar los métodos de cultivo de células de ratón ES, recientemente hemos desarrollado un nuevo método basado en la utilización selectiva combinada de dos compuestos de moléculas pequeñas para mantener el estado de hypomethylated y pluripotentes de ADN. Aquí, presentamos el co tratamiento de vitamina C (Vc) y PD0325901 puede borrar cerca de 90% de 5-METILCITOSINA (5mC) en 5 días en células ES de ratón. El contenido generado 5mC es comparable a la de PGCs. La investigación mecanicista demuestra que PD0325901 para arriba-regula la expresión Prdm14 para suprimir la Dnmt3b (metiltransferasa de ADNde novo ) y Dnmt3l (el cofactor de Dnmt3b), reduciendo la síntesis de novo de 5mC. VC facilita la conversión de 5mC 5-hidroximetilcitosina (5hmC) catalizado principalmente por Tet1 y Tet2, indicando la participación de demethylations de ADN activos y pasivos. Por otra parte, bajo condiciones de Vc/PD0325901, las células ES de ratón muestran morfología homogénea y estado pluripotente. Colectiva, proponemos una novela y un método de cultura química-sinergia para lograr hypomethylation de la DNA y el mantenimiento de la pluripotencia en las células ES de ratón. El método de química dependiente de molécula pequeña supera las deficiencias principales de la cultura de suero y tiene promesa de generar células de ES homogéneas para más aplicaciones clínicas e investigaciones.

Introduction

Células madre embrionarias se originan del ICM de un blastocisto1. Las células están en un estado de pluripotencia y pueden formar todos los linajes somáticos y del germline las células2. Creación de células madre embrionarias ofrece la oportunidad de investigar el desarrollo de procesos en vitro y puede generar células de importancia médica para la medicina regenerativa basada en su pluripotencia3.

Establecido dos grupos seminally las líneas de células ES de ratón en 1981 y cuando las células derivadas del embrión temprano de ratón fueron cultivadas en suero fetal bovino (FBS)-que contiene medio con fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) como el alimentador capa1,4 . MEFs fueron inactivadas mitotically y crecieron los platos antes de cultivar células madre embrionarias. MEFs proporcionan soporte para el accesorio de células de ratón ES y producen factores de crecimiento para promover la propagación y reprimir la diferenciación5, mientras que FBS ofrece factores tróficos esenciales y hormonas para la proliferación celular. Estudios posteriores indicaron que LIF producido por las células de alimentador estaba de la citoquina clave para la auto renovación y mantenimiento de la pluripotencia en las células ES de ratón, y la adición de LIF en el medio podría sustituir células de alimentador6. En la actualidad, el mantenimiento de las células ES de ratón en medio de la FBS/LIF en alimentadores sigue siendo el método estándar adoptado por muchos investigadores. Sin embargo, algunos problemas con este enfoque de la cultura clásica. En primer lugar, alimentador células secretan factores exceso y sin control y pueden causar contaminación patógena7. Para evitar esta interferencia, cubriendo la superficie de los platos con gelatina y la adición de LIF en suero que contiene medio son métodos alternativos para mantener las células de ratón ES sin células de la capa de alimentador. Además, las células ES de ratón cultivadas bajo condiciones de suero/LIF exhiben heterogeneidad morfológica en poblaciones de la célula e incluso en el nivel de expresión de factores relacionados con la pluripotencia8. Estudios recientes sugieren que bajo condiciones de suero/LIF, los factores de transcripción básicos relacionados con la pluripotencia (incluyendo OCT4, SOX2 y Nanog) pueden mantener la pluripotencialidad LIF y WNT de señalización; sin embargo, en particular, también activan una señal de fibroblastos factor de crecimiento (FGF) para activar la diferenciación8. Debido a la doble acción ambivalente de los factores de transcripción del núcleo, células ES de ratón cultivadas en suero presentan heterogeneidad, consistiendo en dos poblaciones intercambiables, uno similar al ICM y otro parecido al epiblasto preparado estado8. Por otra parte, las células de ratón ES en suero a menudo muestran hipermetilación global9, mientras que ICM y PGCs se encuentran en un estado de hypomethylated global, que está estrechamente vinculado con su pluripotencia9,10.

Existe una demanda considerable para desarrollar nuevos métodos para el cultivo de células ES de ratón. Se han establecido varios protocolos mejorados desde 200311 pero sigue habiendo algunas limitaciones y defectos7. Desde 2008, la utilización combinada de dos inhibidores de la cinasa de molécula pequeña, PD0325901 (inhibidor de la cinasa de proteína activada por mitógeno (MAPK) / extracelular regulada por señal quinasa (ERK) (MEK)) y CHIR99021 (el inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3)), en N2B27 medio con LIF y sin suero ha abierto nuevas perspectivas para células de ratón cultivo ES12. Este nuevo medio definido se caracteriza por el uso de dos inhibidores (2i). Las células ES de ratón cultivadas en medio 2i/LIF son más homogéneas en poblaciones celulares y la expresión de factores de pluripotencia. Además, las células de ratón 2i/LIF-cultivadas ES objeto expuesto hypomethylation de la DNA a nivel mundial, que está más cerca de ICM-como las células9,13. Aún así, la cultura 2i tiene sus desventajas. PD0325901 y CHIR99021 son insolubles en agua y generalmente se disuelven en dimetil sulfóxido (DMSO)-basado en la solución para añadir en medio de cultivo. Los estudios han demostrado a largo plazo y dosis bajas de exposición de las células a DMSO puede llevar a citotoxicidad14.

Aquí, utilizamos dos compuestos de moléculas pequeñas y desarrolló un nuevo método de cultivo de células ES de ratón. El método de cultivo novela combina Vc y MEK inhibidor PD0325901 para promover el hypomethylation de la DNA rápidamente y con eficacia a un nivel comparable de PGC, nombrado como el protocolo de cultivo de Vc/PD0325901. Células ES de ratón en Vc/PD0325901-agregado que contiene el suero medio exhiben homogeneidad en morfología y se mantienen en un estado de tierra. En comparación con cultura de 2i, células ES de ratón cultivadas bajo condiciones de Vc/PD0325901 exhiben cinética más rápida de la desmetilación del ADN y pueden alcanzar el nivel de la hipometilación comparable a la del PGC. Además, el uso de un único inhibidor (PD0325901) disminuye la cantidad de entrada de DMSO en medio en comparación con la utilizada en 2i (PD0325901/CHIR99021) y reduce el daño a las células.

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Protocol

1. preparaciones

  1. Preparar una solución de 1,0 mM PD0325901 (inhibidor de la MEK) y 3,0 mM CHIR99021 (inhibidor GSK3).
    1. Pesar 2 mg de PD0325901 y 4,15 mL de DMSO en un frasco de vidrio ámbar.
    2. Pesar 2 mg de CHIR99021 y 1,43 mL de DMSO en un frasco de vidrio ámbar.
    3. Siguiente reconstitución, almacenar alícuotas (50 μl/tubo en tubos PCR de 200 μL) a-20 ° C y protegido de la luz. Quitar un tubo que contiene el caldo congelado del congelador y descongelar a temperatura ambiente antes de usar.
  2. Pesar 0,0176 g de Vc en 1 mL de un tubo de centrífuga y reconstituir con 1 mL de agua estéril a una concentración final de antes 100 mM.
  3. Inactivar FBS: incubar 500 mL de SBF en un baño de agua a 56 ° C durante 30 minutos.
  4. Preparar 600 mL de medio de base para el cultivo de células ES de ratón.
    1. Utilice una botella de DMEM alta glucosa medio (500 mL) y saque 40 mL.
    2. Suplemento 460 mL de medio DMEM alta glucosa 20% inactivado FBS (120 mL), 1.000 U/mL LIF (60 μL de solución stock de 107 U/mL), 0.1 mM no aminoácidos esenciales (AANE) (6 mL de solución stock de 10 mM), piruvato de sodio 1 mM (6 mL de solución stock de 100 mM) , 2 mM L-glutamina (6 mL de solución stock de 200 mM), 0,1 mM β-mercaptoetanol (600 μl de solución stock de 100 mM) y 33 UI/mL penicilina y estreptomicina 33 de μg/mL (2 mL de penicilina-estreptomicina mezclada solución (10,000 UI/mL de penicilina y estreptomicina 10.000 de μg/mL)) . Definir el medio de base como medio de suero.
    3. Pipetee 50 μl de solución de PD0325901 (1,0 mM) y Vc (100 mM), respectivamente, en 50 mL de medio de suero (concentración final: 1,0 μm PD0325901 y 100 μm Vc) y definir el medio como medio de Vc/PD0325901.
      Nota: Preparar el fresco medio Vc/PD0325901 antes de su uso debido a la inestabilidad de la Vc.
    4. Mediante una pipeta, transferir 50 μl de solución de PD0325901 (1,0 mM) y CHIR99021 (3,0 mM), respectivamente, en 50 mL de medio de suero (concentración final: PD0325901 1.0 μm y CHIR99021 3.0) y definir el medio como medio de 2i.
  5. Preparar los platos recubiertos de gelatina.
    1. Preparar la solución de gelatina 0.1%: 0,3 g de gelatina se disuelven en 300 mL de agua ultrapura en un frasco de reactivo con una tapa y esterilizar en autoclave a 121 ° C por 20 min tienda la solución estéril a temperatura ambiente.
    2. Incubar los platos de cultivo celular (6 cm diámetro) con 2 mL de solución al 0.1% gelatina durante 15 min a temperatura ambiente y luego aspirar la gelatina. Secar los platos en el aire y use dentro de las 12 h.
  6. Preparar 10 mL de células de ratón ES congelación medio en un tubo de centrífuga de 15 mL: 90% FBS (9 mL) y 10% DMSO (1 mL). Usar el medio dentro de 1 día.
  7. Preparar un recipiente congelación: Añadir 100% de alcohol isopropílico a la línea de llenado del recipiente de congelación y desechar el viejo alcohol isopropílico. Añadir nuevo alcohol isopropílico directamente después de cada uso quinto.
  8. Hacer que el buffer de digestión enzimática: pesaje 1,2114 g de Tris en polvo en 100 mL de agua ultrapura para preparar 100 mM Tris solución y añadir concentrado solución HCl (aproximadamente 12 M) en la solución de Tris para ajustar el pH a 7,6 (aproximadamente 0,6 mL de solución concentrada de ácido clorhídrico).
  9. Preparar 50 mL de tampón de ensayo de inmunoprecipitación de radio (almacenador intermediario RIPA): 20 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, glicerol al 20%, 0.5% NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. Suplemento con 1 mM DTT, 1 X inhibidor de la proteasa coctel y 1 mM antes de PMSF usar. Una vez que se agrega el PMSF, utilice el búfer dentro de 30 minutos.

2. crecer células ES de ratón en platos recubiertos de gelatina

  1. Las células de ratón previamente caliente ES (tipo salvaje, 129 SvEv) cultura medio, tripsina y solución amortiguada de fosfatos (PBS) en un baño de agua a 37 ° C.
  2. Las células de paso. Aspire el medio totalmente de la parabólica y la pipeta 2 mL de PBS a los platos para lavar las células.
    1. Quitar el PBS con una pipeta y lavar las células otra vez con 2 mL de PBS.
    2. Retirar el PBS y añadir 0,3 mL de tripsina-EDTA (0.25%) a cada plato.
    3. Cubra el plato entero con la tripsina rápidamente y retire inmediatamente.
    4. Poner el plato en una incubadora a 37 ° C durante 1 min separar las células del plato. Los platos de la incubadora y añadir 2 mL de suero precalentado medio para terminar la acción de la tripsina.
    5. Disocian las colonias de células en una suspensión unicelular de resuspender con una pipeta (punta de la pipeta de 5 mL) 10 veces.
  3. Transferencia 150 μL de 2 mL de la solución de células (células aproximadamente 190.000 contando con un hemocitómetro) en una nueva placa de cubierta de gelatina y complementar con 3 mL de medio de Vc/PD0325901 recién hecho por la placa de cultivo de 6 cm. Cultura de las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2.
  4. Cada 24 h durante la incubación, retirar el medio de cultivo antiguo y añadir 3 mL de Vc/PD0325901-medio fresco en el plato de la cultura debido a la inestabilidad de la confluencia de Vc. esperar 70 – 80% después de 2-3 días.
  5. Después de llegar a 70-80% de confluencia, paso de las células y continuar a la cultura como se describe en los pasos 2.2 – 2.4.

3. congelar y descongelar las células ES de ratón

  1. Congelar las células ES de ratón.
    1. Separar las células de los platos con tripsina, siguiendo el paso 2.2.
    2. Transferir las células a un tubo de plástico de 15 mL y centrifugar a 800 x g y temperatura ambiente por 3 minutos.
    3. Volcar suavemente el sobrenadante en un vaso de precipitados y resuspender el sedimento celular con 1 mL de recién hecho medio de congelación. Preparar la congelación medio 30 min antes de este paso para que esté a temperatura ambiente antes de usar.
    4. Transferencia de las células en medio a un tubo de microcentrífuga de 1.8 mL con una pipeta 1 mL de congelación y coloque el tubo de microcentrífuga en un recipiente de congelación. Añadir alcohol isopropílico a la línea de llenado del recipiente de congelación y mantener a temperatura ambiente antes de usar.
    5. Dejar los recipientes de congelación durante la noche en un congelador de-80 ° C.
    6. Los tubos de microcentrífuga de transferencia a un contenedor de nitrógeno líquido hasta 2 – 3 años.
      Nota: No mantener las células en el medio de congelación durante mucho tiempo y transferir rápidamente las células a un congelador de-80 ° C debido a la toxicidad de DMSO.
  2. Descongelar las células ES de ratón.
    1. Pre-calentar 50 mL de medio de suero en un baño de agua de 37 ° C.
    2. Sacar un frasco que contiene la célula desde el contenedor de nitrógeno líquido y sumerja el frasco tapado en un baño de agua de 37 ° C. Agitar rápidamente en el baño de agua para descongelar. Transferir las células a un tubo de 15 mL con una pipeta de 1 mL. Añadir 2 mL de medio de cultivo con suero en el tubo para diluir el medio de congelación y luego centrifugar a 800 x g y temperatura ambiente durante 3 minutos.
    3. Quite el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet celular con 3 mL de medio fresco de Vc/PD0325901 con una pipeta de 5 mL.
    4. Las células de transferencia del tubo de 15 mL a un plato cubierto de gelatina y las células para 24 h. cultura la cultura las células otra vez como se describe en el paso 2.

4. Extracto de la proteína Total de las células

  1. Enjuague las células recolectadas con 1 mL de PBS y luego centrifugar a 800 x g y temperatura ambiente durante 3 minutos.
  2. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células completamente con RIPA buffer suplementado con TDT, inhibidor de la proteasa cóctel y PMSF mediante pipeteo suave. El volumen del almacenador intermediario RIPA es cerca de 5 x que de la celda de pellets.
    Nota: Llevar a cabo la resuspensión de células en el hielo.
  3. Mantener las células en almacenador intermediario RIPA por 30 min en hielo y centrifugar a 13.000 x g y 4 ° C durante 5 minutos.
  4. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y guardar en alícuotas a-80 ° C.
  5. Determinar la concentración de la proteína con un kit de análisis de la proteína de Bradford.

5. extraer el ADN de las células y síntesis de ADN en un nucleósido solo usando enzimas

  1. Recoger las células con tripsina como se describe en los pasos 3.1.1 y 3.1.2.
  2. Realizar la extracción de ADN con un kit de purificación de DNA genómico siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Almacenar el ADN extraído en tubos de centrífuga de 1 mL. Añada 100 μl de agua ultrapura en el tubo de centrífuga y disolver el ADN mediante pipeteo aproximadamente 15 veces. Determinar la concentración y evaluación de la calidad de la DNA por la medida de la absorbancia a 260 nm y 280 nm15. La concentración de ADN es aproximadamente 500 ng/μl.
  4. Digest 5 μg de ADN en un sistema de 50 μl de la solución: Añadir 5 μl de solución de Tris-HCl, pH 7.6 de 100 mM (concentración final: 10 mM), 2 U becerro intestinal la fosfatasa, 1 U DNasa I, 0.005 U snake venom fosfodiesterasa I y 5 μg de ADN (calcular el volumen añadido según la correcta concentración de ADN rojo, ~ 10 μl) en un tubo de centrífuga y aumentar el volumen de la solución a 50 μL con agua ultrapura. Incubar la mezcla a 37 ° C durante la noche. La solución de ADN digerida a 1.000 g y temperatura ambiente durante 1 minuto recoger la solución en la parte inferior de los tubos de centrífuga.
  5. Trasvasar la solución de ADN digerida de los tubos de centrífuga tubos de ultra filtración (un corte del peso de la molécula: 3 kDa) y centrifugar a 13.000 g y 4 ° C por 30 min eliminar las enzimas de la digestión.
  6. Preparar las muestras para análisis de 5mC y 5hmC.
    1. Para el análisis de 5hmC: pipeta 36 μl de solución de filtro a una nueva centrífuga de tubos (1 mL) y añada 4 μL de 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-desoxicitidina ([D3]-5hmC) con la concentración final de 3 nM.
    2. Para el análisis de la 5mC: Añadir 196 μl de agua ultrapura en un nuevo tubo de centrífuga y pipeta 4 μL de solución de filtrado al tubo (50-fold dilución), debido a la alta densidad de 5mC en la DNA genomic. 36 μl de la solución diluida de transferencia a un nuevo tubo de centrífuga y agregar 4 μL de (5'-(methyl-d3)-2'-desoxicitidina ([D3]-5mC) con la concentración final de 50 nM. Uso [D3]-5hmC y [D3]-5mC como estándar interno para calibrar 5hmC y 5mC, respectivamente.
  7. Transferir la solución de la muestra a tubos de medición y almacenar a 4 ° C. Analizar 5mC y 5hmC con ultra alto rendimiento líquido cromatografía-triple cuadrupolo espectrometría de masa con reacción múltiple monitoreo (UHPLC-MS/MS (MRM)) como se describe en un informe anterior15.

6. analizar la 5mC y 5hmC usar UHPLC-MS/MS15

  1. Configurar varios parámetros para el análisis de 5mC y 5hmC utilizando el software MS UHPLC.
    1. Establecer un nuevo método. Abra el software y haga clic en "archivo | Nuevo | Método". Exponer el cuadro de mensaje del Editor de métodos de"" el contenido "desea guardar los cambios para el método actual" y haga clic en "No".
    2. Construir los parámetros del muestreador. Haga clic en "Sampler | Configuración | Inyección". Entrada "a 5 μL en el volumen de inyección" y seleccione "Inyección estándar".
    3. Construir los parámetros de la bomba en UHPLC.
      1. Haga clic en "BinPump2 | Setup"para construir los parámetros de la bomba. Configurar el "Flujo" en "0.25 mL/min" y "Detener el tiempo" en "15 minutos".
      2. Configurar "Solvente B en 5%" y "Límites de la presión" en el "bar Max 600".
      3. Haga clic en "BinPump2 | Calendario"para construir la isocrática parámetros de elución para análisis de 5mC. Haga clic en "Añadir" para agregar una fila. Entrada "0.00" en el "Tiempo" y "5.0" en el "B %". Haga clic en "Añadir" una vez más para agregar una nueva fila. Entrada "15.00" en el "Tiempo" y "5.0" en el "B %".
      4. Haga clic en "BinPump2 | Calendario"para la construcción de los parámetros de elución gradiente para el análisis de 5hmC. Haga clic en "Append para agregar una fila. Entrada de 0.00 en el tiempo y 5.0 "B %". Haga clic en "Añadir" una vez más para agregar una nueva fila. Entrada "3.00" en el "Tiempo" y "5.0" en el "B %". Haga clic en "Añadir" para que otro 6 veces agregar 6 hileras. Entrada "3.01" en "Tiempo" y "15.0" en "% B", "6.00" en "Tiempo" y "15.0" en "% B", "6.01" en "Tiempo" y "100" a "B %", "10.00" en "Tiempo" y "100.0" en "% B", "10.01" en "Tiempo" y "5.0" en el "B %", "15.00" en el "Tiempo" y "5.0" en el "B %" en secuencia.
        Nota: Realice el análisis de 5mC y 5hmC individualmente debido a las condiciones de separación diferente de UHPLC.
    4. Construir los parámetros de la temperatura del compartimiento columna (TCC) en UHPLC.
      Haga clic en "TCC | Configuración | temperatura (izquierda) "y"30 ° C".
    5. Establecer los parámetros de la QQQ-MS/MS.
      1. Haga clic en "MS QQQ | Detener el tiempo | Sin límite/As de la bomba"," fuente de Ion | ESI"," tiempo de filtrado | Anchura máxima: 0,07 min ". Configurar "segmentos de tiempo: hora de Inicio: 0"; "Tipo de exploración: MRM"; "Valor de Div: MS"; "Delta EMV (+): 200" y "Delta EMV (-): 0".
      2. Construir los parámetros de control de las transiciones de 5mC, D3-5mC, CC, 5hmC y D3-5hmC
        1. Haga clic en "MS QQQ | Adquisición | Analizar los segmentos: Moran: 90"; "Fragmentor: 90"; "Energía de la colisión: 5"; "Voltaje de acelerador de la célula: 4" y "polaridad: positiva".
        2. Entrada "5mC" en"compuesto", "242" en "Precursor Ion", "126" en "Producto Ion" para el análisis de la 5mC. Haga clic en el botón derecho y seleccione "Agregar fila" para agregar una nueva fila. Entrada "D3-5mC" en"compuesto", "245" a "Precursor Ion", "129" a "Producto Ion" para D3-análisis de 5mC.
        3. Otro suplemento tres filas utilizando el mismo modo. Entrada "dC" en"compuesto", "228" a "Precursor Ion", "112" a "Producto Ion" para el análisis dC. Entrada "5hmC" en"compuesto", "258" en "Precursor Ion", "142" a "Producto Ion" para el análisis de 5hmC. Entrada D3-5hmC en el nombre compuesto "261" en "Precursor Ion", "145" a "Producto Ion" para D3-análisis de 5hmC.
      3. Construir los parámetros de la fuente del gas. Haga clic en "MS QQQ | Fuente | Fuente de los parámetros: temperatura del Gas: 300 ° C "; "Flujo de gas: 11 L/min"; "Nebulizador: 15 psi"; "Positivo-tubo capilar: 3500 V".
      4. Guardar el método propuesto. Haga clic en "MS QQQ | Instrumento | Guardar método como". Seleccione un camino para el método propuesto por el "Directorio" y dar un nombre para el método de introducir el contenido en el "Método", por ejemplo: Análisis de 5mC y 5hmC.
  2. Separación de UHPLC y MS/MS análisis de mononucleosides
    1. Preparar la fase móvil de 5mC y citosina (C) análisis: forma de la fase móvil de solución A y B. solución A: 500 mL de agua ultrapura con 500 μl de ácido fórmico (concentración final: 0,1%) y solución B: 500 mL de metanol al 100%. Mezclar solución A y B en el 95: 5 (v: v) como fase móvil a fin de eluir 5mC y C (definido en el paso 6.1.3.3). Fijar el caudal de 0.25 mL/min (ubicado en paso 6.1.3.1).
    2. Preparar la fase móvil por disolventes A y B para el análisis de 5hmC. A solvente es solución acuosa de los3 de 2.0 mM NH4HCO (pH 9.0) (500 mL), y B es 100% metanol (500 mL). 5hmC separados por una elución gradiente optimizado: 0-3 min, B el 5.0% y 95% A (v: v); 3-6 min., 15.0% B y 85% A; 6-10 min, 100% B; 10-15 min, B el 5.0% y 95% un (sistema de paso 6.1.3.4). Fijar el caudal de 0.25 mL/min (ubicado en paso 6.1.3.1).
  3. Utilizar electrospray MS/MS con MRM modo (en el paso 6.1.5.1) para analizar la elución de la columna y adoptar el modo de ion positivo (definido en el paso 6.1.5.2.1).
    1. Seguimiento de las transiciones: 5mC, 242→126 de m/z (energía de la colisión, 5 eV); [D,3]-5mC, 245→129 de m/z (eV 5); dC, 228→112 de m/z (eV 5); 5hmC, 258→142 de m/z (eV 5); [D,3]-5hmC, 261→145 de m/z (eV 5) (fije en paso 6.1.5.2.2).
    2. Las tensiones capilares y fragmento en +3,500 V (definido en el paso 6.1.5.3) y 90 V (ubicado en paso 6.1.5.2.1), respectivamente.
    3. El volumen de inyección en 5 μl y analizar cada muestra 3 veces (definidos en el paso 6.1.2). Emplean las correspondientes curvas estándar para evaluar la cantidad de 5mC y 5hmC.
      1. Establecer la curva estándar de 5mC: transferir 1 – 50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, concentración final) solución estándar de 5mC en centrífuga de tubos y añadir 50 nM [D3]-5mC para tubos. Suplemento del volumen total de 50 μl. realizar el análisis de 5mC estándar siguiendo las instrucciones de la 5mC muestra (paso 6).
      2. Construir la curva estándar de 5hmC: transferir 1-20 nM (1, 2, 5, 10, 20 nM, concentración final) solución estándar de 5hmC a tubos de centrífuga y añadir 3 nM [D3]-5hmC a los tubos. Suplemento del volumen total de 50 μl. realizar el análisis de 5hmC estándar siguiendo las instrucciones de la muestra 5hmC (paso 6).

7. analizar la significación estadística

  1. Realizar el análisis estadístico utilizando el software.
    1. Abra el software y seleccione "Columna" en "nueva tabla y gráfico". Establecer los parámetros como sigue: "datos de la muestra | Inicio con una tabla de datos vacía"; "Elige un gráfico, el primer modo"; "Gráficas repeticiones o barras de error | Parcela | Significa con SEM".
    2. Haga clic en "Crear" para introducir las tres repeticiones del grupo Control y Vc/PD0325901-tratada en la línea "A" y "B", respectivamente. Seleccionar los seis datos y haga clic en "Analizar" en el "análisis".
    3. Seleccione "pruebast (y pruebas no paramétricas)" en "Análisis de columnas" y haga clic en "Aceptar" para entrar en la siguiente interfaz.
    4. Establecer los parámetros como sigue: "prueba de elegir | Nombre de prueba | Prueba t ; Opciones | Dos colas"; "Intervalos de confianza: 95%"; «Dígitos | Mostrar 4 dígitos". Haga clic en "Aceptar" para adquirir el valor de p entre el tratamiento Control y Vc/PD0325901.
  2. Evaluar la significación estadística entre el control y los grupos experimentales empleando dos colas y del estudiante t-pruebas16.
    Nota: p < 0.05 denota la diferencia que posee significación estadística. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

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Representative Results

VC/PD0325901 había inducido sinergia global de eliminación de las células ES de ratón. Mouse ES cells en suero exhiben hipermetilación del ADN, mientras que células ICM pluripotentes y PGCs muestran borrado global de metilación del ADN y el estado de hypomethylated está estrechamente relacionado con su pluripotencia9,10.

Anteriormente, nosotros y otros encontraron que Vc puede realzar la 5mC Tet-mediada del demethylation15,17. Mientras tanto, 2i también fue encontrado para inhibir la síntesis de novo de 5mC. En el contexto de estos hallazgos, propuso además la manipulación sinérgica de células ES de ratón usando Vc y 2i juntos. Después del análisis de UHPLC-MS/MS, se encontró que Vc y 2i en el medio que contiene el suero pueden reducir dramáticamente el contenido de 5mC desde 3.2 a 0,33 por 100 C (~ 90% pérdida de 5mC) día 11 en células de ratón ES (figura 1A). En cambio, Vc o 2i-tratamiento solo sólo causó 58% borrado con el nivel constante en 5mC o 61% reducción de 1.4% en el nivel de 1.3% 5mC.

El medio de 2i se compone de MEK inhibidor PD0325901 y GSK3β inhibidor CHIR99021. A continuación, investigamos qué componente induce la pérdida global de 5mC durante el cotratamiento de Vc y 2i. Interesante, Vc/PD0325901 causó un declive más rápido en los niveles de metilación del ADN que Vc/2i. VC/PD0325901 había alcanzado niveles de 5mC constante (~0.33% 5mC) después de 5 días, mientras que Vc/2i alcanzó un nivel comparable al día 11. Por el contrario, el suplemento de CHIR99021 había suprimido en parte desmetilación del ADN activadas por Vc (figura 1A). Estos datos sugieren claramente que PD0325901 en 2i contribuye a la hipometilación global del ADN genómico en células de ratón ES, mientras que CHIR99021 de 2i inhibe parcialmente la eliminación de 5mC. Por lo tanto, especulamos que el más rápido desmetilación del ADN inducida por Vc/PD0325901 en relación con Vc/2i puede atribuirse a la inhibición parcial de la CHIR99021 de desmetilación.

La hipótesis de que la eliminación global de 5mC en células ES de ratón inducido por Vc/PD0325901 puede ser parcialmente pertinente para la mejora de la desmetilación del ADN. Por lo tanto, se examinaron los productos de la oxidación genómica de 5mC. Se ha divulgado que eso 5mC puede ser convertido a 5hmC por la oxidación catalítica de dioxygenases familia Tet, que dependen de la Fe (II) y 2-oxoglutarato18,19. 5hmC genómica puede diluirse por ADN replicación20. Además, 5hmC puede ser oxidado más por Tet dioxygenases para producir 5-formylcytosine (fC 5) y 5-carboxylcytosine (5caC), que puede ser suprimido eficientemente por timina ADN glicosilasa (TDG) recuperar unmethylated citosina, lo que indica un ADN activo desmetilación21,22.

En consonancia con el anterior trabajo15, tratamiento que contiene el Vc (Vc, Vc/2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021) aumentado 5hmC frecuencia (5hmC/10,6 C) después de 1 día y luego disminuyeron gradualmente los niveles 5hmC (figura 1B) debido a la progresiva reducción de substrato 5mC. En particular, Vc/PD0325901 y Vc/2i mostraron más rápida cinética de pérdida de 5hmC en comparación con Vc y Vc/CHIR99021 debido a la reducción más rápida de 5mC. Además, también observamos que en el día 1, Vc-tratamiento estimula más generación de 5hmC en comparación con Vc/CHIR99021, indicando que CHIR99021 en parte había reprimida la producción inducida de Vc de 5hmC e inhibe la desmetilación del ADN. pérdida de 5hmC en el tratamiento de 2i se debe atribuir a la disminución del sustrato 5mC. Tomados en conjunto, estos resultados mostraron que actividad de desmetilación del ADN mejorado Vc contribuyó en parte a la hipometilación sinérgicamente en tratamiento Co de Vc/PD0325901 y Vc/2i.

Ambos de Habibi et al. 23 y von Meyenn et al. 24 también informó de que las células ES de ratón bajo condiciones 2i mostraban ADN global hipometilación e ingenuo pluripotencia. niveles de 5mC demostrados disminución gradualmente y alcanzaron un estado estacionario (5mC ~ 1%) en 12 – 14 días después de la reversión del suero a 2i. En el sistema de cultivo de Vc/PD0325901, el tratamiento Co había causado más rápido desmetilación del ADN y había alcanzado un nivel estable (0.33% 5mC) después de la suplementación de Vc/PD0325901 en medio de suero durante 5 días, debido al efecto sinérgico de Vc/PD0325901. El nivel alcanzado metilado (0.33% 5mC) era pronouncedly más bajo que condiciones 2i por Habibi et al. y von Meyenn et al., mientras que 5hmC los niveles fueron mayores debido a la generación promovida de Vc.

PD0325901 elevado Prdm14 expresión para reprimir Dnmt3b y Dnmt3l, pero no Dnmt3a25. Para investigar la acción de PD0325901 en la inducción de pérdida de 5mC, se examinó una serie de expresión de proteína relacionada con la 5mC, incluyendo el mantenimiento (Dnmt1) y la de novo (Dnmt3a y Dnmt3b) metiltransferasas de ADN y su cofactor (Uhrf1 y Dnmt3l) y proteína (Prdm14) Reglamento 8,9,26. Tras el análisis de Western blot, Prdm14 pronouncedly fue elevado en PD0325901, incluyendo cultura (figura 2). Por el contrario, Dnmt3b y su cofactor Dnmt3l demostraron considerable regulación de expresión de la proteína PD0325901-incluyendo tratamiento (figura 2). CHIR99021 tratamiento leve o no mostró efecto sobre el nivel de Prdm14 y Dnmt3b Dnmt3l. No cambió la expresión de Dnmt3awas y la causa es confusa. Además, el mantenimiento ADN metiltransferasa Dnmt1 y su factor de segmentación Uhrf1 también no mostraron ninguna alteración y no se muestran los datos.

Estudios recientes han indicado que Prdm14 puede reclutar polycomb 2 complejo represivo (PRC2) a algunos promotores de genes para reprimir su expresión, como de novo ADN metiltransferasas (Dnmt3a y Dnmt3b) y su cofactor (Dnmt3l) y contribuye a mantenimiento del hypomethylation en 2i condiciones8,27. Nuestros datos revelaron que PD0325901 elevado el nivel de expresión de Prdm14 para inhibir la Dnmt3b y Dnmt3l y había reducida síntesis de novo de 5mC genómica por el mecanismo.

Para explorar el mantenimiento de la pluripotencia de las células de ratón ES Vc/PD0325901 condiciones, niveles de expresión de mRNA de varios factores de pluripotencia ligada de base fueron examinados, y se han confirmado estos factores que juegan un papel vital en pluripotencia28. Análisis PCR en tiempo real encontraron que Oct4, SOX2, Esrrb y Sall4 mostraban niveles de expresión uniforme a través de 5 días de tratamiento con Vc/PD0325901 en contraste con la cultura de suero (Figura 3A). Nanog y Tcf3 aumentado 1.3-fold y 1.6-fold, respectivamente. Por el contrario, Klf4 mostró 42% abajo-regulación y Rex1 sólo disminuyó en un 12%. Estos resultados sugieren que Vc/PD0325901 co tratamiento induce diversas alteraciones en la expresión de factores de pluripotencia; sin embargo, Oct4 y SOX2, los factores fundamentales más, mantienen niveles casi constantes de expresión.

A continuación, se realizó un ensayo de fosfatasa alcalina (AP) para determinar si las células de ratón ES estaban en un estado no diferenciado o diferenciado. Fotos de las células (figura 3B y 3C) fueron obtenidas de una cámara conectada a un microscopio invertido con amplificación de 10 veces por un objetivo. Después de cultivo continuo de 26 días en medio de suero Vc/PD0325901-añadida, las células de ratón ES demostraron morfología homogénea. Además, casi todas las células se tiñeron de púrpura negro y exhiben un estado similar a la bola sin fruto (figura 3), mostrando un estado indiferenciado. Por el contrario, en condiciones de suero, una porción de las células de ratón ES en el día 26 fueron púrpura negro después de la coloración y tenía un estado de la bola como en morfología, mientras que otros presentan color claro con outspreading marcadas por líneas discontinuas blancas de oval (figura 3B); Esto indica que las células de ratón cultivadas en suero ES eran heterogéneas en morfología y en un estado de pluripotencialidad, que es consistente con informes anteriores13. Colectivamente, los datos de apoyaron que PD0325901 en combinación con Vc puede mantener excelente morfología y un estado indiferenciado de las células ES de ratón.

Figure 1
Figura 1: Vc/PD0325901 sinérgica inducida por eliminación global 5mCin genómica ES de células de ratón. (A) frecuencia de 5mC (5mC/C) y (B) 5hmC frecuencia (5hmC/C)-cambio dependiente durante un tratamiento de 26 días de un continuo suplemento con Vc, 2i, 2i/Vc, Vc/PD0325901 o Vc/CHIR99021 en suero que contiene medio. Barra de error muestra la desviación estándar (SD) de tres análisis repetidos de UHPLC-MS/MS. C: citosina. Esta figura ha sido modificada de Li et al. 25. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La alteración de la expresión de la proteína de Prdm14 y DNA metiltransferasas (Dnmt3a, Dnmt3b y Dnmt3l). Las bandas actuales (de izquierda a derecha) se obtuvieron a través de un tratamiento de día 5 de cultivo suero (Control), Vc, PD0325901, CHIR99021, 2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021 y Vc/2i, respectivamente. La expresión de Prdm 14 fue para arriba-regulados y Dnmt3b y Dnmt3l disminuyeron después de PD0325901, incluyendo la cultura. Dnmt3a no exhibió ningún cambio. Β-tubulina se estableció como referencia interna. Con: Control; PD: PD0325901; CH: CHIR99021. Esta figura ha sido modificada de Li et al. 25. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Vc PD0325901-inducido de la alteración en la expresión del mRNA de genes pluripotenciales y en la actividad de la fosfatasa alcalina. (A) el mRNA nivel de genes pluripotenciales parcial fue cambiado mediante un tratamiento de 5 días de Vc/PD0325901 en relación a las condiciones del suero (Control). Los datos fueron representados como media ± SD Se evaluó la significación estadística y p < 0.05 fue estadísticamente significativa. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 y ns representado no significativa. PD: PD0325901. Mouse ES cells en suero durante 26 días (B) exhiben consecuencia parcial marcado por líneas discontinuas blancas de oval, mientras que Vc/PD0325901-ha añadido medio de suero había mantenido gran morfología y un estado indiferenciado (C). Estas imágenes fueron adquiridas de un microscopio invertido conectado con una cámara en el campo luminoso. Esta figura ha sido modificada de Li et al. 25. barras de la escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En el trabajo, hemos demostrado un nuevo método de la combinación de capital y PD0325901 para mantener las células de ratón ES en un estado indiferenciado y hypomethylated, que fue alcanzada por una acción sinérgica de promover la desmetilación del ADN por Vc y supresión de novo de DNA metilación de PD0325901. Por otra parte, las células ES de ratón demostraron gran morfología bajo el sistema de cultivo de Vc/PD0325901.

Para sustentar mejor el estado de las células de ratón ES en el sistema de cultivo de Vc/PD0325901, hay algunos pasos críticos. En primer lugar, FBS lotes deben ser preseleccionados para encontrar y almacenar los mejores lotes; reemplazo frecuente de suero es también perjudicial a proliferación celular y el mantenimiento de la pluripotencia. En segundo lugar, evitar pipetear las células durante la disociación de las colonias de células a una suspensión de células individuales en la etapa del paso de la célula. En tercer lugar, para atenuar el efecto adverso de la tripsina durante el cultivo celular, la tripsina debe quitarse inmediatamente después de que cubre las células en los platos durante pases de células. Además, el medio de cultivo de Vc/PD0325901 debe reemplazarse diariamente debido a la inestabilidad de la Vc.

En comparación con la cultura clásica del suero, las células ES de ratón Vc/PD0325901 condiciones muestran una población más homogénea de la célula (figura 3B, C) y un estado de hypomethylated, que se asemeja al ICM y PGC. Además, en comparación con la cultura de 2i recientemente desarrollados, nuestro método puede realizar la hipometilación con cinética más rápida, y la utilización de un único inhibidor (PD0325901) reduce la cantidad de entrada de DMSO, disminuyendo el daño a las células. Sin embargo, debido a la adición de FBS en nuestro sistema de cultura, las acciones duales ambivalentes de FBS pueden causar diferenciación celular durante el cultivo a largo plazo. En general, este sistema novedoso de la cultura es conveniente para el mantenimiento y ampliación en gran escala de las células ES de ratón.

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Disclosures

Los autores no divulgar conflictos de interés.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China (21435008 y 21327006 a H.W.) y el programa de investigación prioridad estratégica de la Academia China de Ciencias (XDB14030200 a H.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

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References

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Las células madre embrionarias de bioquímica número 136 vitamina C PD0325901 ratón hypomethylation de la DNA Prdm14 pluripotencia
Un método de cultura alternativa para mantener la hipometilación genómica de células madre embrionarias del ratón usando MEK inhibidor PD0325901 y vitamina C
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Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

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