Summary
Det här protokollet beskriver en experimentell förfarande för att kvantitativt och grundligt undersöka metabolismen av flera näringskällor. Detta arbetsflöde, baserat på en kombination av isotopiska tracer experiment och en analytisk procedur, tillåter ödet för förbrukade näringsämnen och molekyler synthetized metabolisk ursprung av mikroorganismer skall fastställas.
Abstract
Studier inom mikrobiologi är beroende av genomförandet av en rad olika metoder. Särskilt bidrar utvecklingen av lämpliga metoder väsentligen till att ge omfattande kunskap av metabolismen av mikroorganismer växer i kemiskt definierade media som innehåller unika kväve och kolkällor. Förvaltningen genom metabolism av flera näringskällor, trots deras bred närvaro i naturliga eller industriella miljöer, är däremot fortfarande nästan outforskade. Denna situation beror främst på bristen på lämpliga metoder, som hindrar utredningar.
Vi rapporterar en experimentell strategi att kvantitativt och grundligt utforska hur ämnesomsättningen fungerar när ett näringsämne tillhandahålls som en blandning av olika molekyler, dvs, en komplex resurs. Här, beskriver vi sin ansökan för att bedöma delningen av flera kväve källor genom jäst metaboliska nätverk. Arbetsflödet kombinerar information som erhålls under stabil isotop tracer experiment med valda 13C- eller 15N-märkt substrat. Den första består av parallella och reproducerbara fermentering i samma medium, som innehåller en blandning av N-innehållande molekyler; en valda kväve källa är dock märkt varje gång. En kombination av analytiska förfaranden (HPLC, GC-MS) genomförs att bedöma märkning mönster av riktade föreningar och kvantifiera konsumtion och återvinning av substrat i andra metaboliter. En integrerad analys av hela datamängden innehåller en översikt över ödet av förbrukade substrat inom celler. Denna strategi kräver en korrekt protokoll för insamling av prover – underlättas av ett robot-assisterad system för online-övervakning av fermentering – och uppnåendet av många tidskrävande analyser. Trots dessa begränsningar är tillåtet det att förstå, för första gången av uppdelning av flera kväve källor i hela jäst metabola nätverket. Vi klarlagd omfördelning av kväve från mer rikliga källor mot andra N-föreningar och beslutsam metabolisk ursprung flyktiga molekyler och proteinogena aminosyror.
Introduction
Förståelse är hur mikrobiell ämnesomsättning fungerar en nyckelfråga för design av effektiva strategier för att förbättra jäsningsprocesser och modulera produktion av fermentativa föreningar. Framstegen inom genomik och funktionsgenomik i dessa senaste två decennierna i hög grad bidragit till att utöka kunskapen om topologin för metaboliska nätverk i många mikroorganismer. Tillgång till denna information ledde till utvecklingen av metoder som syftar till en omfattande översikt av cellulär funktion1. Dessa metoder är ofta beroende av en modellbaserad tolkning av mätbara parametrar. Dessa experimentella data inkluderar, å ena sidan, metabolit upptag och produktion priser och, å andra kvantitativa intracellulära informationen som erhålls från isotopen tracer experiment. Dessa uppgifter ger viktig information för avdrag för aktiviteten i vivo av olika vägar i en definierad metaboliska nätverk2,3,4. För närvarande är de tillgängliga analytiska teknikerna bara aktivera exakt detektion av märkning mönster av molekyler när du använder en enda element isotop och eventuellt när Co märkning med två isotopiska element. Dessutom under de flesta odlingsbetingelser består kol källan bara av en eller två-föreningar. Följaktligen, metoder som bygger på 13C-isotopiska spårämnen från kol substrat allmänt och framgångsrikt tillämpades för att utveckla en fullständig förståelse av kol metabola network operations5,6,7 ,8.
Däremot i många naturliga och industriella miljöer består resursen tillgängligt kväve som stöder mikrobiell tillväxt ofta av ett brett utbud av molekyler. Exempelvis under jäsning av vin eller öl tillhandahålls kväve som en blandning av 18 aminosyror och ammonium vid varierande koncentrationer9. Denna samling av N-föreningar som är tillgängliga för anabolism gör dessa komplexa media villkor avsevärt skiljer sig från de vanligaste för fysiologiska studier, eftersom det senare uppnås med hjälp av en unik källa till kväve, vanligtvis ammonium.
Sammantaget internaliserat kväve föreningar kan ingå i proteiner eller kataboliseras direkt. Nätstrukturen av kväve metabolism i många mikroorganismer, inklusive jästen Saccharomyces cerevisiae, är mycket komplext i enlighet med mångfalden av substrat. Schematiskt, är detta system baserat på en kombination av den centrala kärnan av kväve metabolism vilket katalyserar omvandling av glutamin, glutamat och α-ketoglutarat10,11, med transaminaser och deaminases. Genom detta nätverk, amine grupper från ammonium eller andra aminosyror är samlade och α-keto syror släppt. Dessa intermediärer är också synthetized genom centrala kol metabolism (CCM)12,13. Detta stora antal Grenade reaktioner och intermediärer, involverade i både katabolismen av exogena kväve källor och anabolism proteinogena aminosyror, uppfyller de anabola kraven i cellerna. Aktiviteten via dessa olika sammanlänkade vägar leder även utsöndring av metaboliter. I synnerhet kan α-keto syror omdirigeras via Ehrlich vägen att producera högre alkoholer och deras acetat ester derivat14, som är viktig bidragsgivare till de sensoriska profilerna av produkter. Därefter spelar hur kväve ämnesomsättning fungerar en nyckelroll i produktion av biomassa och bildandet av flyktiga molekyler (arom).
De reaktioner, enzymer och gener som är involverade i metabolismen av kväve är utförligt beskrivna i litteraturen. Dock har frågan om fördelningen av flera kväve källor i hela ett metaboliska nätverk inte ännu tagits upp. Det finns två huvudsakliga skäl som förklarar denna brist på information. Först, med tanke på viktiga komplexiteten av kväve metabolism nätverket, en stor mängd kvantitativa data krävs för en fullständig förståelse av verksamheten som inte var tillgänglig förrän nu. Andra, många experimentella begränsningar och begränsningar av analysmetoder hindrade genomförandet av strategier som tidigare användes för förtydligandet av CCM funktion.
För att övervinna dessa problem, valde vi att utveckla en strategi för system-nivå som baseras på försoningen av data från en serie isotopiska tracer experiment. Arbetsflödet innehåller:
-En uppsättning av fermentering som utförs under samma miljöförhållanden, medan en annan valda näringsämnen källa (substrat) är märkta varje gång.
-En kombination av analytiska förfaranden (HPLC, GC-MS) för en noggrann bestämning, i olika skeden av jäsning, av kvarvarande koncentrationen av märkt substrat och koncentrationen och isotopiska anrikningen av föreningar som härrör från katabolismen av märkt molekylen, inklusive härledda biomassa.
-En beräkning av massa och isotopiska balansen för varje konsumeras märkt molekyl och ytterligare en integrerad analys av datamängden att få en global översikt över förvaltningen av flera näringskällor av mikroorganismer genom bestämning av flux nyckeltal .
För att tillämpa denna metod, måste det uppmärksammas att reproducerbara beteendet av stam/mikroorganism mellan kulturer. Prover från olika kulturer måste dessutom tas under samma väldefinierade jäsning. I experimentella arbetet redovisas i detta manuskript, används ett robot-assisterad system för online-övervakning av fermentering att ta hänsyn till dessa begränsningar.
Dessutom är det viktigt att välja en uppsättning märkt substrat (förening, natur och ställning märkning) som är lämpligt att ta itu med vetenskapliga problemet av studien. Här valdes 15N-märkt ammonium, glutamin och arginin som de tre stora kväve källorna hittade i druvjuice. Detta gjorde att bedöma mönstret av kväve omfördelning från förbrukade föreningar till proteinogena aminosyror. Vi syftar också till att utreda ödet för kol ryggraden i de förbrukade aminosyrorna och deras bidrag till produktionen av flyktiga molekyler. För att uppfylla detta mål, enhetligt 13C-märkta leucin, ingick isoleucin, treonin och valin i studien som aminosyror som härleds från stora intermediärer av Ehrlich väg.
Sammantaget utforskade vi kvantitativt hur jäst hanterar en komplex kväve resurs genom att omfördela exogena kväve källor för att uppfylla dess anabola krav under hela jäsningen medan dessutom att ta bort överskottet av kol prekursorer som flyktiga molekyler. Experimentella förfarandet redovisas i detta dokument kan användas för att undersöka andra flera näringskällor används av någon annan mikroorganism. Det verkar vara en lämplig metod för analys av effekterna av genetisk bakgrund eller miljöförhållanden på metabola uppförandet av mikroorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. jäsning och provtagning
-
Förberedelse av media och komposter
Obs: Alla fermentering är utföras parallellt, med hjälp av samma stam och i samma kemiskt definierade syntetiskt medium (SM, sammansättning anges i tabell 1), som innehåller en blandning av ammonium och aminosyror som kväve källor15. För varje jäsning tillhandahålls en enda kväve förening uteslutande i ett enhetligt märkta 13C eller 15N formulär (100%), medan andra förblir omärkt. För varje märkt kväve källa som används i uppsättningen experiment (här: 15NH4, U -15N4-Arg, U -15N2-Gln, U -13C6-Leu, U -13C5-Val, U -13C6-Ile, U -13C4-Thr), två komposter är beredda. För varje villkor utförs dubbla jäsningen med endast omärkt molekyler (7 styrning fermentering).- För varje N-källa att studeras, förbereda 500 mL SM märkt medium som innehåller alla kväve källor som anges i tabell 1, med undantag för föreningen som ska användas i 100% form.
Obs: Märkt molekylen läggs till i nästa steg. - Pastörisera varje medium i en 1 L mätkolv (10 min, 100 ° C) som innehåller en magnetisk omrörning bar. Väga lämplig mängd märkt molekyl att nå den slutliga koncentration som redovisas i tabell 1 och Lös det i mediet.
- Sterilisera mediet använder en disponibel vakuum filtreringssystem (cellulosaacetat membran, 0,22 µm). Med hjälp av en steril mätcylinder, dela medelväg mellan två försteriliserade Fermentorer (250 mL) som innehåller en magnetisk omrörning bar och är utrustade med jäsning lås för att undvika att upptagandet av syre men tillåta utsläpp av CO2.
- Värm de jäsning kolvarna till 28 ° C genom att placera dem i inkubation rummet för 1 natt (temperatur ligger på 28 ° C).
- För varje N-källa att studeras, förbereda 500 mL SM märkt medium som innehåller alla kväve källor som anges i tabell 1, med undantag för föreningen som ska användas i 100% form.
-
Inympningen och övervakning av fermentering
- Växa S. cerevisiae stam i sterilt rör innehållande 10 mL YPD medium vid 28 ° C med skakningar (150 rpm) för 12 h. Sedan Pipettera 1 mL YPD preculture och överföra det till 10 mL SM medium (i 15 mL sterilt rör). Inkubera kulturen för 12 timmar vid 28 ° C med skakningar (150 rpm).
- Under laminärt flöde, samla en preculture alikvotens och kvantifiera cell befolkningen som använder en elektronisk partikelräknare som är utrustad med en 100 µm-bländare. Centrifugera i preculture (2 000 x g, 15 min, 4 ° C) och centrifugerade i en lämplig volym sterilt vatten för att få en slutlig koncentration på 2,5 x 108 celler/mL. Inokulera varje fermenteren med 1 mL cellsuspension.
Obs: Robotsystem används för att övervaka jäsning beskrivs i figur 1. - Förbered den jäsning plattformen genom att installera Fermentorer i support guider som är korrekt placerade på 21-position omrörning plattorna och inställd omrörningshastigheten på 270 rpm. För att starta den on-line övervakning av varje jäsning, starta robot-kontroll ansökan, och sedan klicka på knappen ”starta test” och välj volymen jäsning skall utföras (300 mL).
- Gränssnittet visas tillåter indikeringen av antalet och placeringen av komposter på plattformen. Detta inträffar, högerklicka på kursort och välja ”Aktivera” Aktivera övervakning av den jästanken som ligger på denna position.
- Initiera beräkning programvaran, permanent körs i systemet, före start vikt förvärvet. Klicka på knappen ”Initialiser” och bekräfta med ”ok”. Klicka på ”Start” knappen robot-kontroll ansökan att starta vikt förvärven.
-
Provtagningsförfarandet
Obs: För varje jäskärlet, prover tas när CO2 produktion (värde visas on-line på datorn som kör programvaran beräkning) når den nödvändiga set-punkten: 5, 10, 40 och 90 g/L i denna studie.-
Provtagning förfarande för kulturer med märkta föreningar.
- Centrifugera två 6 mL prov (2 000 x g, 5 min, 4 ° C). Spara och förvara frysta supernatanterna i två portioner vid-80 ° C. Tvätta pellets två gånger med 5 mL destillerat vatten och förvaras vid-80 ° C för mätning av isotopiska rikedomar.
- Provtagning förfarande för kulturer utan märkta föreningar
- Skörda 10 mL av kultur, som kommer att användas för bestämning av torrvikt. Pellet cellerna från två 10 mL prov genom centrifugering (2 000 x g, 5 min, 4 ° C). Tvätta pellets två gånger med 10 mL destillerat vatten och lagra dem vid-80 ° C för bestämning av protein-och aminosyra.
-
Provtagning förfarande för kulturer med märkta föreningar.
2. kvantifiering av förbrukade kväve källor
-
Enzymatisk bestämning av kvarvarande ammoniakkoncentration
Obs: Bestämning av ammoniak koncentration i supernatanterna utförs med en kommersiell enzym-baserade kit; alla reagenser tillhandahålls av tillverkaren.- Förbereda en standard ammoniaklösning (61,4 mg/L) genom att lösa upp 25 mg av just vägde (NH4)2så4 i en 100 mL mätkolv.
- För att uppfylla tillverkarens instruktioner, utföra en 1:2 utspädning av de prover som togs före jäsning och på 5 g/L av CO2 släpptes. Justera pH-värdet i proverna till cirka 8 genom att lägga till 1 M KOH. Ta del av den extra volymen och ta hänsyn i utspädningsfaktorn.
- I 4 mL spektrofotometer kyvetter, mix 100 µL prov (spätt vid behov), destillerat vatten eller standard ammoniaklösning med 2 mL reagens 1 (0,75 mM ADP och 30 U/mL glutamat laktatdehydrogenas i pH 7,8 buffert) och 500 µL av reagens 2 (1.3 mM NADH). Inkubera i 15 min i rumstemperatur och läsa NADH absorbansen vid 340 nm (A1).
- Tillsätt 500 µL av reagens 3 (60 mM α-ketoglutarat i pH 8 buffert), inkubera provet för 20 min i rumstemperatur och läsa NADH absorbansen vid 340 nm (A2).
- Beräkna ammoniak koncentration med hjälp:
Cammoniak (g/L) = 0,083 x [(0.839 x A1-A2)prov- (0.839 x A1-A2)destillerat vatten] - Kontrollera att rätt koncentration erhålls med standardlösningen.
-
Kromatografisk analys av kvarvarande aminosyra koncentrationer
Obs: Bestämning av aminosyra koncentrationer i supernatanterna uppnås med hjälp av en dedikerad aminosyra analyssystem som baseras på jonbyteskromatografi med post kolumn derivatisering av N-föreningar med ninhydrin, vilket gör att deras kolorimetriska upptäckt.- Bered en referens genom att lägga till 200 µL av en kommersiell blandning av neutrala och sura aminosyror, 200 µL av en kommersiell blandning av grundläggande aminosyror och 200 µL av 2,5 mM glutamin 400 µL av 200 mM lithium citratbuffert, pH 2,2. Detta kemiskt definierade referenslösning behandlas som ett stickprov.
- Tillsätt 200 µL av 25% (w/v) sulfosalicylic syra lösning som innehåller 2,5 mM norleucine (intern standard) till 800 µL prov ta bort molekyler med hög molekylvikt. Inkubera i 1 h vid 4 ° C, centrifug (3 000 x g, 10 min, 4 ° C) och filtrera genom ett 0,22 µm porstorlek nitrocellulosa membran (spruta system).
- I programmerare programvaran, klicka på knappen ”Kör” för att börja vätskekromatografi (LC) analyser med analyzer utrustad med en katjon-exchange kolumn (litium formulär). Eluera aminosyrorna med successiva litium buffertar att skapa både en pH gradient och en övertoning i kampen mot jonkoncentration i kombination med en temperaturgradient (tabell 2).
- Kvantifiera kväveföreningar efter ninhydrin derivatisering av en spektrofotometrisk detektor på 570 nm (lila färg: reaktion mellan ninhydrin och amine grupp av aminosyror) och 440 nm (gul färg: reaktion mellan ninhydrin och Imin grupp prolin).
- Utför en enda punkt intern kalibrering med referenslösning och norleucine som intern standard för att beräkna koncentrationen av aminosyror i proverna med tillverkarens programvara.
3. kvantifiering av proteinogena aminosyror
-
Mätning av torr cell vikt
- Filtrera 10 mL av kulturen genom en nitrocellulosa filter (por storlek 0,45 µm) som är pre vägde i en aluminium-cup, med hjälp av en vakuumanordning. Tvätta två gånger med 50 mL destillerat vatten.
- Placera filtret i aluminium cup och torka i en värme ugn vid 105 ° C för 48 h (tills inga ytterligare förändringar i vikt observeras) innan omvägning filtret i koppen. Beräkna viktskillnaden.
- Beräkna medelvärdet för minst 3 oberoende mätningar att exakt fastställa den torr cell vikten av jästkultur.
-
Kvantifiering av proteinhalten i celler
Obs: Kvantifiering av den protein fraktionen celler utförs minst i tre exemplar med omärkt cell pellets som erhölls som beskrivs i avsnitt 1.3.2.- Extrahera proteiner genom tillsats av 1 mL DMSO lösning (50% v/v) till frysta pellets och inkubera vid 105 ° C för 1 h i torr värme ugn.
- Kvantifiera proteinhalten i DMSO extrakt med biokemiska kolorimetriska analys som baseras på minskningen av proteiner av Cu++ till Cu+ -joner som fälls ut ytterligare av bicinchoninic syra i en blå komplex (BCA assay).
-
Bestämning av de relativa bidragen av aminosyror i proteiner
Obs: Profilen för proteinogena aminosyror bestäms minst tre exemplar från omärkta cell pellets (1.3.2.).- Förbereda ett oxiderat utdrag genom att avbryta cellpelleten i 200 µL permyrsyra syra (90% myrsyra, 10% väteperoxid). Inkubera i 4 timmar vid 4 ° C och stoppa reaktionen genom tillsats av 33,6 mg natrium sulfat.
Obs: Oxidation steget krävs att konvertera cystein och metionin till metionin sulfon och cysteinsyra syra, vilket ytterligare kvantifieras genom jonbyteskromatografi. Dock är vissa aminosyror (tyrosin, fenylalanin, histidin och arginin) denatureras vid oxidation behandling. Följaktligen, två hydrolysat (med och utan oxidation) är beredda. - Tillsätt 800 µL 6N HCl i cell pellets eller oxideras extrakt och inkubera provet i ett hermetiskt tillslutna glasrör för 16 h vid 110 ° C i en torr värme ugn. Tillsätt 200 µL av 2,5 mM norleucine och ta bort HCl med en kväveström. Tvätta (omblandning det torkade extraktet och ta sedan bort vätskan med en kväve-ström) två gånger med 800 µL destillerat vatten och sedan med 800 µL etanol. Ta upp i 800 µL av 200 mM litium acetatbuffert, pH 2,2.
Obs: Bör uppmärksammas att inkubationstiden för hydrolys som vissa aminosyror inte är stabila under sura förhållanden. Den tryptofan fraktionen i protein uppskattas från data som finns i litteratur16, eftersom denna aminosyra är helt denaturerats under HCl hydrolys. - Förbereda en hydrolysat standard för enpunkts-intern kalibrering. Tillsätt 160 µL av en kommersiell lösning av hydrolyserat aminosyror till 840 µL av 200 mM litium acetatbuffert, pH 2.2, som innehåller 625 µM metionin sulfon, 625 µM cysteinsyra syra och 625 µM norleucine.
- Bestämma den relativa koncentrationen av aminosyror i proteiner med den kromatografiska metod som beskrivs i avsnitt 2.2.
- Förbereda ett oxiderat utdrag genom att avbryta cellpelleten i 200 µL permyrsyra syra (90% myrsyra, 10% väteperoxid). Inkubera i 4 timmar vid 4 ° C och stoppa reaktionen genom tillsats av 33,6 mg natrium sulfat.
-
Beräkningar
- Beräkna vikt av alla aminosyror i proteiner genom att dividera de uppmätta mängden varje aminosyra (mg/L) av den totala mängden aminosyra som mättes i protein extraktet (summan i mg/L).
- Multiplicera procentsatsen med koncentrationen av proteiner i kulturen (mg/L), dvs, produkten mellan proteininnehåll av biomassa och torr vikt, att bedöma koncentrationen av varje proteinogena aminosyra i kulturen (mg/L).
4. mätning av isotopiska anrikning av proteinogena aminosyror
Obs: För mätning av isotopiska anrikning av proteinogena aminosyror, använda märkt cell pellets. Tre olika agenter används för derivatisering steg för att kvantifiera den isotopiska anrikningen av aminosyror. Stödnivåerna kluster joner mäts för att uppskatta de märkning mönster av aminosyror. Signalen från varje kluster ion motsvarar överflödet av den massa isotopomers (m0 = utan märkning, m+ 1 = 1 märkt atom,...) av en aminosyra fragmentet. Ett exempel på ett kromatogram som erhålls efter förfarandet för DMADMF ges i figur 2.
-
Biomassa hydrolys
- Hydrolysera cell pellets (motsvarande 1-2 mg torkad biomassa) genom tillsats av 1,2 mL 6 M HCl och ruvning provet för 16 h vid 105 ° C i väl tillslutet glasrör i torr värme ugn.
- Tillsätt 1,2 mL destillerat vatten och centrifugera vid 3 000 x g i 5 min att ta bort cellulära skräp. Fördela supernatanten i sex 400 µL fraktioner i öppet glasrör. Torka fraktionerna i en värme ugn vid 105 ° C tills de når konsekvens av sirap (4-5 h).
-
Ethylchloroformate (ECF) derivatisering
- Lös upp torkade Hydrolysatet i 200 µL 20 mM HCl; Lägg sedan till 133 µL av pyridin: etanol (1:4). Tillsätt 50 µL av ECF derivatize aminosyror och vänta tills alla CO2 har släppts. Överför blandningen för att Centrifugera rören som innehåller 500 µL av diklormetan till extraktet de derivatized föreningarna.
- Vortex rören under 10 s och centrifugera dem för 4 min på 10 000 x g; samla den lägsta organiska fasen med Pasteur Pipettera och överföring till GC injektionsflaskor som innehåller konisk glas skär så att proverna kan injiceras direkt in i GC/MS-instrumentet.
-
(N, N)-dimetylformamid dimethyl acetal (DMFDMA) derivatisering.
- Lös upp torkade Hydrolysatet i 50 µL av metanol och 200 µL av acetonitril. Tillsätt 300 µL av DMFDMA. Vortex röret och överföring av proven till GC autosampler injektionsflaskor som innehåller konisk glas skär.
-
N, O-Bis (trimetylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) derivatisering
- Avbryta Hydrolysatet i 200 µL av acetonitril. Tillsätt 200 µL av BSTFA, hermetiskt stänga glasröret och inkubera i 4 h på 135 ° C innan du överför extraktet direkt till GC injektionsflaskor.
-
GC-MS analys
- Analysera prover med en gaskromatograf som är utrustad med en autosampler injektor och är kopplad till en masspektrometer.
- Använda instrumentspecifika programvara för att styra instrumentet och analysera kromatogrammen. I menyn ”sekvens”, klicka på ”Log exempeltabellen” för att skapa listan prov och klicka på knappen ”Kör” för att starta injektionerna.
Obs: Gaskromatografen är försedda med en 30 m x 0,25 mm apolar kiseldioxid kapillärkolonn med en 0,15 μm filmtjocklek. Ställa in masspektrometer quadrupole temperaturen vid 150 ° C och håll överföringsraden vid 250 ° C för alla analyser. Tre analytiska program, varje en specifik till varje derivatisering agent, används. - ECF derivat: Används helium som den mobila fasen med ett flöde av 1,2 mL/min. Ställ temperaturen på inloppet vid 230 ° C och som av källan på 250 ° C. Programmera autosampler att injicera 1 µL prov med split förhållandet 3:1. Kör de analyser, gradvis öka ugnstemperaturen som följer: 130 ° C under 3 minuter; lutning av 15 ° C/min till 260 ° C; upprätthålla temperaturen vid 260 ° C i 20 min.
- DMFDMA derivat: Används helium som den mobila fasen med ett konstant flöde av 1,2 mL/min. Ställ temperaturen på inloppet vid 230 ° C och som av källan på 250 ° C. Programmera autosampler att injicera 1 µL prov med split förhållandet 3:1. Kör de analyser, gradvis öka ugnstemperaturen enligt följande: 60 ° C i 1 min. lutning av 20 ° C/min till 130 ° C; andra lutning på 4 ° C/min till 260 ° C; upprätthålla temperaturen vid 260 ° C i 10 min.
- BSTFA derivat: Används helium som den mobila fasen med ett konstant flöde av 1,2 mL/min. Ställ temperaturen på inloppet på 275 ° C och som källan vid 300 ° C. Köra analyser (injektion: 1 µL), gradvis öka ugnstemperaturen som följer: 110 ° C i 1 min. första gradienten av 2 ° C/min till 154 ° C; andra lutning på 5 ° C/min till 300 ° C; upprätthålla temperaturen vid 300 ° C i 10 min.
- Upptäckt förfarande: För varje derivatisering, injicera ett prov (1 µL) i läget skanna med positiva elektron inverkan jonisering på 70 eV och ta del av retentionstiden för varje aminosyra.
- Använda dessa värden för att definiera tid windows hela kromatogrammet och för de olika utvalda joner, som är karakteristisk för varje aminosyra som förtecknas i tabell 3. dessa värden bör inkluderas för varje aminosyra. Inkludera denna information i SIM upptäckt programmet och kör analyserna i SIM-läge med positiva elektron inverkan jonisering på 70 eV.
- Använda instrumentspecifika programvara för att styra instrumentet och analysera kromatogrammen. I menyn ”sekvens”, klicka på ”Log exempeltabellen” för att skapa listan prov och klicka på knappen ”Kör” för att starta injektionerna.
- Samla in resultaten av analyserna; nämligen för varje aminosyra, registrera ett kluster av intensiteter som motsvarar till dess olika massa isotopomers. Bearbeta data med hjälp av dedicatedsoftware17 att korrigera för naturliga märkning och beräkna den isotopiska anrikningen av proteinogena aminosyror (definierat som andelen märkt av en aminosyra med avseende på dess totala belopp i proteinet prover).
Obs: Den isotopiska anrikningen av en molekyl (dvs.), uttryckt i procent, beräknas att summan av den massa isotopomers med märkning korrigerade stödnivåerna (m1, m2,.. .mn) summan av den korrigerade stödnivåer för alla de massa isotopomers (m0m1, m2,... mn):
I. E. = (m1 + m2 +... + mn) / (m0 m1+ m2 +... + mn)
- Analysera prover med en gaskromatograf som är utrustad med en autosampler injektor och är kopplad till en masspektrometer.
5. kvantifiering och isotopiska anrikning av flyktiga föreningar
-
Utvinning av märkt flyktiga föreningar
- Tillsätt 10 µL deutererade interna standarder i 5 mL av supernatanten (slutlig koncentration av deutererade föreningar: 100 µg/L) i en 15 mL glasrör. Tillsätt 1 mL diklormetan, tätt nära rören och skaka dem på en gungande plattform för 20 min. Centrifugera under 5 minuter vid 3000 x g och samla den organiska lägsta fasen i en 15 mL glasrör. Upprepa diklormetan utvinning.
- Torka det organiska extraktet över 500 mg vattenfritt natriumsulfat och samla den flytande fasen med en Pasteur Pipettera. Koncentrera sig extraktet av en faktor fyra under kväve flux och överföra den till en GC autosampler injektionsflaska.
-
GC-MS kvantifiering av flyktiga föreningar
- Utrusta gaskromatografen med en 30 m x 0,25 mm smält kiseldioxid kapillärkolonn med 0,25 μm filmtjocklek och tillämpa ett konstant helium flöde på 1,0 mL/min. Håll spridaren och överföringsraden vid 250 ° C.
- Injicera 2 µL prov med split förhållandet 10:1 och separera de extraherade flyktiga molekyler använder följande ugn temperaturprofil: Håll temperaturen för 3 min vid 40 ° C, öka det med 4 ° C/min upp till 220 ° C och sedan hålla ugnen på 220 ° C i 20 min.
- Upptäcka de föreningar med en masspektrometer med dess källa temperatur på 230 ° C och dess masspektrometer quadrupole temperatur på 150 ° C. Registrera masspektra i valt Ion övervakning (SIM) läge med positiva elektron inverkan jonisering på 70 eV och hjälp ion kluster specifika till flyktiga föreningar som redovisas i tabell 4.
- Använd en extern 7-punktskalibrering för att kvantifiera koncentrationerna av flyktiga molekyler från summorna av stödnivåerna motsvarande ion klustret. Förbereda stamlösningar av varje förening (10 g/L) i 100% etanol. Förbered sedan, standardlösningar för varje klass av flyktiga molekyler (etyl estrar, acetater, alkoholer och syror) genom att blanda lager lösningar. Slutligen, späd olika mängder standardlösningarna en 12% Hydroalkoholextrakt lösning innehållande 5 g/L vinsyra med pH justerat till 3.3 att förbereda kalibreringslösningar.
- Parallellt, korrigera för naturliga märkning av stödnivåerna för varje ion kluster och beräkna den isotopiska berikning av flyktiga föreningar, som definieras som den märkta fraktionen av molekylerna och uttrycks som en procentandel som använder dedikerade programvara 17.
6. beräkningar för en integrerad analys av datamängden
-
Insamling av primärdata
- Med hjälp av kalkylblad som visas i tabell 5, 6, 7, och 8, ange rådata värden som motsvarar koncentrationen av extracellulära aminosyror, cell torrvikt, proteinhalten i celler, koncentrationen av flyktiga molekyler, och isotopiska anrikning av proteinogena aminosyror och flyktiga molekyler.
Obs: De data som visas i tabellerna är uttryckt i mM. Alla resultat är också uttryckt i mg/L genom att multiplicera värdena i mM med molekylvikt av varje molekyl eller i mg N/L genom att multiplicera millimolar koncentrationen av en proteinogena aminosyra med atommassa av kväve (14 u) och av antalet kväve ato MS som tillhandahålls av katabolismen av denna molekyl. - Beräkna massan av alla aminosyror i proteiner genom dess belopp i mg/L i hydrolysatet divideras med den totala mängden aminosyror (deras summa i mg/L).
- Beräkna medel, STDAV(p) och standardfel för medelvärdet från de data som erhölls från de oberoende experiment.
- Beräkna den proteinogena koncentrationen (mg/L) för varje aminosyra genom att multiplicera procentandelen av denna aminosyra i proteiner (mg aa/g proteiner) av den protein fraktionen i biomassa (g proteiner/g DW) och torrsubstansinnehållet (produktion av biomassa) i den medium (g DW/L).
- Med hjälp av kalkylblad som visas i tabell 5, 6, 7, och 8, ange rådata värden som motsvarar koncentrationen av extracellulära aminosyror, cell torrvikt, proteinhalten i celler, koncentrationen av flyktiga molekyler, och isotopiska anrikning av proteinogena aminosyror och flyktiga molekyler.
-
15 N isotopiska tracer experiment
- Med hjälp av kalkylblad som presenteras i tabell 9, beräkna de märkta och omärkta fraktioner av kväve som finns i de proteinogena aminosyror (uttryckt i mg N/L) från deras totala koncentrationer (uttryckt i mg N/L) och deras isotopiska rikedomar. Märkt fraktionen motsvarar produkten mellan dess totala koncentration och dess isotopiska anrikning för varje aminosyra, och den omärkta delen är skillnaden mellan totalen och märkta belopp.
- Sedan bestämma fraktionen av totalkväve i proteiner som finns i de proteinogena aminosyror kvantifieras i denna studie genom att summera det totala beloppet för Ala Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, hans, Glu och Arg (i mg N/L) och dividera totalen en Mount kväve i proteiner av denna summa.
- Beräkna det kväve som tillhandahålls av arginin, glutamin eller ammonium som återfanns i de proteinogena syror kvantifieras i denna studie genom att summera den märkta fraktionen (i mg N/L) av proteinogena aminosyror som kvantifierades i studien (Ala Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, hans, Glu och Arg) under experiment i närvaro av 15N-märkt arginin, glutamin, eller ammonium och denna märkt-kväve fraktion divideras med den totala mängden kväve i de kvantifierade proteinogena aminosyror syror.
- Utvärdering av bidraget av de 3 mest förekommande aminosyrorna till intracellulära poolen av kväve som används för de novo biosyntes genom att kombinera data från 13C och 15N isotopen tracer experiment (kalkylblad i tabell 7).
- Från den totala mängden (uttryckt i mM) proteinogena Val, Leu, Ile eller Thr, dra av den del som härrör från direkta införlivandet av förbrukade föreningar (13C experiment) och den del som var de novo synthetized med hjälp av kväve från 3 viktiga källor för att bedöma den fraktion som var de novo synthetized med hjälp av kväve från de andra aminosyrorna.
- Sedan beräkna förhållandet mellan mängden aminosyra de novo synthetized med hjälp av kväve som tillhandahålls av Gln, Arg och NH4+ (summan uttryckt i mM) till den totala mängden proteinogena aminosyror (i mM) att kvantifiera bidrag arginin, glutamin och ammonium till intracellulära kväve poolen.
-
13 C isotopiska tracer experiment
- Beräkna de märkta och omärkta fraktionerna av de proteinogena aminosyrorna från uttryckt i mM och isotopiska rikedomar av proteinogena aminosyror som erhölls under experiment i närvaro av 13C-märkta Leu, Val, Ile eller Thr. (se 6.2.1, tabell 10).
- Beräkna de märkta och omärkta fraktionerna av flyktiga föreningar från uttryckt i mM och isotopiska rikedomar av flyktiga föreningar som erhölls under experiment i närvaro av 13C-märkta Leu, Val, Ile eller Thr ( Tabell 10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 visar en schematisk bild av det arbetsflöde som genomfördes för att undersöka hanteringen av jäst av flera kväve källorna som finns under vin jäsning.
På olika punkter för provtagning, biologiska parametrar – tillväxt egenskaper, kväve konsumtionsmönster och profilen för proteinogena aminosyror – Visa en hög reproducerbarhet bland fermentering (figur 4). Denna konsekvens validerar relevansen av den strategi som bygger på kombinationen av data som genereras under en uppsättning 14 oberoende fermentering.
Figur 5 visar en omfattande översikt av omfördelning av kväve från källor som är tillgängliga i druvsaft till alla proteinogena aminosyror. Denna analys stöds främst av de resultat som erhölls från försök utförts i närvaro av 15N-märkta föreningar. Mätning av isotopiska anrikningen av proteinogena aminosyror kombinerat med bestämning av massa och isotopiska saldon, och som första kvantifiering av kväve-påbörjade arginin, glutamin, ammonium och andra bidrag källor till amine grupper av var och en av dessa föreningar. Viktigt omfördelning av kväve som är understruket här speglar de novo syntesen av aminosyror i hållbar jäst tillväxt betydande roll.
Dessutom tillåter denna studie, som jämförde mängder märkta föreningar i proteiner med sin konsumtion, fraktionen av förbrukade N-innehållande molekyler som ingår direkt i proteiner när de anger cellerna som skall bedömas. Proteinogena aminosyror göras åtskillnad mellan enligt deras nivå direkt inblandningsprocent i biomassa; några av dem är uteslutande (Asp, Glu) eller mer än 80% de novo synthetized, medan endast små mängder av andra föreningar genereras genom de novo syntes. Intressant nog innehåller detta sista gruppen lysin och histidin, som är de enda aminosyror som alla förbrukade källorna ingår direkt.
Figur 5B presenterar också, för vissa aminosyror, en jämförelse mellan mängden förbrukade aminosyra som återvinns direkt in i biomassa, beräknat från data som erhållits i 15N-märkning experiment och mäts experimentellt i 13 C-märkning experiment. Små skillnader mellan dessa värden visar tillförlitligheten och robustheten hos den metod som tillämpades i denna studie.
Figur 6 visar ett exempel på kvantitativa partitionering (nyckeltal) av flöden genom metaboliska vägar som erhölls genom att genomföra arbetsflödet rapporterade i denna uppsats. Denna karta drogs genom att kombinera information från isotopiska tracer experiment med 15N- och 13C-märkta substrat och beskriver uppdelningen av de förbrukade alifatiska aminosyrorna i metaboliska nätverk som är inblandade i valin och leucin biosyntes i jäst (för beräkningar, se tabell 1 och tabell 2). Genom att mäta produktion och isotopiska anrikning av både proteinogena aminosyror och flyktiga föreningar, bedömde vi beloppet för dessa föreningar som var synthetized från de kol ryggrader av förbrukade U-C13- valin och U-C13- leucin, vilket motsvarar den märkta fraktionen av föreningar. Därefter kunde vi bestämma CCM bidrag till deras bildande (den omärkta fraktionen av föreningar). Carbon massa saldon ställa in med hjälp av arbetsflödet och beräkningsmetoden som föreslås här visar att mer än 96% av de förbrukade valin och leucin återvinns i deras konvertering produkter, nämligen, proteinogena leucin och valin, flyktiga högre alkoholer. Detta konstaterande bekräftas lämpligheten av den rapportera strategin för kvantitativa studier av metabolism. Integrerat och övergripande analys av datamängden erbjuder nya insikter i öde konsumeras aminosyror. Överraskande, en betydande del av valin och leucin är kataboliseras trots en betydande obalans mellan tillgängligheten av dessa föreningar i medium och deras innehåll i biomassa. Fraktionen av exogena N-föreningar direkt införlivas proteinerna beror dock på vilken typ av aminosyran. En annan viktig punkt gäller metabolisk ursprung proteinogena aminosyror och flyktiga molekyler. Analys av 13C-märkning mönstret av proteinogena leucin och valin avslöjar att kol skelettet av dessa aminosyror kommer främst från prekursorer som var synthetized genom CCM. I linje med denna iakttagelse visar låg införlivandet av märkning i isobutanol och isoamylacetat alkohol mycket begränsad inblandning av katabolismen av valin och leucin som förbrukats av jäst i bildandet av dessa högre alkoholer.
Figur 1. Automatiserad robotsystem för övervakning hög genomströmning fermentering. (A) Robotic platform. Komposter placeras (a) i support guider på magnetisk omrörning plattor (b). En säkerhet ljusridå (c) skyddar användare. En robotarm (d) flyttas Fermentorer successivt från sin plats på en av de 6 omrörning plattor till en precision balans (e) till vänster om den arbetsbord, att mäta vikten var 4 timmar. Den robotic plattformen ligger i ett temperaturkontrollerade rum. (B) Schematisk bild av Programvaruarkitekturen. Ett grafiskt gränssnitt gör det möjligt för användare att definiera experimentella inställningarna. Denna information överförs till programmet kontroll som styr robotarmen och registrerar olika vikt i olika raw data.xlm filer (1 fil/jäsning). Beräkning programvaran sedan samlar xlm filer och beräknar, för varje tidpunkt, mängden CO2 som släpps (uttryckt i g/L), som är proportionell till mängden sockerarter som har förbrukats vid denna tidpunkt, och andelen jäsning, vilket motsvarar CO2 produktionstakten, i g CO2/L/h (proportionell till graden av sockerkonsumtion). Data lagras i en relationsdatabas och visualiseras i en hängiven grafiska gränssnittet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. GC-MS analys av proteinogena aminosyror: exempel på alanin. (A) kromatogram erhålls efter derivatisering av proteinogena aminosyror med hjälp av DMFDMA. (B) massa spectra derivatized alanin. Två huvudsakliga toppar som motsvarar fragment med m0/z = 99 och m0/z = 158. (C) derivatisering reaktion av alanin med DMFDMA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Arbetsflöde för kvantitativ analys av metabolismen av flera kväve källor av jäst. Denna process inkluderar (i) en uppsättning 28 fermentering (7 kväve källor och fermentering med eller utan kväveföreningar i två exemplar); (ii) en analytisk del som innebär olika förfaranden för utvinning och derivatisering av molekyler och HPLC eller GM-MS analyser och (iii) bearbetning av raw-data och en integrerad analys av datamängderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Reproducerbarhet av biologiska parametrar från en uppsättning oberoende fermentering. (A-B) Medelvärden och standardavvikelser av torrvikt och proteininnehåll som erhölls från de 14 oberoende fermentering med hjälp av omärkta föreningar. (C-D) Medelvärden och standardavvikelser proteinogena och förbrukas aminosyror som mättes under 14 oberoende fermentering med hjälp av omärkta föreningar. CO2 -produktion: 5 (grön), 10 (blå), 40 (rosa) och 90 (lila) g/L. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5. Omfördelning av kväve från de tre största kväve-källorna till proteinogena aminosyror under jäsningen. (A) metabolisk ursprung proteinogena aminosyror: direkt införlivandet av förbrukade motsvarighet (blå) och de novo syntes använder kväve som tillhandahålls av förbrukade arginin (orange), glutamin (grön), ammoniumsulfat (rosa) eller andra aminosyror ( (lila). Uttryckt som en procentandel av det totala beloppet för varje proteinogena aminosyra. (B) jämförelse mellan mängden förbrukade amino syra (blå) och del av den förbrukade aminosyra som återvinns direkt i proteiner, beräknat från data som erhölls i 15N tracer experiment (lila) eller experimentellt mätt under jäsningen med 13C-märkta molekyler (rosa). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Kvantitativ analys av valin och leucin metabolism. Partitionering av förbrukade leucin (grön) och valin (blå) genom metaboliska nätverket när 40 g/L CO2 produceras. Barerna är proportionell mot mängden varje förening och uttrycks i µM, inklusive den fraktion som var synthetized från centrala kol metabolism (orange). Värden i vanliga teckensnitt: belopp i µM; värden i kursiv teckensnitt: andelen konsumerade valin (blå) eller leucin (grön) som var kataboliseras via vägen. Beräkningarna finns i tabell 1 och tabell 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Föreningar | Belopp per liter |
| Glukos C6H12O6 | 240 g |
| Äppelsyra C4H6O5 | 6 g |
| Citronsyra C6H8O7 | 6 g |
| Kalium fosfat KH2PO4 | 0,75 g |
| Kalium sulfat K2SO4 | 0,5 g |
| Magnesiumsulfat MgSO4, 7 H2O | 0,25 g |
| Kalciumklorid CaCl2, 2 H2O | 0.155g |
| Natriumklorid NaCl | 0,2 g |
| Myo-inositol | 20 mg |
| Kalcium pantothenate | 1,5 mg |
| Tiamin hydroklorid | 0.223 mg |
| Nikotinsyra | 2 mg |
| Pyridoxin | 0,25 mg |
| Biotin | 0,003 |
| MnSO4· H2O | 4 mg |
| ZnSO4·7H2O | 4 mg |
| CuSO4·5H2O | 1 mg |
| CoCl2·6H2O | 0,4 mg |
| H3BO3 | 1 mg |
| (NH4) 6 Mo7O24 | 1 mg |
| Ergosterol | 3,75 mg |
| Oljesyra | 1,25 ΜL |
| Tween 80 | 125 ΜL |
| Tyrosin | 8,6 mg |
| Tryptofan | 84,4 mg |
| Isoleucin | 15.4 mg |
| Aspartat | 20,9 mg |
| Glutamat | 56,7 mg |
| Arginin | 176,2 mg |
| Leucin | 22,8 mg |
| Treonin | 35,7 mg |
| Glycin | 8,6 mg |
| Glutamin | 237,8 mg |
| Alanin | 68,4 mg |
| Valin | 20,9 mg |
| Metionin | 14,8 mg |
| Fenylalanin | 17,9 mg |
| Serin | 37,0 mg |
| Histidin | 15.4mg |
| Lysin | 8,0 mg |
| Cystein | 6,2 mg |
| Proline | 288.3 mg |
| Ammoniak klorid NH4Cl | 220 mg |
| PH-värdet i mediet justerades till 3,3 med NaOH 10 M. | |
Tabell 1. Sammansättningen av det syntetiska medium som används i denna studie. Detta kemiskt definierade medium efterliknar sammansättningen av druvsaft.
| Eluering buffert | Temperatur | |
| Från 0 till 6 min | Lithium citrate, 200 mM, pH 2,8 | 32 ° C |
| Från 6 till 38 min | Lithium citrate, 300 mM, pH 3 | 32 ° C |
| Från 38 till 57 min | Lithium citrate, 500 mM, pH 3,15 | 64,5 ° C |
| Från 57 till 83 min | Lithium citrate, 900 mM, pH 3,5 | 75 ° C |
| Från 83 till 120 min | Lithium citrate, 1650 mM, pH 3,55 | 75 ° C |
| Från 120 till 130 min | Litium hydroxyde, 300 mM |
Tabell 2. Villkor som används för separation av aminosyror genom jonbyteskromatografi-. Eluering buffertar med ökade salt koncentrationer används successivt i kombination med en temperaturgradient aktivera separation av aminosyror.
| Aminosyror | Derivatizing reagens | RT (min) | Ion kluster (m/z) |
| Alanin | ECFen | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| Glycin | ECFen | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ECFen | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| Valin | ECFen | 4,97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7.37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| Leucin | ECFen | 5,67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| Isoleucin | ECFen | 5,85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| Treonin | ECFen | 6,48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECFen | 6,48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| Serin | ECFen | 6,53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECFen | 6,53 | 175, 176, 177, 178 | |
| Proline | ECFen | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartat | ECFen | 7,89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11,77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11,77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| Glutamat | ECFen | 8,81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12,75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12,75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12,75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| Fenylalanin | ECFen | 9.53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13,67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lysin | ECFen | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Histidin | ECFen | 12.54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| Arginin | BSTFAc | 18,8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
| en ECF, etyl chloroformate; b DMFDMA, (N, N)-dimetylformamid dibutyl acetal; c BSTFA, (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide). | |||
Tabell 3. Analytiska parametrar som används för bestämning av isotopiska rikedomar av aminosyror med hjälp av valda ion övervakning (SIM) läge. Denna tabell sammanfattar de kemiska agenser som används för derivatisering, retentionstiden för derivatized föreningar och kluster av joner som erhållits i MS (läge Electron inverkan) för varje aminosyra.
| Aminosyror | Derivatizing reagens | RT (min) | Ion kluster (m/z) |
| Alanin | ECFen | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| Glycin | ECFen | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ECFen | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| Valin | ECFen | 4,97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7.37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| Leucin | ECFen | 5,67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| Isoleucin | ECFen | 5,85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| Threonin | ECFen | 6,48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECFen | 6,48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| Serin | ECFen | 6,53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECFen | 6,53 | 175, 176, 177, 178 | |
| Proline | ECFen | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartat | ECFen | 7,89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11,77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11,77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| Glutamat | ECFen | 8,81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12,75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12,75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12,75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| Fenylalanin | ECFen | 9.53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13,67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lysin | ECFen | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Histidin | ECFen | 12.54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| Arginin | BSTFAc | 18,8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
Tabell 4. Analytiska parametrar som används för bestämning av isotopiska rikedomar och kvantifiering av flyktiga föreningar med valda ion övervakning (SIM) läge. Denna tabell sammanfattar retentionstiden och kluster av joner som erhållits i MS (läge Electron inverkan) för varje flyktiga föreningar.
Tabell 5. Bearbetning av raw-data erhållits från kvantifiering av kvarvarande aminosyror datamängden innehåller data från mätningar av ursprungliga och återstående aminosyror. Dessa värden används för att beräkna mängden förbrukade aminosyra (genom subtraktion). Medelvärden och standardavvikelser beräknas för ytterligare beräkningar. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Tabell 6. Bearbetning av raw-data erhållits från kvantifiering av proteinogena aminosyror. Den här datamängden innehåller uppgifter om sammansättningen i aminosyror av biomassa hydrolysat (A) och fraktionen av proteiner i biomassa (B). Dessa värden används för att bedöma den massa procentandelen av alla aminosyror i proteiner (C). Medelvärden och standardavvikelser beräknas för ytterligare beräkningar. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Tabell 7. Proteinogena aminosyror. Här kalkylbladet används för att beräkna koncentrationen (i mM) proteinogena aminosyror från data sammanfattas i tabell 5 och tabell 6. Medelvärden och standardavvikelser beräknas för ytterligare beräkningar. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Tabell 8. Bearbetning av raw-data erhållits från kvantifiering av högre alkoholer. Datamängden innehåller data från mätningar av flyktiga sammansatta koncentrationerna (A) och konverterar data uttryckt i enheter mg/l till µM (B). Medelvärden och standardavvikelser beräknas för ytterligare beräkningar. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Tabell 9. Bearbetning av raw-data erhållits från bestämning av isotopiska rikedomar av proteinogena aminosyror med hjälp av 15N-märkt substrat.
Medelvärden och standardavvikelser beräknas för ytterligare beräkningar. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Tabell 10. Bearbetning av raw-data erhållits från bestämning av isotopiska rikedomar av proteinogena aminosyror och flyktiga föreningar använder 13C-märkta substrat.
Medelvärden och standardavvikelser beräknas för ytterligare beräkningar. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantifiering av uppdelning av föreningar genom metaboliska nätverk med isotopiska tracer experiment är en lovande strategi för att förstå driften av mikrobiell metabolism. Denna metod, kan medan tillämpats med ett eller två märkta substrat, inte för närvarande tillämpas för att studera metabolismen av olika källor med hjälp av flera märkta elementärt isotoper (dvs, mer än två substrat). Faktiskt, de tillgängliga analytiska teknikerna aktivera noggrann bestämning av märkning konsumtionsmönster proteinogena aminosyror och molekyler uteslutande när isotoper av ett enda element och eventuellt när Co märkning med två element. Följaktligen, för att ta itu med dessa begränsningar och bedöma hanteringen av flera näringskällor av mikroorganismer, valde vi att upprepa en uppsättning kulturer under samma miljöförhållanden medan märkning en valda substrat med 13C eller 15 N isotoper. Sedan, ytterligare kombination av specifik information som tillhandahålls av varje 13C eller 15N tracer experiment erbjuder en kvantitativ Utökad vy av metabolismen av flera källor.
Uppnåendet av det rapportera tillvägagångssättet bygger på genomförandet av en reproducerbar rad kulturer under standart villkorar och insamling av prover från en population av celler i en definierad fysiologiska tillstånd som är samma för alla kulturer (cell tillväxt, konsumtion av substrat, osv). Dessa villkor måste vara uppfyllda så att uppgifter som erhållits från oberoende experiment kan blandas och analyseras tillsammans. Som uppfyller dessa villkor kräver noggrann och frekvent övervakning av mikrobiella aktiviteten som genomfördes i det experimentella arbetet redovisas här, med en robot-assisterad system för online-övervakning av jäst jäsning aktivitet. Mer konventionella metoder för mikroorganism odling och övervakning, såsom bestämning av celltillväxt genom att mäta optisk densitet, kan dock användas för att normalisera provtagningsförfarandet.
En annan förutsättning för att utföra denna metod är att ha en tydlig vision av metaboliska vägar som är involverade i nätverket för utredas. Denna kunskap är viktig för att välja uppsättningen märkt substrat som är lämpligast för att hantera frågan studeras. De märkta föreningarna samt art och positionen för märkning (13C, 15N, eller andra) inom molekylerna måste väljas passande för att jag) återställa alla etiketter som tillhandahålls av substratesna i de föreningar som härrör från deras katabolism och är ytterligare analyseras i förfarandet och ii) erhålla redundanta data som visar riktigheten av metodiken och giltigheten av resultaten. Proceduren som beskrivs här har även ett stort antal analyser som kan vara tidskrävande och kostsamma i mänskliga och finansiella resurser. Dessutom kan några analytiska begränsningar begränsa användningen av denna metod. Användare bör kontrollera först att alla de analysmetoder som krävs för kvantifiering av de föreningar som producerats under mikrobiell metabolism och för bestämning av deras isotopiska anrikning är tillgängliga. Detta tillvägagångssätt gäller andra endast bedömningen av metabolismen av substrat för vilka alla omvandlingen föreningar produceras i tillräckliga mängder för att kvantifieras exakt.
I detta papper tillämpat vi detta arbetsflöde för att utforska förvaltningen av flera kväve källor av jäst under vin jäsning. Detta betänkande erbjuder nya insikter på jäst metabolism, inklusive betydande katabolismen av mest konsumerade aminosyror, i kombination med deras låga direkt införlivande i proteiner och CCM att leverera prekursorer som används vidare för större bidrag både de novo syntesen av proteinogena aminosyror och bildandet av flyktiga molekyler.
Mer allmänt, den metod som beskrivs här kan användas för att kvantifiera delningen av flera substrat genom det metaboliska nätverket av någon mikroorganism. Det gör att forskare att belysa ödet för alla förbrukade föreningar efter de in i cellerna och åtgärda identifiering av metabolisk ursprung prekursorer och produkter. Denna information kan vara användbar för att jämföra den metaboliska aktiviteten av stammar som har olika genetisk bakgrund eller växa under olika förhållanden och, följaktligen, för att utforma rationella strategier för att förbättra jäsningsprocesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin och Jean-Marie Sabalyrolles för att bidra till befruktningen av robot-assisterad jäsning systemet och Martine Pradal, Nicolas Bouvier och Pascale Brial för deras tekniska support. Finansiering av detta projekt lämnades av Ministère de l'Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
| D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
| DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
| Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
| Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
| Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
| Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
| Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
| Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
| L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
| L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
| L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
| 13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
| 13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
| 15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
| ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
| U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
| Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
| Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
| Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
| Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
| Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
| Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
| Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
| Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
| Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
| Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
| 2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
| 2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
| 3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
| 2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
| 2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
| 2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
| 3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
| Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
| 2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
| Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
| 2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
| 2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
| 3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
| Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
| Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
| Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
| Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
| Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
| Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
| Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
| Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
| BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
| BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
| Incubator shaker | Infors HT | ||
| Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
| Centrifuge | Jouan | GR412 | |
| Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
| Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
| RobView | In-house developed calculation software | ||
| My SQL | International source database | ||
| Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
| BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
| Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
| Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
| Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
| Amino acids standards physiological - acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
| Amino acids standards physiological - basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
| Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
| Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
| Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
| Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
| EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
| Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
| Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
| Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
| Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
| Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
| Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
| Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
| Combustion oven | Legallais | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
| Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
| L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
| L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
| Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
| Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
| Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
| Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
| Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
| GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
| Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
| N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
| BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
| DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
| Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
| Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
| Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
| Helium BIP | Air products | 26699 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |
References
- Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
- Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
- Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
- Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
- Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
- Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
- Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
- Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
- Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
- Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
- Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
- Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).
- Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).
- Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
- Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
- Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
- Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).
